9

Prosiding Pertemuan Ilmiah Radioisotop, Radiofarmaka dan Siklotron Tahun 2011

ISSN : 2087-9652

Martalena Ramli1, Basuki Hidayat2, Cahya Nova Ardiyatno1, Sri Aguswarini1, Karyadi1 Cecep Taufik Rustendi1, Muhammad Subur1, Titis Sekar Humani1, Rien Ritawidya1.

117

Uji Preklinis 177Lu-DOTA-trastuzumab Radiofarmaka Potensial Untuk Terapi Kanker Payudara Positif HER-2


1) Pusat Radioisotop dan Radiofarmasi, Badan Tenaga Nuklir Nasional Kawasan PUSPIPTEK, Tangerang Selatan, Banten 15314

e-mail: [email protected]

2 ) Instalasi Kedokteran Nuklir, Rumah Sakit Hasan Sadikin Jl. Pasir Kaliki Bandung

ABSTRAK Radiofarmaka berbasis antibodi monoklonal anti human ephitelial receptor type 2 (HER-2) 177Lu-DOTA-trastuzumab yang potensial untuk diagnosis dan terapi kanker payudara yang mengekspresikan HER-2, dengan kemurnian radiokimia > 99% setelah proses pemurnian dengan kolom Sephadex G-25 M telah disiapkan. Uji preklinis dilakukan secara in vitro dan in vivo dan bertujuan untuk mendapatkan data dasar yang nantinya akan digunakan sebagai acuan dalam pelaksanaan uji klinis terutamanya untuk melihat apakah 177Lu-DOTA-trastuzumab lebih efektif dalam membunuh sel kanker yang mempunyai ekpresi HER-2 dibandingkan dengan trastuzumab tidak bertanda. Beberapa uji yang dilakukan dalam penelitian ini adalah uji clearance, uji pencitraan, uji sitotoksisitas. Dari hasil uji clearance 177Lu-DOTA-trastuzumab pada tikus normal dapat dilihat bahwa clearance 177Lu-DOTA-trastuzumab dari tikus lebih dominan melalui urin dibandingkan melalui feses. Sementara itu hasil uji pencitraan 177Lu-DOTA-trastuzumab pada tikus normal memperlihatkan masih adanya residu radioaktifitas di daerah hati 144 jam paska injeksi. Walaupun residu pada hati ini relatif kecil ( 99% had been prepared. Preclincal test including in vitro dan in vivo testings, which were aimed in providing basic data for clinical trial and in particular in finding out the effectiveness of 177Lu-DOTA-trastuzumab in killing cancerous cells which express HER-2 compared to the unradiolabelled trastuzumab, had been investigated. These included urine and feces clearance tests, imaging with gamma camera and cytotoxycity test. The experimentental results showed that the clearance of radioactivty after injection of 177Lu-DOTA-trastuzumab on rat more rapid throught urine compared to throught feces. The gamma camera image of normal rat up to 144 hours after the injection of 177Lu-DOTA-trastuzumab showed that there was still trace of radioactivity in hepatic area. This residue of radioactivity (< 5%, quantified by biodistribution test) was found to be relatively lower compared to the residue of radioactivty of other radiolabelled trastuzumab such as 111In-trastuzumab. Hovewer this residue of radioactivity has to be taken into a serious consideration when 177Lu-DOTA-trastuzumab is going to be applied on cancerreous patients. Cytotoxycity test showed that 177Lu-DOTA-trastuzumab was far more effective in killing cancereous cells positive HER-2 (SKOV-3 cell line) compared to the unradiolabelled trastuzumab. Keyword: breast cancer, HER-2, radiolabelled anti-HER-2 monoclonal antibody, 177Lu-DOTA-

trastuzumab, preclinical test

mailto:[email protected]


ISSN : 2087-9652


118

PENDAHULUAN Kanker merupakan salah satu masalah

utama kesehatan masyarakat kita. Saat ini di Indonesia kanker merupakan penyebab kematian nomor tiga(1). Sementara itu menurut laporan Golbocan, kanker payudara adalah jenis keganasan yang paling banyak diderita oleh perempuan Indonesia(2). Globocan juga melaporkan bahwa pada tahun 2008 di Indonesia ada 39.831 kasus kanker payudara dengan tingkat mortalitas mencapai of 20.052 orang. Statistik ini memperlihatkan betapa kanker menjadi beban yang cukup berat secara fisik, emosinal dan kesejahteraan masyarakat.

