Oleh: Purwadi, M.SiDisampaikan pada kuliah Kromatografi, UTB 2009

Elusi

Kromatografi Cair (KC)Merupakan sistem kromatografi dengan fase gerak cairanBagaimana fase diamnya?JawabBisa padat bisa juga cair

Fakta: Kromatografi Cair digunakan 90%, Kromatografi Gas hanya 10%, mengapa ?

Karena Kromatografi CairMempunyai banyak mekanisme pemisahanTidak ada persyaratan analit harus menguap, sedangkan sebagian besar senyawa mempunyai titik didih relatif tinggiJenis alat kromatografinya banyak (lihat Bagan)Teknologi tidak harus tinggi: misal KLT, KKtTidak harus mahal: KLT, KKt

Pembagian Kromatografi Berdasarkan fase gerak

Mekanisme kromatografi cair apakah dipengaruhi jenis peralatan ? Apakah mekanisme pemisahan dalam KLT pasti berbeda dengan KCKT?JawabJenis peralatan tidak mempengaruhi mekanisme pemisahan secara kromatografi CairTerkadang mekanisme pemisahan dalam KLT sama dengan KCKT

KCKTKLTKrom. KertasKrom Kolom KolomMekanismeADSORBSIPARTISIPERTUKARAN IONKROM. IONFILTRASI GELPASANGAN IONPERMEASI GELSIZE EXCLUSION

Mengapa begitu banyak mekanisme?Apakah dalam satu perangkat alat kromatografi mempunyai bermacam mekanisme?JawabTidak, dalam satu kromatografi hanya terdapat satu mekanisme sajaMisal 1. kita bisa memilih KLT dengan mekanisme AdsorbsiMisal 2. kita bisa memilih KLT dengan mekanisme partisi

Farktor apa yang mendasari kita memilih satu mekanisme pemisahan dalam kromatografi?JawabYang mendasari kita memilih satu mekanisme pemisahan dalam kromatografi sifat dan jenis analit yang ingin dipisahkan

KROMATOGRAFI DENGAN MEKANISME ADSORBSI ATAU DIKENAL DENGAN KROMATOGRAFI ADSORBSIUntuk analit yang bagaimana?Jawab: untuk analit yang polarBagaimana prinsipnya:Adsorbsi dan desorbsi

Bagaimana maksudnya adsorbsi - desorbsiJawabAnda ingat like disolve like, seperti itulah mekanismenyaPerjanjian: dalam kromatografi adsorbsi: fase diam selalu polar (contoh Silika, Alumina, dll)

Berdasarkan perjanjian tersebutJika fase diam Polar, kemudian Ada campuran analit, dengan sifat Polar dan lainnya non polar, maka yang bersifat polar akan disukai oleh fase diam (dengan kata lain teradsorbsi lebih kuat) dibanding analit lain yang kurang polar.m = fase geraks = fase diam (polar)Analit Lebih polar

Cerita mekanisme adsorbsiCampuran analit pertama-tama dijerapkan pada fase diam, selanjutnya aliran fase gerak akan memaksa analit-analit tersebut untuk bermigrasi (terdesorbsi). Analit yang lebih polar akan lebih terikat kuat pada fase diam yang juga polar, akibatnya kecepatan migrasinya lambat, dibanding analit yang kurang polar.Sehingga => terjadi pemisahan

Jadi Kromatografi dengan mekanisme adsorbsiDigunakan untuk pemisahan analit yang bersifat polarFase diam yang digunakan bersifat polar: misal Silika dan AluminaMekanismenya adsorbsi dan desorbsiJadi kalau kita menggunakan fase diam silika pada KLT atau pun KCKT dll maka mekanismenya adalah adsorbsi

Kolom HPLC fase normalSilica gel : pemakaian umumCyano : pemakaian umumAmino : analisa gulaDiol : analisa proteinSilica gelSiSi-Si-CH2CH2CH2CN-Si-CH2CH2CH2NH2-Si-CH2CH2CH2OCH(OH)-CH2(OH)Modifikasi Si

Kasus: Suatu Campuran berisiDilakukan KLT dengan fase diam silika (polar) dan fase gerak heksan. Mana yang akan mempunyai nilai Rf lebih tinggi??

Jawab

Silica gel (polar)Ikatan hidrogenNon-polar

Apa yang terjadi jika campuran analit tersebut dipisahkan dengan KCKT dengan kolom berisi silika?OHHOSiOHSiOHkuatlemah

KROMATOGRAFI DENGAN MEKANISME PARTISI ATAU DIKENAL DENGAN KROMATOGRAFI PARTISIUntuk analit yang bagaimana?Jawab: untuk analit yang Non-polarBagaimana prinsipnya:partisi

Apa yang dimaksud dengan partisi?Jawab: Ingatkah anda apa yang akan terjadi jika analit dimasukkan dalam corong pisah yang berisi dua cairan yang tidak saling larut? Analit tersebut setelah terjadi kesetimbangan sebagian akan masuk ke cairan satu dan sebagian lagi akan masuk ke cairan dua.

