SKRIPSIdosen.univpancasila.ac.id/dosenfile/2099211031129924184604March... · B. Perumusan Masalah...

UJI AKTIVITAS ANTIPLASMODIUM SECARA VITRO TERHADAP

(Garcinia parvifoliaPlasmodium falcifarum

SKRIPSI

UJI AKTIVITAS ANTIPLASMODIUM SECARA TERHADAP EKSTRAK DAUN ASAM KANDIS

Garcinia parvifolia (Miq)Miq) PADA KULTUR Plasmodium falcifarum STRAIN D6 DAN STRAIN

Oleh :

SUCI FITRIYANI

NPM: 2005210210

Dibuat untuk memperoleh Gelar Sarjana Farmasi pada

Universitas Pancasila

UNIVERSITAS PANCASILA FAKULTAS FARMASI

JAKARTA 2010

UJI AKTIVITAS ANTIPLASMODIUM SECARA IN DAUN ASAM KANDIS

PADA KULTUR STRAIN W2

PERNYATAAN SKRIPSI DAN SUMBER INFORMASI

Saya yang bertandatangan di bawah ini menyatakan skripsi dengan judul ’UJI

AKTIVITAS ANTIPLASMODIUM SECARA IN VITRO TERHADAP EKSTRAK

DAUN ASAM KANDIS (Garcinia parvifolia (Miq)Miq) PADA KULTUR

Plasmodium falcifarum STRAIN D6 DAN STRAIN W2’ adalah karya saya sendiri

dan belum diajukan untuk publikasi dalam bentuk apapun kepada pihak manapun.

Informasi yang berasal atau dikutip adalah karya yang diterbitkan maupun tidak

diterbitkan dari penulis lain telah dicantumkan dalam daftar rujukan di bagian akhir

skripsi ini.

Jakarta, Juli 2010

Suci Fitriyani

NPM : 2005210210

UNIVERSITAS PANCASILA

FAKULTAS FARMASI

JAKARTA

PERSETUJUAN SKRIPSI

NAMA : Suci Fitriyani

NPM : 2005210210

PEMINATAN : FARMASI KLINIK DAN KOMUNITAS

JUDUL : UJI AKTIVITAS ANTIPLASMODIUM SECARA

IN VITRO TERHADAP EKSTRAK DAUN ASAM

KANDIS (Garcinia parfivolia(Miq)Miq) PADA

KULTUR Plasmodium falcifarum STRAIN D6

DAN STRAIN W2

Disetujui oleh :

Pembimbing

(Dr. Syamsudin, M.Biomed., Apt.)

UNIVERSITAS PANCASILA

FAKULTAS FARMASI

JAKARTA

PENGESAHAN SKRIPSI

Judul

UJI AKTIVITAS ANTIPLASMODIUM SECARA IN VITRO TERHADAP EKSTRAK DAUN ASAM KANDIS (Garcinia

parvifolia (Miq)Miq) PADA KULTUR Plasmodium falcifarum STRAIN D6 DAN STRAIN W2

OLEH:

SUCI FITRIYANI

NPM : 2005210210

Dipertahankan di hadapan Panitia Penguji Skripsi

Fakultas Farmasi Universitas Pancasila Pada tanggal 02 Agustus 2010


Fakultas Farmasi

Dekan

(Drs. I Wayan Redja, M.Chem., Apt.)

Pembimbing : 1. Dr. Syamsudin, M.Biomed, Apt 1......................... Penguji: 1. Dra. Syarmalina., M.Si., Apt 1......................... 2. Dr. Ros Sumarny, M.S., Apt 2......................... 3. Prof. ris. Drh. Darmono, M.Sc. 3........................

KATA PENGANTAR

Alhamdulillah, puji dan syukur penulis panjatkan kehadirat Allah SWT atas segala

rahmat dan taufik, serta hidayah-Nya sehingga penulis dapat menyelesaikan skripsi

dengan judul “UJI AKTIVITAS ANTIPLASMODIUM SECARA IN VITRO

TERHADAP EKSTRAK DAUN ASAM KANDIS (Garcinia parvifolia

(Miq)Miq) PADA KULTUR Plasmodium falcifarum STRAIN D6 DAN STRAIN

W2” diajukan untuk memperoleh gelar Sarjana Farmasi di Fakultas Universitas

Pancasila, Jakarta.

Dalam penulisan dan penyusunan skripsi ini, penulis telah banyak menerima

bantuan dari berbagai pihak. Oleh karena itu penulis menyampaikan rasa hormat dan

terima kasih yang sebesar-besarnya kepada Dr. Syamsudin, M. BIOMED, Apt,

selaku dosen pembimbing skripsi yang dengan sabar, tulus dan ikhlas telah

memberikan waktu, tenaga serta pikirannya dalam mengarahkan dan membimbing

penulis dalam penyusunan skripsi.

Ucapan terima kasih yang sebesar-besarnya juga disampaikan kepada:

1. Bapak Drs. I Wayan Redja, M.Chem, Apt., selaku Dekan Fakultas Farmasi


2. Ibu Dr. Shirly Kumala, M.Biomed., Apt., selaku Pembantu Dekan I Fakultas

Farmasi Universitas Pancasila,

3. Ibu Dra. Erlindha gangga, Msi., Apt., selaku Dosen Pembimbing Akademik.

4. Ayah, ibu dan adikku tersayang, yang telah memberikan dukungan moral, doa,

kasih dan sayangnya selama penulis melakukan penelitian.

5. Seluruh pihak yang telah membantu, yang tidak dapat penulis sebutkan satu

persatu.

Akhir kata, penulis berharap semoga skripsi ini bermanfaat bagi penelitian

dan pengembangan ilmu pengetahuan.

Jakarta, Juli 2010

Penulis

DAFTAR ISI

Halaman

KATA PENGANTAR ......................................................................................... iv

DAFTAR ISI ...................................................................................................... v

DAFTAR TABEL.............................................................................................. viii

DAFTAR GAMBAR ......................................................................................... ix

DAFTAR SINGKATAN.................................................................................... xi

DAFTAR LAMPIRAN ..................................................................................... xii

ABSTRAK ......................................................................................................... xiii

BAB I PENDAHULUAN

A. Latar Belakang ........................................................................... 1

B. Perumusan Masalah ................................................................... 2

C. Tujuan Penelitian ........................................................................ 2

D. Manfaat Penelitian ...................................................................... 3

BAB II TINJAUAN PUSTAKA

A. Asam Kandis ............................................................................... 4

1. Klasifikasi Tanaman.............................................................. 4

2. Sinonim ................................................................................. 4

3. Nama Daerah ......................................................................... 4

4. Deskripsi ............................................................................... 4

B. Xanton ......................................................................................... 5

C. Kromatografi................................................................................ 6

D. Ekstraksi ...................................................................................... 7

E. Malaria ........................................................................................ 8

1. Epidemiologi malaria............................................................... 8

2. Spesies parasit malaria............................................................. 9

3. Strain D6 dan strain W2 .......................................................... 14

F. Landasan teori ............................................................................. 14

BAB III RANCANGAN PENELITIAN

A. Prinsip Penelitian ........................................................................ 16

B. Bahan penelitian .......................................................................... 16

C. Tempat penelitian ........................................................................ 16

D. Prosedur penelitian ...................................................................... 16

E. Analisis data ............................................................................... 17

BAB IV BAHAN, ALAT DAN METODE PENELITIAN

A. Bahan........................................................................................... 18

B. Alat .............................................................................................. 19

C. Metode Penelitian........................................................................ 19

1.Identifikasi ekstrak.................................................................... 19

2.Pembuatan kultur P. falcifarum................................................ 22

3. Preparasi bahan uji .................................................................. 23

4. Sinkronisasi ............................................................................. 23

5. Uji aktivitas plasmodium ........................................................ 24

BAB V HASIL PENELITIAN DAN PEMBAHASAN

1. Identifikasi ekstrak ........................................................................ 26

a. Penapisan fitokimia ................................................................. 26

b. Analisis dengan KLT .............................................................. 26

2. Pengujian aktivitas antiplasmodium ............................................. 36

a. Metode Mikroskopik .............................................................. 36

b. Metode SYBR Green I ........................................................... 45

BAB VI SIMPULAN DAN SARAN

A. Simpulan .................................................................................... 50

B. Saran ........................................................................................... 50

DAFTAR RUJUKAN ....................................................................................... 51

LAMPIRAN....................................................................................................... 53

DAFTAR TABEL

Halaman

Tabel V.1 Senyawa-senyawa yang terkandung dalam ekstrak kloroform

dan ekstrak metanol daun asam kandis ............................................ 26

Tabel V.2 Hambatan pertumbuhan P. falcifarum strain D6 (%) dari

ekstrak kloroform dan ekstrak metanol daun asam kandis

pada berbagai konsentrasi .............................................................. 36

Tabel V.3 Hambatan pertumbuhan P. falcifarum strain W2 (%) dari

ekstrak kloroform dan ekstrak metanol daun asam kandis


Tabel V.4 Hambatan pertumbuhan P. falcifarum strain D6 dan strain

W2 (%) dari klorokuin pada berbagai konsentrasi ......................... 44

Tabel V.5 Nilai linieritas fluoresensi pada P. falcifarum dari ekstrak

kloroform daun asam kandis pada berbagai konsentrasi ................ 45

Tabel V.6 Nilai linearitas fluoresensi pada P. falcifarum dari ekstrak

metanol daun asam kandis pada berbagai konsentrasi ................... 45

Tabel V.7 Nilai linieritas fluoresensi pada P. falcifarum dari klorokuin


Tabel V.8 Nilai IC50 dari tiap ekstrak daun asam kandis ................................. 46

DAFTAR GAMBAR

Halaman

Gambar II.1 Garcinia parvifolia (Miq)Miq ..................................................... ... 5

Gambar II.2 Rumus umum xanton ................................................................... ... 5

Gambar II.3 Daerah geografi penyebaran malaria didunia .............................. ... 9

Gambar II.4 Stadium-stadium perkembangan P. falcifarum .......................... ... 10

Gambar II.5 Siklus perkembangan P. falcifarum ............................................ ... 14

Gambar IV.1 Gambaran lempeng sumur mikro uji aktivitas antiplasmodium...... 25

Gambar V.1 Profil bercak KLT ekstrak kloroform………………….................. 27

Gambar V.2 Profil bercak KLT ekstrak kloroform diuapi dengan uap amoniak. 28

Gambar V.3 Profil bercak KLT ekstrak kloroform disemprot denganpereaksi

Liebermann Burchard…………………………………………....... 29

Gambar V.4 Profil bercak KLT ekstrak kloroform dengan pereaksi serium sulfat.30

Gambar V.5 Profil bercak KLT ekstrak metanol………………...……………... 32

Gambar V.6 Profil bercak KLT ekstrak metanol diuapi dengan uap amoniak…. 33

Gambar V.7 Profil bercak KLT ekstrak metanol dengan pereaksi Liebermann-

Burchard………………………………………………………...... 34

Gambar V.8 Profil bercak KLT ekstrak metanol dengan pereaksi serium sulfat... 35

Gambar V.9 Kurva persamaan garis regresi linier antara log konsentrasi dan

probit.................................................................................................. 37

Gambar V.10 P. falcifarum strain D6 ekstrak kloroform daun asam kandis dalam

sel darah merah pada berbagai konsentrasi……………………….... 38

Gambar V.11 P. falcifarum strain D6 ekstrak metanol daun asam kandis dalam

sel darah merah pada berbagai konsentrasi……………………….. 39


probit................................................................................................ 41

Gambar V.13 P. falcifarum strain W2 ekstrak kloroform daun asam kandis dalam


Gambar V.14 P. falcifarum strain W2 ekstrak metanol daun asam kandis dalam



probit................................................................................................ 44

DAFTAR SINGKATAN

1. CCM : Complete Culture Medium

2. DNA : Deoxyribonucleatid Acid

3. HEPES : N-(2-hydoroxyethyl) piperazine-N’-(2-ethaneculfonic acid)

4. IC50 : 50 % inhibitory Concentration

5. LAF : Laminary Air Flow

6. RPMI : Roswell Park Memorial Institute

7. WHO : World Health Organization

DAFTAR LAMPIRAN

Halaman

Lampiran 1. Hasil determinasi daun asam kandis................................................. 53

Lampiran 2. Skema pembuatan ekstrak daun asam kandis…………...………… 54

Lampiran 3. Skema kerja pembuatan kultur P. falcifarum……………………… 55

Lampiran 4. Skema pengujian aktivitas antiplamodium (metode mikroskopi)….. 56

Lampiran 5. Skema pengujian aktivitas antiplamodium (metode SYBR Green I) 57

Lampiran 6. Foto bahan uji antiplasmodium…………………………………….. 58

Lampiran 7. Foto alat uji antiplasmodium……………………………………….. 59

Lampiran 8. Gambar grafik dari metode SYBR Green I......................................... 61