Dilaporkan bahwa 25 - 30% dari total

kasus payudara yang ada diketahui mempunyai ekspresi berlebihan anti human ephithelial receptor type 2 (HER-2) (3,4,5). Ekspresi berlebihan HER-2 yang mencapai tujuh kali lebih tinggi dibandingkan dengan pada sel normal, mengindikasikan bahwa jenis kanker payudara ini termasuk pada jenis kanker payudara yang agresif, cenderung bermetastasis, cenderung kambuh dan lebih sulit ditangani. Selain pada kanker payudara, ekspresi berlebihan HER-2 juga ditemukan pada beberapa jenis kanker lainnya seperti rahim, kanker lambung dan kanker ganas seperti uterine serous endometrial carcinoma.

Secara klinis HER-2 ini merupakan

target dari antibodi monoklonal trastuzumab yang dipasarkan dengan nama Herceptin untuk penanggulangan kanker payudara dan dan kanker lambung positif HER-2 (6,7). Mekanisme penghentian proses proliferasi keganasan oleh antibodi monoklonal trastuzumab adalah dengan cara mengikat HER-2 yang menyebabkan HER-2 signalling tidak meneruskan pesan untuk proses poliferasi sel.

Radiofarmaka merupakan sediaan

farmasi yang salah satu atom penyusunnya berupa radionuklida pemancar sinar (gamma), partikel (beta) atau (alfa) (8). Radiofarmaka dengan radionuklida pemancar sinar gamma umumnya di bagian kedokteran nuklir digunakan sebagai radiofarmaka untuk pencitraan dengan tujuan, antara lain mendiagnosa, mengidentifikasi dan melokalisasi lesi keganasan, serta meramalkan dan menilai respon terapi. Radiofarmaka dengan radionuklida pemancar partikel di bagian kedokteran nuklir digunakan sebagai sediaan farmasi terapi radiasi interna pada berbagai penyakit, temasuk penanganan kanker. Radiofarmaka dengan radionuklida yang dapat memancarkan partikel dan sinar gamma mempunyai keunggulan ganda, karena dapat

digunakan sebagai sediaan terapi dan sebagai diagnostik pencitraan pada kasus keganasan. Pada awal perkembangan radiofarmaka untuk terapi, deposisi radionuklida pada organ atau target yang diinginkan didasarkan hanya pada absorpsi biologis spesifik organ target. Misalnya penggunaan NaI-131 untuk penanganan kanker tiroid. Tapi pada perkembangannya akhir-akhir ini, deposisi radionuklida pada organ atau target yang diinginkan dibantu oleh molekul pembawa, yang mampu membawa radionuklida secara selektif pada area target (misalnya sel-sel kanker). Molekul pembawa ini dapat berupa, antibodi monoklonal, peptida, liposom dan lain sebagainya.

Lutesium-177 adalah salah satu

radionuklida yang mempunyai sifat fisika yang menarik dan sesuai untuk digunakan untuk pencitraan dan terapi penyakit (9,10). Lutesium-177 memancarkan partikel beta [Emax 497 keV (78,6%) dan 176 keV (12,2%)] yang berguna untuk radioterapi kanker yang berukuran kecil dan juga memancarkan radiasi gama [113 keV (6,4%) and 208 keV (11%) keV] sangat dekat energi gamma yang dipancarkan oleh 99mTc, radionuklida yang sangat popular untuk penatahan di kedokteran nuklir, jadi sangat sesuai untuk untuk pencitraan. Untuk dapat digunakan pada prosedur diatas, 177Lu harus ada dideposisikan pada organ atau penyakit yang akan dicitra atau diterapi. Penyediaan 177Lu juga relatif mudah yaitu dengan cara mengirradiasi 176Lu dengan netron dengan reaksi nuklir 176Lu(n,)177Lu (tampang lintang reaksi 2090 barn).

Radionuklida 177Lu beberapa tahun

terakhir ini telah coba diteliti oleh beberapa peneliti untuk pengembangan beberapa radiofarmaka baru[11, 12]. Beberapa jenis peptide dan antibodi monoklonal (mAbs) telah ditandai dengan radinuklida 177Lu dengan bantuan bifunctional chelating agent (BFCA). Diantara radiofarmaka tersebut adalah 177Lu-Octreotate-and 177Lu-BB2 bombesin GRP untuk terapi kanker neoroendocrine dan payudara dan 177Lu-PSMA antibodi untuk terapi kanker prostat. Radiofamaka-radiofarmaka ini saat ini sedang dalam proses uji klinis tahap akhir dan dalam waktu dekat siap untuk dilepas kepasaran.

