3

BAB 1

TINJAUAN PUSTAKA

Pada bab ini dibahas mengenai validasi metode analisis beserta karakteristiknya, metode

analisis komparatif atau instrumental, kromatografi cari kinerja tinggi sebagai objek dari

tugas akhir ini dan Microsoft Visual Basic 6.0 sebagai media dalam pembuatan perangkat

lunak SVMAK

1.1 Validasi Metode Analisis

Validasi Metode Analisis merupakan suatu proses penilaian terhadap parameter analitik

tertentu berdasarkan percobaan laboratorium untuk membuktikan bahwa parameter

tersebut memenuhi syarat untuk tujuan penggunaannya. Validasi metode analisis ini

bertujuan untuk mendapatkan suatu hasil analisis yang absah atau valid, dapat dipercaya

dan dapat dipertanggungjawabkan secara ilmiah dan hasil analisis ini dapat menunjukkan

kesesuaian dengan tujuan pengujian.

Proses validasi metode analisis ini dilakukan sekurang-kurangnnya empat tahapan utama

yaitu : Validasi perangkat lunak, validasi perangkat keras, validasi metode dan kesesuaian

sistem. Proses diawali dengan menggunakan perangkat lunak yang telah divalidasi dan

sistem yang telah dikualifikasi. Validasi metode dilakukan dengan menggunakan sistem

yang telah dikualifikasi dan pengujian kesesuaian sistem. Masing-masing tahap tersebut

sangat menentukan bagi keberhasilan proses validasi (Swartz, 1978).

VALIDASI

(1) Perangkat Keras

(2) Perangkat Lunak (3) Kesesuaian Sistem

(4) Validasi Metode

Gambar 1.1 Proses Validasi

Menurut farmakope, validasi metode analisis mensyaratkan bahwa metode pengujian yang

digunakan untuk menetapkan kualitas produk farmasi dan kesesuaiannya terhadap

persyaratan spesifikasi harus sudah dibuktikan kesesuaiannya dengan kecermatan baku dan

reliabilitas yang telah ditetapkan.

4

Tahapan validasi metode analisis dilakukan dalam dua bagian besar yaitu :

1. Tahap persiapan

i) Kalibrasi instrumen dan alat-alat gelas yang digunakan dalam proses validasi

ii) Penyiapan bahan acuan baku dan matriks sediaan (plasebo)

iii) Uji kesesuaian sistem untuk metode kromatografi

2. Tahap validasi

i) Spesifisitas

ii) Linieritas dan rentang

iii) Batas deteksi

iv) Batas kuantisasi

v) Akurasi

vi) Presisi

Untuk setiap metode analisis, tahap-tahap validasi metode analisis yang dilakukan bisa

berbeda-beda sesuai dengan kebutuhan dari metode analisis tersebut. USP XXIV

menerangkan bahwa setiap metode analisis memerlukan beberapa persyaratan validasi

yang harus dipenuhi agar suatu metode analisis absah dan dapat dipertanggungjawabkan.

Adapun persyaratan validasi untuk masing-masing jenis metode analisis dilampirkan pada

Lampiran A, Tabel 1.1

1.1.1 Spesifisitas

Spesifisitas merupakan kemampuan untuk menguji secara akurat dan spesifik suatu analit

dengan adanya komponen lain dalam matriks sampel seperti adanya pengotor, hasil

degradasi dan komponen matriks. Spesifisitas atau selektifitas ini juga merupakan

kemampuan metode analisis untuk memberikan signal analit pada campuran analit dalam

sampel tanpa adanya interaksi antar analit. Metode selektif dapat dinyatakan sebagai suatu

seri metode spesifik (Ibrahim, 2007).

