Oleh: Purwadi, M.Si

Disampaikan pada kuliah Kromatografi, UTB 2009

Elusi

Kromatografi Cair (KC)

• Merupakan sistem kromatografi dengan fase gerak cairan

Bagaimana fase diamnya?

Jawab

Bisa padat bisa juga cair

Fakta: Kromatografi Cair digunakan 90%, Kromatografi Gas hanya 10%, mengapa ?

Karena Kromatografi Cair

1. Mempunyai banyak mekanisme pemisahan

2. Tidak ada persyaratan analit harus menguap, sedangkan sebagian besar senyawa mempunyai titik didih relatif tinggi

3. Jenis alat kromatografinya banyak (lihat Bagan)

4. Teknologi tidak harus tinggi: misal KLT, KKt

5. Tidak harus mahal: KLT, KKt

Pembagian Kromatografi Berdasarkan fase gerak

Kromatografi

Fase gerak gas Fase gerak cair

Kromatografi Gas

Krom. Kolom

K L T Krom. Kertas

KCKT

KK. Terbuka

KK. Vakum

Kroma-totron

Mekanisme kromatografi cair apakah dipengaruhi jenis peralatan ?

Apakah mekanisme pemisahan dalam KLT pasti berbeda dengan KCKT?

Jawab

Jenis peralatan tidak mempengaruhi mekanisme pemisahan secara kromatografi Cair

Terkadang mekanisme pemisahan dalam KLT sama dengan KCKT

KCKT

KLT

Krom. Kertas

Krom Kolom

Kolom

Mekanisme

ADSORBSI

PARTISI

PERTUKARAN ION

KROM. ION

FILTRASI GEL

PASANGAN ION

PERMEASI GEL

SIZE EXCLUSION

Mengapa begitu banyak mekanisme?

Apakah dalam satu perangkat alat kromatografi mempunyai bermacam mekanisme?

Jawab

Tidak, dalam satu kromatografi “hanya” terdapat satu mekanisme saja

Misal 1. kita bisa memilih KLT dengan mekanisme Adsorbsi

Misal 2. kita bisa memilih KLT dengan mekanisme partisi

Farktor apa yang mendasari kita memilih satu mekanisme pemisahan dalam kromatografi?

Jawab

Yang mendasari kita memilih satu mekanisme pemisahan dalam kromatografi sifat dan jenis analit yang ingin dipisahkan

KROMATOGRAFI DENGAN MEKANISME ADSORBSI ATAU DIKENAL DENGAN KROMATOGRAFI ADSORBSI

Untuk analit yang bagaimana?

Jawab: untuk analit yang polar

Bagaimana prinsipnya:

Adsorbsi dan desorbsi

Bagaimana maksudnya adsorbsi - desorbsi

Jawab

Anda ingat like disolve like, seperti itulah mekanismenya

Perjanjian: dalam kromatografi adsorbsi: fase diam selalu polar (contoh Silika, Alumina, dll)

Berdasarkan perjanjian tersebut

Jika fase diam Polar, kemudian Ada campuran analit, dengan sifat Polar dan lainnya non polar, maka yang bersifat polar akan disukai oleh fase diam (dengan kata lain teradsorbsi lebih kuat) dibanding analit lain yang kurang polar.

m = fase geraks = fase diam (polar)

Analit Lebih polar

Cerita mekanisme adsorbsi

Campuran analit pertama-tama dijerapkan pada fase diam, selanjutnya aliran fase gerak akan memaksa analit-analit tersebut untuk bermigrasi (terdesorbsi). Analit yang lebih polar akan lebih terikat kuat pada fase diam yang juga polar, akibatnya kecepatan migrasinya lambat, dibanding analit yang kurang polar.

