Post on 10-Feb-2018
7/22/2019 Identifikasi Molekuler Dan Pengaruh Pemberian Potensial Probiotik Bakteri Asam Laktat Bal Asal Dadih Terhadap Kolesterol Daging Itik Bayang Sumber Daya …
http://slidepdf.com/reader/full/identifikasi-molekuler-dan-pengaruh-pemberian-potensial-probiotik-bakteri-asam 1/22
IDENTIFIKASI MOLEKULER DAN PENGARUH PEMBERIAN
POTENSIAL PROBIOTIK BAKTERI ASAM LAKTAT (BAL)
ASAL DADIH TERHADAP KOLESTEROL DAGING ITIK
BAYANG SUMBER DAYA GENETIK SUMATERA BARAT
ARTIKEL
Oleh:
RONAL DEPSON
0821207020
PROGRAM PASCASARJANA
UNIVERSITAS ANDALAS
PADANG
2012
7/22/2019 Identifikasi Molekuler Dan Pengaruh Pemberian Potensial Probiotik Bakteri Asam Laktat Bal Asal Dadih Terhadap Kolesterol Daging Itik Bayang Sumber Daya …
http://slidepdf.com/reader/full/identifikasi-molekuler-dan-pengaruh-pemberian-potensial-probiotik-bakteri-asam 2/22
Identifikasi Molekuler dan Pengaruh Pemberian Potensial Probiotik Bakteri
Asam Laktat (BAL) Asal Dadih Terhadap Kolesterol Daging Itik Bayang
Sebagai Sumber Daya Genetik Sumatera Barat Ronal Depson, di bawah bimbingan :
Prof. Dr. Sumaryati Syukur, MSc dan Prof. Drh. Hj. Endang Purwati, MS, PhD
Abstrak
Ternak itik lokal merupakan ternak unggas penghasil telur, daging dan bulu.
Produksi telur itik lokal mencapai 220 butir pertahun dan persentase karkas daging
itik jantan sangat tinggi mencapai 70%. Sumatera Barat memiliki itik Bayang sebagai
sumber daya genetik yang dipelihara peternak di Kecamatan Bayang KabupatenPesisir Selatan. Itik Bayang dipelihara secara ekstensif dengan melepaskannya di
sawah pada siang hari dan mengkandangkannya dimalam hari. Namun daging itik
memiliki kadar kolesterol 50 mg/dl dan kadar lemak 17%, sehingga perlu upayauntuk menurunkan kadar lemak dan kolesterol daging itik tersebut. Upaya tersebutadalah dengan melakukan pemberian probiotik Bakteri Asam Laktat (BAL) yang
diisolasi dari dadih Sitingkai Kecamatan Palupuh. Selain itu juga perlu dilakukan
identifikasi molekuler BAL asal dadih Sitingkai tersebut.Penelitian ini dilakukan untuk mengetahui karakteristik molekuler dan
pengaruh pemberian probiotik BAL asal dadih Sitingkai terhadap kadar kolesterol
daging itik Bayang. Penelitian ini merupakan penelitian eksperimen dengan
rancangan acak lengkap (RAL), empat perlakuan dan empat kali ulangan. PerlakuanA adalah kontrol (tanpa pemberian probiotik/ placebo); B (pemberian 1,27 x 10
7
CFU/g probiotik Weisella paramesenteroides); C (pemberian 2,54 x 107 CFU/g
probiotik Weisella paramesenteroides) dan D (pemberian 3,81 x 107 CFU/g probiotikWeisella paramesenteroides). Pemberian probiotik dilakukan selama 1 bulan, setelah
itik Bayang berumur 1 bulan.
Hasil penelitian menunjukkan bahwa bakteri probiotik BAL dadih Sitingkaiadalah Weisella paramesenteroides dengan tingkat kesamaan dengan Gen Bank data
mencapai 99% melalui analisis BLAST. Pemberian probiotik Weisella
paramesenteroides mampu menurunkan kadar kolesterol daging itik Bayang 32%
pada dosis 1 ml (1,27 x 107 CFU/g).
Kata kunci : kolesterol, probiotik, Weisella paramesenteroides, dadih, itik Bayang.
7/22/2019 Identifikasi Molekuler Dan Pengaruh Pemberian Potensial Probiotik Bakteri Asam Laktat Bal Asal Dadih Terhadap Kolesterol Daging Itik Bayang Sumber Daya …
http://slidepdf.com/reader/full/identifikasi-molekuler-dan-pengaruh-pemberian-potensial-probiotik-bakteri-asam 3/22
PENDAHULUAN
Produk peternakan terutama daging dan telur itik serta olahannya sangat
diminati dan disukai masyarakat, berbagai macam pangan berbahan baku daging dan
telur itik sangat banyak kita jumpai pada kehidupan sehari-hari. Ternak itik
merupakan ternak unggas penghasil telur (220 butir/tahun), daging (70%) dan bulu.
Sumatera Barat memiliki itik Bayang sebagai sumber daya genetik yang dipelihara
peternak di Kecamatan Bayang Kabupaten Pesisir Selatan. Itik Bayang betina
dipelihara sebagai penghasil telur dan yang jantannya sebagai pedaging.
Namun demikian, daging itik mengandung lemak yang cukup tinggi yaitu
17% (Erlian dan Jailani, 2001 dalam Samudra dan Arif, 2008) dan kolesterol itik
mencapai 50 mg/dl (Setiabudi, 2011). Oleh sebab itu perlu upaya untuk menurunkan
kadar kolesterol tersebut. Salah satu upaya tersebut adalah dengan pemberian
probiotik pada ternak itik karena probiotik mempunyai kemampuan untuk
menurunkan kadar kolesterol serum darah (Kusumawati, et al., 2003) dan kandungan
kolesterol telur ayam (Abdulrahim, et al., 1996). Salah satu probiotik adalah Bakteri
Asam Laktat (BAL) yang mampu memproduksi asam laktat sebagai produk akhir
perombakan karbohidrat, hydrogen peroksida dan bakteriosin. Beberapa jenis
bakteriosin dari BAL mempunyai spektrum yang luas dan mempunyai aktivitas
menghambat terhadap pertumbuhan beberapa bakteri patogen pada makanan seperti
Listeria monocytogenes dan Staphylococcus aureus (Kusmiati dan Malik, 2002).
