m.k Teknologi Bioindustri

TEKNIK KULTIVASI

DAN

PROSES HILIR

Departemen Teknologi Industri PertanianFATETA - IPB

Skema Umum Proses Kultivasi

Biorektor

Pengembangan Inokulum

Kultur Stok

LabuKocok

BioreaktorInokulum

Sterilisasi Media

Formulasi Media

Bahan Baku Media

Cairan Fermentasi

Biomassa

PemisahanSel

SupernatanBebas Sel

Ekstraksi Produk

Pemurnian Produk

Pengemasan produk

PenangananLimbah Cair

Metode kultivasi berdasarkan cara operasi bioreaktor :

- curah (batch) - sinambung (continuous) - semi sinambung (fed- batch)  

METODE KULTIVASI

Continuous

Kultur Curah (BatchKultur Curah (Batch

tXX

dtX

dX

Xdt

dX

V

FXX

dt

dX

0lnln

00

matisel

mati sel -n pengeluara - seln pertumbuha selAkumulasi

Neraca Biomassa

Plot ln X vs t akan memperoleh nilai

Keterangan : : laju pertumbuhan spesifik (waktu-1)F : laju alir (vol/waktu)X : konsentrasi biomassa (g/l)

rX = dX/dt

Ln X

t

rx = X

Pembentukan Produk :

Keterangan : P = konsentrasi produk (g/l) qp = laju spesifik pembentukan produk (g/g sel.jam) k = tetapan laju destruksi produk

Xq

kPV

FPXqr

p

pp

dt

dP

00dt

dP

destruksi-npengeluara-sintesis produk Akumulasi

rp == qp X

Konsumsi Substrat :

Keterangan : S = konsentrasi substrat (g/l) ; m = tetapan pemeliharaan sel

qs = laju spesifik penggunaan substrat (g/g sel.jam)

sp

p

sx

s

sp

p

sx

sp

p

sx

i

Y

q

Yq

dt

dS

X

mXY

Xq

Y

X

V

SFmX

Y

Xq

Y

X

V

SF

1

m :aerobik dt

dS-

00

dt

dS-

npengeluara - selan pemelihara - P sintesisunt konsumsi

-n pertumbuhaunt konsumsi -umpan substrat akumulasi

00

rs = qs X

Yield Coefficient (Tetapan Rendemen) pembentukan produk berasosiasi dengan pertumbuhan sel

Yp/x = dP/dX = rp/rx

Yp/s = dP/dS = rp/rs

Yx/s = dX/dS = rx/rs

rp = Yp/x rx

qpX = Yp/x µX qp = Yp/x µ

rp = Yp/s rs

qpX = Yp/s qs X qp = Yp/s qs

rx = Yx/s rs

µX = Yx/s qs X µ = Yx/s qs

Laju Spesifik Pembentukan Produk & Penggunaan Substrat

(g/g sel.jam) qp & qs : tidak tergantung konsentrasi sel menggambarkan efektivitas sel dlm mensintesis

produk atau penggunaan substrat berguna untuk membandingkan efektivitas hasil

suatu fermentasi

Laju Volumetrik (Q ; g/l.jam) : Qp & Qs tergantung dari konsentrasi sel menggambarkan laju sintesis produk atau kebutuhan

substrat untuk tiap satuan volume bioreaktor

Pola Pembentukan Produk : Pembentukan produk berasosiasi dengan

pertumbuhan (growth associated) = Metabolit Primer

Pembentukan produk tidak berasosiasi dengan pertumbuhan (non growth associated) = Metabolit Sekunder

Campuran keduanya

Aplikasi Kultur Curah :

• Digunakan untuk memproduksi biomassa, metabolit primer dan Digunakan untuk memproduksi biomassa, metabolit primer dan metabolit sekundermetabolit sekunder

• Untuk produksi Untuk produksi biomassabiomassa digunakan kondisi kultivasi yang digunakan kondisi kultivasi yang mendukung pertumbuhan biomassa, sehingga mencapai maksimalmendukung pertumbuhan biomassa, sehingga mencapai maksimal

• Untuk prodiksi Untuk prodiksi metabolit primermetabolit primer kondisi kultivasi harus dapat kondisi kultivasi harus dapat memperpanjang fase eksponensial yang dibarengi dengan sintesisi memperpanjang fase eksponensial yang dibarengi dengan sintesisi produkproduk