Adapun pengujian yang dilakukan untuk penetapan spesifisitas ini adalah sebagai berikut :

i) Untuk identifikasi

Metode harus mampu menyeleksi senyawa-senyawa yang ada didalam sampel yang

berkaitan dengan struktur molekulnya. Dapat dibuktikan dengan hasil positif atau

dibandingkan dengan bahan acuan standar yang diketahui dari sampel yang

5

mengandung analit dan digabungkan dengan hasil negatif dari sampel yang tidak

mengandung analit.

ii) Untuk penetapan cemaran

Dilakukan dengan menguji sampel yang ditambahkan sejumlah tertentu cemaran

atau hasil urai dan terlihat dengan nyata cemaran itu dapat ditetapkan secara akurat

dan presisi yang memadai.

iii) Untuk penetapan kadar

Dinyatakan dengan jelas bahwa prosedur tidak dipengaruhi oleh adanya cemaran

atau matriks. Dalam praktek dapat dilakukan dengan cara menguji sampel yang

ditambahkan sejumlah tertentu cemaran atau matrik dan terlihat nyata bahwa

prosedur tidak dipengaruhi oleh komponen asing tersebut (USP Convention, 1999).

1.1.2 Linieritas

Linieritas merupakan kemampuan metode analisis untuk memnunjukan respon/hasil uji

secara langsung atau melalui transformasi matematika yang jelas, proporsional (sepadan)

terhadap konsentrasi analit dalam sampel dan dalam rentang konsentrasi yang digunakan.

Adapun cara penetapan linieritas ini dilakukan dalam beberapa tahap, yaitu :

i) Menyiapkan larutan analit sebanyak minimal 6 konsentrasi dengan rentang

konsentrasi 20 – 120 % dari konsentrasi aktual.

ii) Mengukur respon instrumen keenam larutan tersebut, masing masing paling sedikit

tiga kali pengukuran.

iii) Membuat kurva antara respon instrumen terhadap konsentrasi analit dan menghitung

persamaan matematika yang memadai (persamaan garis regresi linier atau regresi

kuadrat).

iv) Menghitung derajat linieritas melalui parameter-parameter antara lain, yaitu koefisien

korelasi, koefisien variasi regresi, nilai gawat t dan % y-intercept (Ibrahim, 2007).

6

0 1 2 3 4 5

Konsentrasi analit

Resp

on In

stru

men

6

Gambar 1.2 Kurva kalibrasi antara konsentrasi dengan respon instrumen

Untuk linieritas ini dibuat persamaan garis regresi linier dengan persamaan sebagai berikut

abXY += …………….…………………………. 1)

Dengan Y adalah respon instrumen, b adalah kemiringan garis regresi, x adalah konsentrasi

analit, dan a adalah intersept atau perpotongan garis dengan sumbu Y. Untuk b atau

kemiringan garis regresi linier dapat dihitung dengan persamaan sebagai berikut :

( )( )( )∑

∑−

−−= 2

xx

yyxxb

i

ii ……………………………………2)

atau dengan persamaan :

( )( )[ ]∑ ∑

∑ ∑ ∑−

−=

nxx

nyxxyb 22

…………………………………..3)

Untuk a yaitu intersept atau perpotongan terhadap sumbu Y dapat dihitung dengan

persamaan :

XbYa −= ………………………………………..4)

Koefisien korelasi merupakan ketergantungan faktor sumbu X terhadap sumbu Y.

koefisien korelasi ini dinyatakan dengan dengan koefisien (r) dan merentang dari -1

sampai +1. Koefisien 1, dengan tanda + atau - , menunjukkan korelasi sempurna antara

dua peubah. Sebaliknya, koefisien nol menunjukkan tidak adanya korelasi sama sekali

(Schelfler, 1978) . Koefisien korelasi ini dapat dihitung dengan persamaan sebagai berikut

:

( )( ) ( )( )∑ ∑∑ ∑∑ ∑ ∑

−−

−=

nyynxx

nyXxyr

2222……………………………5)

7

Koefisien Variansi regresi (Vx0) merupakan koefisien yang menentukan nilai linieritas

suatu persamaan (Ibrahim, 2007). Koefsien ini dapat dinyatakan dengan persamaan :