BAL dapat diisolasi dari dadih yang merupakan produk olahan khas Sumatera
Barat yang terbuat dari susu kerbau dengan cara fermentasi alami pada suhu kamar
selama 2 hari (Sugitha, 1995). Dadih yang diproduksi masing-masing daerah berbeda
7/22/2019 Identifikasi Molekuler Dan Pengaruh Pemberian Potensial Probiotik Bakteri Asam Laktat Bal Asal Dadih Terhadap Kolesterol Daging Itik Bayang Sumber Daya …
http://slidepdf.com/reader/full/identifikasi-molekuler-dan-pengaruh-pemberian-potensial-probiotik-bakteri-asam 4/22
rasa dan aromanya hal ini dikarenakan bakteri potensial yang terdapat dalam dadih
tersebut berbeda. Adapun daerah di Sumatera Barat yang berpotensi untuk
memproduksi dadih yaitu daerah Alahan Panjang (Aia Dingin) Kabupaten Solok,
(Sitingkai) Kabupaten Agam, (Tanjung Bonai) Kabupaten Tanah Datar, (Kelurahan
Batu Payung Gadut) Kabupaten Limapuluh Kota, (Batang Panjang) Kabupaten
Sijunjung.
Tujuan penelitian adalah untuk mengetahui karakteristik molekuler dan
pengaruh pemberian dosis potensial probiotik BAL asal dadih Sitingkai terhadap
kolesterol daging itik Bayang pedaging. Hasil penelitian ini dapat memberikan
informasi ilmiah karakteristik molekuler bakteri potensial probiotik BAL asal dadih
Sitingkai untuk menurunkan kolesterol pada daging itik Bayang pedaging.
MATERI DAN METODE
Materi
Sampel dadih diperoleh dari Jorong Sitingkai Kanagarian Pasia Laweh
Kecamatan Palupuh Kabupaten Agam. Sedangkan ternak itik Bayang pedaging jantan
diperoleh dari Kecamatan Bayang Kabupaten Pesisir Selatan Sumatera Barat.
Penelitian ini dilakukan dengan metode eksperimen dengan rancangan acak lengkap
(RAL) pola 4 x 4, dimana ada 4 perlakuan dengan 4 kali ulangan dan setiap unit
terdapat 4 ekor itik Bayang. Perlakuan adalah dosis bakteri probiotik Weisella
paramesentroides yang diberikan pada itik Bayang yaitu Perlakuan A (sebagai
Kontrol), Perlakuan B (pemberian 1,27 x 107 CFU/g Weisella paramesentroides),
Perlakuan C (Pemberian 2,54 x 107 CFU/g Weisella paramesentroides), Perlakuan D
7/22/2019 Identifikasi Molekuler Dan Pengaruh Pemberian Potensial Probiotik Bakteri Asam Laktat Bal Asal Dadih Terhadap Kolesterol Daging Itik Bayang Sumber Daya …
http://slidepdf.com/reader/full/identifikasi-molekuler-dan-pengaruh-pemberian-potensial-probiotik-bakteri-asam 5/22
(pemberian 3,81 x 107 CFU/g Weisella paramesentroides), Kemudian dilakukan
isolasi dan karakteristik di laboratorium Teknologi Hasil Ternak serta untuk uji
biologis dilakukan di kandang penelitian.
Cara Kerja
a) Total Koloni BAL (Purwati et al., 2005)
Semua peralatan yang dibutuhkan seperti: cawan petri ( petridish), tabung reaksi,
erlenmeyer, tabung eppendorf , tip pipet mikro, hockey stick , disterilkan dalam
autoclave pada suhu 121ºC selama 15 menit dengan tekanan 15 lbs. Dipersiapkan
media preenrichment yaitu dengan melarutkan 7.05 g de Mann Rogosa Sharpe
(MRS) Broth (Merck) dalam 135 ml aquades untuk 3 sampel dan sampai
pengenceran 510
(Pembuatan secara umum adalah 52.2 g MRS Broth dalam 1 000
ml aquades). Selanjutnya dihomogenisasi dengan magnetic stirrer diatas hot-plate
pada suhu 100ºC, kemudian di autoclave (15 menit, 121ºC dan tekanan 15 lbs).
Dipersiapkan media MRS Agar dengan melarutkan 2.98 g MRS Agar dalam 45 ml
aquades (Pembuatan secara umum adalah 66.2 g MRS Agar dalam 1 000 ml
aquades), kemudian dihomogenisasi dengan magnetic stirrer , diatas hot plate pada
suhu 100ºC, lalu di autoclave, setelah agak dingin (± 55ºC) lalu dituang ke dalam 7
cawan petri masing-masing sebanyak ± 15 ml. Dengan menggunakan sendok steril
dan aluminium foil dadih ditimbang sebanyak 1 g, kemudian dilarutkan dengan 9 ml
larutan MRS Broth, lalu divortex sampai homogen. Hasil ini disebut pengenceran
110
. Hasil pengenceran tersebut diambil 1 ml dimasukkan ke dalam tabung reaksi
yang berisi 9 ml larutan MRS Broth, lalu divortex sampai homogen. Hasil
7/22/2019 Identifikasi Molekuler Dan Pengaruh Pemberian Potensial Probiotik Bakteri Asam Laktat Bal Asal Dadih Terhadap Kolesterol Daging Itik Bayang Sumber Daya …
http://slidepdf.com/reader/full/identifikasi-molekuler-dan-pengaruh-pemberian-potensial-probiotik-bakteri-asam 6/22
pengenceran ini disebut dengan pengenceran 210
, begitu seterusnya sampai pada
pengenceran 510
. Dari pengenceran 510
diambil 100 µl sampel dan ditanam
dengan metode spread pada petridish yang telah berisi media MRS Agar kemudian
diratakan dengan hockey stick yang sebelumnya telah diberi alkohol dan dibakar
dengan bunsen. Pekerjaan ini dilakukan dalam lamina flow dan di dekat bunsen.