Berdasarkan fenomena ini, dapat

dihipotesiskan banwa monokonal antibodi anti-HER-2 (trastuzumab) bertanda radionuklida pemancar gamma dan alfa- dan/atau beta-partikel, dan yang terjaga bio-karakternya, akan dapat berinteraksi secara spesifik dengan HER-2. Monoklonal antibodi trastuzumab tidak hanya berfungsi untuk membawa radionuklida pada target yang diinginkan tapi juga berfungsi untuk


ISSN : 2087-9652


119

menghentikan proliferasi sel kanker. Sementara itu beta-partikel yang dipancarkan oleh radionuklida akan mentransferkan energinya cross fire pada sel-sel kanker yang ada disekitarnya yang pada akhirnya akan membunuh sel-sel kanker tersebut. Sedangkan sinar gama yang dipancarkan akan membantu pencitraan/ lokalisasi keganasan. Sinergi trastuzumab dan pemancar partikel beta (177Lu) ini diharapkan akan meningkatkan indeks terapi untuk penanggulangan kanker positif HER-2 dibandingkan dengan pengunaan monoklonal antibodi atau radiasi secara sendiri-sendiri untuk terapi kanker.

Tujuan penelitian ini adalah untuk

melihat karakter 177Lu-DOTA-trastuzumab baik secara in vitro maupun in vivo, dan terutamanya adalah untuk melihat apakah 177Lu-DOTA-trastuzumab lebih efektif dalam membunuh sel kanker yang mempunyai ekpresi HER-2 dibandingkan dengan trastuzumab tidak bertanda. Data hasil uji yang didapatkan diharapkan dapat digunakan sebagai bahan acuan dalam pelaksanaan uji klinis. PROSEDUR DAN METODOLOGI Bahan dan Peralatan

Bahan kimia yang digunakan dalam penelitian ini adalah NHS-DOTA (Macrocyclic), resin penukar ion Chelex 100 (Bio-Rad), larutan salin (IPHA), ammonium asetat, NaHCO3,

K2HPO4, KH2PO4, Trastuzumab (Roche), HCl, NaOH, dan EDTA (E. Merck), Bovine Serum Albumin (BSA, Sigma), dan air bebas ion (hambatan 18 MegaOhm) didapatkan dari sistem Sartonet. Bahan lain yang digunakan adalah kaset dialisa (20.000 MWCO, Pierce), dan Sephadex G-25 Medium (Pharmacia). Lu-177 (177LuCl3) diperoleh dengan cara iradiasi 176Lu (176Lu2O3, pengkayaan 80,20%, Isoflex,) di RSG-GAS yang kemudian diproses di laboratorium PRR. Sel SKOV-3 (sel kanker ovarium positif HER-2) pemberian dari LAPTIAB-BBPT. Semua bahan kimia digunakan sebagaimana adanya kecuali jika ada pemurnian akan dijelaskan dalam prosedur kerja. Alat Penelitian yang Digunakan

Alat yang digunakan dalam penelitian ini diantaranya adalah magenetic stirer (Labcompanion), kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT, Shimadzu) yang dilengkapi dengan detektor UV-Vis (Shimadzu), thermomixer (Bio Rad, Plate Reader (BioTek), Kromatografi Lapisan Tipis (KLT) scanner (Bioscan) Prosedur dan Metodologi

Trastuzumab bertanda 177Lu disiapkan melalui beberapa tahap reaksi seperti terlihat pada Gambar 1. Preparasi dan uji stabilitas 177Lu-DOTA-trastuzumab ini sebelumnya telah dilaporkan (13).

N

NN

N

COH

OC

O

O

COH

OCHO

O

N

O

OSO3

N

NN

N

COH

OC

NH

O

COH

OCHO

O

Trastuzumab

177Lu

N

NN

N

COH

OC

NH

O

COH

OCHO

O

Trastuzumab

1

2

NH2-Trastuzumab

Gambar 1. Skema Reaksi Penandaan DOTA-trstuzumab dengan 177Lu Preparasi 177Lu-DOTA-trastuzumab

diawali dengan penyiapan, pemurnian dan kendali kualitas immunokonjugat DOTA-trastuzumab yang kemudian dilanjutkan dengan penandaan 177Lu. 177Lu-DOTA-trastuzumab yang terbentuk kemudian dimurnikan dari 177Lu

yang tidak berikatan dengan DOTA-trastuzumab dengan kolom Sephadex-G25M. Berikut ini rinkasan prosedur penyiapan 177Lu-DOTA-trastuzumab.