%100./0Xb

xSyVx = ……………………………………6)

Dengan b adalah kemiringan garis regresi linier, X adalah rata-rata dari sumbu X atau

konsentrasi, dan Sy/x adalah simpangan baku regresi linier yang dapat dinyatakan dengan

persamaan :

( )2

/2

−

−= ∑

nyy

xSy i …………………………………….7)

atau dengan persamaan :

( )( ) ( )2

/22

−

−−−= ∑ ∑ ∑∑ ∑

nnyxxybnyy

xSy …………………8)

Nilai gawat t merupakan nilai yang menentukan tingkat korelasi antara sumbu X dan

sumbu Y, apakah terdapat hubungan yang signifikan atau tidak (Schelfler, 1978). Nilai

gawat t ini dapat dinyatakan dalam persamaan :

22 1

2

r

nrtN −

−=− ……………………………………….9)

dengan r adalah koefisien korelasi dari garis regresi, dan n adalah jumlah pengukuran yang

dilakukan dalam penetapan

Kriteria Linieritas dan rentang yang dapat diterima dalam berbagai metode analisis

dilampirkan pada Lampiran A, tabel 1.2

1.1.3 Rentang Konsentrasi

Rentang konsentrasi adalah interval atau batas antara batas terendah dan batas tertinggi

konsentrasi analit yang telah terbukti dapat dibuktikan dengan metode analisis dengan hasil

presisi, akurasi, dan linieritas yang dapat diterima.

Rentang metode diuji dengan melakukan verifikasi yang menghasilkan data yang

memperlihatkan presisi, akurasi dan linieritas yang dapat diterima, baik pada konsentrasi

terendah dan tertinggi maupun pada konsentrasi lain dalam rentang sesuai dengan tujuan

metode analisis (Ibrahim, 2007).

8

1.1.4 Batas Deteksi dan Batas Kuantitasi

Batas Deteksi merupakan konsentrasi terendah analit dalam sampel yang masih dapat

terdeteksi, tetapi tidak perlu ditetapkan secara kuantitatif dalam kondisi percobaan yang

telah dinyatakan. Pada metode instrumen, batas deteksi ini dinyatakan sebagai konsentrasi

analit pada saat ratio signal-noise 3 : 1 ( S/N = 3) atau mengukur besarnya respon

instrumen dari larutan blangko dan menghitung simpangan bakunya (Ibrahim, 2007).

Batas deteksi ini dapat dihitung melalui persamaan, yaitu :

bSDBD 3,3

= ……………………………………….10)

dengan SD adalah simpangan baku blanko, dan b adalah kemiringan garis regresi.

Batas Kuantitasi merupakan konsentrasi terendah analit didalam sampel yang dapat

ditentukan dengan presisi dan akurasi yang dapat diterima dalam kondisi percobaan yang

ditetapkan. Pada metode instrumen, batas kuantitasi ini dapat dinyatakan dengan mengukur

besarnya respon latar belakang analisis dengan cara menganalisis sejumlah larutan blanko

sampel dan menghitung simpangan bakunya. Simpangan baku dikalikan dengan faktor

(10/b) merupakan batas kuantitasi (Ibrahim, 2007). Batas kuantitasi ini dinyatakan dalam

persamaan :

bSDBD 10

= …………………………………………..11)

dengan SD adalah simpangan baku blanko, dan b adalah kemiringan garis regresi. SD

dapat dihitung dengan cara menghitung simpangan baku blanko, simpangan baku residual

garis regresi (Sy/x), dan simpangan baku perpotongan garis dengan sumbu Y (Sa). Dengan

Sa dapat dinyatakan dengan persamaan :

( )∑∑

−×= 2

2

./

xxn

xxSySa

i

i …………………………………..12)

1.1.5 Akurasi (Kecermatan)

Akurasi adalah tingkat kedekatan hasil pengujian dengan metode yang sedang divalidasi

dengan nilai yang sebenarnya atau nilai yang dinyatakan benar (Ibrahim, 2007). Akurasi

ini ditentukan dengan empat cara sebagai persen perolehan kembali (% recovery).

i) analisis kadar analit dengan metode yang divalidasi terhadap sampel yang telah

diketahui kadarnya.