Inokulum disimpan dalam anaerob jar lalu dimasukkan dalam inkubator selama 24
jam pada suhu 37ºC dan dilakukan pengkodean petridish dengan menandai masing-
masing petridish. Setelah 24 jam, koloni BAL yang tumbuh dilihat dengan
menggunakan alat quebec colony counter. Total koloni BAL/Colony Forming Unit
(CFU)/g dihitung dengan rumus sebagai berikut :
CFU/g = jumlah koloni BALl BeratSampe
xn Pengencera
x 11
b) Isolasi BAL dan Pewarnaan Gram (Purwati et al., 2005)
Semua peralatan yang dibutuhkan seperti: cawan petri, tabung reaksi,
erlenmeyer, tip pipet mikro, hockey stick , disterilkan dalam autoclave pada suhu
121ºC selama 15 menit dengan tekanan 15 lbs. Dipersiapkan media enrichment yaitu
dengan melarutkan 9.87 g MRS Broth dalam 189 ml aquades kemudian dipanaskan
sambil dihomogenisasi dengan hot plate – stirrer pada suhu 100ºC, lalu di autoclave
(15 menit, 121 ºC dan tekanan 15 lbs). Dipersiapkan media MRS Agar dengan
melarutkan 5.96 g MRS Agar dalam 90 ml aquades kemudian dipanaskan sambil
dihomogenisasi dengan hot plate – stirrer pada suhu 100ºC, lalu di autoclave, setelah
agak dingin (± 55ºC) dituang ke dalam masing-masing cawan petri sebanyak ± 15
7/22/2019 Identifikasi Molekuler Dan Pengaruh Pemberian Potensial Probiotik Bakteri Asam Laktat Bal Asal Dadih Terhadap Kolesterol Daging Itik Bayang Sumber Daya …
http://slidepdf.com/reader/full/identifikasi-molekuler-dan-pengaruh-pemberian-potensial-probiotik-bakteri-asam 7/22
ml. Menggunakan sendok steril dan aluminium foil dadih ditimbang sebanyak 1 g,
kemudian dilarutkan dengan 9 ml larutan MRS Broth dalam tabung reaksi, lalu
divortex sampai homogen. Hasil ini disebut pengenceran1
10
, dimasukkan ke dalam
anaerob jar , kemudian diinkubasi selama 24 jam dalam inkubator dengan suhu 37ºC.
Hasil 110
tersebut diambil 1 ml dimasukkan ke dalam tabung reaksi yang berisi 9 ml
larutan MRS Broth, lalu divortex sampai homogen. Hasil pengenceran ini disebut
dengan pengenceran 210
, begitu seterusnya sampai pada pengenceran 710
. Dari
pengenceran 710
diambil 100 µl sampel dan ditanam dengan metode spread pada
petridish yang telah berisi media MRS Agar, kemudian diratakan dengan hockey stick
yang sebelumnya disteril dengan alkohol dan dibakar dengan bunsen lalu diangin-
anginkan. Inokulum disimpan dalam anaerob jar kemudian diinkubasi dalam
inkubator selama 48 jam pada suhu 37ºC dan dilakukan pengkodean petridish dengan
menandai masing-masing petridish. Setelah 48 jam, single colony yang mencirikan
BAL yaitu bulat licin berwarna putih kekuningan dipindahkan ke media MRS Agar
untuk pemurnian koloni dengan metode streak yaitu dengan menggunakan jarum ose
kenudian diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37ºC. Koloni yang menciri BAL
dilakukan pewarnaan gram menurut prosedur Dwidjoseputro (1989) sebagai berikut :
1) Diambil biakan bakteri dan bakteri diratakan di atas kaca benda ( preparat ) yang
telah dibersihkan dengan alkohol, 2) lalu dikeringkan di atas bunsen atau alat
pengering, 3) ditetesi dengan zat warna kristal violet, 4) kemudian ditunggu selama 1
menit agar zat warna meresap oleh bakteri, 5) lalu dibilas dengan air mengalir dan
ditetesi dengan larutan iodin kompleks, kemudian ditunggu selama 1 menit, lalu
7/22/2019 Identifikasi Molekuler Dan Pengaruh Pemberian Potensial Probiotik Bakteri Asam Laktat Bal Asal Dadih Terhadap Kolesterol Daging Itik Bayang Sumber Daya …
http://slidepdf.com/reader/full/identifikasi-molekuler-dan-pengaruh-pemberian-potensial-probiotik-bakteri-asam 8/22
dibilas dengan air mengalir, 6) dicuci dengan alkohol dengan cara mencelupkan ke
dalam alkohol encer, 7) ditetesi dengan zat warna safranin, lalu ditunggu 30 detik, 8)
setelah itu dikeringkan dan diperiksa di bawah mikroskop dengan menggunakan
minyak celup (minyak inersi).
c) Resistensi Anti Mikroba BAL
Uji resistensi antimikroba BAL dilakukan terhadap lima bakteri uji yaitu
Eschericia coli NBRC 14237 , Staphylococcus aureus NBRC 13276 , Bacillus subtilis
BTCCB 612, Salmonella tyhpiidan Lysteria monocytogenesis (Koleksi Pusat
Penelitian Kimia LIPI Bandung). Kultur BAL 3 ml disentrifuse dengan kecepatan 8
000 rpm selama 5 menit dengan suhu 4ºC, kemudian supernatannya digunakan untuk
resistensi antimikroba. Bakteri uji 200 μl yang sudah diremajakan kembali dalam
Nutrient Broth (NB) masing-masingnya dituang ke dalam 20 ml media Nutrient Agar
(NA) yang masih cair, suhu berkisar antara 40ºC, kemudian baru dituang ke dalam
cawan petri steril, dibiarkan selama 30 menit agar mengeras. Diletakkan kertas
cakram steril dengan pinset diatas NA tersebut kemudian diteteskan 20 μl supernatan
BAL dengan pipet mikro, lalu diletakkan juga antibiotic testing paper yaitu Penicillin
sebagai pembanding , kemudian diinkubasi pada suhu 37ºC secara anaerob.
Dilakukan pengamatan terhadap zona hambat dengan cara mengukur zona bening
yang berbentuk lingkaran pada jam ke- 24 dengan menggunakan mistar (Mustopa,
2009).
7/22/2019 Identifikasi Molekuler Dan Pengaruh Pemberian Potensial Probiotik Bakteri Asam Laktat Bal Asal Dadih Terhadap Kolesterol Daging Itik Bayang Sumber Daya …
http://slidepdf.com/reader/full/identifikasi-molekuler-dan-pengaruh-pemberian-potensial-probiotik-bakteri-asam 9/22
d) Isolasi Genomik DNA BAL, (Mustopa, 2009).