ISSN : 2087-9652


120

Penyiapan immunokonjugat DOTA-trastuzumab

Ke dalam tabung yang berisi 2 mL trastuzumab (5 mg/ mL) ditambahkan larutan sulfo-NHS-DOTA yang dilarutkan dalam dapar fosfat 0,1 M pH 7,5. Jika diperlukan atur pH campuran reaksi menjadi 7,3 dengan penambahan 0,2 M Na2HPO4 pH 9. Campuran reaksi ini kemudian diinkubasi pada rotator selama 24 jam pada 4 C. Immunokonjugat DOTA-trastuzumab yang terbentuk kemudian dimurnikan dengan cara dialisis menggunakan kaset dialisa (MCO 20000).

Penyiapan 177LuCl3

177LuCl3 disiapkan dengan cara mengiradiasi 0,5 1,0 mg 176Lu (176Lu2O3, pengkayaan 80.20%) di RSG-GAS selama 4 atau 10 hari. Target yang telah diiradiasi kemudian dipindahkan kedalam gelas beaker dan kemudian ditambahkan 2 mL HCl 6 M. Campuran kemudian didiamkan selama 30 menit sebelum ditambahkan 2 mL H2O2. Campuran reaksi kemudian dipanaskan dengan pengadukan sampai kering. Garam Lu-177 yang terbentuk kemudian dilarutkan dengan 3 mL HCl 0,5 M. Penandaan immunokonjugat DOTA-trastuzumab dengan 177Lu

Ke dalam aliquot immunokonjugat DOTA-trastuzumab ditambahkan aliquot 177LuCl3 (yang telah dikondisikan dengan amonium asetat 0,25 M pH 7,0; 1: 3). Campuran reaksi kemudian diatur pH nya sampai menjadi 5,5 dengan penambahan larutan HCl 1 M. Campuran reaksi kemudian diinkubasi pada suhu 42 C selama 1 jam. Pada akhir reaksi ditambahkan larutan EDTA 0,05 M secara berlebih (perbandingan mol EDTA : 177Lu = 20 : 1) dan diinkubasi selama 5 menit pada suhu 42 C. Pemurnian 177Lu-DOTA-trastuzumab dilakukan dengan melewatkan larutan ke dalam kolom Sephadex G-25 Medium (panjang 20 cm x diameter 1 cm) yang sudah dijenuhkan dengan 1 mL larutan BSA 10%. Kolom kemudian dielusi dengan 0,1 M phosphate buffer saline (PBS) pH 7,2. Eluat kemudian ditampung dalam 50 tabung reaksi (0,5 mL/tabung). Kemurnian radiokimia 177Lu-DOTA-trastuzumab ditentukan dengan kromtografi lapisan tipis (KLT) dengan menggunakan fase diam dan fase gerak berturut-turut ITLC-SG dan larutan salin. Persentase kemurnian radiokimia dihitung berdasarkan total cacah yang berada di bawah puncak radioimmunokonjugat dibandingkan terhadap cacah total yang diaplikasikan.

Uji Pencitraan Uji pencitraan dilakukan dengan cara

menginjeksikan masingmasing 200 Ci 177Lu-DOTA-trastuzumab pada lima ekor tikus. Pada waktu yang telah ditentukan (3, 24, 48, 72 dan 144 jam) paska injeksi tikus dibius dan kemudian dicitra dengan kamera gamma.

Uji Clearance

Uji clearance dilakukan dengan cara menginjeksikan masing-masing 400 Ci 177Lu-DOTA-trastuzumab pada dua ekor tikus. Masing-masing tikus kemudian ditempatkan pada metabolic cage. Urin dan feses ditampung secara terpisah. Setiap 24 jam contoh urin dan feses yang ditampung kemudian dicacah. Pengamatan dilakukan selama 240 jam. Sel Kultur

Sel SKOV-3 (kanker ovarium positif HER-2) dikultur dengan RPMI dengan 10% fetal bovine serum dan 1% penicillin-streptomicin di dalam inkubator dengan 5% CO2 pada 37C. Pasase dilakukan setiap tiga kali sehari sampai didapatkan jumlah sel yang memadai untuk uji sitotoksisitas dan uji binding affinity. Uji Sitotoksisitas

Uji sitotoksisitas dilakukan untuk melihat kemampuan 177Lu-DOTA-trastuzumab membunuh sel kanker yang mempunyai ekspresi HER-2 dibandingkan dengan naked trastuzumab. Uji ini dilakukan secara in vitro dengan menggunakan sel yang mempunyai reseptor HER-2.