9

ii) Analisis kadar analit yang ditambahkan kedalam matriks sampel yang dianalisis

(spiked method). Yang dapat dinyatakan dalam persamaan :

% Recovery = (Ch – Cb)/Cs x 100 % …………………………13)

Dengan Ch adalah kadar analit yang diihitung dari metode yang divalidasi, Cb

adalah kadar tanpa analit (blangko), dan Cs adalah kadar analit teoritis

iii) Jika matriks dan eksipien tidak tersedia , maka akurasi dinyatakan dengan persen

perolehan kembali kadar analit yang ditambahkan pada produk jadi yang sudah

mengandung analit (Standar addition method)

iv) Membandingkan hasil analisis analit dengan metode yang divalidasi terhadap hasil

dengan metode baku (Cara grafik).

Adapun kriteria penerimaan akurasi yang baik dilampirkan dalam Lampiran A, tabel 1.3

1.1.6 Presisi (keseksamaan)

Presisi atau keseksamaan adalah tingkat kesesuaian diantara hasil analisis individual jika

prosedur dilakukan berulang kali terhadap sampel ganda atau beberapa sampel yang

homogen. Presisi metode analisis ini dinyatakan sebagai simpangan baku relatif (SBR)

atau Koefisien Variasi (KV). Adapun ukuran presisi metode analisis ini adalah mengetahui

kesalahan karena sistem, tidak tergantung pada penyiapan sampel (Repeatabilitas Sistem)

dan ukuran dari variabilitas intrinsik termasuk kesalahan karena penyiapan sampel

(Repeatabilitas Metode) (Ibrahim, 2007).

Presisi metode dinyatakan dengan tiga jenis penetapan yaitu repeatabilitas (keterulangan),

presisi antara dan reproduksibilitas

i) Repeatabilitas (keterulangan) merupakan kemampuan metode untuk memberikan

hasil analisis yang sama untuk beberapa sampel yang kadarnya sama.

ii) Presisi (Ruggedness) antara adalah pengukuran kinerja metode dimana sampel-

sampel diuji dan dibandingkan menggunakan tenaga analis berbeda, peralatan

berbeda atau hari berbeda (interday presicion). Presisi antara ini tidak perlu

dilakukan jika kajian reproduksibilitas telah dilakukan.

iii) Reproduksibilitas (ketertiruan) merupakan presisi yang terakhir dan tuntas. Diuji

dengan cara menyiapkan sampel yang homogen dan stabil, lalu diuji oleh beberapa

laboratorium (studi kolaboratif). Hal ini akan memperlihatkan adanya galat acak

yang disebabkan oleh sampel dan laboratorium, serta adanya galat sistemik yang

belum tuntas dikoreksi

10

Penentuan presisi atau keseksamaan validasi metode analisis ini ditentukan dengan nilai

simpangan baku relatif (SBR) atau Relatif Standard Deviation (RSD) yang dapat dihitung

dengan persamaan :

%100×=x

SDRSD ………………………………….14)

dengan SD adalah simpangan baku yang dirumuskan dengan persamaan :

1)( 2

−

−= ∑

nxx

SD i ……………………………………..15)

dan x adalah rata-rata dari jumlah data terhadap n pengukuran

Adapun kriteria penerimaan presisi yang baik dilampirkan pada Lampiran A, Tabel 1.4

Kriteria penerimaan presisi juga dapat dinyatakan dengan menggunakan kurva terompet

Horwitz, dengan simpangan baku relatif yang akan meningkat dengan menurunnya

konsentrasi analit, dan menghasilkan suatu persamaan untuk simpangan baku relatif yaitu :

RSD = ± 2(1-0,5 log C) ......................................................16)

Dengan C adalah konsentrasi yang dinyatakan dalam fraksi desimal (Ibrahim, 2007).