Diinokulasikan kultur BAL ke dalam 3 ml MRS Broth, kemudian diinkubasi 24
jam pada suhu 37°C. Diambil 1 ml yang telah tumbuh tersebut kemudian dipindahkan
ke tabung eppendorf dan disentrifugasi dengan kecepatan 10 000 rpm (4°C) 15 menit.
Didapat pellet dan supernatan, pellet digunakan untuk isolasi genomik DNA
sedangkan supernatan digunakan untuk uji resistensi anti mikroba BAL. Pellet
ditambah 500 µl Tris-EDTA (TE) (10 mM Tris-HCl, 1mM EDTA dan pH 7.6).
Ditambah lysozyme 40 µl dan inkubasi selama 1 jam dengan suhu 37°C. Setelah itu
ditambahkan 200 µl 10% SDS, NaCl 5M dan 80 µl CTAB 10% (sebelumnya, CTAB
10% sudah ditambah dengan 20 µl mercapetanol di dalam tabung eppendorf 1 ml).
Setelah itu dipanaskan pada suhu 68°C selama 30 menit (dibolak-balik setiap 10
menit), lalu didinginkan sebentar kemudian ditambahkan khloroform (100 %) (1 : 1
perbandingan bahan dengan volume sampel). Setelah itu disentrifugasi 10 000 rpm
(4°C) selama 15 menit, lalu supernatan yang bagian paling atas (bening) diambil dan
dipindahkan ke tabung eppendorf baru. Ditambahkan ethanol 100% (dingin)
sebanyak 1 kali volume sampel, campuran tersebut disentrifus 10 menit dengan
kecepatan 10 000 rpm (4°C). Supernatan dibuang, lalu tabung eppendorf dicuci
dengan ethanol 70% sebanyak 1/2 ml. Disentrifus selama 5 menit dengan kecepatan
10 000 rpm (4°C). Tabung eppendorf dimiringkan selama 1 jam di atas tisue sampai
cairannya kering, kemudian ditambahkan 27 µl ddH2O dan 3 µl RNAse, diinkubasi
setengah jam (37°C), disimpan di -20°C.
7/22/2019 Identifikasi Molekuler Dan Pengaruh Pemberian Potensial Probiotik Bakteri Asam Laktat Bal Asal Dadih Terhadap Kolesterol Daging Itik Bayang Sumber Daya …
http://slidepdf.com/reader/full/identifikasi-molekuler-dan-pengaruh-pemberian-potensial-probiotik-bakteri-asam 10/22
e) Reaksi 16S rRNA PCR, (Mustopa, 2009).
Isolasi genomik DNA dari koloni bakteri murni diamplifikasi dengan PCR.
Reaksi amplifikasi DNA dilakukan dalam Thermocycler Mupid-Exu dengan
menggunakan primer 8F (5’AGAGTTTGATCCTGGCTCAG) dan
1541R(5’AAGGAGGTGATCCAGCC). DNA template yang digunakan adalah 3 µl
dimasukkan ke dalam tabung eppendorf . Bahan-bahan untuk satu sampel dalam
reaksi PCR adalah 38,5 µl ddH2O, primer F dan R masing-masing 0.5 µl dan 2 µl 2.5
mM dNTP, taq-polymerase 0.5 µl dan 10 x buffer 5 µl dibuat dalam eppendorf 0.5
ml. Sebanyak 47 µl bahan di atas ditambahkan ke dalam tabung eppendorf DNA
template. Protokol PCR adalah sebanyak 35 siklus PCR ( predenaturasi 96°C selama
5 menit), (denaturasi 96°C selama 1 menit, annealing 55°C selama 1 menit),
(extension 72°C selama 3 menit dan final extension 72°C selama 7 menit). Produk
PCR dianalisa pada 1% gel agarose dan divisualisasi dengan ultraviolet illumination
setelah ditambah ethidium bromide 5 µl. Band DNA yang diperoleh pada agar
dipotong dan dipurifikasi dengan Promega Kit Protokol.
f) Gel Electrophoresis.
Setelah di PCR 3 μl DNA ditambah dengan 5 μl loading dying buffer
dielektroforesis pada 1 000 voltase selama 40 menit pada 1 % gel agarose dalam
0.5xTBE. Sebagai marker digunakan 1 kb DNA ladder (Takara). Gel kemudian
diletakkan di dalam wadah ditambah lagi dengan TBE sampai terendam serta zat
warna ethidium bromide (5 µl) direndam sambil digoyang dengan shacker (Rocker,
7/22/2019 Identifikasi Molekuler Dan Pengaruh Pemberian Potensial Probiotik Bakteri Asam Laktat Bal Asal Dadih Terhadap Kolesterol Daging Itik Bayang Sumber Daya …
http://slidepdf.com/reader/full/identifikasi-molekuler-dan-pengaruh-pemberian-potensial-probiotik-bakteri-asam 11/22
NB-104) selama 30 menit. Gel kemudian dilihat di bawah lampu UV (Mustopa,
2009).
g) Purifikasi DNA dengan Promega Kit Protocol, (Mustopa, 2009).
Band DNA dipotong dari gel agarose. Dimasukkan gel ke dalam tabung
eppendorf dan ditambah 300 µl nucleuse free water , kemudian diletakkan di
waterbath pada 60°C selama 10 menit. Dimasukkan sampel pada kolom QIAquick
dan disentrifugasi 10 000 rpm selama 45 detik pada suhu ruang. Ditambahkan 700 µl
membrane wash solution dan disentrifugasi 10 000 rpm selam 1 menit pada suhu
ruang. Ditambahkan lagi 700 µl membrane wash solution dan disentrifugasi lagi 10
000 rpm selama 1 menit pada suhu ruang. Dipindahkan kolom QIAquick pada 1.5 ml
tabung eppendorf baru dan ditambah elusi (30 µl nuclease free water ) pada bagian
tengah kolom QIAquick . Ditunggu 1 menit, kemudian dipindahkan ke dalam tabung
eppendorf baru dan disentrifugasi 10 000 rpm selama 2 menit, lalu disimpan pada
suhu – 20°C.
h) Analisis Data Sekuensing
Analisis data sekuensing dilakukan dengan menggunakan program software
DNA star. Untuk analisa sequence alignment , dilakukan dengan membandingkan
sekuens yang diperoleh (query) dengan yang telah ada pada Gene Bank dengan data
base searches NCBI internet site (http//www.ncbi.nlm.nih.gov) menggunakan
BLAST ( Basic Local Alignment Search Tool ), selanjutnya untuk melihat
kekerabatannya dilanjutkan dengan Clustal W (Mustopa, 2009).