Sehingga => terjadi pemisahan

Jadi Kromatografi dengan mekanisme adsorbsi

1. Digunakan untuk pemisahan analit yang bersifat polar

2. Fase diam yang digunakan bersifat polar: misal Silika dan Alumina

3. Mekanismenya adsorbsi dan desorbsi

4. Jadi kalau kita menggunakan fase diam silika pada KLT atau pun KCKT dll maka mekanismenya adalah adsorbsi

Kolom HPLC fase normal

Silica gel : pemakaian umum Cyano : pemakaian umum Amino : analisa gula Diol : analisa protein

Silica gel

Si

Si

-Si-CH2CH2CH2CN-Si-CH2CH2CH2NH2-Si-CH2CH2CH2OCH(OH)-CH2(OH)

Modifikasi Si

Kasus: Suatu Campuran berisi

Dilakukan KLT dengan fase diam silika (polar) dan fase gerak heksan. Mana yang akan mempunyai nilai Rf lebih tinggi??

Jawab

Silica gel (polar)

Ikatan hidrogenIkatan hidrogenNon-polar

Apa yang terjadi jika campuran analit tersebut dipisahkan dengan KCKT dengan kolom berisi silika?

OH

HO

SiOH

SiOH

kuatkuat

lemahlemah

KROMATOGRAFI DENGAN MEKANISME PARTISI ATAU DIKENAL DENGAN KROMATOGRAFI PARTISI

Untuk analit yang bagaimana?

Jawab: untuk analit yang Non-polar

Bagaimana prinsipnya:

partisi

Apa yang dimaksud dengan partisi?

Jawab: Ingatkah anda apa yang akan terjadi jika analit dimasukkan dalam corong pisah yang berisi dua cairan yang tidak saling larut? Analit tersebut setelah terjadi kesetimbangan sebagian akan masuk ke cairan satu dan sebagian lagi akan masuk ke cairan dua.

Apakah bisa fase diam berupa cairan?

Jawab: bisa

Apakah tidak terjadi abrasi jika terkena aliran fase gerak?

Jawab: bisa.

Bagaimana caranya biar tidak terkena abrasi?

Jawab: cairan tersebut ditambatkan dalam padatan

-Si-C18H35

Si

Bagaimana jika kita menginginkan cairan C18H36 sebagai fase diam?

Jawab. Cairan tersebut di reaksikan secara kimia dengan padatan silika.

Perjanjian:

Kromatografi partisi: menggunakan fase diam non polar, dan fase gerak polar

Sistem kromatografi dengan menggunakan fase diam non polar, dan fase gerak polar

dikenal sebagai fase balik

Bagaimana mekanisme partisi dalam kromatografi menjelaskan pemisahan kedua analit beikut?

Jawab:

Ingat perjanjian: fase diam adalah bersifat non polar. Fase diam adalah cairan. Jika campuran analit A dan B dimasukkan ke sistem maka keduanya akan terpartisi masing-masing ke dua cairan, yaitu fase diam dan fase gerak. Senyawa B akan terparisi lebih banyak dalam fase diam karena dia lebih non polar. Akibatnya B akan tertahan lebih lama pada fase diam

A B

Bagaimana interaksi?

InteraksiInteraksihidrofobikhidrofobik

Non-polar

Solven polar

Hidrofobisitas

Jika sampel memiliki– CH3CH2CH2--- : rantai karbon– : gugus aromatis

Jika sampel memiliki– -COOH : gugus karboksil– -NH2 : gugus amino– -OH : gugus hidroksil– X

HidrofobisitasHidrofobisitas

Jadi lebih kuat.Jadi lebih kuat.

Hidrofobisitas Hidrofobisitas jadi lebih lemah.jadi lebih lemah.

Waktu retensi dan Hidrofobisitas

OH

OH

C18 (ODS)

kuat

lemah

Pengaruh fase diam

C18 (ODS)

kuat

C8

sampel

sampel

sampel

C4

Medium

lemah

Mekanisme pemisahan untuk melekul ionik

Bagaimana pembagian mekanisme pemisahan untuk analit ion?

Kromatografi pasangan ion

Kromatografi penekanan ion

Kromatografi pertukaran ion

Kromatografi Pasangan Ion

Apa dasar pasangan ion?

Dalam satu sistem kromatografi bisa saja terjadi beberapa mekanisme, jika hal tersebut terjadi maka dapat mengakibatkan pemisahan tidak baik, misalnya terjadi pengekoran dan atau puncak pecah.