Apakah bisa fase diam berupa cairan?Jawab: bisaApakah tidak terjadi abrasi jika terkena aliran fase gerak?Jawab: bisa.Bagaimana caranya biar tidak terkena abrasi?Jawab: cairan tersebut ditambatkan dalam padatan

-Si-C18H35SiBagaimana jika kita menginginkan cairan C18H36 sebagai fase diam?Jawab. Cairan tersebut di reaksikan secara kimia dengan padatan silika.

Perjanjian:Kromatografi partisi: menggunakan fase diam non polar, dan fase gerak polarSistem kromatografi dengan menggunakan fase diam non polar, dan fase gerak polar dikenal sebagai fase balik

Bagaimana mekanisme partisi dalam kromatografi menjelaskan pemisahan kedua analit beikut?Jawab:Ingat perjanjian: fase diam adalah bersifat non polar. Fase diam adalah cairan. Jika campuran analit A dan B dimasukkan ke sistem maka keduanya akan terpartisi masing-masing ke dua cairan, yaitu fase diam dan fase gerak. Senyawa B akan terparisi lebih banyak dalam fase diam karena dia lebih non polar. Akibatnya B akan tertahan lebih lama pada fase diam AB

Bagaimana interaksi?InteraksihidrofobikNon-polarSolven polar

HidrofobisitasJika sampel memilikiCH3CH2CH2--- : rantai karbon : gugus aromatis

Jika sampel memiliki-COOH : gugus karboksil-NH2 : gugus amino-OH : gugus hidroksilX

HidrofobisitasJadi lebih kuat.Hidrofobisitas jadi lebih lemah.

Waktu retensi dan HidrofobisitasOHOHC18 (ODS) kuatlemah

Pengaruh fase diamC18 (ODS) kuatC8sampelsampelsampelC4Mediumlemah

Mekanisme pemisahan untuk melekul ionik

Bagaimana pembagian mekanisme pemisahan untuk analit ion?Kromatografi pasangan ionKromatografi penekanan ionKromatografi pertukaran ion

Kromatografi Pasangan IonApa dasar pasangan ion?Dalam satu sistem kromatografi bisa saja terjadi beberapa mekanisme, jika hal tersebut terjadi maka dapat mengakibatkan pemisahan tidak baik, misalnya terjadi pengekoran dan atau puncak pecah.

Molekul ionik bisa dibuat non ionik dengan cara dipasangkan dengan ion lawannya, sehingga mempunyai satu mekanisme, misalnya partisi. Tidak partisi dengan sedikit adsorbsi

Kromatografi Fase Terbalik dengan pasangan ionIon-Pair Reagent

Untuk apa dipasangkan?Jawab.Agar molekul analit netral sehingga bersifat non polar. Ingat: PARTISI: Pemisahan senyawa non polar dengan fase diam non polar (misal C-18)

Reagen Ion-PairUntuk Analit bersifat Anion, maka pasangannya: Tetra-n-butylammonium hydroxide (TBA)Untuk Analit bersifat Kation, maka pasangannya:Butanesulfonic acid sodium salt (C4)Pentanesulfonic acid sodium salt (C5)Hexanesulfonic acid sodium salt (C6)Heptanesulfonic acid sodium salt (C7)Octanesulfonic acid sodium salt (C8)Decanesulfonic acid sodium salt (C10)

Ion PairingSeparation of Carboxylic Acids

Pasangan IonHal yang penting diperhatikanTipe reagen Ion-PairKonsentrasi reagen Ion-PairpH solven

Tipe reagen ion-pairHexane Sulfonate Pentane Sulfonate

Mekanisme: Penukar ionN+RRRSampelKekuatan antar ionJika analit anion maka fase diam kation, fase gerak anion

SO3-Sampel+++++++++++++Jika analit kation maka fase diam anion, fase gerak kation

Penukar ionLingkungan biologi (protein, peptide, amino acid analysis)Kromatografi ion

Penukar kationStrong Cation Exchange(SCX)(R-SO3-)Week Cation Exchange(WCX) (R-COO-)Penukar anionStrong Anion Exchange (SAX) (R4N+)Week Anion Exchange (WAX)(DEAE)

Hal yang perlu diperhatikanpada Kromatografi Penukar ionpH larutan daparKonsentrasi larutan daparMetoda elusiElusi IsokratikElusi gradien pHElusi gradien peningkatan kekuatan ionik

Mekanisme pemisahan berdasarkan ukuran molekul

Apakah SEC ?Size Exclusion Chromatography (SEC)GPC (Gel Permeation Chromatography)terutama untuk sampel polimerGFC (Gel Filtration Chromatography)terutama untuk sampel biologi

Prinsip SEC Tidak ada kekuatan interaksiPerbedaan waktu tempuh

SECFase diam: partikel berporiMolekul ber BM besarMolekul relatif besar tidak dapat dijebak oleh fase diam, akibatnya waktu tambat singkat Molekul relatif kecil dapat dijebak oleh fase diam, akibatnya waktu tambat lama

Hubungan antara Bobot molekul & waktu tambatBerat molekul (LogMW)KolomGPC

Batas eksklusiBatas permeasiWaktu

Kromatografi Afinitas

PustakaSusanR.Mikkelsen and Eduardo Corton, 2004, BIOANALYTICAL CHEMISTRY, A JOHNWILEY&SONS, INC., PUBLICATION, New Jersey.

PT. Ditek Jaya. Presentation for Shimadzu LC