Pada setiap sumuran dari Microplate 96

ditambahkan 5.000 sel dalam RPMI dengan fetal bovine serum 10% dan penicillin-streptomicin 1%. Sel kemudian diinkubasi selama 24 jam dalam inkubator dengan 5% CO2 pada 37C. Media kultur dari setiap sumuran dibuang dan kemudian ditambahkan 177Lu-DOTA-trastuzumab atau trastuzumab tidak bertanda dengan konsentrasi tertentu (50, 100, 200 dan 250 ppm). Kemudian ke dalam setiap sumuran ditambahkan 150 L media kultur. Campuran kemudian diinkubasi kembali selama 24 jam dalam inkubator dengan CO2 5% pada 37C. Media kultur dari setiap sumuran kemudian dibuang dengan pipet yang dilanjutkan proses pembilasan dengan 150 L PBS. Pada setiap sumuran kemudian ditambahkan 10 L MTT (5 mg/ml) dan 90 L media kultur yang kemudian diikuti dengan inkubasi selama 4 jam dalam inkubator pada 37 C. Terakhir ditambahkan pada setiap sumuran 100 L SDS 10% pada setiap sumuran yang diikuti dengan inkubasi selama 24 jam. Baca absorbansi setiap pada 570 nm dengan plate reader.


ISSN : 2087-9652


121

HASIL DAN PEMBAHASAN Trastuzumab merupakan protein yang

tidak bisa langsung ditandai dengan 177Lu, oleh sebab itu trastuzumab harus dimodifikasi terlebih dahulu sedemikian rupa sehingga mampu mengikat 177Lu dengan stabil. Dalam penelitian ini digunakan 1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7,10-tetraacetic acid (DOTA) sebagai BFCA, senyawa yang dilaporkan mampu mengikat logam termasuk lantanida dengan stabil. Konjugasi DOTA pada trastuzumab dilakukan cara mereaksikan sulfo-NHS-DOTA dengan trastuzumab pada pH 7,3 untuk membentuk DOTA-trastuzumab (Gambar 1.).

DOTA-trastuzumab yang terbentuk

kemudian dimurnikan dan ditandai dengan 177Lu. Untuk menentukan kemurnian radiokimia hasil penandaan DOTA-trastuzumab dengan 177Lu sebelum dan sesudah pemurnian dilakukan dengan KLT dengan fase diam dan fase gerak berutut-turut ITLC-SG dan larutan salin. Pada sistem kromatografi ini 177Lu-DOTA-trastuzumab akan memberikan Rf < 0,3 sedangkan 177Lu bebas dalam bentuk kompleks 177Lu-EDTA memberikan Rf > 0,6.

Berikut adalah radiokromatogram 177Lu-

DOTA-trastuzumab sebelum (Gambar 2) dan sesudah (Gambar 3) dimurnikan. Penandaan DOTA-trastuzumab dengan 177Lu berhasil memberikan 177Lu-DOTA-trastuzumab dengan kemurnian kimia 94% (Gambar 2).

Gambar 2. Radiokromatogram 177Lu-DOTA-trastuzumab sebelum dilewatkan pada kolom sephadex G-25

Catatan: Rf 177Lu-DOTA-Trastuzumab 0.6

Pemurnian dengan kolom Spehadex G-25M (diameter 1 cm x panjang 15 cm) yang telah dijenuhkan dengan BSA berhasil memberikan 177Lu-DOTA-trastuzumab dengan kemurnian radiokimia > 99% (Gambar 3).

Gambar 3. Radiokromatogram 177Lu-DOTA-trastuzumab Setelah Proses Pemurnian Dengan Kolom Sephadex G25

Catatan: Rf 177Lu-DOTA-trasuzumab 0.6

Penentuan clearance melalui urin dan

feses dilakukan dengan cara menginjeksikan 177Lu-DOTA-trastuzumab pada tikus. Uji ini dimaksudkan untuk melihat kecenderungan ekskresi 177Lu-DOTA-trastuzumab apakah melalui urin atau feses dan seberapa lama atau seberapa cepat 177Lu-DOTA-trastuzumab dapat diekskresikan keluar tubuh tikus. Uji ini dilakukan dengan cara menginjeksikan 177Lu-DOTA-trastuzumab pada seekor tikus yang kemudian dimasukan kedalam metabolic cage. Urin dan feses yang diekskresikan oleh tikus ini dikumpulkan secara terpisah dan diambil setiap 24 jam atau lebih untuk dicacah. Hasil pengamatan clearance urin dan feses sampai dengan 240 jam setelah penyuntikan diperlihat pada Tabel 1.