7/22/2019 Identifikasi Molekuler Dan Pengaruh Pemberian Potensial Probiotik Bakteri Asam Laktat Bal Asal Dadih Terhadap Kolesterol Daging Itik Bayang Sumber Daya …
http://slidepdf.com/reader/full/identifikasi-molekuler-dan-pengaruh-pemberian-potensial-probiotik-bakteri-asam 12/22
i) Pemberian Weisel la paramsentr oides pada Itik Bayang
Stok kultur ( glicerol stock ) bakteri probiotik Weisella paramsentroides dari
dadih ditumbuhkan dalam media MRS Broth dan diinkubasi pada suhu 37
0
C dalam
shaker inkubator selama 24 jam. Setelah 24 jam, kultur disentrifus selama 5 menit
dengan kecepatan 12 000 rpm. Lalu dibuang supernatannya dan dibilas dengan air
saline (NaCl 0,10%). Kemudian diatur sampai Optical Density (ODλ=580) dan
absorban menunjukkan 0. Sampel ini yang diberikan pada itik Bayang sesuai dengan
perlakuan. Pemberian Weisella paramesentroides pertama kali diberikan setelah itik
Bayang beradaptasi dikandang selama 10 hari kemudian diberikan lagi pemberian
tahap kedua selang 10 hari kemudian. 10 hari setelah pemberian yang kedua itik atau
itik berumur 2 bulan dipotong untuk analisa kadar kolesterol dagingnya.
j) Kolesterol Daging Itik Bayang
Cara ekstraksi bahan untuk analisis kadar kholesterol menurut Plummer (1978):
Sampel diambil sebanyak 1 g, dimasukkan ke dalam tabung reaksi kemudian
tambahkan 10 ml Aceton Etanol. Pelarut Aceton Etanol dengan sampel diuapkan
didalam waterbath pada suhu 60˚C sehingga volume pelarut separuh dari volume
awal atau diuapkan selama 15 menit. Pelarut yang tinggal disaring dengan
menggunakan kertas Whatman 41. Residu sampel dilarutkan kembali dengan Aceton
Etanol sebanyak 5 ml, kemudian diuapkan kembali pada suhu 60˚C selama 10 menit.
Pelarut yang tersisa disaring dan diulang sekali lagi. Hasil ekstraksi dipanaskan di
dalam waterbath pada suhu 60˚C sehingga volume pelarut yang tertinggal adalah 1
ml. Larutan ekstraksi ini kemudian dianalisa kadar kolesterolnya.
7/22/2019 Identifikasi Molekuler Dan Pengaruh Pemberian Potensial Probiotik Bakteri Asam Laktat Bal Asal Dadih Terhadap Kolesterol Daging Itik Bayang Sumber Daya …
http://slidepdf.com/reader/full/identifikasi-molekuler-dan-pengaruh-pemberian-potensial-probiotik-bakteri-asam 13/22
Analisis kolesterol dengan metode Warna Enzimatik (SHM, 2000) : Sebanyak
1 ml reagent (kit) kolesterol dipipetkan ke dalam tabung reaksi kemudian
ditambahkan serum atau hasil ekstraksi sebanyak 0.01 ml. Larutan kemudian
diinkubasi selama 20 menit di dalam waterbath pada suhu 37˚C sehingga warna
larutan berubah menjadi warna lembayung. Pembuatan blanko: 1 ml kit kolesterol
dipipetkan ke dalam tabung reaksi. Blanko dibuat sebagai pembanding. Setiap satu
analisa dibuatkan satu seri blanko. Blanko dimasukkan ke dalam sel spektrofotometer
setelah diarahkan pada panjang gelombang 520 nm, setelah angka dimonitor
menunjukkan angka 0 dimasukkan sampel yang akan dibaca. Kadar kolesterol
merupakan angka yang terbaca di monitor spektrofotometer.
HASIL DAN PEMBAHASAN
Dadih Jorong Sitingkai Kecamatan Palupuh Kabupaten Agam
Pengambilan sampel dilakukan di Jorong Sitingkai Kecamatan Palupuh
Kabupaten Agam. Daerah Sitingkai merupakan daerah penghasil dadih di Kabupaten
Agam, dadih dari Sitingkai biasanya di jual langsung oleh peternak ke Bukittinggi.
Adapun cara pembuatan dadihnya adalah: Kerbau diperah, sebelumnya ambing
kerbau dibersihkan, kemudian pada saat pemerahan, kerbau diberi pakan berupa
rumput liar (asal tidak beracun), susu ditampung menggunakan teko air, kemudian
susu disaring sebanyak 0.25 l, kemudian baru ditambah starter berupa dadih yang
telah jadi sebanyak 5 sendok makan. Kemudian bambu ditutup menggunakan plastik
bening, diikat dengan karet gelang dan disimpan dalam peti terbuat dari kayu di suatu
ruangan dan diperam selama 3 hari.
7/22/2019 Identifikasi Molekuler Dan Pengaruh Pemberian Potensial Probiotik Bakteri Asam Laktat Bal Asal Dadih Terhadap Kolesterol Daging Itik Bayang Sumber Daya …
http://slidepdf.com/reader/full/identifikasi-molekuler-dan-pengaruh-pemberian-potensial-probiotik-bakteri-asam 14/22
Total Koloni Bakteri Asam Laktat
Dari hasil penelitian didapatkan total koloni BAL yang dihitung dengan
rumus CFU/g adalah 2.31 x 10
8
CFU/g, total koloni ini lebih tinggi bila dibandingkan
dengan penelitian Sugitha et al, (1997) dengan rata-rata koloni bakteri adalah 3.33 x
105 – 121 x 10
5 koloni per ml bakteri dadih yang dibuat dalam tabung plastik dengan
penambahan starter Streptococcus lactis. Jumlah total koloni pada dadih dari
Sitingkai ini telah sesuai dengan kriteria FAO/WHO (2001), karena sebagai pangan
probiotik total koloni BAL yang dihasilkan berada pada jumlah 106 – 10
8 CFU/g.
Isolasi Bakteri Asam Laktat dan Pewarnaan Gram
Pada waktu melakukan isolasi BAL dari dadih Sitingkai secara konvensional
didapatkan koloni BAL yang berwarna putih kekuningan pada MRS Agar dengan
pengenceran 10-7
. Hal ini sesuai dengan penelitian Purwati et al . (2005) bahwa koloni
BAL pada media MRS agar berwarna putih kekuningan seperti pada Gambar 1.