Lampiran 9. Jumlah skizon hidup dalam seluruh jumlah sel dalam area pandang

Mikroskop…………………………………………………………… 63

Lampiran 10. Tabel probit…………………………………………………………. 65

ABSTRAK

(A) SUCI FITRIYANI (2005210210) (B) UJI AKTIVITAS ANTIPLASMODIUM SECARA IN VITRO TERHADAP

EKSTRAK DAUN ASAM KANDIS (Garcinia parvifolia (Miq)Miq) PADA KULTUR Plasmodium falcifarum STRAIN D6 DAN STRAIN W2

(C) xiv + 65 Halaman; 8 tabel; 21 gambar; 7 singkatan; 10 lampiran (D) Kata Kunci : Antiplasmodium, daun asam kandis, kultur P. falcifarum

Resistensi antiplasmodium terhadap obat malaria mendorong untuk dilakukan pengembangan terhadap obat baru. Salah satunya adalah daun asam kandis (G. parvifolia (Miq)Miq) yang digunakan sebagai obat alternatif karena mengandung senyawa xanton. Tujuan penelitian ini untuk mengetahui aktivitas antiplasmodium dari ekstrak daun asam kandis (G. parvifolia (Miq)Miq ) dengan menggunakan metode mikroskopik dan SYBR Green I yang ditunjukkan dengan nilai IC50. Daun asam kandis diekstraksi secara berkesinambungan kemudian di uji aktivitas antiplasmodium secara in vitro dengan metode mikroskopik dan SYBR Green I. Pada metode mikroskopik, diperoleh nilai IC50 dari ekstrak kloroform 33,17 µg/mL pada strain D6 dan 0,55 µg/mL pada strain W2. Nilai IC50 dari ekstrak metanol 32,44 µg/mL pada strain D6 dan 41,23 µg/mL. Pada metode SYBR Green I diperoleh nilai IC50

dari ekstrak kloroform 14,29 µg/mL pada strain D6 dan 0,214 µg/mL pada strain W2. Nilai IC50 dari ekstrak metanol 48,00 µg/mL pada strain D6 dan 56,37 µg/mL pada strain W2. Hasil penelitian menunjukkan bahwa ekstrak kloroform dan ekstrak metanol daun asam kandis (G. parvifolia (Miq)Miq) mempunyai aktivitas antiplasmodium terhadap kultur P. falcifarum strain D6 dan strain W2 pada metode mikroskopik dan metode SYBR Green I. Ekstrak kloroform mempunyai aktivitas antiplasmodium lebih kuat dari ekstrak metanol.

(E) Daftar Rujukan : 22 buah (1983-2009) (F) Dr. Syamsudin, M.Biomed.,Apt. (G) 2010

ABSTRACT

(A) SUCI FITRIYANI (2005210210) (B) IN VITRO ANTI-PLASMODIUM ACTIVITY TEST ON LEAVES OF

Garcinia parvifolia Miq ON CULTURE OF Plasmodium falcifarum strain D6 AND strain W2.

(C) xiv + 65 Pages; 13 tables; 12 figures; 6 abbreviations; 10 appendices (D) Key words: Anti-plasmodium, leaves of Garcinia parvifolia Miq, culture of

P.falcifarum

Malaria is the issue of world health either for developing or developed countries. Much P. falcifarum resistant to malaria medicine encourages people to improve new medicines. One of the medicines is leaves of G. parvifolio Miq that are used as alternative medicine because of containing xanton compound. The objective of this research is to know anti-plasmodium activity of G. parvifolio Miq leaves by means of microscopic and SYBR Green I methods shown by the value of IC50. Leaves of G. parvifolio Miq are extracted by means of chloroform and methanol solvent then the anti-plasmodium activity is tested in in vitro by means of microscopic and SYBY Green I method. In microscopic method, the value of IC50 from chloroform extract 33,17 µg/mL in strain D6 and 0,55 µg/mL in strain W2 is obtained. In SYBR Green I, the value of IC50 from methanol extract 48,00 µg/mL in strain D6 and 56,37 in strain W2 is obtained. From this research, it can be inferred that chloroform and methanol extracts of G. parvifolia Miq leaves have anti-plasmodium activity on culture of P. falcifarum strain D6 and strain W2 on microscopic and SYBR Green I methods in which chloroform extract has stronger anti-plasmodium than methanol extract does.

(E) List of references: 22 references (1983-2009) (F) Dr. Syamsudin, M.Biomed.,Apt. (G) 2010

BAB I

PENDAHULUAN

A. Latar belakang

Malaria merupakan masalah kesehatan di dunia, baik pada negara

berkembang maupun negara yang sudah maju. Penyakit malaria terjadi pada 105

negara dengan 300- 500 juta kasus malaria dan lebih dari satu juta jiwa kematian

pada tiap tahunnya, sehingga kebutuhan obat malaria sangat diharapkan. Spesies

yang banyak di jumpai di daerah tropis adalah P. falcifarum dan P. vivax yang

mengakibatkan terdiagnosisnya infeksi malaria sampai 95 persen, P. vivax

terdistribusi lebih luas dari pada P. falcifarum tetapi lebih sedikit kemungkinan

terjadi kematian. Sedangkan P. malariae ditemukan di beberapa daerah namun

prevalensinya sangat rendah. Di Indonesia, P. ovale hanya ditemukan didaerah

Papua (1).

Malaria merupakan penyakit yang disebabkan oleh parasit yang ditularkan

kepada manusia dan hewan. Vektor yang berperan pada penyakit ini adalah

nyamuk Anopheles. Salah satu faktor utama penyebab kegagalan pemberantasan

malaria adalah adanya nyamuk Anopheles yang resisten terhadap parasit malaria

yakni Plasmodium yang resisten terhadap antimalaria yang tersedia. Masalah

resistensi terhadap Plasmodium terutama pada Plasmodium falcifarum telah

menjadi masalah serius. Hal ini telah mendorong para peneliti untuk berusaha

menemukan antimalaria baru untuk menggantikan antimalaria yang sudah tidak

sensitif lagi . Salah satu usaha untuk menemukan antimalaria baru tersebut adalah

melalui eksplorasi senyawa aktif dari bahan obat alam utamanya tanaman obat

yang secara tradisional digunakan masyarakat untuk mengobati malaria di

berbagai daerah endemik di dunia (2).

Senyawa xanton diketahui memiliki aktivitas farmakologi yang luas antara

lain : antimikroba, anti kanker, antioksidan, dan antimalaria. Beberapa penelitian

senyawa turunan xanton dari tanaman genus Garcinia telah berhasil di uji

aktivitasnya antara lain : garciniaxanton dan cowaxanton dari tanaman G. dulcis

dan G. cowa yang mempunyai aktivitas antiplasmodium paling kuat dengan IC50

berturut-turut sekitar 0,96 µg/ml dan 1,5µg/ml (3).

Pada penelitian sebelumnya menunjukkan ekstrak kulit batang asam kandis

(G. parvifolia (Miq)Miq) mempunyai aktivitas antiplasmodium yang kuat (4).

Ektraksi bertingkat dari serbuk kulit batang asam kandis (G. parvifolia

(Miq)Miq) dengan menggunakan pelarut dengan tingkat kepolaran yang berbeda

yaitu n-heksana, etil asetat, dan ekstrak n-butanol. Pada uji anti plasmodium baik

secara in vitro pada kultur P. falcifarum strain FCR-3 dan 3D7 maupun uji in

vivo yang diinfeksi dengan P. berghei menggunakan ekstrak n-heksana kulit

batang asam kandis (G. parvifolia (Miq)Miq) pada mencit menggunakan ekstrak

n-heksana kulit batang asam kandis (G. parvifolia (Miq)Miq) lebih efektif

dibanding ekstrak etil asetat dan ekstrak n-butanol (5). Pada penelitian ini

dilakukan uji antiplasmodium secara invitro terhadap daun asam kandis pada

kultur P. falcifarum strain D6 (sensitif klorokuin) dan W2 (resisten klorokuin),

diharapkan dapat diketahui aktivitas antiplasmodium ekstrak tersebut terhadap P.

falcifarum strain D6 (sensitif klorokuin) dan W2 ( resisten klorokuin).

B. Perumusan masalah

Apakah pada ekstrak daun asam kandis (G. parvifolia (Miq)Miq) memiliki efek

antiplasmodium terhadap kultur P. falcifarum strain D6 (sensitif klorokuin) dan

strain W2 (resisten klorokuin) dengan menggunakan metode mikroskopik dan

metode SYBR Green I?

C. Tujuan Penelitian

Untuk mengetahui aktivitas antiplasmodium dari ekstrak daun asam kandis (G.

parvifolia (Miq)Miq) dengan menggunakan metode mikroskopik dan metode

SYBR Green I yang ditunjukkan dengan nilai IC50.

D. Manfaat Penelitian

Diharapkan dapat mendorong penemuan anti malaria yang berasal dari

tumbuhan, khususnya dari tumbuhan keluarga Guttiferae.

BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

A. Asam Kandis (Garcinia parvifolia (Miq)Miq) (6)

1. Klasifikasi Tanaman

Divisi : Spermatophyta

Sub Divisi : Angiospermae

Kelas : Dicotyledoneae

Bangsa : Parietales

Suku : Guttiferae

Marga : Garcinia

Jenis : Garcinia Parvifolia (Miq)Miq

Nama Umum : Asam Kandis

2. Sinonim

Garcinia dioica blume

Garcinia globulosa ridley

Garcinia motletana pierre

3. Nama Daerah

Kandis, Kandis Burung, Sempat Tebu

4. Deskripsi

Habitus : Pohon tinggi, tinggi 12-15 m dan besar batangnya 45 cm,

tumbuh di dataran Sumatra.

Kayu : Kayu berwarna kekuning-kuningan, agak keras dan awet,

tetapi mudah rapuh dan hanya dapat diperoleh dalam

ukuran kecil-kecil jika ditoreh akan keluar eksudat yang

berwarna kuning buram.

Kulit Kayu : Kulit kayu berwarna coklat tua, tebal 1-2 mm.

Getah

Buah

Daun

Bunga

B. Xanton

Xanton adalah pigmen fenol kuning yang reaksi warnanya dan hasil

kromatografinya sama dengan flavonoid (8). Golongan xanton mempunyai rumus

umum dibenzogamapiron.

: Getah kayunya mengandung getah kuning yang sangat

banyak, yang mengeras menjadi gumpalan

pada batang.

: Buahnya yang berwarna kuning jingga sebesar buah

tempuyung, agak bulat atau panjang.

: Permukaan daun kasar dan dari dasar daun

daun meruncing.

: Bunga jantan, panjang tangkai 4-10 mm, luas lingkar

tangkai 7-10 mm.

Gambar II.1 Garcinia parvifolia (Miq)Miq (7)



umum dibenzogamapiron.

Gambar II.2 Rumus Umum Xanton ( 9)

Getah kayunya mengandung getah kuning yang sangat

banyak, yang mengeras menjadi gumpalan-gumpalan kecil

: Buahnya yang berwarna kuning jingga sebesar buah

: Permukaan daun kasar dan dari dasar daun hingga ujung

10 mm, luas lingkar



Beberapa senyawa turunan xanton telah berhasil diisolasi dari tanaman

genus Garcinia dan dibuktikan aktivitas antiplasmodiumnya. Likhitwitayawuid

et al. berhasil menguji aktivitas beberapa turunan xanton dari tanaman G. dulcis

dan G. cowa. Diantara turunan xanton yang diuji, garciniaxanton dan cowaxanton

mempunyai aktivitas antiplasmodium paling kuat dengan nilai IC50 (konsentrasi

hambatan maksimal yang dapat menghambat pertumbuhan 50% dari

plasmodium) berturut-turut sekitar 0,96µg/ml dan 1,5 µg/ml (3).

C. Kromatografi

Kromatografi lapis tipis (KLT) adalah cara pemisahan campuran zat

menggunakan sebuah lapisan tipis bahan penyerap, karena menggunakan lapisan

tipis maka prosedurnya disebut Kromatografi Lapis Tipis. Campuran zat

ditempatkan pada satu ujung lapisan bahan penyerap, kemudian dengan bantuan

cairan rambat digerakkan ke ujung lainnya sampai batas tertentu, batas ini

disebut batas rambat. Selama perjalanan dari satu ujung ke ujung yang lain terjadi

pemisahan dari campuran zat, yang disebabkan oleh perbedaan sifat antara zat-

zat tersebut. Ada zat yang tetap tinggal dititik permulaan, ada zat yang merambat

sampai setengah perjalanan dan ada pula yang bergerak terus sampai mencapai

batas rambat. Pemisahan dianggap berhasil bila zat-zat dapat terpisah satu sama

lain sepanjang lapisan bahan penyerap.