1.1.7 Robustness (ketegaran)

Robustness merupakan ukuran kemampuan metode untuk tak terpengaruh dan bertahan

terhadap pengaruh kecil. Tapi dilakukan dengan sengaja dengan membuat variasi dalam

faktor metode yang memberikan indikasi realibilitas metode normal pada pengujian.

Contoh perubahan atau variasi parameter metode analisis adalah stabilitas larutan contoh

dan waktu ekstraksi contoh. Bila pengukuran peka terhadap variasi kondisi analisis maka

kondisi tersebut harus dikendalikan atau harus berhati-hati terhadap kondisi tersebut.

Kesesuaian sistem harus ditetapkan pada evaluasi robustness untuk menjamin keabsahan

metode analisis tetap terpelihara ketika digunakan (Ibrahim, 2007).

1.2 Metode Analisis Komparatif

Metode analisis komparatif merupakan suatu metode analisis yang digunakan untuk

memperoleh informasi kuantitatif mengenai spesimen atau sampel. Adalah suatu metode

yang memerlukan kalibrasi terhadap baku yang diketahui komposisi dan kadarnya untuk

memperoleh hasil kuantitatif yang lebih cermat. Pada umumnya metode analisis

11

komparatif meliputi teknik fisika dan instrumentasi dimana sifat utama analit (padat atau

larutan) dapat diukur.

Dalam semua metode analisis komparatif terdapat hubungan matematika yang menyatakan

parameter fisika yang diukur sebagai fungsi dari konsentrasi analit. Oleh karena itu

kalibrasi diperlukan untuk membangun persamaan matematika yang menggambarkan

hubungan antara respon instrumen yang mengukur sifat alami respon dengan konsentrasi

analit (C) atau secara linier Respon(R) berkaitan dengan Konsentrasi(C).

R = b.C …………………………………………17)

Atau

R = b Log C ……………………………………….18)

Dengan b adalah tetapan proporsionalitas dan harus diukur, R adalah Respon instrumen

dan C adalah Konsentrasi analit, sebelumnya parameter R dapat dikonversi kedalam

konsentrasi (C) . Cara untuk menentukan nilai b ini disebut dengan kalibrasi (Ibrahim,

2007).

Kurva kalibrasi yang digunakan untuk melihat hubungan linier antara respon instrumen

dan konsentrasi analit serta untuk menentukan nilai proporsionalitas b dapat dibuat dengan

berdasarkan beberapa metode baku, dimana baku ini merupakan suatu senyawa atau

pereaksi yang diketahui konsentrasinya dan ditambahkan kedalam proses. Adapun metode

baku yang digunakan dalam menentukan kurva kalibrasi ini adalah metode baku luar,

metode baku dalam dan metode baku tinambah (Ibrahim, 2007).

1.2.1 Metode Baku Luar (External Standard Method)

Metode baku luar ini merupakan metode dengan membuat serangkaian larutan sampel

yang diketahui kadarnya , kemudian diukur dengan instrumen dibawah kondisi yang sama

dengan yang dipakai untuk sampel uji. Kemudian dibuat kurva kalibrasi antara respon

instrumen dan konsentrasi analit, dan kadar analit dari sampel uji dapat dihitung melalui

interpolasi terhadap persamaan garis yang diperoleh

1.2.2 Metode Baku Dalam (Internal Standard Method)

Metode baku dalam ini merupakan Metode analisis dengan membandingkan respon

instrumen yang diberikan senyawa lain yang tidak bereaksi dengan sampel uji serta

diketahui kadarnya, yang ditambahkan kedalam sampel kalibrasi dan sampel uji.