Gambar 1. Penampakan Koloni BAL 10-7 pada Medium MRS Agar
Tahap selanjutnya dilakukan pemurnian sampai dua kali pemurnian untuk
bakterial stock yang akan digunakan untuk uji selanjutnya, untuk pewarnaan gram,
koloni yang dipilih adalah koloni yang masih muda berumur ± 18 jam. Tujuannya
adalah agar bakteri tidak terlalu tua untuk diuji, karena Menurut Unus (2005) jika
Koloni
BAL
7/22/2019 Identifikasi Molekuler Dan Pengaruh Pemberian Potensial Probiotik Bakteri Asam Laktat Bal Asal Dadih Terhadap Kolesterol Daging Itik Bayang Sumber Daya …
http://slidepdf.com/reader/full/identifikasi-molekuler-dan-pengaruh-pemberian-potensial-probiotik-bakteri-asam 15/22
bakteri terlalu tua maka bakteri akan cenderung menyerap warna safranin (merah)
sehingga akan dinyatakan gram negatif walaupun bakteri tersebut adalah bakteri gram
positif.
Hasil isolasi BAL dan pewarnaan gram dari dadih Sitingkai adalah Gram
Positif (+) dengan Morfologi batang ( Bacill), hal ini sesuai dengan pernyataan Unus
(2005) yang menyatakan bahwa bakteri gram positif akan mengambil warna crystal
violet yang berwarna ungu walaupun sudah dicuci dengan alkohol dan ketika diberi
safranin yang berwarna merah, bakteri tersebut tetap akan berwarna ungu sedangkan
warna merah menunjukkan bakteri gram negatif. Selain itu hal ini juga sesuai dengan
penelitian Sujaya, et al , (2008) bahwa isolat yang teridentifikasi sebagai
Lactobacillus sp, Weissella sp dan Leuconostoc sp mempunyai bentuk sel batang.
BAL yang diisolasi dari dadih ada berbentuk batang seperti Lactobacillus sp dan
berbentuk bulat seperti Pediococcus sp dan Enterococcus sp.
Resistensi Anti Mikroba Bakteri Asam Laktat
Uji resistensi anti mikroba BAL dilakukan terhadap lima bakteri uji yaitu
Eschericia coli NBRC 14237 , Staphylococcus aureus NBRC 13276 , Bacillus subtilis
BTCCB 612, Salmonella tyhpii dan Lysteria monocytogenesis. Adapun hasil uji
resistensi anti mikroba yang telah dilakukan terhadap ke-5 bakteri patogen dapat
dilihat pada Tabel. 1.
7/22/2019 Identifikasi Molekuler Dan Pengaruh Pemberian Potensial Probiotik Bakteri Asam Laktat Bal Asal Dadih Terhadap Kolesterol Daging Itik Bayang Sumber Daya …
http://slidepdf.com/reader/full/identifikasi-molekuler-dan-pengaruh-pemberian-potensial-probiotik-bakteri-asam 16/22
Tabel 1. Pengamatan Resistensi Anti Mikroba BAL terhadap 5 Bakteri Patogen pada
Waktu 24 Jam
Isolat BAL BakteriPatogen
L. monocytogenes B. subti li s S. aureus E.coli S.typhi i
BAL dadih Sitingkai - + ++ - ++
Keterangan : Zona Hambat (mm) : ++ = 8-14 mm; + = 1-7 mm; - = tidak memiliki
zona hambat.
Dilihat dari Tabel 1, BAL dadih Sitingkai mempunyai zona hambat yang
terbaik terhadap S. aureus dan Salmonella tyhpii dengan nilai zona hambat berkisaran
8-14 mm, sedangkan terhadap bakteri B. subtilis kisaran nilai 1-7 mm selanjutnya
tidak mampu menghambat pertumbuhan bakteri L. Monocytogenes dan E. coli.
Identifikasi Bakteri Asam Laktat dengan 16S rRNA
Amplifikasi gen 16S rRNA dengan PCR
Setelah dilakukan isolasi BAL dan uji resistensi, kemudian dilanjutkan
dengan amplifikasi gen 16S rRNA dengan PCR 35 siklus untuk menentukan genus
dan spesies BAL secara akurat. Hal ini sesuai dengan penelitian Mustopa (2009) yang
menyatakan dalam 16S rRNA menggunakan primer: 8 F:
AGAGTTTGATCCTGGCTAG dan primer 1541 R: AAGGAGGTGATCCAGCC
dapat menghasilkan genus dan spesies yang spesifik. Gambar 2 berikut ini merupakan
gambar hasil amplifikasi gen 16S rRNA.
7/22/2019 Identifikasi Molekuler Dan Pengaruh Pemberian Potensial Probiotik Bakteri Asam Laktat Bal Asal Dadih Terhadap Kolesterol Daging Itik Bayang Sumber Daya …
http://slidepdf.com/reader/full/identifikasi-molekuler-dan-pengaruh-pemberian-potensial-probiotik-bakteri-asam 17/22
2 kb
1500 bp1 kb
M Isolat Dadih Sitingkai
Gambar 2. Hasil Amplifikasi Gen 16S rRNA
Pada Gambar 2 terlihat hasil elektroforesis menunjukkan kegiatan PCR yang
telah dilakukan berhasil mengamplifikasikan daerah gen 16S rRNA. Hal ini dapat
dilihat dengan munculnya fragmen produk PCR dengan ukuran 1500 base pare (bp)
(1.5 kilo bite (kb)) yang merupakan ukuran yang diharapkan dengan menggunakan
kombinasi primer 8 F : GAGTTTGATCCTGGCTCAG untuk arah forward dan
primer 1541 R : AAGGAGGTGATCCAGCC untuk arah reverse. Dari gambar 2
dapat dilihat bahwa intensitas fragmen yang dihasilkan cukup tinggi dan layak
digunakan untuk kegiatan sekuensing pada tahap berikutnya. Dimana terlihat jelas
band yang terbentuk dan tidak ditemukan smear.