Bahan penyerap disebut juga fase diam, fase stasioner atau fase tidak

bergerak, sebab bahan ini memang tetap tinggal diam selama proses

kromatografi. Sebaliknya cairan rambat disebut sebagai fase bergerak karena

merambat perlahan-lahan dari ujung lempeng ke ujung yang lain. Dan pada

umumnya silika gel biasa digunakan sebagai bahan penyerap.

Fase gerak (cairan rambat, cairan eluasi atau cairan pengembang) ialah

medium angkut dan terdiri atas satu atau beberapa pelarut. Fase gerak bergerak di

dalam fase diam, yaitu suatu lapisan berpori, karena ada gaya kapiler. Fase gerak

biasanya berupa zat organik mudah menguap, komposisinya sangat beragam, ada

yang terdiri dari satu zat organik, ada yang berupa campuran dua zat organik atau

lebih, semuanya tergantung pada keperluan sifat dari campuran zat yang akan

dipisahkan. Cairan pengembang yang banyak digunakan: n-heksana, heptana,

sikloheksana, karbontertraklorida, benzena kloroform, eter, etil asetat, piridina,

aseton, etanol, metanol, air (10).

D. Ekstraksi

Ekstraksi adalah kegiatan penarikan kandungan kimia yang dapat larut

sehingga terpisah dari bahan yang tidak dapat larut dengan pelarut cair. Simplisia

yang diekstrak mengandung senyawa aktif yang dapat larut dan senyawa yang

tidak dapat larut seperti serat, karbohidrat, protein, dan lain-lain. Senyawa aktif

yag terdapat dalam berbagai simplisia dapat digolongkan ke dalam golongan

flavonoid, minyak atsiri, dan lain-lain. Dengan diketahuinya senyawa aktif yang

dikandung simplisia akan mempermudah pemilihan pelarut dan cara ekstraksi

yang tepat. Simplisia yang lunak seperti daun dan rimpang mudah diserap oleh

pelarut, karena itu pada proses ekstraksi tidak perlu diserbuk sampai halus (8).

Metode Ekstraksi, antara lain :

1) Cara Dingin

a. Maserasi

Maserasi adalah proses pengekstraksian simplisia dengan menggunakan

pelarut dengan beberapa kali pengocokan atau pengadukan pada

temperatur ruangan (kamar). Secara teknologi termasuk ekstraksi dengan

prinsip metode pencapaian konsentrasi pada keseimbangan. Maserasi

kinetik berarti dilakukan pengadukan yang kontinu (terus menerus).

Remaserasi berarti dilakukan pengulangan penambahan pelarut setelah

dilakukan penyaringan maserat pertama, dan seterusnya.

b. Perkolasi

Perkolasi adalah ekstraksi dengan pelarut yang selalu baru sampai

sempurna (exhaustive extraction) yang umumnnya dilakukan pada

temperatur ruangan. Proses terdiri dari tahapan pengembangan bahan,

tahap maserasi antara, tahap perkolasi sebenarnya (penetesan /

penampungan ekstrak), terus menerus sampai diperoleh ekstrak (perkolat)

yang jumlahnya 1-5 kali bahannya.

2) Cara Panas

a. Refluks

Refluks adalah ekstraksi dengan pelarut pada temperatur titik didihnya,

selama waktu tertentu dan jumlah terbatas yang relatif konstan dengan

adanya pendingin balik. Umumnya dilakukan pengulangan proses pada

residu pertama sampai 3-5 kali sehingga dapat termasuk proses ekstraksi

sempurna

b. Soxhletasi

Soxhletasi adalah ekstraksi menggunakan pelarut yang selalu baru yang

umumnya dilakukan dengan alat khusus sehingga terjadi ekstraksi

kontinu dengan jumah pelarut relatif konstan dengan adanya pendingin

balik.

c. Digesti

Digest adalah maserasi kinetik (dengan pengadukan kontinu) pada

temperatur yang lebih tinggi dari temperatur ruangan (kamar), yaitu

secara umum dilakukan pada temperatur 40-50o C.

d. Infus

Infus adalah ekstraksi dengan pelarut air pada temperatur penangas air

(bejana infus tercelup dalam penangas air mendidih, temperatur terukur

96-98o C) selama waktu tertentu (15-20 menit)

e. Dekok

Dekok adalah infus pada waktu yang lebih lama (≥30 menit) dan

temperatur sampai titik didih air (8,11).

E. Malaria

1. Epidemiologi Malaria

Di negara tropis maupun subtropis, hingga saat ini malaria masih menjadi

masalah kesehatan lebih dari 40 % atau 2,1 miliyar penduduk dunia di

perkirakan tinggal di daerah yang mempunyai resiko tinggi terkena malaria.

Tercatat 273 juta kasus penderita malaria di diagnosis secara klinis setiap

tahunnya. Kematian yang ditimbulkan akibat malaria mencapai 2 juta

pertahun yang terjadi terutama pada anak-anak dan ibu hamil (12). Di

Indonesia, di perkirakan sebanyak 2 orang dari 100.000 populasi mengalami

kematian akibat penyakit malaria. Hampir semua propinsi di Indonesia

mempunyai daerah endemis malaria, walaupun tingkat endemisitinya

berbeda-beda (13).

Gambar II.3 Daerah geografi penyebaran malaria di dunia (14)

2. Spesies Parasit Malaria

Penyebab malaria di indonesia sampai saat ini ada empat macam

plasmodium, yaitu : P. falciparum, P. vivax, P. malariae dan P. ovale.

Seorang penderita dapat ditulari oleh lebih dari satu jenis plasmodium yang

disebut infeksi campuran (mixed infection) misalnya infeksi oleh P.

falcifarum dengan P. vivax atau P. malariae. Infeksi campuran tiga jenis

parasit jarang terjadi. Dari keempat parasit tersebut, P. falciparum yang

sering menyebabkan malaria dengan gejala klinis berat sampai dapat

menimbulkan kematian (15).

Pada P. falciparum ukuran eritrosit terinfeksi normal, dan sering terdapat

lebih dari satu bentuk cincin didalam eritrosit. Bentuk tropozoit awal sering

terlihat di darah tepi, sedang skizon banyak terdapat di organ-organ dan otot,

jarang atau hanya sedikit dapat di temukan di darah tepi dan bentuknya

seperti topi dengan ukuran lebih kecil dari skizon P. vivax, dan mengandung

banyak merozoit. Didalam eritrosit kadang ada endapan sitoplasma yang

dinamakan titik-titik maurers merupakan bercak-bercak merah dengan

distribusi ireguler atau berbentuk celah-celah, ciri khas lain adalah pada

sitoplasma terdapat pseudopodia yang tampak pada lapisan darah. Parasit

malaria P. falciparum mengalami tiga perubahan morfologik yang berbeda

selama siklus 24 dan 72 jam dalam eritrosit manusia. Setelah invasi kedalam

eritrosit, parasit menjadi matur kedalam stadium cincin. Pertumbuhan

berikutnya kedalam stadium tropozoit yang di tandai oleh perubahan

morfologi dan biokimia pada membran plasma inang. Selanjutnya terjadi

maturasi parasit tropozoit kestadium skizon.

Gambar II.4 Stadium-stadium perkembangan P. falcifarum (16)

Daur hidup Plasmodium terdiri dari fase seksual eksogen (sporogoni) dalam

badan nyamuk Anopheles dan fase aseksual (skizogoni) dalam badan hospes

vertebrata.

a. Parasit dalam hospes vertebrata

1) Fase jaringan

Bila nyamuk Anopheles betina yang mengandung parasit malaria dalam

kelenjar liurnya menusuk hospes, sporozoit yang berada dalam air

liurnya masuk melalui probosis yang ditusukkan kedalam kulit.

Sporozoit segera masuk dalam peredaran darah dan setelah ½ jam

sampai 1 jam masuk kedalam sel hati. Sebagian sporozoid masuk ke sel

hati dan berkembang biak proses ini disebut skizogoni pra-eritrosit. Inti

parasit membelah diri berulang-ulang disertai oleh pembelahan

sitoplasma yang mengelilingi setiap inti sehingga terbentuk beribu-ribu

merozoit berinti satu. Pada akhir fase pra-eritrosit, skizon pecah,

merozoit keluar dan masuk di peredaran darah, sebagian besar

menyerang eritrosit yang berada di sinusoid hati tetapi beberapa

difagositosit. Pada P. vivax dan P. ovale sebagian sporozoit yang

menjadi hipnozoit setelah beberapa waktu (beberapa bulan sampai 5

tahun) menjadi aktif kembali dan mulai dengan skizogoni

eksoeritrositik sekunder.

2) Fase aseksual dalam darah

Waktu antara permulaan infeksi sampai parasit malaria ditemukan

dalam darah pertama kalinya karena jumlah parasit telah melewati

ambang mikroskopik disebut masa pra-paten, masa ini dapat dibedakan

dengan masa tunas atau masa inkubasi yang berhubungan dengan

timbulnya gejala klinis penyakit malaria. Masa tunas terbagi menjadi

dua yaitu masa tunas intrinsik dan masa tunas ekstrinsik. Masa tunas

intrinsik pada malaria adalah waktu antara sporozoit masuk dalam

tubuh hospes sampai timbul gejala demam biasanya berlangsung 8-37

hari. Masa tunas ekstrinsik adalah waktu antara nyamuk menghisap

darah yang mengandung gametosit sampai mengandung sporozoit

dalam kelenjar liurnya. Merozoid yang dilepaskan oleh skizon jaringan

mulai menyerang eritrosit. Stadium termuda dalam darah berbentuk

bulat, kecil; beberapa diantaranya mengandung vakuola. Stadium muda

ini disebut tropozoid. Kemudian parasit berkembang biak secara

aseksual melalui proses pembelahan yang disebut skizogoni. Inti parasit

membelah diri menjadi sejumlah inti yang lebih kecil, kemudian

dilanjutkan dengan pembelahan sitoplasma untuk membentuk skizon

skizon matang mengandung bentuk-bentuk bulat kecil, terdiri dari inti

dan sitoplasma yang disebut merozoid. Setelah skizogoni selesai,

eritrosit dan merozoid dilepaskan dalam aliran darah (sporulasi),

kemudian merozoid memasuki eritrosit baru dan generasi lain dibentuk

dengan cara yang sama. Pada daur eritrosit, skizogoni berlangsung

secara berulang-ulang selama infeksi dan menimbulkan parasitemia

yang meningkat dengan cepat sampai proses dihambat oleh imun

hospes.

3) Fase seksual dalam darah

Setelah 2 atau 3 generasi (3-15 hari) merozoid dibentuk, sebagian

merozoit tumbuh menjadi bentuk seksual. Proses ini disebut

gametogoni (gametogenesis). Bentuk seksual tumbuh tetapi intinya

tidak membelah. Gametosit mempunyai bentuk yang berbeda pada

berbagai spesies: pada P. falcifarum bentuknya seperti sabit atau pisang,

pada spesies lain bentuknya bulat.

b. Parasit dalam hospes invertebrata

1) Eksflagetasi

Bila nyamuk Anopheles betina menghisap darah hospes manusia yang

mengandung parasit malaria, parasit aseksual dicerna bersama dengan

eritrosit, tetapi gametosit dapat tumbuh terus. Inti pada mikrogametosit

membelah menjadi 4 sampai 8 yang masing-masing menjadi bentuk

panjang seperti benang (flagel) dengan ukuran 20-25 mikron, menonjol

keluar dari sel induk, bergerak-gerak sebentar dan kemudian

melepaskan diri. Flagel atau gamet jantan disebut mikrogamet;

makrogametosit mengalami proses pematangan (maturasi) dan menjadi

gamet betina atau makrogamet. Dalam lambung nyamuk mikrogamet

tertarik oleh makrogamet yang membentuk tonjolan kecil tempat masuk

mikrogamet sehingga pembuahan dapat berlangsung. Hasil pembuahan

disebut zigot.