Molekul ionik bisa dibuat non ionik dengan cara dipasangkan dengan ion lawannya, sehingga mempunyai satu mekanisme, misalnya partisi. Tidak partisi dengan sedikit adsorbsi

Kromatografi Fase Terbalik dengan pasangan ion

Ion-Pair Reagent

Untuk apa dipasangkan?

Jawab.

Agar molekul analit netral sehingga bersifat non polar. Ingat: PARTISI: Pemisahan senyawa non polar dengan fase diam non polar (misal C-18)

Reagen Ion-Pair

Untuk Analit bersifat Anion, maka pasangannya: – Tetra-n-butylammonium hydroxide (TBA)

Untuk Analit bersifat Kation, maka pasangannya:– Butanesulfonic acid sodium salt (C4)

– Pentanesulfonic acid sodium salt (C5)

– Hexanesulfonic acid sodium salt (C6)

– Heptanesulfonic acid sodium salt (C7)

– Octanesulfonic acid sodium salt (C8)

– Decanesulfonic acid sodium salt (C10)

Ion PairingSeparation of Carboxylic Acids

Column: Bonded C18

Mobile Phase: H2O/MeOH1:1 with Tetrabutyl-Ammonium Hydroxide

Pasangan IonHal yang penting

diperhatikan Tipe reagen Ion-Pair Konsentrasi reagen Ion-Pair pH solven

R-COOH RCOO- + H+

(pKa=4.5)

R-NH2 + H+ R-NH3+

(pKa=6.0)

Tipe reagen ion-pair

Mobile Phase: H2O/MeOH1:1,with 0.005M ion pairingreagent and 1% HOAc

1 Maleic Acid2 Phenylephrine3 Phenylpropanolamine4 Naphazoline5 Phenacetin6 Pyrilamine

Hexane Sulfonate Pentane Sulfonate

Mekanisme: Penukar ion

N+

R

R

R

Sampel

Kekuatan antar ion

Jika analit anion maka fase diam kation, fase gerak anion

SO3- Sampel

+

++

++

++

+

++++

+

Jika analit kation maka fase diam anion, fase gerak kation

Penukar ion

Lingkungan biologi (protein, peptide, amino acid analysis) Kromatografi ion

– Penukar kation• Strong Cation Exchange (SCX) (R-SO3-)• Week Cation Exchange (WCX) (R-COO-)

– Penukar anion• Strong Anion Exchange (SAX) (R4N+)• Week Anion Exchange (WAX) (DEAE)

Hal yang perlu diperhatikanpada Kromatografi Penukar

ion

pH larutan dapar Konsentrasi larutan dapar Metoda elusi

– Elusi Isokratik– Elusi gradien pH– Elusi gradien peningkatan kekuatan ionik

Mekanisme pemisahan berdasarkan ukuran molekul

Apakah SEC ?

Size Exclusion Chromatography Size Exclusion Chromatography

(SEC)(SEC)– GPC (Gel Permeation Chromatography)

• terutama untuk sampel polimer

– GFC (Gel Filtration Chromatography)

• terutama untuk sampel biologi

Prinsip SEC

Tidak ada kekuatan interaksiTidak ada kekuatan interaksi Perbedaan waktu tempuhPerbedaan waktu tempuh

SEC

Fase diam: partikel berpori Molekul ber BM besar Molekul relatif besar tidak dapat dijebak

oleh fase diam, akibatnya waktu tambat singkat

Molekul relatif kecil dapat dijebak oleh fase diam, akibatnya waktu tambat lama

Hubungan antara Bobot molekul & waktu tambat

Ber

at m

olek

ul

(Log

MW

)

KolomGPC

Batas eksklusi

Batas permeasi

Waktu

Kromatografi Afinitas

Pustaka

SusanR.Mikkelsen and Eduardo Corton, 2004, BIOANALYTICAL CHEMISTRY, A JOHNWILEY&SONS, INC., PUBLICATION, New Jersey.

PT. Ditek Jaya. Presentation for Shimadzu LC