12

Metode baku dalam ini dilakukan apabila beberapa prosedur analisis yang dilakukan tidak

dapat memberikan garansi kecermatan kuantitas untuk kalibrasi maupun untuk uji,

sehingga metode baku dalam ini digunakan untuk mengurangi galat analisis yang dapat

terjadi baik sebelum maupun selama pengukuran.

Senyawa baku dalam adalah senyawa yang tidak atau bukan komponen dari sampel yang

diuji dan terukur secara terpisah dari analit, biasanya dipilih senyawa yang homolog

dengan analit, mempunyai sifat fisika dan kimia yang mirip dan terpisah dengan baik dari

analit dibawah kondisi percobaan, tidak bereaksi secara kimia dengan analit atau

komponen lain dalam sampel dan tidak mengganggu analisis, serta baku dalam yang

dipilih harus bercampur dengan sempurna dengan pelarut ketika analisis dilakukan.

Metode baku dalam ini digunakan untuk meningkatkan kecermatan dan keseksamaan hasil

analisis, dimana metode instrumen biasa yang menggunakan metoe kalibrasi memberikan

kecermatan ± 1 – 2 %, sedangkan dengan metode baku dalam kecermatan meningkat 0,5 %

dari nilai benar (Ibrahim, 2007).

1.2.3 Metode Baku Tinambah (Addition Sstandard Method)

metode analisis yang dilakukan dengan menambahkan senyawa yang sama dengan sampel

uji, yang biasa digunakan karena kadar dan tingkat keterukuran sampel uji yang kecil, serta

matriks sampel yang berpengaruh selama pengukuran

1.3 Kromatografi Cair Kinerja Tinggi

Kromatografi merupakan teknik pemisahan satu atau lebih komponen dari suatu sampel

yang dibawa oleh fase gerak melewati fase diam yang dapat berbentuk padat atau cairan.

Distribusi komponen sampel, terjadi diantara fase gerak dan fase diam. Komponen yang

afinitasnya tinggi terhadap fase diam akan tertahan lebih lama. Pemisahan komponen

dalam sampel tersebut didasarkan pada perbedaan mobilitas karena perbedaan adsorpsi,

partisi, kelarutan, tekanan uap, ukuran molekul komponen atau muatan ion (Snyder, 1997).

1.3.1 Uji Kesesuaian Sistem

Sistem kromatografi terutama kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT) harus diuji terlebih

dahulu sebelum digunakan untuk analisis, melalui uji kesesuaian sistem agar dapat

mendapatkan keyakinan tentang keefektifan sistem kromatografi sehingga data analisis

13

yang dihasilkan cukup handal untuk dipakai dalam menyimpulkan suatu hasil pengujian.

Hal ini karena banyak faktor yang dapat memberikan perbedaan hasil uji seperti kolom

yang walaupun jenisnya sama, umur kolom, komposisi dan pH fase gerak (Snyder, 1997).

Parameter uji kesesuaian sistem dapat digunakan sebagai petunjuk mendesain

pengoperasian kromatografi ini, meliputi :

i) Keberulangan penyuntikan

Keberulangan penyuntikan ditetapkan dengan penyuntikan berulang larutan analit

dan dinyatakan dalam simpangan baku relatif (SBR) yang dapat dihitung dari

persamaan berikut :

x

nxxSBR i∑ −−

=)1/()(.100

(%)2

............................19)

x dan adalah nilai rata-rata dari n pengukuran dan nilai hasil pengukuran

individual. Bila digunakan baku dalam, maka nilai xi = rs/ri. Nilai rs dan ri adalah

luas kromatogram baku pembanding dan baku dalam. Bila figunakan baku luar,

maka nilai xi adalah rs (luas kromatogram baku pembanding). Nilai RSD yang

dapat diterima adalah tidak lebih dari 1,0 % untuk bahan baku obat, tidak lebih dari

2,0 % untuk sediaan obat dan tidak lebih dari 5 % untuk cemaran atau hasil

degradasi (USP Convention, 1999).

ii) Daya pemisahan (resolusi)