2) Sporogoni

Pada permulaan, zigot merupakan bentuk bulat tidak bergerak, tetapi

dalam waktu 18-24 jam menjadi bentuk panjang dan dapat bergerak;

stadium seperti cacing ini berukuran panjang 8-24 mikron dan disebut

ookinet. Ookinet kemudian menembus dinding lambung melalui sel

epitel ke permukaan luar lambung dan menjadi bentuk bulat, disebut

ookista. Ookista makin lama makin besar dan kemudian pecah, ribuan

sporozoit dilepaskan dan bergerak dalam rongga badan nyamuk untuk

mencapai kelenjar liur, nyamuk betina sekarang menjadi infektif. Bila

nyamuk ini menghisap darah setelah menusuk kulit manusia, sporozoit

dimasukkan ke luka tusuk dan mencapai aliran darah hospes perantara.

Sporogoni yang dimulai dari pematangan gametoist sampai menjadi

sporozoit infektif, berlangsung selama 8 sampai 35 hari, bergantung

pada suhu luar dan spesies parasit (19).

Gambar II.5 siklus perkembangang P. falcifarum (18)

3. Strain D6 dan strain W2

Berdasarkan prosedur standar protokol dari WHO untuk menguji obat

antimalaria tehadap parasit malaria secara in vitro digunakan klon Sierra

Leone/D6 yang merupakan strain dari parasit malaria yang sensitif terhadap

klorokuin dan klon Indochina/W2 yang merupakan strain dari parasit malaria

yang resisten terhadap klorokuin. Selanjutnya kedua klon ini dikultur dalam

medium kultur jaringan dan digunakan secara teratur pada pengujian di

laboratorium malaria untuk penelitian antimalaria dengan menggunakan

berbagai metode (19).

F. Landasan Teori

1. Serbuk daun asam kandis diekstraksi secara berkesinambungan dengan

pelarut yang berbeda kepolarannya yaitu kloroform dan metanol dengan

tujuan untuk prefraksinasi awal.

2. Pada penelitian sebelumnya, ekstrak n-heksana, etil asetat dan n-butanol dari

kulit batang asam kandis mempunyai aktivitas antiplasmodium terhadap

strain FCR-3 dan 3D7.

3. Untuk menguji aktivitas antiplasmodium secara in vitro digunakan P.

falcifarum strain D6 (sensitif klorokuin) dan strain W2 (resisten klorokuin)

dengan metode mikroskopik dan metode SYBR Green I.

4. Ekstrak daun asam kandis mengandung senyawa xanton yang dapat berfungsi

sebagai anti malaria.

BAB III

RENCANA PENELITIAN

A. Prinsip Penelitian

Penelitian merupakan penelitian eksperimental secara in vitro, efek dari ekstrak

daun asam kandis (G. parvifolia (Miq)Miq) dilihat berdasarkan aktivitas

hambatan pertumbuhan dari P. falcifarum strain D6 (sensitif klorokuin) dan

strain W2 (resisten klorokuin) pada kultur.

B. Bahan Penelitian

Bahan Penelitian adalah daun asam kandis (G. parvifolia (Miq)Miq) yang

diperoleh dari Desa Nangkalis Kab. Kapuas Hulu, Kalimantan Barat di

determinasi di Herbarium Bogoriensis Botani, LIPI Bogor.

C. Tempat Penelitian

Penelitian dilakukan di Laboratorium Penelitian Skripsi Fakultas Farmasi

Universitas Pancasila dan di Laboratorium NAMRU-2 bagian Parasitic Diseases,

Program, Badan Litbang Kesehatan, Jakarta.

D. Prosedur Penelitian

1. Pengumpulan bahan

2. Pembuatan simplisa

3. Pembuatan ekstrak

4. Identifikasi ekstrak

5. Pembuatan kultur

6. Preparasi bahan uji

7. Uji aktivitas antiplasmodium

E. Analisis Data

Hasil yang diperoleh dalam penelitian dianalisis sebagai berikut :

1. Metode mikroskopik

Data ditampilkan dalam bentuk tabel % hambat pertumbuhan. Konsentrasi

penghambatan 50 % (IC50) ditetapkan dengan analisa probit berdasarkan

hubungan log konsentrasi dan nilai probit.

Angka parasitemia = Jumlah eritrosit yang terinfeksi parasit x 100% Jumlah eritrosit yang diamati

% Hambat = Kontrol – Angka parasitemia x 100% Kontrol

2. Metode SYBR Green I

Data ditampilkan dalam bentuk tabel log konsentrasi dan linieritas

fluoresensi. Konsentrasi penghambatan 50 % (IC50) didapatkan dengan

memasukkan data antara log konsentrasi dan linieritas fluoresensi ke dalam

program Microsoft Excel. Selanjutnya data dianalisis dengan regresi non

linier menggunakan Software Graphad Prism (San Diego, CA)

BAB IV

BAHAN, ALAT DAN METODE PENELITIAN

A. Bahan

1. Bahan utama penelitian

Ekstrak kloroform dan ekstrak metanol dari daun asam kandis (G. parvifolia

(Miq)Miq, biakan parasit P. falcifarum strain D6 (sensitif klorokuin) dan

strain W2 (resisten klorokuin).

2. Bahan pereaksi

a. CCM

RPMI 1640 (Gibco BRL, Cat.No:31800-014), HEPES (Sigma, Cat.

No:H-3375), Natrium bicarbonat, Gentamicin Sulphate Solution 50

mg/mL (Sigma, G-1522).

b. Uji aktivitas antiplasmodium

CCM, Natrium klorida 3,5 %, sorbitol 500 g (Sigma, Cat.No:5-3889),

Giemsa 10 % (merk, Cat.No:1.09204.0500), Methanol pro analysis

(Merk,Cat.No:1.06009.2500),Microscopy immersion oil (Merk,

Cat.No:1.04699.0500), Hypoxanthine (Sigma, Cat.No:H9377), Lysis

buffer, SYBR Green I stock solution (Molecular Probes Inc, Cat.No:S-

7563), sel darah manusia golongan O+, serum darah manusia golongan O+.

c. Identifikasi ekstrak

Ammoniak 30 %, kloroform, asam klorida pekat, serbuk magnesium, amil

alkohol, natrium hidroksida 1 N, besi (III) klorida 1%, natrium asetat,

eter, asam asetat anhidrat, asam sulfat pekat, petroleum eter, pereaksi

Dragendorff, pereaksi Mayer, pereaksi stiassny, pereaksi Liebermann-

Burchard, pereaksi semprot serium sulfat.

B. Alat

Saringan milipore 0,2µm (Nalgene disposable filterware, Cat.No:120-0020),

Water-bath (Fisher scientific, Cat.No:15-458-106), Candle jar (Pyrex), Inkubator

(NAPCO, Cat.No:G101FC1), Laminary Air Flow (Biogard Hood The Baker

Company, model:315, Type:A2,Class:II, Cat.No:BM18502) Cultur Flask /

Lempeng kultur (Corning Flask. Cat.No:430168), 96 Well cell Cultur Cluster /

mikroplate dengan 96 sumuran (Costar, Cat.No:3596), Screw capped conical

tubes 15 mL (Labcon, Cat.No:3131-345008), Mikro pipet (P20, P50,P100 µL)

(Gilson), yellow tip dan blue tip 20 µL, 50 µL, 100 µL (Hydrologix pipet tips,

Cat.No:3920), mikroskop (NICON Eclipse E400 dan NICON Eclipse E600),

gelas obyek (Diagger 4591, Cat.No:615978A), fluorescence plate reader (infinite

200), tissue culture disk, ukuran:60x15mm polystrene 20/slave (Corning,

Cat.No:steril 25010), disposable serological pipet 1mL, 2mL, 5mL, 10mL non

pyrogenic polystrene individually wrapped steril (Costar, Cat.No:4051), pipet

tetes (Brand, Cat.No:747720), tabung sterilisasi pipet tetes (Bellco, Cat.No:B38),

tabung effendorf, Lab count denominator, bejana kromatografi, lempeng KLT.

C. Metode penelitian

1. Identifikasi Ekstrak

a. Penapisan fitokimia terhadap ekstrak

1) Identifikasi golongan alkaloid

Sejumlah lebih kurang 40 mg ekstrak dilembabkan dengan 5 mL

ammonia 30 % dan digerus dalam mortir. Setelah itu ditambahkan 20

mL kloroform, gerus kembali dengan kuat, campuran tersebut

disaring dengan kertas saring. Filtrat berupa larutan organik diambil

(sebagai Larutan A). Sebagian larutan A (10 mL) diekstraksi dengan

asam klorida (1:10) dengan pengocokan dalam tabung reaksi,

kemudian ambil fase asam (larutan B). sebagian larutan A diteteskan

beberapa tetes pada kertas saring atau diteteskan dengan pereaksi

Dragendorff, terbentuk warna merah atau jingga menunjukkan adanya

alkaloid. Ke dalam dua tabung reaksi yang berisi 5 mL larutan B

ditambahkan beberapa tetes pereaksi Dragendorff terbentuk warna

jingga atau endapan putih dengan pereaksi Mayer, membuktikan

adanya alkaloid.

2) Identifikasi golongan flavonoid

Sejumlah lebih kurang 40 mg ekstrak ditambahkan dengan 100 mL air

panas, didihkan selama 5 menit, kemudian saring dengan kertas

saring, filtrat yang diperoleh akan digunakan sebagai larutan

percobaan. Sebanyak 5 mL larutan percobaan dimasukkan kedalam

tabung reaksi, kemudian ditambahkan serbuk atau lempeng

magnesium secukupnya dan 1 mL amil alkohol dikocok dengan kuat,

dibiarkan hingga memisah, akan terbentuk warna merah, kuning atau

jingga pada lapisan amil alkohol menunjukkan adanya senyawa

golongan flavonoid.

3) Identifikasi golongan saponin

Sejumlah lebih kurang 10 mL yang diperoleh dari percobaan (b)

diatas, dimasukkan kedalam tabung reaksi dan dikocok secara vertikal

selama 10 detik, jika dibiarkan selama 10 menit terbentuk busa yang

stabil dalam tabung reaksi menunjukkan adanya golongan saponin,

bila diteteskan 1 tetes asam klorida 1 % (encer) busa tetap stabil.

4) Identifikasi golongan tanin

Sejumlah lebih kurang 40 mg ekstrak ditmabahkan dengan 100 mL air

panas, di didihkan selama 1 menit, didinginkan dan disaring dengan

kertas saring dan filtrat dibagi menjadi dua bagian. Ke dalam filtrat

yang pertama ditambahkan larutan besi (III) klorida 1 %, terbentuk

warna biru tua atau hijau kehitaman menunjukkan adanya senyawa

golongan tannin. Ke dalam filtrat yang kedua jika ditambahkan 15 mL

peraksi stiassny (formaldehid 30 % - asam klorida pekat = 2 : 1),

dipanaskan diatas penangas air, terbentuk endapan warna merah muda

menunjukkan adanya tannin katekuat. Selanjutnya endapan disaring,

filtrate dijenuhkan dengan natrium asetat, ditambahkan beberapa tetes

larutan besi (III) klorida 1 % terbentuk warna biru tinta menunjukkan

adanya tannin galat.

5) Identifikasi golongan kuinon

Sejumlah lebih kurang 10 mL larutan percobaan yang diperoleh dari

percobaan (b), dimasukkan ke dalam tabung reaksi. Ditambahkan

beberapa tetes larutan natrium hidroksida 1 N, terbentuk warna merah

menunjukkan adanya senyawa golongan kuinon.

6) Identifikasi golongan steroid dan triterpenoid

Sejumlah lebih kurang 40 mg ekstrak dimaserasi dengan 20 mL eter

selama 2 jam (dalam wadah tertutup rapat), disaring dan diambil

filtratnya, 5 mL dari filtrat tersebut diuapkan dalam cawan penguap

hingga diperoleh residu atau sisa, ke dalam residu ditambahkan 2 tetes

asam asetat anhidrat dan 1 tetes asam sulfat pekat (pereaksi

Liebermann-Burchard), terbentuk warna hijau menunjukkan adanya

senyawa steroid dan warna merah menunjukkan adanya triterpenoid.

7) Identifikasi golongan minyak atsiri

Sejumlah lebih kurang 40 mg ekstrak ke dalam tabung reaksi,

ditambahkan 10 mL pelarut petroleum eter dan dipasangkan corong

gelas (yang diberi lapisan kapas yang telah dibasahi dengan air) pada

mulut tabung, dipanaskan selama 20 menit diatas penangas air

didinginkan, disaring dengan kertas saring, filtrat diuapkan pada

cawan penguap, residu berbau aromatis atau menyenangkan,

menunjukkan adanya senyawa golongan minyak atsiri.

