7/17/2019 Penciptaan Sel Bakteri Dikendalikan Oleh Genome Kimia Yang Disintesis

http://slidepdf.com/reader/full/penciptaan-sel-bakteri-dikendalikan-oleh-genome-kimia-yang-disintesis 1/3

Penciptaan Sel Bakteri Dikendalikanoleh Genome Kimia Yang DisintesisPada tahun 1977 , Sanger dan rekanditentukan urutan genetik lengkap fagφX174 ( 1 ) , genom DNA pertama angmen!adi "enar#"enar diurutkan $ Delapan

"ela% tahun kemudian, pada 199& , timkami mampu mem"a'a lengkap pertamaurutan genetik dari "akteri mereplika%i diri,aemophilu% inuen*ae$ +em"a'ageneti' urutan "er"agai %pe%ie% telahmeningkat ek%ponen%ial dari %tudi aal-emampuan untuk 'epat mendigitalkaninforma%i genomi' telah meningkat le"ihdari delapan kali lipat%elama .& tahun terakhir$ /paa untukmemahami%emua informa%i ini genomik "arumemiliki melahirkan "er"agai komputa%i"aru dan paradigma ek%perimental ,namun pengetahuan genom kami ma%ih%angat ter"ata% $ 0idak ada %a7tu %elularSi%tem memiliki %emua gen angdipahami dalam hal peran "iologi% mereka$ 2ahkan dalam "akteri %ederhana %el ,apakah kromo%om mengandung %eluruhgeneti' repertoar3 ika demikian, "i%a%i%tem genetik lengkap direproduk%i olehkimia %inte%i% mulai dengan hana urutanDNA digital ang terkandung di komputer3

+inat kami dalam %inte%i%molekul DNA "e%ar dan kromo%om tum"uhdari upaa kami%elama 1& tahun terakhir untukmem"angun %el minimal ang hanamengandung gen penting$ -ara iniadalah dire%mikan pada tahun 199& ketikakami mem"ari%kan genom +'opla%magenitalium, "akteridengan pelengkap terke'il gen dari %etiapdikenal organi%me ang mampu tum"uh%endiri di la"oratorium$ 5e"ih dari 166 dari4& gen penandi protein +$ genitaliumadalah di"uang ketika terganggu %atu per%atu (4#)$ -ami mengem"angkan %trategiuntuk perakitan 8iral%i*ed potongan untuk

mengha%ilkan molekul DNA "e%ar angmemungkinkan kita untuk merakit %e"uah+$ %inteti% genitalium$ enom dalamempat tahap dari di%inte%i% %e'ara kimia$-a%et DNA rata#rata %ekitar k" dalamukuran$al ini dilakukan melalui kom"ina%idalam metode en*imatik in 8itro dan in8i8o rekom"ina%i

di Sa''harom'e% 'ere8i%iae$ Seluruhgenom %inteti% :&.$976 pa%angan "a%a("p); adalah %ta"il tum"uh %e"agaipla%mid ragi 'entromeri' (<=P) (7)$2e"erapa rintangan dapat diata%i ditanam dan mengek%pre%ikan kromo%om

di%inte%i% %e'ara kimiadalam %el penerima$ -ita perlumeningkatkan metode untukmengek%trak%i kromo%om utuh dari ragi$-ita !uga perlu "ela!ar "agaimana untuktran%planta%i genom ini men!adi penerima%el "akteri ke mem"angun %eldikendalikan hana oleh genom %inteti%$-arena +$ genitalium memiliki tingkatpertum"uhan ang lam"at, kita "erpalingke dua le"ih 'epat tum"uh# %pe%ie%+'opla%ma, +$ m'oide% %u"%pe'ie%'apri (+1.) %e"agai donor, dan +$'apri'olum %u"%pe%ie%'apri'olum (=-)%e"agai penerima$ /ntuk mem"angunkondi%i dan pro%edur untuk tanam genom%intetik dari ragi, -ami mengem"angkanmetode untuk kloning %eluruh "akterikromo%om %e"agai pla%mid 'entromeri'dalam ragi, terma%uk a%li +$ m'oide%genom (, 9)$Namun, upaa aal untuk mengek%trak +$m'oide% genom dari ragi dantran%planta%i itu ke +$ 'apri'olum gagal$-ami menemukan "aha donor danpenerima m'opla%ma% "er"agi umum%i%tem pem"ata%an$ Donor genom adalahtermetila%i dalam a%li +$ m'oide% %el danoleh karena itu dilindungi terhadappem"ata%an %elama tran%planta%i dari %eldonor a%li (16)$ Namun, genom "akteritum"uh dalam ragi ang unmethlateddan tidak dilindungi dari %i%tempem"ata%an tunggal %el penerima$ -amimengata%i ham"atan pem"ata%an inidengan methlating DNA donor denganmethla%e% dimurnikan atau minakmentah +$ m'oide% atau +$ 'apri'olumek%trak, atau dengan hana mengganggupem"ata%an penerima %el$ -ita %ekarang

telah menetapkan pro%edur danmelaporkan %inte%i%,perakitan, kloning, dan tran%planta%i%uk%e% dari m'oide% 1,6#+"p +$ =>?#%n1$6 genom, untuk mem"uat %el "aruang dikendalikan oleh ini genom %intetik$Desain genom sintetik $ De%ain +$m'oide% =>?#%n1$6 genom dida%arkanpada urutan genom ang %angat akurat