• Untuk produksi Untuk produksi metabolit sekundermetabolit sekunder kondisi kultivasi harus dapat kondisi kultivasi harus dapat memperpendek fase eksponensial dan memperpanjangmemperpendek fase eksponensial dan memperpanjang

fase stasionerfase stasioner

Kultur Sinambung

XS

F0 (l/jam)S0 (g/l)X0 (g/l) = 0(umoan steril)

F (l/jam)S (g/l)X (g/l)

Neraca Biomassa :

Dstate)(steady tunak kondisi pada

0

000

sel Akumulasi mati Sel - tumbuh Sel keluar Sel -masuk Sel

DV

FX

V

FX

XXV

F

dt

dXXXX

V

FXo

V

F

Keterangan : D = laju dilusi = F/V (jml vol kultur yang melalui bioreaktor)

(jam-1)

VKultur sinambung dijalankan setelahtercapai Xmaks

Kultur SinambungKultur Sinambung

Neraca substrat

sx

sx

sp

p

sx

Y

DXSSD

DY

XSSo

V

F

mXY

Xq

Y

XS

V

FSo

V

F

dt

dS

0

)(

000

anpemelihara - *konsumsi -keluar -umpan Akumulasi

SSYXsx 0

Bila tidak ada pembentukan P, Contohnya PST

*

*Konsumsi unt pertumb & pembentukan produk)

Neraca Produk

XYDPXYPV

F

XYPV

F

XYPV

FPo

V

F

dt

dP

xpxp

xp

xp

/1/1

/1

/1

0

)0(

sintesis keluar -umpan Akumulasi

P1 = (Yp/x. µX)/D

Untuk hubungan antara X, S dan D, diperlukan model yang mengekspresikan laju pertumbuhan sebagai fungsi dari substrat pembatas Model Monod

Keterangan : Ks = tetapan “half-rate saturation” = konsentrasi S pada μ = ½ μmaks

SK

S

s

.maks

SK

S

s

.DD crit

D

K s

critD

D.S

Dcrit

s0

sx0

sx D

D.KSYXSSYX

Dcrit = laju dilusi kritis

(menggambarkan laju dilusi maksimum dari operasi keadaan

tunak) biasanya Dcrit = μmaks

D (Ks + S) = Dcrit S

D Ks + D S = Dcrit S

D Ks = Dcrit S - D S = S (Dcrit – D)

X,S,P

P

X S

D

Kurva Pengaruh D pada Kultur Sinambung

Aplikasi Kultur Sinambung :Aplikasi Kultur Sinambung :

Merupakan ‘alat’ untuk penelitian fisiologi dan biokimia Merupakan ‘alat’ untuk penelitian fisiologi dan biokimia mikroba, dikarenakan kondisinya mantap, laju mikroba, dikarenakan kondisinya mantap, laju pertumbuhan dapat diatur oleh laju alir dan laju pertumbuhan dapat diatur oleh laju alir dan laju pertumbuhan dibatasi oleh konsentrasi substrat pembatas pertumbuhan dibatasi oleh konsentrasi substrat pembatas dapat digunakan untuk penelitian pengaruh substrat dapat digunakan untuk penelitian pengaruh substrat pembatas thd kinerja mikroba, untuk perbaikan sistem pembatas thd kinerja mikroba, untuk perbaikan sistem curah/semi sinambungcurah/semi sinambung

Untuk Untuk isolasi dan seleksi mikrobaisolasi dan seleksi mikroba penghasil enzim penghasil enzim menggunakan media diperkaya menggunakan media diperkaya

Untuk produksi Untuk produksi biomassabiomassa, contoh ICI (Imperial Chemical , contoh ICI (Imperial Chemical Industries, kapasitas bioreaktor 3000 mIndustries, kapasitas bioreaktor 3000 m33, substrat metanol) , substrat metanol)

Untuk produksi Untuk produksi birbir menggunakan bioreaktor menara menggunakan bioreaktor menara (tower bioreactor)(tower bioreactor)

Kultur ini merupakan kultur curah yang diberi umpan secara sinambung atau sekuensial, tanpa pengeluaran isi bioreaktor, sehingga volume bervariasi selama kultivasi konsentrasi nutrien bervariasi

Keuntungan :

1. Dapat menekan efek represif sumber karbon dan mempertahankan kapasitas aerasi dalam bioreaktor

2. Dapat mencegah efek toksik komponen media

Keadaan “quasy-steady state” :