8) Identifikasi golongan kumarin

Sejumlah lebih kurang 40 mg ekstrak dimasukkan ke dalam tabung

reaksi dengan 10 mL pelarut kloroform yang dipasang corong (diberi

lapisan kapas yang tekah dibasahi air) pada mulut tabung, selanjutnya

dilakukan pemanasan selama 10 menit diatas penangas air dan

didinginkan disaring dengan kertas saring, filtrat diuapkan pada

cawan penguap sampai kering, sisa ditambah air panas. Sebanyak 10

mL filtrat didinginkan,larutan dimasukkan ke dalam tabung reaksi,

ditambahkan 0,5 mL larutan ammonia 10 %, diamati di bawah sinar

lampu ultraviolet pada panjang gelombang 366 nm, maka tejadi

fluoresensi warna biru atau hijau menunjukkan adanya golongan

kumarin.

b. Analisa dengan Kromatografi Lapis Tipis (KLT)

Ekstrak yang diperoleh dianalisa menggunakan kromatografi lapis tipis,

dengan menotolkan 10 µL sampel pada lempeng silika gel GF254

kemudian dieluasi. Cairan eluasi untuk ekstrak kloroform adalah n-

heksana : etil asetat = 3 : 2 dan untuk ekstrak metanol adalah kloroform :

etil asetat = 2 : 3. Bercak yang didapat diamati pada sinar biasa, UV 254

nm, dan 366 nm. Kemudian disemprot dengan pereaksi semprot serium

sulfat, Liebermann-Burchardatt, dan uap amoniak. Bercak diamati pada

sinar biasa, UV 254 nm, dan 366 nm.

2. Pembuatan kultur P. falcifarum

Prosedur penelitian berdasarkan Standard Operating Procedure Cultivation Of

Plasmodium falciparum In Vitro (22) dan Malaria SYBR Green I-Based

Fluorescence (MSF) Assay Protocol dari U.S. NAMRU-2 (23).

a. Thawing P. falcifarum

Ampul yang mengandung strain P. falcifarum diambil dari tabung

nitrogen, dicairkan pada water bath 37o C selama beberapa menit. Isi

ampul dipindahkan ke conical tube, ditambahkan larutan natrium klorida

3,5 %. Larutan dipindahkan ke dalam tabung sentrifugasi dan

disentrifugasi dengan kecepatan 1500 rotasi per menit selama 7 menit.

Supernatan di buang. Ditambahkan 0,15 mL CCM dan disentrifugasi

dengan kecepatan 1500 rotasi per menit selama 7 menit, dihilangkan

supernatan. Kemudian tambahkan CCM dan sel darah merah yang tidak

terinfeksi. Tiap 1 mL suspensi di tambah 5 mL CCM dan dipindahkan 2

mL larutan suspensi kedalam lempeng kultur.

b. Pembuatan kultur P. falcifarum

P. falcifarum dibiakan dengan metode candle jar (Trager dan Jensen,

1976). Sel darah merah yang terinfeksi parasit dibiakan dalam lempeng

kultur yang mengandung 4 mL CCM. Kultur tersebut dilakukan di dalam

LAF dalam kondisi steril, kemudian di inkubasi di dalam inkubator pada

temperatur 37o C.

c. Mempertahankan kultur

Pergantian medium untuk mempertahankan kultur dilakukan tiap 24 jam

dan dilakukan di dalam LAF dalam kondisi steril. Lempeng kultur di

ambil dari dalam inkubator dan dimasukkan kedalam LAF. Medium lama

dibuang dengan menggunakan pipet tetes steril tanpa mengambil sel

darah merah yang terinfeksi. Kemudian dengan menggunakan pipet steril

tambahkan 3,5 mL – 4 mL medium baru kedalam tiap-tiap lempeng

kultur, kemudian homogenkan. Lempeng kultur dimasukkan ke dalam

candle jar kemudian dimasukkan ke dalam inkubator suhu 37o C. Apabila

angka parasitemia mencapai 6 - 8% maka kultur siap untuk di panen,

selanjutnya mengikuti prosedur 4.

3. Preparasi bahan uji

Bahan uji (ekstrak daun asam kandis) sebanyak 5 mg dilarutkan dengan

etanol sebanyak 3 mL sebagai larutan stock. Larutan stock ini kemudian di

encerkan dengan RPMI 1640 sehingga didapatkan satu seri konsentrasi

larutan uji 4, 20, 100, 200, dan 400 µg/mL.

4. Sinkronisasi

Untuk uji aktivitas antiplasmodium, parasit yang dipakai adalah stadium ring.

Untuk proses sikronisasi, dipindahkan sel darah merah yang terinfeksi

kedalam tabung sentrifugasi dan di sentrifugasi dengan kecepatan 1500-2000

putaran per menit selama 10 menit, supernatant dibuang. Larutan sorbitol 5 %

ditambahkan ke dalam endapan parasit, dihomogenkan dan didiamkan selama

5 menit. Kemudian disentrifugasi dengan kecepatan 1500-2000 putaran per

menit selama 10 menit, supernatan dibuang. Kemudian CCM ditambahkan

untuk membuat suspensi parasit sehingga endapan parasit yang hanya terdiri

dari stadium ring akan di peroleh. Parasit dikembalikan kedalam lempeng

kultur dan di inkubasi pada suhu 37o C selama 48 jam.

5. Uji aktivitas antiplasmodium

Mikrokultur yang digunakan mempunyai 96 sumuran. Pada kolom pertama

dimasukkan RPMI 1640 sebanyak 12,5 µL, pada kolom dua sampai enam

dimasukkan 12,5 µL ekstrak kloroform dan kolom tujuh sampai sebelas

dimasukkan 12,5 µL ekstrak metanol dari konsentrasi rendah ke konsentrasi

tinggi. Masing- masing sumuran diisi dengan 100 µL kultur. Mikrokultur

kemudian diletakkan candle jar. Agar terdapat konsentrasi gas optimal,

candle jar ditutup rapat pada sewaktu nyala lilin di dalamnya akan mati,

kemudian diinkubasi dalam inkubator pada temperatur 37o C selama 48 jam.

Lempeng sumur mikro dikeluarkan, untuk metode mikroskop, suspensi

bagian atas dibuang. Suspensi yang pekat dibuat sediaan apusan darah tebal

dengan cara suspensi pekat dipipet kemudian diteteskan pada objek glass,

apusan yang terbentuk dikeringkan selama 5-10 menit. Setelah kering

ditambahkan pewarna giemsa 10 % pada apusan darah dan dibiarkan 15 - 20

menit, selanjutnya giemsa dicuci dengan air mengalir dan dikeringkan.

Apusan yang terbentuk dapat dilihat pada mikroskop (perbesaran 100 kali)

dengan menambahkan minyak emersi kemudian dihitung sel darah merah

yang terinfeksi P. falcifarum setiap 200 sel darah merah dan dihitung angka

% parasitemia. Untuk metode SYBR Green I, 100 µL lisis buffer yang berisi

SYBR Green I dimasukkan pada tiap-tiap sumuran. Lempeng sumur mikro

diinkubasi dalam kondisi gelap selama 1 jam dan dibaca pada alat fluoresence

plate reader.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

A

B

C

D

E

F

G

H

Gambar IV.1. gambaran lempeng sumur mikro uji aktivitas antiplasmodium

Keterangan :

= RPMI 1640

= diisi dengan berbagai konsentrasi (fase kloroform)

= diisi dengan berbagai konsentrasi (fase metanol)

A-B = Strain D6

C-D = Strain W2

BAB V HASIL PENELITIAN DAN PEMBAHASAN

1. Identifikasi Ekstrak

a. Penapisan fitokimia

Tabel V.1 senyawa-senyawa yang terkandung dalam ekstrak kloroform dan ekstrak metanol daun asam kandis.

Senyawa kimia Ekstrak klorofom Ekstrak metanol

Alkaloid - - Flavonoid + + Saponin - + Tanin - -

Kuinon - + Steroid/triterpenoid + +

Minyak atsiri - - Kumarin + +

Keterangan : + : terdapat senyawa dalam ekstrak - : tidak terdapat senyawa dalam ekstrak

Tabel V.1 menunjukkan hasil penapisan fitokimia. Pada ekstrak

kloroform diperoleh senyawa flavonoid, steroid/triterpenoid, dan

kumarin. Sedangkan pada ekstrak metanol diperoleh senyawa

flavonoid, saponin, kuinon, steroid/triterpenoid dan kumarin.

b. Analisis dengan Kromatografi Lapis Tipis (KLT)

Hasil analisis dengan KLT pada ekstrak kloroform dan ekstrak

metanol daun asam kandis (G. parvifolia (Miq)Miq)

1) Ekstrak kloroform

Gambar V.1 Profil bercak KLT pada ekstrak kloroform Keterangan : fase diam :

Pada Gambar V.1 dapat dilihat terdapat

kloroform jika dilihat dari sinar biasa. Pada sinar UV 245 nm

terdapat 6 bercak, sedangkan pada UV 366 nm terdapat

Ekstrak kloroform

(A) (B)

(D) (E) (F)

Gambar V.1 Profil bercak KLT pada ekstrak kloroform Keterangan : fase diam : silika gel

fase gerak : n-heksana : etil asetat = 3 : 2 (A) : KLT pada sinar biasa (B) : KLT pada sinar UV 254 nm (C) : KLT pada sinar UV 366 nm (D) : Pola bercak KLT pada sinar biasa(E) : Pola bercak KLT pada sinar UV 254 nm(F) : Pola bercak KLT pada sinar UV 366 nm

Pada Gambar V.1 dapat dilihat terdapat 5 bercak pada ekstrak


terdapat 6 bercak, sedangkan pada UV 366 nm terdapat

(B) (C)

(D) (E) (F)

: Pola bercak KLT pada sinar biasa : Pola bercak KLT pada sinar UV 254 nm Pola bercak KLT pada sinar UV 366 nm

bercak pada ekstrak


terdapat 6 bercak, sedangkan pada UV 366 nm terdapat 6 bercak.

Gambar V.2 PKeterangan : fase diam

Pada gambar V.2 dapat dilihat terdapat 5

kecokelatan dilihat dari sinar biasa, pada sinar UV 254 terdapat

bercak berwarna kuning sedangkan pada sinar UV 366 nm terdapat

(A) (B)

(D) (E) (F)

Gambar V.2 Profil bercak KLT ekstrak kloroform diuapi dengan uap amoniakKeterangan : fase diam : silika gel

fase gerak : n-heksana : etil asetat = 3 : 2 (A) : KLT pada sinar biasa (B) : KLT pada sinar UV 254 nm (C) : KLT pada sinar UV 366 nm

(D) : Pola bercak KLT pada sinar biasa(E) :Pola bercak KLT pada sinar UV 254 nm(F) : Pola bercak KLT pada sinar UV 366 nm

Pada gambar V.2 dapat dilihat terdapat 5 bercak

kecokelatan dilihat dari sinar biasa, pada sinar UV 254 terdapat


(C)

(D) (E) (F)

rofil bercak KLT ekstrak kloroform diuapi dengan uap amoniak

: Pola bercak KLT pada sinar biasa (E) :Pola bercak KLT pada sinar UV 254 nm (F) : Pola bercak KLT pada sinar UV 366 nm

bercak berwarna kuning

kecokelatan dilihat dari sinar biasa, pada sinar UV 254 terdapat 6


6 bercak

panah) yang merupakan senyawa flavonoid.

Gambar V.3. Profil bercak KLT ekstrak kloroform dengan pereaksi

Keterangan : fase diam : silika gel

Pada

Liebermann

bercak, dimana bercak kuning kehijauan ( ditunjukkan oleh

panah) yang merupakan senyawa flavonoid.

(A) (B)

(D) (E) (F)

Gambar V.3. Profil bercak KLT ekstrak kloroform dengan pereaksi Liebermann-Burchard.

Keterangan : fase diam : silika gel fase gerak : n-heksana : etil asetat = 3 : 2

(A) : KLT pada sinar biasa (B) : KLT pada sinar UV 254 nm (C) : KLT pada sinar UV 366 nm

(D) : Pola bercak KLT pada sinar biasa (E : Pola bercak KLT pada sinar UV 254 nm (F) : Pola bercak KLT pada sinar UV 36

Pada gambar V.3 lempeng KLT setelah disemprot dengan pereaksi

Liebermann-burchard dan dipanaskan di oven suhu 100

( ditunjukkan oleh

(C)

(D) (E) (F)

Gambar V.3. Profil bercak KLT ekstrak kloroform dengan pereaksi

(D) : Pola bercak KLT pada sinar biasa (E : Pola bercak KLT pada sinar UV 254 nm (F) : Pola bercak KLT pada sinar UV 366 nm

gambar V.3 lempeng KLT setelah disemprot dengan pereaksi

burchard dan dipanaskan di oven suhu 100oC selama

10 menit membuat

pada sinar UV 254 nm bercak tidak dapat terlihat dengan jelas

dimana titik

semprotnya, sedangkan pada sinar UV 366 nm

adanya bercak warna biru muda (ditunjukkan oleh panah)

merupakan senyawa ste

Gambar V.4 Profil bercak KLT ekstrak kloroform dengan pereaksi serium sulfatKeterangan : fase diam : silika gel

10 menit membuat 4 bercak menjadi warna coklat


dimana titik-titik ungu merupakan warna dari pereaksi

semprotnya, sedangkan pada sinar UV 366 nm


merupakan senyawa steroid-triterpenoid.