7/17/2019 Penciptaan Sel Bakteri Dikendalikan Oleh Genome Kimia Yang Disintesis

http://slidepdf.com/reader/full/penciptaan-sel-bakteri-dikendalikan-oleh-genome-kimia-yang-disintesis 2/3

dari dua %train la"oratorium +$m'oide%%u"%pe'ie% 'apri +1. (, 9, 11)$Salah %atuna donor genom angdigunakan oleh 5artigue et al$ :en2ankak%e%i =P661.1; (16)$ <ang lainnaadalah %train ang di"uat oleh

tran%planta%i dari genom ang telah diklondan rekaa%a dalam ragi, <=p+m'1$1#Dtpe???re% :en2ank ak%e%i =P661;()$ Proek ini %angat tergantung padakeakuratan ini urutan$ +e%kipun kamiper'aa "aha kedua %ele%ai +$ m'oide%urutan genom dapat diandalkan, ada 9&%itu% di mana mereka "er"eda$ -ita mulaimeran'ang genom %intetik %e"elum keduaurutan %ele%ai$ Aki"atna, %e"agian "e%arka%et diran'ang dan di%inte%i% 2er"a%i%pada urutan =P661.1 (11)$ -etika itu%ele%ai, kami memilih urutan genom ang"erha%il dipindahkan dari ragi (=P661)%e"agai a'uan de%ain kami (ke'uali "ahakami teru% tpe???re% utuh gen)$ Semuaper"edaan ang mun'ul "iologi% %igni@kanantara =P661 dan ka%et di%inte%i%%e"elumna dikorek%i untuk men'o'okkanper%i% (11)$ Per"edaan urutan antara ka%et%inteti% dan =P661 ang ter!adi pada19 %itu% mun'ul tidak "er"ahaa dan%e"againa tidak dikorek%i$ ?nimem"erikan 19 polimor@k per"edaanantara genom %inteti% kami (=>?#%n1$6)dan alami (non%ntheti') genom(<=p+m'1$1) ang telah kita kloning diragi dan digunakan %e"agai %tandar untuktran%planta%i genom dari ragi$ /ntuk le"ihmem"edakan antara genom %inteti% danang alami,kami meran'ang empat urutan atermark(g"r$ S1) ke mengganti %atu atau le"ihka%et di daerah ek%perimentalmenun!ukkan :atermark 1 (1.4 "p)dan . (161 "p); atau dipredik%i :tanda air (1169 "p) dan 4 (1... "p); untuk tidakmengganggu kelang%ungan hidup %el$/rutan atermark ter%e"ut mengkodekanpengidenti@ka%i unik %ementara

mem"ata%i ter!emahan mereka men!adipeptida$ 0a"el S1 daftar per"edaan antaragenom %inteti% dan %tandar alam ini$am"ar S. menun!ukkan peta darim'oide% +$ =>?#%n1$6 genom$ -a%etdan perakitan menengah "ata%,atermark, penghapu%an, %i%ipan, dangen dari %n1$6 +$ m'oide% =>?ditun!ukkan pada gam"ar$ S., dan urutan

tran%planta%i +'opla%ma 'lone%+m<=p.&#1 telah di%ampaikan kepadaen2ank (ak%e%i =P66.6.7)$Strategi Sintetis perakitan genom$-a%et diran'ang umumna 166 "pdengan 6#"p tumpang tindih ka%et ang

"erdekatan (11)$ +ereka %emua diproduk%ioleh perakitan kimia ang men%inte%i%oligonukleotida oleh 2lue eron (2othell,Ba%hington) $ Setiap ka%et itu %e'araindi8idual di%inte%i% dan urutan di8eri@ka%ioleh produ%en$ /ntuk mem"antu dalampro%e% pem"angunan , DNA ka%et danperakitan intermediet diran'angmengandung 0idak %aa %itu% re%trik%ipada mereka termini dan diga"ungkandengan adana 8e'tor elemen untukmemungkinkan pertum"uhan dan %elek%idalam ragi ( 7 , 11 ) $ Se"uah %trategihirarki% diran'ang untuk merakit genomdalam tiga tahap oleh tran%forma%i danrekom"ina%i homolog diragi dari 1$67 ka%et 1 # k" ( am"ar $ 1 ) (1. , 1 )$ +a!eli% intermediet %inteti% 16 #k" $ Pada tahap pertama , ka%et dan8ektor ang diga"ungkan dalam ragi danditran%fer ke C%'heri'hia 'oli (11)$ DNApla%mid kemudian dii%ola%i dari indi8idu C$'oli klon dan di'erna untuk %krining %elang mengandung 8ektor dengan"erkumpul 16#k" ma%ukkan$ Satu %uk%e%16#k" perakitan diakili ("r$ .A)$ Se'araumum, %etidakna %atu 16#k" dirakitfragmen dapat diperoleh %krining 16 klonragi$ Namun, tingkat -e"erha%ilan"er8aria%i dari 16 hingga 166$ Semuatahap pertama intermediet di%ekuen%ing$Sem"ilan "ela% out dari 111 rakitanterdapat ke%alahan$ 2ergantian klondipilih, urutan#di8eri@ka%i, dan pindah ketahap perakitan "erikutna (11)$ +a!eli%intermediet %inteti% 166#k"$ Dikumpulkanrakitan 16#k" dan ma%ing#ma%ing 8ektorkloning ang diu"ah men!adi ragi %e"agaidi ata% untuk mengha%ilkan intermedietperakitan 166#k" (11)$ a%il kami