ISSN : 2087-9652


122

Tabel 1. Data Hasil Uji Clearance Urin dan Feses 177Lu-DOTA-trastuzumab Pada Tikus Normal

No Rentang Waktu Pengambilan Contoh (Jam)

Radioaktifitas Dalam Urin (%)

Radioaktifitas Dalam Feses

(%) 1 0 - 3 Jam 0,10 0,00 2 4 - 24 Jam 0,66 0,47 3 25 - 48 Jam 3,82 0,84 4 49 - 72 Jam 5,00 0,40 5 73- 144 Jam 11,60 1,51 6 145- 168 Jam 2,94 0,19 7 169 - 192 Jam 4.04 1,76 8 193 - 216 Jam 3,86 0,81 9 217 - 240 Jam 2,56 0,47 Sub Total 34,57 7,18

Dari Tabel 1 di atas dapat dilihat bahwa

clearance 177Lu-DOTA-trastuzumab lebih banyak melalui urin dibandingkan dengan melalui feses. Total radioaktifitas yang diekskresi melalui urin sampai dengan 240 jam paska penyuntikan adalah 34,57% dibandingkan dengan 7,18% melalui feses. Pola clearance 177Lu-DOTA-trastuzumab ini pada tikus normal yang lebih cenderung melalui urin ini sangat dimungkinkan oleh radioimmunokonjugat yang bermuatan negatif seperti 177Lu -DOTA-trastuzumab.

Uji pencitraan dilakukan dengan cara

menginjeksikan masingmasing 200 Ci 177Lu-DOTA-trastuzumab pada lima ekor tikus. Pada waktu yang telah ditentukan (3, 24,48, 72 dan 144 jam) paska injeksi tikus dibius dan kemudian dicitra dengan kamera gamma. Hasil uji pencitraan ini dapat dilihat pada Gambar 4, 5, 6, 7, dan 8.

Gambar 4. Hasil Pencitraan Tikus 3 Jam Paska Injeksi Dengan 177Lu-DOTA-Trastuzumab

Gambar 5. Hasil Pencitraan Tikus 24 Jam Paska Injeksi Dengan 177Lu-DOTA-Trastuzumab

Gambar 6. Hasil Pencitraan Tikus 48 Jam Paska Injeksi 177Lu-DOTA-Trastuzumab



ISSN : 2087-9652


123


Dari gambar hasil uji pencitraan di atas

dapat dilihat bahwa sebagian radioaktifitas masih terakumulasi di daerah hati 144 jam paska injeksi 177Lu-DOTA-trastuzumab. Hasil ini tidak jauh berbeda dengan hasil uji biodsitribusi yang dilakukan sebelumnya yang mengindikasikan adanya ~ 5% ID/g residu radioaktiftas dihati 72 jam paska injeksi 177Lu-DOTA-tratuzumab (13). Residu radioaktifitas di hati ini jauh lebih kecil jika dibandingkan dengan residu radioaktiftas radioimmunokojugat 111In-trastuzumab, 111In-NLS3-trastuzumab, 111In-NLS6-trastuzumab, dan 111In-NSL3-h-IgG yang berurut-turut adalah 11.5 0.5 % ID/g, 11.0 0.4 2 % ID/g, 12.3 0.4%, 12.6 0.9% ID/g 72 jam paska injeksi yang dilaporkan oleh Constantini, et al. [14]. Uji pencitraan 177Lu-DOTA-trastuzumab pada tikus normal ini mengindikasikan sebagian radioimmunokonjugat dimetabolisme di hati yaitu organ yang dikenal sebagai organ dimana molekul dengan berat molekul yang relatif besar seperti antibodi monoklonal (~ 15 KD) dikatabolisasi. Suatu radioimmunokonjugat yang baik diharapkan tidak meninggalkan residu radioaktifitas terlalu tinggi pada organ-organ yang bukan target seperti hati, paru dan pada organ sensitif lainnya yang bukan merupakan organ target sehingga organ-organ tersebut tidak terekspos oleh iradiasi yang tidak diinginkan. Jika dibandingkan dengan clearance radioaktifitas trastuzumab bertanda 111In seperti yang telah didiskusikan di atas clearance 177Lu-DOTA-trastuzumab dari organ-organ yang bukan target terlihat relatif lebih cepat.

Uji sitotoksisitas dilakukan untuk melihat

kemampuan 177Lu-DOTA-trastuzumab membunuh sel kanker yang mempunyai ekspresi HER-2 dibandingkan dengan trastuzumab tidak bertanda. Uji ini dilakukan secara in vitro dengan menggunakan sel yang mempunyai reseptor HER-2. Pada awalnya uji

sitoksisitas 177Lu-DOTA-trastuzumab rencananya akan diuji menggunakan sel SK-BR-3 (sel kanker payudara positif HER-2) yang diimpor dari ATCC. Tetapi karena proses pasase sel ini tidak berhasil dilakukan dengan baik yang pada gilirannya menyebabkan sel ini mati, maka pengujian kemudian dilakukan dengan menggunakan sel penganti SKOV-3. Sel ini adalah sel kanker ovarium yang positif HER-2.