(A) (B) (C)

(D) (E) (F)

Gambar V.4 Profil bercak KLT ekstrak kloroform dengan pereaksi serium sulfatKeterangan : fase diam : silika gel

fase gerak : n-heksana : etil asetat = 3 : 2 (A) : KLT pada sinar biasa (B) : KLT pada sinar UV 254 nm

(C) : KLT pada sinar UV 366 nm (D) : Pola bercak KLT pada sinar biasa(E) : Pola bercak KLT pada sinar UV 254 nm(F) : Pola bercak KLT pada sinar UV 366 nm

bercak menjadi warna coklat pada sinar biasa,


titik ungu merupakan warna dari pereaksi

semprotnya, sedangkan pada sinar UV 366 nm terdapat 5 bercak,


(B) (C)

(D) (E) (F)

Gambar V.4 Profil bercak KLT ekstrak kloroform dengan pereaksi serium sulfat

(D) : Pola bercak KLT pada sinar biasa (E) : Pola bercak KLT pada sinar UV 254 nm (F) : Pola bercak KLT pada sinar UV 366 nm

Pada gambar V.4 lempeng KLT setelah disemprot dengan pereaksi

serium sulfat dan dipanaskan di oven suhu 100oC selama 10 menit

terlihat 4 bercak berwarna abu-abu pada sinar biasa(ditunjukkan

oleh panah), pada sinar UV 254 nm bercak tidak dapat terlihat

dengan jelas dimana titik-titik ungu merupakan warna dari

pereaksi semprotnya, sedangkan pada sinar UV 366 nm terdapat 1

bercak yang berwarna kuning kehijauan (ditunjukkan oleh panah)

merupakan senyawa flavonoid.

2) Ekstrak metanol

(A) (B) (C)

(D) (E) (F) Gambar V.5 profil bercak KLT ekstrak metanol Keterangan : fase diam : silika gel

fase gerak : kloroform : etil asetat = 2 : 3 (A) : KLT pada sinar biasa (B) : KLT pada sinar UV 254 nm (C) : KLT pada sinar UV 366 nm


Dari gambar V.5 tidak terlihatnya bercak pada sinar biasa dan

sinar UV 254 nm, sedangkan terdapat 1 bercak tipis berwarna

kuning kehijauan (ditunjukkan oleh panah) terlihat pada sinar UV

366 nm.

(A) (B) (C)

(D) (E) (F) Gambar V.6 profil bercak KLT ekstrak metanol diuapi dengan uap amoniak Keterangan : fase diam : silika gel



Dari gambar V.6 tidak didapatkan bercak jika dilihat dari sinar

biasa dan sinar UV 254 nm, sedangkan terlihat 1 bercak tipis

berwarna kuning kehijauan (ditunjukkan oleh panah) yang


(A) (B) (C)

(D) (E) (F) Gambar V.7 Profil bercak KLT ekstrak metanol dengan pereaksi Liebermann-

Burchard. Keterangan : fase diam : silika gel


(D) : Pola bercak KLT pada sinar biasa (E) : Pola bercak KLT sinar UV 254 nm (F) : Pola bercak KLT sinar UV 366 nm

Dari gambar V.7 lempeng KLT setelah disemprot dengan pereaksi

Liebermann-burchard dan dipanaskan di oven suhu 100oC selama

10 menit tidak terdapat bercak pada sinar biasa. Pada sinar UV 254

nm tidak terlihatnya bercak dan titik-titik ungu merupakan warna

dari pereaksi semprotnya. Pada sinar UV 366 nm terdapat 1 bercak

tipis berwarna biru (ditunjukkan oleh panah) yang merupakan

senyawa steroid/triterpenoid.

(A) (B) (C)

(D) (E) (F) Gambar V.8 profil bercak KLT ekstrak metanol dengan pereaksi serium sulfat Keterangan : fase diam : silika gel



Dari gambar V.8 lempeng KLT setelah disemprot dengan pereaksi

serium sulfat dan dipanaskan di oven suhu 100oC selama 10 menit

tidak terdapat bercak pada sinar biasa. Pada sinar UV 254 nm tidak

terlihatnya bercak dan titik-titik ungu merupakan warna dari

pereaksi semprotnya, sedangkan pada sinar UV 366 nm adanya 1

bercak tipis warna kuning kehijauan (ditunjukkan oleh panah)


2. Pengujian aktivitas antiplasmodium

Hasil pengamatan terhadap aktivitas penghambatan pertumbuhan parasit

P. falcifarum strain D6 dan strain W2 secara in vitro dari berbagai ekstrak

daun asam kandis dengan metode mikroskopik dan metode SYBR Green

I.

a. Metode Mikroskopik

1) Ekstrak kloroform dan ekstrak metanol strain D6 ( Sensitif

Klorokuin)

Tabel V.2 Hambatan pertumbuhan P. falcifarum strain D6 (%) dari ekstrak kloroform dan ekstrak metanol daun asam kandis (G. parvifolia (Miq)Miq pada berbagai konsentrasi.

Konsentrasi ekstrak (µg/mL)

% hambat pertumbuhan

Ekstrak kloroform Ekstrak metanol

4 -42,93 14,04

20 36,48 10,49

100 73,55 85,45

200 88,95 93,37

400 96,50 97,88

Pada tabel V.2 dihitung % hambat pertumbuhan P. falcifarum

strain D6 dari berbagai konsentrasi ekstrak kloroform dan ekstrak

metanol, terlihat pada ekstrak kloroform semakin tinggi

konsentrasi maka semakin tinggi nilai % hambat pertumbuhan P.

falcifarum. Sedangkan pada ekstrak metanol terlihat terjadi

penurunan % hambat pertumbuhan pada konsentrasi 20 µg/mL

dan kemudian pada konsentrasi berikutnya akan mengalami

peningkatan. Nilai negatif pada ekstrak kloroform pada

konsentrasi 4 µg/mL menunjukkan bahwa tidak terjadi hambatan

pertumbuhan P. falcifarum.


probit Untuk memperoleh nilai IC50 dibuat terlebih dahulu kurva

persamaan garis regresi linier (Gambar V.9). Berdasarkan

persamaan garis linier tersebut didapat nilai IC50 dari ekstrak

kloroform daun asam kandis sebesar 33,17 µg/mL dan dari

ekstrak metanol sebesar 32,44 µg/mL.

y = 2,2119 + 1,8333 x

-6-4

-2

02

4

6

810

0 1 2 3

pro

bit

log konsentrasi

ekstrak kloroform

ekstrak metanol

(RPMI 1640) (konsentrasi 4 µg/mL)

(konsentrasi 20 µg/mL) (konsentrasi 100 µg/mL)


Gambar V.10 P. falcifarum Strain D6 (sensitif) ekstrak kloroform daun asam kandis (G. parvifolia. (Miq)Miq) dalam sel darah merah pada berbagai konsentrasi

Pada gambar V.10. menunjukkan perkembangan P. falcifarum

strain D6 dibandingan dengan kontrol negatif (RPMI 1640),

terlihat semakin tinggi konsentrasi dari ekstrak kloroform maka

perkembangan hidup P. falcifarum semakin berkurang. Daerah

yang ditunjukkan oleh tanda panah merupakan sel darah merah

yang terinfeksi oleh P. falcifarum.


(konsentrasi 20µg/mL) (konsentrasi 100 µg/mL)


Gambar V.11 P. falcifarum strain D6 (sensitif) ekstrak metanol daun asam kandis (G. parvifolia (Miq)Miq) dalam sel darah merah pada berbagai konsentrasi

Dari gambar V.11 menunjukkan perkembangan P. falcifarum

strain D6 dan dibandingan dengan kontrol negatif (RPMI 1640),

terlihat semakin tinggi konsentrasi dari ekstrak metanol maka

perkembangan hidup P. falcifarum semakin berkurang. Daerah

yang ditunjukan oleh panah merupakan sel darah merah yang

terinfeksi P.falcifarum.

2) Ekstrak kloroform dan ekstrak metanol Strain W2 ( Resistensi Klorokuin) Tabel V.3 Hambatan pertumbuhan P. falciparum strain W2 (%) dari ekstrak

kloroform dan ekstrak metanol daun asam kandis (G. parvifolia. (Miq)Miq) pada berbagai konsentrasi.

Konsentrasi ekstrak (µg/mL)

% hambat pertumbuhan

Ekstrak kloroform Ekstrak metanol

4 -27,98 7,97

20 69,32 -8,84

100 82,87 60,66

200 83,50 90,34

400 92,66 91,28

Pada tabel V.3 dihitung % hambat pertumbuhan P. falcifarum

strain W2 dari berbagai konsentrasi ekstrak kloroform dan ekstrak

metanol, terlihat pada ekstrak kloroform semakin tinggi

konsentrasi maka semakin tinggi nilai % hambat pertumbuhan P.

falcifarum. Sedangkan pada ekstrak metanol terlihat terjadi

penurunan % hambat pertumbuhan pada konsentrasi 20 µg/mL dan

kemudian pada konsentrasi berikutnya akan mengalami

peningkatan. Nilai negatif pada ekstrak kloroform pada

konsentrasi 4 µg/mL dan ekstrak metanol pada konsentrasi 20

µg/mL menunjukkan bahwa tidak terjadi hambatan pertumbuhan

P. falcifarum.

Gambar V.12 kurva persamaan garis regresi linier antara log konsentrasi dan

probit Untuk dapat memperoleh nilai IC50 dibuat terlebih dahulu kurva

persamaan garis regresi linier (gambar V.12). Berdasarkan

persamaan garis linier tersebut didapat nilai IC50 dari ekstrak

kloroform daun asam kandis sebesar 0,55 µg/mL dan dari ekstrak

metanol sebesar 41,23 µg/mL.

-6

-4

-2

0

2

4

6

8

10

0 1 2 3

pro

bit

log konsentrasi

ekstrak kloroform

ekstrak metanol




Gambar V.13 P. falcifarum Strain W2 (resisten) ekstrak kloroform daun asam kandis (G. parvifolia (Miq)Miq) dalam sel daram merah pada berbagai konsentrasi


strain W2 pada berbagai konsentrasi dan dibandingan dengan

kontrol negatif (RPMI 1640), terlihat semakin tinggi konsentrasi

dari ekstrak kloroform maka perkembangan hidup P. falcifarum

semakin berkurang. Daerah yang ditunjukan oleh panah

merupakan sel darah merah yang terinfeksi P. falcifarum.




Gambar V.14 .P. falcifarum strain W2 (resisten) ekstrak metanol daun asam kandis (G. parvifolia. (Miq)Miq) dalam sel darah merah pada berbagai konsentrasi


strain W2 pada berbagai konsentrasi dan dibandingan dengan

kontrol negatif (RPMI 1640), terlihat semakin tinggi konsentrasi

dari ekstrak metanol maka perkembangan hidup P. falcifarum

semakin berkurang. Daerah yang ditunjukan oleh panah

merupakan sel darah merah yang terinfeksi P.falcifarum.