menun!ukkan "aha produk ini tidakdapat "ertahan %ta"il dalam C$ 'oli,%ehingga diga"ungkan DNA haru%diek%trak dari ragi$ Polmera%e 'hainrea'tion +ultipleE (P=F) adalah dilakukanpada klon ragi ang dipilih (g"r$ S dan

 0a"el S.)$ -arena %etiap perakitan 16#k"menengah diakili oleh %epa%ang primerdi anali%i% ini, kehadiran %emua amplikon

7/17/2019 Penciptaan Sel Bakteri Dikendalikan Oleh Genome Kimia Yang Disintesis

http://slidepdf.com/reader/full/penciptaan-sel-bakteri-dikendalikan-oleh-genome-kimia-yang-disintesis 3/3

akan menarankan dirakit 166#k"menengah$ Di umum, .& atau le"ih dariklon di%aring terkandung %emua amplikondiharapkan untuk perakitan lengkap$ Salah%atu klon ter%e"ut adalah dipilih untuk%krining le"ih lan!ut$ +elingkar pla%mid

DNA diek%trak%i dan ukuran pada gelagaro%a "er%ama penanda %uperkoil$Se'ond%tage %uk%e% rakitan denganurutan 8ektor adalah G 16& k" pan!ang(am"ar$ .2)$ -etika %emua amplikonang diproduk%i multipleE "erikut P=F,%e'ond%tage %e"uah perakitan menengahukuran ang "enar adalah "ia%anadiproduk%i$ Dalam "e"erapa ka%u%,"agaimanapun, ke'il penghapu%an ter!adi$Dalam ka%u% lain, "e"erapa 16#k"fragmen "erkumpul, ang mengha%ilkan"e%ar kedua tahap perakitan menengah$/ntungna, per"edaan#per"edaan inidapat dengan mudah didetek%i pada gelagaro%a %e"elum genom lengkapperakitan$ Perakitan genom lengkap$Dalam per%iapan untuk tahap akhirperakitan, itu perlu untuk mengi%ola%i

 !umlah mikrogram %etiap 11ma!eli% tahap kedua (11)$ Sepertidilaporkan (14),pla%mid melingkar ukuran tahap keduakamima!eli% dapat dii%ola%i dari %pheropla%t%ragi%etelah pro%edur "a%a#li%i%$ /ntuk%elan!utnamemurnikan 11 perakitan intermediet,merekadio"ati dengan eEonu'lea%e dan meleati%e"uah-olom anion#eE'hange$ Se"uah %e"agianke'il dari

 0otal pla%mid DNA (1H166) di'erna dengan 0idak ? dan dianali%i% denganelektrofore%i% gel lapangan in8er%i

(I?C) (am"ar$ .=)$ +etode inimengha%ilkanG 1 mg %etiap perakitan per 466 ml ragi2udaa (G 1611 %el)$+etode di ata% tidak "enar#"enarmenghapu%

%emua kromo%om DNA ragi linear,ang kami temukan %e'ara %u"%tan%ialdapat menurunkantran%forma%i ragi dan e@%ien%i perakitan$/ntukle"ih memperkaa untuk 11 intermedietperakitan melingkar,G .66 %ampel ng %etiap perakitandikumpulkan dan di'ampur denganagaro%e 'air$ Se"agaimengera% agaro%a, %erat "enang melaluidan topologi JperangkapJ DNA melingkar(1&)$DNA linear untrapped kemudian dapatdipi%ahkandari agaro%a plug dengan elektrofore%i%,%ehinggamemperkaa untuk molekul melingkarterperangkap$ ?tu11 intermediet perakitan melingkar angdi'erna

 0idak dengan %aa %ehingga in%ert dapatdi"e"a%kan$Selan!utna, fragmen ang diam"il dariplug agaro%a, dianali%i% dengan I?C(am"ar$ .D),dan "eru"ah men!adi %pheropla%t% ragi(11)$ Ditahap ini ketiga dan terakhir dariperakitan, tam"ahanurutan 8ektor tidak diperlukan karenaelemen ragi kloning ang %udah adadalam perakitan 11#966$