Daya pemisahan adalah ukuran daya pisah dua kromatogram yang terelusi

berdekatan dari dua komponen yang terdapat dalam larutan yang harus terpisahkan

sehingga dapat digunakan untuk analisis kuantitatif secara akurat. Daya pemisahan

(Rs) antara dua kromatogram dapat dihitung dengan persamaan berikut :

Rs = 2 ( tR2 – tR1) / (w1 + w2) ………………………….20)

tR2 dan tR1 adalah waktu retensi kromatogram pertama dan kedua, sedangkan w1

dan w2 adalah lebar kromatogram pertama dan kedua yang diukur dengan cara

ekstrapolasi sisi puncak yang relatif lurus terhadap garis alas kromatogram. Nilai

Rs yang lebih besar dari 1,5 menunjukkan pemisahan yang baik (Snyder, 1997).

iii) Efisiensi kolom

Efisiensi kolom didefinisikan sebagai jumlah lempeng teoritis per meter (N) yang

merupakan ukuran ketajaman kromatogram. Kinerja kolom yang berubah

ditunjukkan dari lebar kromatogram yang berbeda pada analisis berulang sehingga

14

memberikan nilai efisiensi kolom yang berbeda (Johnson, 1991). Efisiensi kolom

(N) dapat dihitung dengan persamaan berikut :

N = 16 ( tR / w )2 = L / HETP ........................................21)

tR, w dan L ada waktu retensi, lebar kromatogram dan panjang kolom. Efisiensi

kolom dapat juga dinyatakan dengan HETP ( Height Equivalent of a Theoritical

Plate) atay tinggi lempeng teoritis setara. Faktor yang mempengaruhi nilai N atau

HETP adalah letak kromatogram, ukuran partikel kolom, laju alir fase gerak, suhu

kolom, viskositas fase gerak dan berat molekul analit dalam sampel. Jumlah

lempeng teoritis yang lebih besar dari 10000/m dianggap cukup memadai untuk

analisis

iv) Faktor ikutan (kesimetrisan)

Faktor ikutan (Tf ) merupakan ukuran kesimetrisan suatu kromatogram dan dapat

dihitung dengan persamaan berikut :

Tf = W0,05 / 2 f ........................................................22)

W0,05 adalah lebar kromatogram pada 5 % tinggi sedangakan f adalah jarak

maksimum kromatogram sampai tepi kromatogram, diukur pada titik dengan

ketinggian 5 % dari tinggi kromatogram terhadap garis alas kromatogram. Nilai Tf

bertambah jika kromatogram makin terlihat berekor. Kecermatan kromatogram

berkurang apabila faktor ikutan bertambah karena recorder / pencatat sukar

menentukan dimana dan kapan kromatogram berakhir sehingga mempengaruhi

perhitungan luas kromatogram (Johnson, 1991). Nilai Tf lebih kecil dari 2,0 yang

masih dapat diterima

v) Faktor kapasitas (k’)

Faktor kapasitas menyatakan kemampuan senyawa tertentu berinteraksi dengan

sistem kromatografi dan menentukan retensi dari senyawa terlarut. Faktor ini

merupakan perbandingan waktu atau jumlah senyawa dalam fase diam dan dalam

fase gerak (Snyder, 1997). Faktor kapasistas (k’) dapat dihitung dengan persamaan

berikut :

k’ = (tR / tN) – 1 = (tR – tn) / tn .......................................23)

tn adalah waktu retensi senyawa yang tidak diretensi oleh kolom dan tR adalah

waktu retensi senyawa tersebut. Jika k’ kurang dari satu, maka elusinya sangat

cepat sehingga senyawa sedikit diretensi oleh kolom dan kromatogram senyawa

terelusi dekat dengan kromatogram senyawa yang tidak diretensi, menunjukkan

15

pemisahan yang buruk. Jika nilai k’ sangat besar ( antara 20 – 30), waktu elusinya

sangat lama sehingga tidak berguna untuk analisis. Nilai k’ harus diantara 1 – 10.