Uji sitotoksisitas didasarkan pada

prinsip kolorimetri dari pemecahan garam tetrazolium (MTT) yang berwarna kuning yang larut dalam air menjadi kristal biru-formazan (15). Pemecahan garam tetrazolium MTT yang berwarna kuning ini disebabkan oleh enzim suksinat dehidrogenase yang dihasilkan dari proses metabolisme yang terjadi pada mitokondria sel yang hidup. Kristal formazan biru yang terbentuk ini dapat dilarutkan dan dikuantifikasi dengan alat spektrofotometer. Hasil absorbansi yang diukur dengan spektrofotometer sebanding dengan konsentrasi biru-formazan yang terbentuk dan hal ini juga sebanding dengan jumlah sel yang hidup. Metoda yang didasarkan pada proses pereduksian MTT oleh enzim suksinat dehidrogenase yang dihasil dari proses metabolisme yang terjadi pada mitokondria sel yang hidup dilaporkan merupakan cara yang dapat dipercaya untuk mendeterminasi proliferasi sel.


ISSN : 2087-9652


124

Gambar 9. Absorban sel SKOV-3 yang tidak dan diperlakukan dengan trastuzumab dan 177Lu-DOTA-

trastuzumab.

Gambar 9 memperlihatkan nilai absorban sel SKOV-3 yang tidak diperlakukan dan diperlakukan dengan trastuzumab tidak bertanda dan 177Lu-DOTA-trastuzumab. Dari gambar 9 diatas dapat dilihat bahwa sel SKOV-3 yang diperlakukan dengan 177Lu-DOTA-trastuzumab absorbannya jauh lebih kecil dibandingkan dengan sel SKOV-3 yang diperlakukan trastuzumab tidak bertanda. Oleh karena nilai absorban sebanding dengan jumlah sel yang masih hidup, maka dapat dilihat bahwa 177Lu-DOTA-trastuzumab jauh lebih efektif dalam membunuh sel dibandingkan dengan trastuzumab tidak bertanda. Dari Gambar 9 di atas dapat dilihat 177Lu-DOTA-trastuzumab dengan konsentrasi 50 ppm mampu membunuh sel dalam jumlah yang sama dengan sel yang diperlakukan dengan 200 ppm trastuzumab tidak bertanda. Indikasi ini memperlihatkan bahwa 177Lu-DOTA-trastuzumab jauh lebih efektif dalam membunuh sel SKOV-3 dibandingkan dengan trastuzumab tidak bertanda. KESIMPULAN

Radiofarmaka berbasis antibodi monoklonal anti HER-2, 177Lu-DOTA-trastuzumab dengan kemurnian radiokimia > 99% setelah dilewatkan pada kolom Sephadex G-25 M telah disiapkan. Uji secara in vitro dan in vivo terhadap 177Lu-DOTA-trastuzumab yang meliputi uji clearance, uji pencitraan, uji sitotoksisitas telah berhasil dilakukan. Hasil uji clearance 177Lu-DOTA-trastuzumab pada tikus normal memperlihatkan bahwa clearance 177Lu-DOTA-Trastuzumab lebih dominan melalui urin dibandingkan melalui feses. Sementara itu hasil uji pencitraan 177Lu-DOTA-trastuzumab pada tikus normal memperlihatkan masih adanya

residu radioaktifitas di daerah hati 144 jam paska injeksi. Walaupun residu pada hati ini relatif kecil (< 5%, dari data hasil uji biodistribusi) bila dibandingkan dengan radioimmunokonjugat lain seperti 111In-trastuzumab, residu radioaktifitas ini tetap harus jadi perhatian yang serius jika 177Lu-DOTA-trastuzumab akan diaplikasikan pada manusia. Hasil uji sitotoksisitas memperlihatkan bahwa 177Lu-DOTA-trastuzumab mampu membunuh sel SKOV-3 lebih efektif dibandingkan dengan penggunaan trastuzumab tidak bertanda. UCAPAN TERIMAKSIH

Ucapan terimakasih kepada Sdr. Abidin, Sdr. Hambali, Sdr. Sriyono dari Bid. Radioisotop yang telah membantu mempersiapkan dan menangani proses irradiasi target Lu-176. Ucapan terimakasih juga kami sampaikan kepada Kepala dan staff Bidang Virologi, BBPMSOH KeMenTan, Gn. Sindur Bogor yang telah membantu proses pasase sel SK-BR-3 dan SKOV-3 dan uji sitotoksisitas. DAFTAR PUSTAKA 1. Kanker. http://id.wikipedia.org/wiki/kanker.