3) Kontrol Positif ( Klorokuin) Tabel V.4 Hambatan pertumbuhan P. falciparum strain D6 dan strain W2 (%)

dari klorokuin pada berbagai konsentrasi Konsentrasi

(ng/mL) % hambat pertumbuhan

strain D6 strain W2

6,25 19,19 -5,78

12,5 32,57 25,91

25 68,04 -49,68

50 88,63 37,04

100 98,19 23,55

200 98,19 40,26

400 96,34 -8,56

800 93,29 38,33

1600 99,04 64,45

Pada tabel V.4 dihitung nilai % hambat pertumbuhan P.

falcifarum strain D6 dari berbagai konsentrasi klorokuin, terlihat

pada konsentrasi 400 ng/mL dan 800 ng/mL mengalami

penurunan % hambat, pada konsentrasi berikutnya akan

mengalami peningkatan. Pada strain W2 terlihat pada konsentrasi

25 ng/mL, 100 ng/mL, 400 ng/mL mengalami penurunan %

hambat. Nilai negatif pada strain W2 menunjukkan bahwa tidak

terjadi hambatan pertumbuhan P. falcifarum.


probit

-6

-4

-2

0

2

4

6

8

10

0 1 2 3 4

pro

bit

log konsentrasi

strain D6

strain W2

Terlihat kurva hubungan antara log konsentrasi dan nilai probit

dari klorokuin. Pada strain D6 terlihat kurva nilai probit

menunjukkan peningkatan aktivitas dengan meningkatnya

konsentrasi, sedangkan pada strain W2 terlihat kurva nilai probit

mengalami penurunan aktivitas dengan meningkatnya konsentrasi.

b. Metode SYBR Green I 1) Ekstrak kloroform

Tabel V.5 Nilai linieritas fluoresensi pada P. falcifarum dari ekstrak kloroform daun asam kandis (G. parvifolia (Miq)Miq) pada berbagai konsentrasi

Konsentrasi (µg/mL)

Log konsentrasi

Linearitas fluoresensi

D6 (I) D6 (II) W2 (I) W2 (II)

4 0,6020 23265 21880 29580 29722

20 1,3010 14450 12848 7313 7343

100 2 9636 9531 6750 6653

200 2,3010 9091 9099 5868 5754

400 2,6020 8379 9790 5124 5286

Pada tabel V.5 menunjukkan semakin meningkat konsentrasi ekstrak

kloroform daun asam kandis maka semakin rendah nilai linieritas

fluoresensi.

2) Ekstrak metanol

Tabel V.6. Nilai linearitas fluoresensi pada P. falcifarum dari ekstrak metanol daun asam kandis (G. parvifolia. (Miq)Miq ) pada berbagai konsentrasi

Konsentrasi (µg/mL)

Log konsentrasi

Linearitas fluoresensi

D6 (I) D6 (II) W2 (I) W2 (II)

4 0,6020 32822 31574 34271 33555

20 1,3010 26422 26079 32396 29937

100 2 12504 11556 7992 7401

200 2,3010 10208 9954 6481 6234

400 2,6020 9593 8895 5933 6270

Pada tabel V.6 menunjukkan semakin meningkat konsentrasi ekstrak

metanol daun asam kandis maka semakin rendah nilai linieritas

fluoresensi.

c. Kontrol positif (Klorokuin) Tabel V.7 Nilai fluoresensi pada P falcifarum dari klorokuin pada berbagai

konsentrasi Konsentrasi

(µg/mL) Log konsentrasi Linearitas fluoresensi

D6 (I) D6 (II) W2 (I) W2 (II)

6,25 0,7958 38189 36948 35634 35206

12,5 1,0969 37309 39701 34410 34904

25 1,3979 30834 33016 34509 33883

50 1,6989 11501 11486 35111 34337

100 2 11279 11229 34625 33464

200 2,3010 10806 11337 30933 28716

400 2,6020 10782 11309 10009 10714

800 2,9030 10804 11339 8599 8534

1600 3,2041 11759 11424 8886 8842

Pada tabel V.7 menunjukkan semakin meningkat konsentrasi

klorokuin maka semakin rendah nilai linieritas fluoresensi.

Tabel V.8 Nilai IC50 dari tiap ekstrak daun asam kandis (G. parvifolia. (Miq)Miq)

Ekstrak

Nilai IC50 pada Metode mikroskopik

Nilai IC50 pada metode SYBR Green

strain D6 strain W2 strain D6 strain W2

Ekstrak Kloroform

33,17 µg/mL 0,55 µg/mL 14,29 µg/mL 0,214 µg/mL

Ekstrak Metanol

32,44 µg/mL 41,23 µg/mL 48,00 µg/mL 56,37 µg/mL

Klorokuin 12,48 ng/mL 1083,9 ng/mL 25,62 ng/mL 227,60 ng/mL

Uji efek antiplasmodium secara in vitro dengan menggunakan

kultur P. falcifarum dapat digunakan sebagai uji pendahuluan untuk

mengevaluasi bahan alam hayati yang prospektif sebagai

antiplasmodium. Penelitian dilakukan pada ekstrak kloroform dan

ekstrak metanol dari daun asam kandis dimana ekstrak kloroform

bersifat semi polar sehingga dapat menarik senyawa-senyawa semi

polar, ekstrak metanol bersifat polar yang dapat menarik senyawa

polar. Penelitian dilakukan terhadap P. falcifarum strain D6 (sensitif

klorokuin) dan strain W2 (resisten klorokuin) dimana kedua strain ini

telah ditetapkan oleh W.H.O sebagai standar strain P. falcifarum yang

digunakan untuk menguji kesensitifan suatu obat atau bahan alam

sebagai antimalaria. Pengujian aktivitas antiplasmodium

menggunakan 2 metode yaitu metode mikroskopik dan metode SYBR

Green I. Penggunaan 2 metode ini bertujuan untuk mengetahui nilai

IC50 dimana metode mikroskopik merupakan metode utama dalam

mendiagnosa malaria dan metode SYBR Green I merupakan metode

alternatif untuk menentukan perkembangan parasit secara in vitro.

Selanjutnya aktivitas antiplasmodium dinyatakan dalam dengan IC50

yaitu yaitu kadar senyawa uji yang mampu menghambat pertumbuhan

parasit sampai 50 %. Berdasarkan penggolongan menurut Gessler et

al,(1994), penggolongan senyawa bahan alam berdasarkan aktivitas

antiplasmodium dikelompokan menjadi 3 kategori antara lain sangat

kuat yaitu tanaman dengan nilai IC50 < 10 µg/mL, kuat yaitu tanaman

dengan nilai IC50 10-50 µg/mL, lemah yaitu tanaman dengan nilai

IC50 > 50 µg/mL.

Sebelum melakukan uji aktivitas antiplasmodium, dilakukan

identifikasi ekstrak daun asam kandis dengan penapisan fitokimia dan

KLT untuk mengetahui senyawa-senyawa yang terkandung dalam

ekstrak kloroform dan ekstrak metanol daun asam kandis. Profil

kromatogram KLT dari ekstrak kloroform menunjukkan adanya

senyawa flavonoid dan steroid/triterpenoid, sedangkan dari ekstrak

metanol menunjukkan adanya senyawa flavonoid dan

steroid/triterpenoid. Hal ini didukung dengan identifikasi KLT

menggunakan uap amoniak yang menyebabkan adanya bercak

berwarna kuning kehijauan yang merupakan senyawa flavonoid,

dengan menggunakan pereaksi semprot Liebermann–burchard yang

menyebabkan adanya bercak berwarna biru muda yang merupakan

senyawa steroid/triterpenoid dan menggunakan pereaksi semprot

serium sulfat yang menyebabkan adanya bercak berwarna kuning

kehijauan yang merupakan senyawa polifenol. Profil KLT ini juga

didukung dengan hasil penapisan fitokimia berdasarkan metode

Fransworth yang diperoleh senyawa flavonoid, steroid/triterpenoid

pada ekstrak kloroform dan diperoleh senyawa flavonoid,

steroid/triterpenoid, saponin, kumarin, dan kuinon pada ekstrak

metanol.

Pengujian aktivitas antiplasmodium daun asam kandis dengan

metode mikroskopik didapatkan nilai IC50 dari ekstrak kloroform

strain D6 adalah 33,17 µg/mL dan strain W2 adalah 0,55 µg/mL.

Sedangkan nilai IC50 dari ekstrak metanol strain D6 adalah 32,44

µg/mL dan strain W2 adalah 41,23 µg/mL. Berdasarkan

penggolongan menurut Gessler et al, (1994), menunjukkan bahwa

ekstrak kloroform strain D6 menunjukkan aktivitas antiplasmodium

kuat dan strain W2 menunjukkan aktivitas antiplasmodium sangat

kuat. Sedangkan ekstrak metanol strain D6 dan strain W2

menunjukkan aktivitas antiplasmodium kuat. Nilai IC50 pada ekstrak

kloroform strain W2 menunjukkan aktivitas antiplasmodium lebih

baik dibandingkan dengan strain D6, hal ini menunjukkan ekstrak

kloroform mempunyai mekanisme kerja yang berbeda yang

menyebabkan ekstrak kloroform lebih sensitif pada strain W2. Tetapi

apabila dibandingkan dengan kontrol positif (klorokuin), ekstrak

kloroform dan ekstrak metanol mempunyai aktivitas antiplasmodium

yang lebih lemah. Hal ini di sebabkan kandungan senyawa dari

klorokuin sudah merupakan bentuk senyawa murni, sedangkan pada

ekstrak kloroform dan ekstrak metanol masih banyak terdapat

campuran senyawa kimia.

Hasil pengujian dari metode SYBR Green I diperoleh nilai

linearitas fluoresensi dari ekstrak kloroform dan ekstrak metanol yang

menunjukkan nilai linieritas fluoresensi dari ke dua ekstrak tersebut

mengalami penurunan dengan semakin meningkatnya konsentrasi.

Hal ini disebabkan karena pada konsentrasi yang tinggi, jumlah

parasit hidup semakin sedikit, dimana prinsip kerja dari metode

SYBR Green I ini adalah berikatan dengan DNA parasit yang masih

hidup dan memberikan fluoresensi berwarna hijau pada DNA parasit.

Pada tabel V.8 terlihat bahwa metode mikroskopik memberikan

hasil IC50 yang berbeda dibandingkan dengan nilai IC50 pada metode

SYBR Green I. meskipun metode SYBR Green I memiliki banyak

keuntungan seperi praktis, memberikan hasil yang cepat,analisa nya

otomatis dan tidak berbahaya tetapi tetapi apabila sampel kurang

homogen maka nilai fluoresensi tidak dapat terbaca dan apabila

kepadatan plasmodium terlalu padat dapat menyebabkan SYBR Green

I tidak dapat mengikat sempurna dengan DNA parasit. Sedangkan

metode mikroskopik merupakan metode utama dalam mendiagnosa

malaria, metode ini sensitif dan spesifik. Mikroskopik dapat

menghitung jumlah parasit dan juga dapat menentukan jenis

Plasmodium malarianya. Cara ini memerlukan keahlian teknik,

kemampuan yang terlatih dalam membaca sediaan malaria,

memerlukan mikroskop yang berfungsi dengan baik tetapi

membutuhkan waktu yang lebih lama dibandingkan dengan metode

SYBR Green I.

BAB VI

SIMPULAN DAN SARAN

A. Simpulan

Ekstrak daun asam kandis (G. parvifolia (Miq)Miq) memiliki aktivitas

antiplasmodium terhadap P. falcifarum pada strain D6 (sensitif klorokuin)

dan strain W2 (resisten klorokuin) dengan menggunakan metode mikroskopik

dan metode SYBR Green I. Ekstrak kloroform daun asam kandis memiliki

aktivitas antiplasmodium lebih kuat dibandingkan dengan ekstrak metanol.

Nilai IC50 dengan metode mikroskopik dari ekstrak kloroform pada strain D6

adalah 33,17 µg/mL dan strain W2 adalah 0,55 µg/mL sedangkan nilai IC50

ekstrak metanol strain D6 adalah 32,44 µg/mL dan strain W2 adalah 41,23

µg/mL. Nilai IC50 dengan metode SYBR Green I ekstrak kloroform strain D6

adalah 14,29 µg/mL dan strain W2 adalah 0,214 µg/mL sedangkan nilai IC50

ekstrak metanol strain D6 adalah 48,00 µg/mL dan strain W2 adalah 56,37

µg/mL.

B. Saran

1. Dilakukan penelitian lanjutan yaitu isolasi dan fraksinasi ekstrak

kloroform daun asam kandis (G. parvifolia (Miq)Miq).

2. Dilakukan penelitian uji aktivitas antiplasmodium terhadap daun asam

kandis (G. parvifolia (Miq)Miq) secara in vivo.

DAFTAR RUJUKAN

1. Sejarah penyakit malaria. Diambil dari : http://www.searo.who.int/en/Section10/ Section21/Section334.htm, Diakses pada tanggal 31 Juli 2009

2. Syamsudin, Soesanto Tjokrosonto, Subagus Wahyuono, Mustofa. Aktivitas

antiplasmodium dari dua fraksi ekstrak n-heksana kulit batang asam kandis (Garcinia parvifolia Miq). Majalah Farmasi Indonesia, 18 (4). 2007. h. 210.

3. Litkhitwitayawuid, K., Chanmahasathein, W., Ruangrungsi, N., Krungkai,J.

Xanthones with antimalarial activity from Garcinia dulcis. Planta Med., 64. 1998. h. 281-282.

4. Syamsudin, Shirly Kumala, Broto Sutaryo. Screening of some extracts from

Garcinia parvifolia Miq (Guttiferae) for antiplasmodial, antioxidant, cytotoxic and antibacterial activities. Asian Journal of Plant Science. 2007. h. 973.