Analisis Sekuen Gen 16S rRNA Isolat dari Dadih
Proses sekuensing gen 16S rRNA yang diperoleh dari kegiatan amplifikasi
dilakukan oleh Vivantis Syah Alam Selangor Malaysia. Sekuensing dilakukan secara
two road direction menggunakan primer yang sama dengan amplifikasi gen 16S
7/22/2019 Identifikasi Molekuler Dan Pengaruh Pemberian Potensial Probiotik Bakteri Asam Laktat Bal Asal Dadih Terhadap Kolesterol Daging Itik Bayang Sumber Daya …
http://slidepdf.com/reader/full/identifikasi-molekuler-dan-pengaruh-pemberian-potensial-probiotik-bakteri-asam 18/22
rRNA dengan PCR. Hasil data sekuensing yang diperoleh dari isolat diedit
menggunakan software DNASTAR (Madison Wisconsin-USA). Total nukleotid gen
16S rRNA yang berhasil tersekuen 1 037 bp. Sementara gen 16S rRNA yang
teramplifikasi dengan PCR berjumlah 1 500 bp Jadi dapat dilihat bahwa belum
tersekuensingnya seluruh nukleotid yang pada daerah 16S rRNA. Sekuen yang telah
di edit akan disimpan dalam bentuk Notepad untuk tahap analisis BLAST NCBI.
Berdasarkan pembandingan isolat BAL dadih Sitingkai dengan ukuran 1 500
bp (1.5 kb) dengan Gen Bank memiliki persentase kesamaan tertinggi sebesar 99%
dengan Weissella pharamesenteroides, dimana nilai maksimum 1323, nilai total 1531
dan kesamaan sekuen DNA dengan Gen Bank data sebesar 93% serta nilai eror 0,0
atau tidak ada. Hal ini berbeda dengan penelitian Hosono et al. (1989) dalam Pato
(2003) bahwa BAL yang disolasi dari dadih adalah Lactobacillus brevis,
Streptococcus faecalis, Leuconostoc mesentroides dan Lactococcus lactis. Berbeda
juga dengan Soomro dan Masud (2006), melakukan isolasi BAL dari dadih Pakistan
dan berhasil mengisolasi Lactobacillus sp, Lactococcus sp dan Streptococcus sp.
Dengan demikian BAL yang di isolasi dari dadih Sitingkai sama dengan BAL dari
susu kuda liar Sumbawa seperti penelitian Sujaya et al . (2008) yaitu bakteri Weissella
pharamesenteroides yang mempunyai bentuk sel batang pendek.
Selain itu berdasarkan diagram filogenetik bakteri isolat Dadih asal Sitingkai
memiliki kekerabatan yang dekat dengan Weisella paramesentroides strain ZJ9 dan
Weisella paramesentroides strain TRJ. 1,4. namun isolat BAL dadih Sitingkai
memiliki kekerabatan yang jauh dengan Weisella paramesentroides strain NRIC.
Seperti terlihat dalam gambar 3.
7/22/2019 Identifikasi Molekuler Dan Pengaruh Pemberian Potensial Probiotik Bakteri Asam Laktat Bal Asal Dadih Terhadap Kolesterol Daging Itik Bayang Sumber Daya …
http://slidepdf.com/reader/full/identifikasi-molekuler-dan-pengaruh-pemberian-potensial-probiotik-bakteri-asam 19/22
Gambar 3. Gambar Filogenetik dari BAL Isolat Dadih Sitingkai terhadap Bakteri
Weisella paramesentroides
Kadar Kolesterol Daging Itik
Rataan kolesterol daging itik Bayang dengan pemberian probiotik Weisella
paramesentroides selama penelitian dapat dilihat pada Tabel 2.
Tabel 2. Rataan Kolesterol Daging Itik Bayang dengan Pemberian Probiotik Weisella
paramesentroides
Perlakuan Kadar Kolesterol daging itik
Bayang (mg/dl)
Kontrol (Tanpa Perlakuan/Placebo) 43,75a
A1 (1 ml Weisella paramesentroides) 29,75
A2 (2 ml Weisella paramesentroides) 30,75
A3 (3 ml Weisella paramesentroides) 32,25
Keterangan : superskrip yang berbeda pada kolom yang sama menunjukkan perbedaan yang sangat nyata (P<0,01)
Dari analisis statistik dapat disimpulkan bahwa pemberian probiotik Weisella
paramesentroides sangat nyata menurunkan kadar kolesterol daging itik Bayang,
namun pemberian dosis yang berbeda tidak memeberikan pengaruh yang signifikan
terhadap kolesterol daging itik. Pemberian 1 ml Weisella paramesentroides telah
nyata menurunkan kolesterol daging itik Bayang sebesar 32%, hal ini berbeda dengan
7/22/2019 Identifikasi Molekuler Dan Pengaruh Pemberian Potensial Probiotik Bakteri Asam Laktat Bal Asal Dadih Terhadap Kolesterol Daging Itik Bayang Sumber Daya …
http://slidepdf.com/reader/full/identifikasi-molekuler-dan-pengaruh-pemberian-potensial-probiotik-bakteri-asam 20/22
Kurnia (2011) yang memberikan 2 ml Lactococcus plantarum dari blondo untuk
menurunkan kolesterol telur ayam.
Penurunan kolesterol terjadi karena terhambatnya sintesa dari kolesterol sebab
adanya probiotik dalam usus mengakibatkan terhambatnya kerja enzim Hydroxi
Metyl Glutaryil-KoA reduktase (HMG-KoA reduktase) yang berperan dalam
pembentukan mevalonat dalam proses sintesis kolesterol sehingga tidak terbentuknya
kolesterol. Sesuai dengan Voet et al. (1999) menyatakan penurunan kolesterol terjadi
karena senyawa yang dihasilkan mikrobia berkompetisi dengan HMG-KoA untuk
berikatan dengan enzim HMG-KoA reduktase.
KESIMPULAN DAN SARAN
Kesimpulan
Dari penelitian yang dilakukan disimpulkan bahwa BAL yang diisolasi dari
dadih Sitingkai Kabupaten Agam adalah bakteri Weisella paramesentroides.