(Accessed on 4 April 2011). 2. Golobocan 2008. Indonesia. www.

Globocan. iarc/fr/factssheets/fractsheet.asp?uno=360. (Accessed on 4 April 2011).

3. W. Tai., R. Mahato., K. Cheng. (2010). The role of HER-2 in cancer therapy and targeted drug delivery. Journal of Control Release. 146. 264 275.

4. HER-2. http://en.wikipedia.org/wiki/HER-2/neu. (Accessed on 5 May April 2011).

0

0.05

0.1

0.15

0.2

0.25

0.3

0.35

0 50 100 150 200 250 300

absorban kontrol

absorban trastuzumab

absorban 177Lu-DOTA-trastuzumab

Abso

rban

Konsentrasi Trastuzumab/ 177 Lu-DOTA-Trastuzumab (ppm)

http://id.wikipedia.org/wiki/kankerhttp://en.wikipedia.org/wiki/HER-2/neuhttp://en.wikipedia.org/wiki/HER-2/neu


ISSN : 2087-9652


125

5. J.S. Ross., J.A. Fletcher., K.J. Bloom., G.P. Linnette., J. Stec., W.F. Symmon., L. Pusztai., G. N. Hortobagy. (2004). Targeted therapy in breast cancer, the HER-2/ neu gene and protein. Molecular and Cellular 3.4. 379- 398.

6. J. Baselga (2001). Phase I and II clinical trial trastuzumab. Annals of Oncology. 12. S49-S55.

7. J. Baselga (2001). Clinical trial of Herceptin. European Journal of Cancer. 37. S18-S24. trastuzumab.

8. Radiopharmaceutical: Production and Availability. www.iaea.or/org/About/Policy/GC/GC51InfDocuments. (Accessed on 5 May April 2011).

9. D. Dvorakova., R. Henkelman., X. Lin., A. Turier., H. Gerstenberg (2008) Applied Radiation and Isotopes. 66 (2). 147 151.

10. A.R. Ketring., M.F. Embree. K. Bailey., T.T. Taylor., J.A. Gawanis., S.S. Jurisson., H.P. Engelbreacht. C.S. Cutler (2002). Production and Supply High Specific Activity Radioisotope for Radiotherapy Application. Revista Medicina Nuclear Alasbimn Journal. Year 5. 17. Special Issue: World Congress of Nuclear Medicine.

11. New promise for radiotherapeutic radiopharmaceutical, Marker Research in the Healthcare with Expertise in Medical Imaging and Radiotherapy. March 19, (2006). (Bio-Tech System, Inc. Accessed on 29 August 2008).

12. 177Lu Radiolabeled Monoclonal antibody HuJ591 (177Lu-J591) and Ketoconazole in Patients With Prostate Cancer. http://clinicaltrialfeeds.org/clinical-trial/show/NCT00859781. (Accessed on 12 Agust 2009).

13. Ramli, M., Humani, T. S. Rustendi, C. T., Subur, M., Aguswarini, S., Karyadi. (2010). Preparation, stability and Biodistribution Studies of 177Lu-DOTA-Trastuzumab, A Potensial Radiopharmaceutical for Radioimmunotherapy of Breast Cancer, Proceeding International Conference and Exhibition on Science and Technology in Biomass Production. School of Life Science and Technology, ITB, Bandung 25-26 . November 2009.

14. Constantini, D.L., Chan, C., Cai, Z., Vallis, K. A., Reilly, R. M. 2007. 111In-Labeled Trastuzumab (Herceptin) Modified with Nuclear Localization Sequences (NLS): An Auger electron-emitting

Radiotherapeutic Agent for HER2/ neu-Aplifeid Breast Cancer. J. Nucl. Med. Vol. 48 (8). 1357 1368.

15. Zachary, I. (2003) Determination of cell number. In Hughes, D. And Mehmet, H. (Editors). Cell poliferation and Apoptosis. BIOS Scientific Publisher Limited, 373 pp.

http://www.iaea.or/org/About/Policy/GC/GC51InfDocumentshttp://www.iaea.or/org/About/Policy/GC/GC51InfDocuments

Penyiapan immunokonjugat DOTA-trastuzumabPenandaan immunokonjugat DOTA-trastuzumab dengan 177Lu

9

Documents

Transcript of 9