5. Syamsudin, Soesanto Tjokrosonto, Subagus Wahyuono, Mustofa. Invitro and

invivo Antiplasmodial activity of stem bark extract of Garcinia parvifolia Miq (Guttiferae), Internasional Journal of Tropical Medicine. Ed. 22. 2007. h. 41-44.

6. Heyne, K. Tumbuhan Berguna Indonesia. Jilid III. Terjemahan Badan Litbang

Kehutanan. Yayasan Sarana Wana Jaya; 1987. h. 1386 7. Daun asam kandis. Diambil dari : http://www.rimbundahan.org/environment/

plant_lists/guttiferae/Garcinia-parvifolia.jpg, Diakses pada 31 Juli 2009 8. Harbone, J.B.,Metode Fitokimia: Penuntun Cara Modern Menganalisa

Tumbuhan, terjemahan Padmawinata, K., Soediro, I., Penerbit ITB, Bandung, 1987. h. 99

9. Winholz, M., Budavari, S, R.f., Otterben, E.S. The merck index an encyclopedia

of chemicals, drugs and biological. 14th ed. Merck and CO, inc. Rahway-USA. 1983. h. 10064

10. Sutrisno B., Reverse approach. Edisi I. Jakarta: Fakultas Farmasi Universitas

Pancasila; 1986. h. 13-15. 11. Agoes, Goeswin. Teknologi Bahan Alam. Bandung: Institut Teknologi Bandung;

2007. h. 12-5,24-5 12. Sunkar, S & Pribadi, W., 1992. Resistensi Plasmodium Falcifarum terhadap

obat- obat malaria. Majalah Kedokteran Indonesia 42 (3). h. 155-162

13. Data kematian akibat malaria. Diambil dari :http://apps.who.int/

ghodata/?vid=450. Diakses pada tanggal 6 Agustus 2009. 14. Malaria-Endemic Areas in the World. Diambil dari : http://globalucf.org/ .

Diakses pada tanggal 5 Agustus 2009 15. Anonim, 1993, Malaria Pengobatan, Departemen Kesehatan Republik Indonesia,

Jakarta, Buku 3. 16. Plasmodium falcifarum. Diambil dari :http://www.rph.wa.gov.av/malaria/

diagnostic.html. Diakses pada tanggal 5 Agustus 2009 17. Gandahusada, S., Ilahude, D.H.D., Pribadi, W. (ed), 198. Parasitologi kedokteran

ed. III, Jakarta: Fakultas Kedokteran Universitas Indonesia. 2002. h. 173-176. 18. Siklus hidup malaria. Diambil dari : http://www.uni-tuebingen.de/modeling/

malaria_LifeCycle.gif. Diakses pada tanggal 5 Agustus 2009 19. Basco Leonardo K. Field application of in vitro assays for the sensitivity of

human malaria parasites to antimalarial drugs. Geneva: World Helath Organization; 2007. p. 16,22.

20. Budi Leksana, Ika Susanti, J. Kevin Baird. Standard operating procedure

cultivation of plasmodium falcifarum in vitro. Jakarta: US NAMRU-2;1995. p. 1-7

21. Johnson Jacob D. Malaria SYBR Green I-based fluorescence (MSF) assay

protocol. Maryland : Departemen of Parasitology Division of Experimental Therapeutic Walter Reed Army Institute of Research; 2006. p.2-7.

22. Finney DJ. Probit analysis; A statistical treatment of the sigmoid response curve.

Cambridge; 1964 dikutip dari Syamsudin, Budi Prasetyo, Antonius. Efek

antiplasmodium dari ekstrak etilasetat kulit batang asam kandis (Garcinia parvifolia) secara in vitro. Jurnal Ilmu Kefarmasian Indonesia. 2007;5(2).

L A M P I R A N

Lampiran 1. Hasil determinasi daun asam kandis

Lampiran 2. Skema pembuatan ekstrak daun asam kandis

Serbuk daun asam kandis (G. parfivolia. (Miq)Miq) ± 300 g

Dimaserasi selama ± 24 jam Dengan kloroform ± 2 liter, Saring, evaporasi

Ampas serbuk ekstrak kloroform kental ( 5, 95 g)

Dimaserasi selama ± 24 jam Dengan metanol ± 2 liter, Saring, evaporasi

Ampas serbuk ekstrak metanol Kental (7,02 g)

Lampiran 3. skema kerja pembuatan kultur P. falcifarum

Dibiakkan dalam kultur plate yang mengandung 4ml CCM

Kultur dilakukan didalam LAF dalam kondisi steril

Medium diganti dengan yang baru setiap 24 jam masa inkubasi didalam inkubator

pada temperatur 37°C

Kultur P. falciparum

Sel darah merah yang telah terinfeksi parasit

Lampiran 4. skema pengujian aktivitas antiplasmodium (metode mikroskopik)

12,5 µL ekstrak

12,5 µL RPMI 1640+ 100 µL kultur

Masukkan dalam sumuran mikrokultur Masing-masing dengan konsentrasi 4; 20; 100; 200; 400 µg/mL Inkubasi 48 jam Dipindahkan ke dalam tabung effendorf Sentrifugasi 10 menit Endapan supernatan Buat hapusan pada objek glass pewarna giemsa biarkan 15 menit siram dengan air keringkan dan tambahkan imersi dilihat dibawah mikroskop

Lampiran 5. skema pengujian aktivitas antiplasmodium (metode SYBR Green I)

12,5 µL ekstrak 12,5 µL RPMI 1640 +

100 µL kultur Masukkan dalam sumuran mikrokultur Masing-masing dengan konsentrasi 4; 20; 100; 200; 400 µg/mL Inkubasi 48 jam Dipindahkan ke dalam tabung effendorf Sentrifugasi 10 menit Endapan supernatan tambahkan 100 µL lysis buffer berisi SYBR Green inkubasi lempeng sumur mikro dalam kondisi gelap selama 1 jam baca pada alat fluorescence plate reader

Lampiran 6. Foto bahan uji antiplasmodium

Larutan uji ekstrak daun asam kandis Sediaan darah tebal pada objek glass dengan berbagai konsentrasi strain D6

Sediaan darah tebal pada objek glass Strain W2

Lampiran 7. Foto alat uji antiplasmodium

Lab count denominator Mikro pipet

Candle jar Inkubator

Laminary Flow Cabinet Mikroskop NICON Eclipse 600

Tabung Nitrogen Water-bath

Lampiran 8. Gambar grafik dari metode SYBR Green I D6 (IC50 :14,29)

Grafik hubungan konsentrasi dari ekstrak kloroform daun asam kandis (G. parvifolia (Miq)Miq) dengan linieritas fluoresensi pada strain D6

W2 (IC50 :0,214) Grafik hubungan konsentrasi dari ekstrak kloroform daun asam kandis (G. parvifolia (Miq)Miq) dengan linieritas fluoresensi pada strain W2

D6 (IC50 : 48,0) Grafik hubungan konsentrasi dari ekstrak metanol daun asam kandis (G. parvifolia (Miq)Miq) dengan linieritas fluoresensi pada strain D6

Transform of AK 2 (D6)

0 1 2 30

5000

10000

15000

20000

25000

Transform of AK 2 (W2)

0 1 2 30

10000

20000

30000

40000

Transform of AK 1 (D6)

0 1 2 30

10000

20000

30000

40000

W2 (IC50 : 56,37) Grafik hubungan konsentrasi dari ekstrak metanol daun asam kandis (G. parvifolia (Miq)Miq) dengan linieritas fluoresensi pada strain W2

D6 (IC50 : 25,62)

Grafik hubungan konsentrasi dari klorokuin dengan linearitas fluoresensi pada strain D6

W2 (IC50: 227,6) Grafik hubungan konsentrasi dari klorokuin dengan linieritas fluoresensi pada strain W2

Transform of AK 1 (W2)

0 1 2 30

10000

20000

30000

40000

T ransform of Data 1

0 1 2 3 40

10000

20000

30000

40000

50000

Transform of Data 2

0 1 2 3 40

10000

20000

30000

40000

Lampiran 9. Jumlah skizon hidup dalam seluruh jumlah stadium parasit dalam sel darah merah pada area pandang mikroskop

Ekstrak kloroform Konsentrasi

(µg/mL) strain D6 (sensitif)

Strain W2 (resisten)

I II I II

4 72 229 65 269 71 383 71 319 31,44 24,16 18,54 22,26

20 20 215 51 331 16 230 7 249 9,30 15,41 6,96 2,81

100 12 204 9 204 8 223 4 214 5,88 4,41 3,59 1,87

200 5 216 4 202 5 248 7 216 2,32 0,44 2,02 3,24

400 2 220 1 219 2 230 3 204 0,91 0,45 0,86 1,47

Ekstrak Metanol Konsentrasi

(µg/mL) strain D6 (sensitif)

strain W2 (resisten)

I II I II

4 37 329 63 284 47 350 59 371 11,25 22,18 13,43 15,90

20 34 314 89 371 59 343 49 280 10,83 23,99 17,20 17,50

100 9 280 7 287 30 342 10 265 3,21 2,44 8,77 3,77

200 3 279 3 202 4 265 4 254 1,08 1,49 1,51 1,57

400 1 278 1 242 4 238 3 271 0,36 0,41 1,68 1,11

Contoh perhitungan:

Jumlah skizon hidup dalam seluruh sel darah merah dalam area pandang

mikroskopik pada ekstrak kloroform strain D6 konsentrasi 4 µg/mL :

72 x 100 % = 31,44 % 229

72 : jumlah skizon

229 : jumlah ring, tropozoit dan skizon

Contoh perhitungan diatas sama dengan perhitungan ekstrak kloroform dan ekstrak

metanol pada tiap-tiap konsentrasi dan tiap strain.

Kontrol positif Klorokuin Konsentrasi

(ng/mL) strain D6 (sensitif)

Strain W2 (resisten)

I II I II

6,25 68 374 109 443 12 386 42 621 18,18 23,74 3,11 6,76

12,5 91 449 55 374 16 489 25 687 20,27 14,71 3,27 3,64

25 18 264 29 297 50 640 40 647

6,82 9,76 7,81 6,18 50 11 222 2 213 23 678 18 685

4,95 0,94 3,25 2,63 100 1 212 1 218 21 728 27 639

0,47 0,46 2,88 4,26 200 0 206 2 213 23 696 15 656

0 0,94 3,30 2,28 400 2 201 2 222 19 231 4 208

0,99 0,90 8,22 1,92 800 1 201 7 235 6 211 6 206

0,49 2,98 2,84 2,91 1600 0 222 1 203 4 220 3 200

0 0,49 1,81 1,50 Contoh perhitungan:

Jumlah skizon hidup dalam seluruh sel darah merah dalam area pandang

mikroskopik pada klorokuin strain D6 konsentrasi 6,25 ng/mL :

68 x 100 % = 18,18 % 374

68 : jumlah skizon

374 : jumlah ring, tropozoit dan skizon.

Contoh perhitungan diatas sama dengan perhitungan klorokuin pada tiap-tiap

konsentrasi dan tiap strain.

Lampiran 10. Tabel Probit (23)

Persentase

Probit

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9

0 - 2,67 2,95 3,12 3,25 3,36 3,45 3,52 3,59 3,66

10 3,72 3,77 3,82 3,87 3,92 3,96 4,01 4,05 4,08 4,12

20 4.16 4,19 4,23 4,26 4,29 4,33 4,38 4,39 4,42 4,45

30 4,48 4,50 4,53 4,56 4,59 4,61 4,64 4,67 4,69 4,72

40 4,75 4,77 4,80 4,82 4,85 4,87 4,90 4,92 4,95 4,97

50 5,00 5,03 5,05 5,08 5,10 5,13 5,15 5,18 5,20 5,23

60 5,25 5,28 5,31 5,33 5,36 5,39 5,41 5,44 5,47 5,50

70 5,52 5,55 5’58 5,61 5,64 5,67 5,71 5,74 5,77 5,81

80 5,84 5,88 5,92 5,95 5,99 6,04 6,06 6,13 6,18 6,23

90 6,28 6,34 6,41 6,48 6,55 6,64 6,75 6,88 7,05 7,33

99

0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9

7,33 7,37 7,41 7,48 7,51 7,58 7,66 7,75 7,88 8,09

SKRIPSIdosen.univpancasila.ac.id/dosenfile/2099211031129924184604March... · B. Perumusan Masalah...

Documents

Transcript of SKRIPSIdosen.univpancasila.ac.id/dosenfile/2099211031129924184604March... · B. Perumusan Masalah...