Kultur curah dengan pertumbuhan yang dibatasi oleh konsentrasi suatu substrat dan semua nutrien lain berlebih

X = Xo + Yx/s ( So– S)

Pada saat S ~ 0, akan tercapai Xmaks dan Xo <<X, sehingga

Xmaks = Yx/s ( So– S)

Kultur Semi SinambungKultur Semi Sinambung

Pada saat X = Xmaks , diberi umpan media dengan D < μmaks, maka S segera dikonsumsi begitu memasuki kultur akumulasi (dS/dt) = 0 Neraca Substrat :

Meskipun total biomassa meningkat terhadap waktu, namun konsentrasi sel tetap mengingat volume juga meningkat dX/dt = 0 μ ~ D (quasy-steady state)

sx

sx

sx

Y

XVSF

Y

XVSF

Y

XS

V

F

0

0

0

.

0.

0.

Akumulasi Konsumsi -Input

Semakin lama, nilai D << karena volume semakin meningkat

Vo = volume awal & F = laju alir ; t = waktu

Pada kultur ini, sisa substrat kecil sebagai akibat konsentrasi sel meningkat

tFV

FD

.0

Penentuan μ pada Kultur Semi-sinambung :

Diintegrasikan : ln VX - ln VoXo = μ t

μ

t

Perbandingan :

Kultur sinambung : μ = DKultur semi Sinambung : D << dan μ << dengan laju yang sama

VXdt

XdV .

ln VX

Fed-batch mode of fermentation has the following features:

Advantages:• Production of high cell densities due to extension of working time (particularly important in the production of growth-associated products) • Controlled conditions in the provision of substrates during the fermentation, particularly regarding the concentration of specific substrates as for ex. the carbon source • Control over the production of by-products or catabolite repression effects due to limited provision of substrates solely required for product formation • The mode of operation can overcome and control deviations in the organism's growth pattern1 as found in batch fermentation • Allows the replacement of water loss by evaporation • Alternative mode of operation for fermentations leading with toxic substrates (cells can only metabolize a certain quantity at a time) or low solubility compounds • Increase of antibiotic-marked plasmid stability by providing the correspondent antibiotic during the time span of the fermentation • No additional special piece of equipment is required as compared with the batch fermentation mode of operation      

       Disadvantages:

• It requires previous analysis of the microorganism, its requirements and the understanding of its physiology with the productivity • It requires a substantial amount of operator skill for the set-up, definition and development of the process • In a cyclic fed-batch culture, care should be taken in the design of the process to ensure that toxins do not accumulate to inhibitory levels and that nutrients other than those incorporated into the feed medium become limiting, Also, if many cycles are run, the accumulation of non-producing or low-producing variants may result • The quantities of the components to control must be above the detection limits of the available measuring equipment

The use of fed-batch culture by the fermentation industry takes advantage of the fact that the concentration of the limiting substrate may be maintained at a very low level, thus :

- avoiding repressive effects of high substrate concentration -controlling the organism’s growth rate and consequently controlling the oxygen demand of the fermentation.

•Saccharomyces cerevisiae is industrially produced using the fed-batch technique so as to maintain the glucose at very low concentrations, maximizing the biomass yield and minimizing the production of ethanol, the chief by-product

•Hepatitis B surface antigen (HbsAg) used as a vaccine against type B hepatitis has been purified from human plasma and expressed in recombinant yeast, being now produced commercially. Again, the production of the recombinant protein is achieved using fed-batch culture techniques very similar to that developed for Saccharomyces cerevisiae. A cyclic method is used due to reports of superior productivity

•Penicillin production is an example for the use of fed-batch in the production of a secondary metabolite. The fermentation is divided in two phases: the rapid-growth phase during which the culture grows at the maximum specific growth rate, and the slow-growth phase in which penicillin is produced. During the rapid-growth phase, an excess of glucose causes an accumulation of acid and a biomass oxygen demand greater than the aeration capacity of the fermentor, whereas glucose starvation may result in the organic nitrogen in the medium being used as a carbon source, resulting in a high pH and inadequate biomass formation. During the production phase, the feed rates utilized should limit the growth rate and oxygen consumption such that a high rate of penicillin synthesis is achieved and sufficient dissolved oxygen is available in the medium

Some other examples are the production of thiostrepton from Streptomyces laurentii and the production of cellulase by Trichoderma reesei. The production of thiostrepton uses pH feedback control and the production of cellulase utilizes carbon dioxide production as a control factor