vi) Faktor selektivitas (α)

Faktor selektivitas (α) suatu kolom dapat dihitung dengan persamaan berikut :

α = K2 / K1 = k’2 / k’1 = (tR2 – tn) / (tR1 – tn) …………………..24)

K2 dan K1 adalah koefisien partisi dari senyawa kedua yang lebih kuat diretensi

oleh kolom. Nilai k’2, k’1 dan tR2, tR1 adalah faktor kapasitas dan waktu retensi

senyawa kedua dan pertama sedangkan tn adalah waktu retensi senyawa yang tidak

diretensi oleh kolom. Faktor selektivitas ini dapat dinyatakan sebagai retensi

selektif yang merupakan ukuran rellatif dari dua kromatogram (Rr). Waktu retensi

relatif (Rr) dinyatakan sebagai perbandingan waktu retensi senyawa kedua dan

pertama (USP Convention, 1999)

1.4 Microsoft Visual Basic 6.0

Perangkat lunak Microsoft Visual Basic 6.0 adalah Perangkat lunak yang digunakan untuk

membuat aplikasi berbasis objek, perangkat lunak merupakan pengembangan program

yang berbasis bahasa Basic yang memungkinkan penggunanya untuk membuat aplikasi

secara lebih mudah dan praktis (Novian, 2004).

Microsoft Visual Basic 6.0 merupakan bahasa pemograman Basic yang memberikan

sistem pengembangan aplikasi Windows. Microsoft Visual Basic 6.0 ini memiliki fitur-fitur

pendukung terutama dalam bidang database dan internet area diantaranya adalah fitur

ADO, DHTML applications, dan WebClasses

1.4.1 Microsoft Access

Microsoft Access adalah salah satu RDBMS yang tersedia di pasaran, yang dikembangkan

oleh Microsoft. Kebanyakan aplikasi basis data terdiri dari bagian back-end dan front-end.

Bagian back-end dari aplikasi adalah yang menangani penyimpanan dan pengambilan data.

Sementara front-end menyediakan antarmuka pengguna atau suatu cara yang membuat

pengguna dapat berinteraksi dengan data pada back-end. Pengguna dari aplikasi seperti itu

biasanya hanya berinteraksi melalui front-end. Bagian ini biasanya terdiri dari “form-form”

yang menampilkan data dengan cara yang menarik dan mudah digunakan.Form-form

inilah yang digunakan untuk menambah, memodifikasi atau secara umum memanipulasi

data dalam tabel-tabel (Aptech, 2002).

16

Microsoft Access bertindak sebagai back-end dengan menyediakan tabel-tabel dimana data

dapat disimpan. Sementara perangkat lunak yang dibangun bertindak sebagai front-end

yang akan menjadi antarmuka pengguna.

1.4.2 Teknologi Akses Data OLEDB dan ADO

Secara tradisional, sebuah aplikasi basis data dikembangkan dengan acuan suatu jenis basis

data. Perubahan dari suatu DBMS ke DBMS lain berarti penulisan ulang aplikasi untuk

menangani data dalam format baru. Artinya banyak waktu dan usaha yang dihabiskan

dalam membuat ulang aplikasi setiap ingin dilakukan penggantian basis data.

Namun dimungkinkan untuk membangun aplikasi yang dapat berkomunikasi dengan

beragam basis data jika dipisahkan komunikasi terhadap basis data yang sebenarnya

dengan aplikasi. Ini dapat dicapai jika aplikasi selalu memberikan perintah dalam cara

tertentu. Perintah ini kemudian “diterjemahkan” sehingga dapat dimengerti oleh DBMS.

Dengan menggunakan berbagai “penerjemah” sebagai perantara aplikasi dengan DBMS,

dapat dilakukan komunikasi dengan basis data yang dibuat dengan DBMS yang berbeda

(Aptech, 2002).