Pemberian 1,27 x 107
CFU/g probiotik Weisella paramesentroides nyata menurunkan
kadar kolesterol daging itik Bayang sebesar 32%.
Saran
Disarankan pada peneliti selanjutnya pemberian probiotik pada itik Bayang
hendaknya juga dilakukan pada pada itik Bayang betina untuk megetahui dosis
optimal menurunkan kadar kolesterol telur itik. Selain itu juga perlu dilakukan
pemurnian dan karakterisasi bakteriosin yang dihasilkan Weisella paramesentroides.
7/22/2019 Identifikasi Molekuler Dan Pengaruh Pemberian Potensial Probiotik Bakteri Asam Laktat Bal Asal Dadih Terhadap Kolesterol Daging Itik Bayang Sumber Daya …
http://slidepdf.com/reader/full/identifikasi-molekuler-dan-pengaruh-pemberian-potensial-probiotik-bakteri-asam 21/22
Ucapan Terima Kasih
Penulis menyampaikan terima kasih dan penghargaan yang setinggi-tingginya
kepada Direktorat Penelitian dan Pengabdian Kepada Masyarakat Direktorat
Pendidikan Tinggi Kementerian Pendidikan Nasional Republik Indonesia dengan
Nomorkontrak: 135/UN16/PL/2011 dan Pelaksana Program Penelitian Hibah
Pascasarjana Tahun Anggaran 2011, dengan Nomor kontrak :
394/SP2H/PL/Dit.litabmas/IV/2011 yaitu Prof. Drh. Hj. Endang Purwati, MS, Ph.D.
Kepada Ibu Prof. Dr. Sumaryati Syukur, M.Sc, selaku pembimbing I dan Ibu Prof.
Drh. Hj. Endang Purwati, MS, PhD selaku pembimbing II, kepada Bapak Dr. H.
Adlis Santoni, Prof. Dr. Admin Alif, M.Sc, Prof. Dr. Abdi Dharma, M.Sc yang telah
banyak memberikan bimbingan, pengarahan dan ilmu pengetahuan yang sangat
berarti bagi penulis.
Daftar Pustaka
Abdulrahim, S.M., M.S.Y. Haddadin, E.A.R. Haslamoun dan R.K. Robinson. 1996.
The influence of Lactobacillus achidophillus and bacitracin on layer
performance of chickens and cholesterol content of plasma and egg yolk.
British poultry. Sci.37:341-346.
Kusmiati dan Malik, A. 2002. Aktivitas Bakteriosin dari Bakteri Leuconostocmesenteroides Pbac1 pada Berbagai Media.
Kusumawati, N; Bettysri, L J; Siswa S; Ratihdewanti dan Hariadi. 2003. Seleksi
Bakteri Asam Laktat Indigenous sebagai Galur Probiotik dengan
Kemampuan Menurunkan Kolesterol. Journal Mikrobiologi Indonesia. Vol.
8(2): 39-43
Kurnia.Y.T. 2011. Pengaruh pemberian probiotik Lactococcus plantarum asal blondo
terhadap performans dan kualitas telur ayam petelur. Thesis Pasca Sarjana
Universitas Andalas, Padang.
Mustopa, A. 2009. Koleksi Protokol Laboratorium Virologi Molekuler. Pusat
Penelitian Bioteknologi. Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia, Bogor.
7/22/2019 Identifikasi Molekuler Dan Pengaruh Pemberian Potensial Probiotik Bakteri Asam Laktat Bal Asal Dadih Terhadap Kolesterol Daging Itik Bayang Sumber Daya …
http://slidepdf.com/reader/full/identifikasi-molekuler-dan-pengaruh-pemberian-potensial-probiotik-bakteri-asam 22/22
Pato, U. 2003. Potensi bakteri asam laktat yang diisolasi dari dadih untuk
menurunkan resiko penyakit kanker.Jurnal Natur Indonesia.Vol. 5 No.2
Hal.162-166.
Purwati, E., S. Syukur, dan Z. Hidayat. 2005. Lactobacillus sp. Isolasi dariBiovicophitomega sebagai Probiotik. Di dalam Proceeding Lembaga
Ilmu Pengetahuan Indonesia, Jakarta 24 -25 Januari 2005.
Samudra, R dan H. Arif. 2008. Warna kulit, lemak abdomen dan lemak karkas itik
alabio ( Anas plathyrhincosnborneo) jantan akibat pemberian azolla dalam
ransum. Animal Production Jurnal.hlm164-167.
Setiabudi. 2011. Daftar kontrol makanan dan kandungan kolesterolnya. www.
Metasolusisehat.com.
SHM. 2000. Prosedur Reagensia Kimia Klinik. PT. Segara Husada Mandiri, Jakarta
Soomro, A. H dan T. Masud. 2007. Protein Pattern and plasmid profile of lactic acid
bacteria isolated from dahi, a traditional fermented milk product of pakistan.
Journal of Food Technol. Biotechnol . 45 (4) 447 – 453.
Sugitha, I. M. 1995. Olahan susu kerbau tradisional Minang, manfaat, kendala dan
prospeknya dalam era industrialisasi Sumatera Barat. Seminar Sehari
Teknologi Hasil Ternak Fakultas Peternakan. Universitas Andalas, Padang.
Sugitha, I. M., Allismawita, E. Martinelly, Y. Heryandi dan Yuherman. 1997.
Kandungan vitamin A dan kadar lemak pada dadih dalam tabung plastik
dengan starter Streptococcus lactis. Laporan Penelitian. Departemen
Pendidikan dan Kebudayaan Universitas Andalas Lembaga Penelitian,
Padang.
Sujaya, N., Y. Ramona., P. N. Widarini., P. N. Suarini., U. M. I. Dwipayanti, A. K.
Nocianitri dan W. Y Nursini. 2008. Isolasi dan karakterisasi bakteri asam
laktat dari kuda Sumbawa. Jurnal Veteriner Vol. 9. No. 2 Edisi Juni 2008.
Fakultas Teknologi Pertanian Universitas Udayana, Bali.
Unus, S. 2005. Mikrobiologi Dasar. Papas Sinar Sinanti, Jakarta.
Voet, D., J.G. Voet dan C.W. Pratt. 1999. Fundamentals of Biochemistry. Brisbane:
John Willey and Sons.