Identifikasi Molekuler Dan Pengaruh Pemberian Potensial Probiotik Bakteri Asam Laktat Bal Asal Dadih...

7/22/2019 Identifikasi Molekuler Dan Pengaruh Pemberian Potensial Probiotik Bakteri Asam Laktat Bal Asal Dadih Terhadap Kolesterol Daging Itik Bayang Sumber Daya …

http://slidepdf.com/reader/full/identifikasi-molekuler-dan-pengaruh-pemberian-potensial-probiotik-bakteri-asam 1/22

IDENTIFIKASI MOLEKULER DAN PENGARUH PEMBERIAN

POTENSIAL PROBIOTIK BAKTERI ASAM LAKTAT (BAL)

ASAL DADIH TERHADAP KOLESTEROL DAGING ITIK

BAYANG SUMBER DAYA GENETIK SUMATERA BARAT

ARTIKEL

Oleh:

RONAL DEPSON

0821207020

PROGRAM PASCASARJANA

UNIVERSITAS ANDALAS

PADANG

2012



Identifikasi Molekuler dan Pengaruh Pemberian Potensial Probiotik Bakteri

Asam Laktat (BAL) Asal Dadih Terhadap Kolesterol Daging Itik Bayang

Sebagai Sumber Daya Genetik Sumatera Barat Ronal Depson, di bawah bimbingan :

Prof. Dr. Sumaryati Syukur, MSc dan Prof. Drh. Hj. Endang Purwati, MS, PhD

Abstrak

Ternak itik lokal merupakan ternak unggas penghasil telur, daging dan bulu.

Produksi telur itik lokal mencapai 220 butir pertahun dan persentase karkas daging

itik jantan sangat tinggi mencapai 70%. Sumatera Barat memiliki itik Bayang sebagai

sumber daya genetik yang dipelihara peternak di Kecamatan Bayang KabupatenPesisir Selatan. Itik Bayang dipelihara secara ekstensif dengan melepaskannya di

sawah pada siang hari dan mengkandangkannya dimalam hari. Namun daging itik

memiliki kadar kolesterol 50 mg/dl dan kadar lemak 17%, sehingga perlu upayauntuk menurunkan kadar lemak dan kolesterol daging itik tersebut. Upaya tersebutadalah dengan melakukan pemberian probiotik Bakteri Asam Laktat (BAL) yang

diisolasi dari dadih Sitingkai Kecamatan Palupuh. Selain itu juga perlu dilakukan

identifikasi molekuler BAL asal dadih Sitingkai tersebut.Penelitian ini dilakukan untuk mengetahui karakteristik molekuler dan

pengaruh pemberian probiotik BAL asal dadih Sitingkai terhadap kadar kolesterol

daging itik Bayang. Penelitian ini merupakan penelitian eksperimen dengan

rancangan acak lengkap (RAL), empat perlakuan dan empat kali ulangan. PerlakuanA adalah kontrol (tanpa pemberian probiotik/ placebo); B (pemberian 1,27 x 10

7

CFU/g probiotik Weisella paramesenteroides); C (pemberian 2,54 x 107 CFU/g

probiotik Weisella paramesenteroides) dan D (pemberian 3,81 x 107 CFU/g probiotikWeisella paramesenteroides). Pemberian probiotik dilakukan selama 1 bulan, setelah

itik Bayang berumur 1 bulan.

Hasil penelitian menunjukkan bahwa bakteri probiotik BAL dadih Sitingkaiadalah Weisella paramesenteroides dengan tingkat kesamaan dengan Gen Bank data

mencapai 99% melalui analisis BLAST. Pemberian probiotik Weisella

paramesenteroides mampu menurunkan kadar kolesterol daging itik Bayang 32%

pada dosis 1 ml (1,27 x 107 CFU/g).

Kata kunci : kolesterol, probiotik, Weisella paramesenteroides, dadih, itik Bayang.



PENDAHULUAN

Produk peternakan terutama daging dan telur itik serta olahannya sangat

diminati dan disukai masyarakat, berbagai macam pangan berbahan baku daging dan

telur itik sangat banyak kita jumpai pada kehidupan sehari-hari. Ternak itik

merupakan ternak unggas penghasil telur (220 butir/tahun), daging (70%) dan bulu.

Sumatera Barat memiliki itik Bayang sebagai sumber daya genetik yang dipelihara

peternak di Kecamatan Bayang Kabupaten Pesisir Selatan. Itik Bayang betina

dipelihara sebagai penghasil telur dan yang jantannya sebagai pedaging.

Namun demikian, daging itik mengandung lemak yang cukup tinggi yaitu

17% (Erlian dan Jailani, 2001 dalam Samudra dan Arif, 2008) dan kolesterol itik

mencapai 50 mg/dl (Setiabudi, 2011). Oleh sebab itu perlu upaya untuk menurunkan

kadar kolesterol tersebut. Salah satu upaya tersebut adalah dengan pemberian

probiotik pada ternak itik karena probiotik mempunyai kemampuan untuk

menurunkan kadar kolesterol serum darah (Kusumawati, et al., 2003) dan kandungan

kolesterol telur ayam (Abdulrahim, et al., 1996). Salah satu probiotik adalah Bakteri

Asam Laktat (BAL) yang mampu memproduksi asam laktat sebagai produk akhir

perombakan karbohidrat, hydrogen peroksida dan bakteriosin. Beberapa jenis

bakteriosin dari BAL mempunyai spektrum yang luas dan mempunyai aktivitas

menghambat terhadap pertumbuhan beberapa bakteri patogen pada makanan seperti

Listeria monocytogenes dan Staphylococcus aureus (Kusmiati dan Malik, 2002).

BAL dapat diisolasi dari dadih yang merupakan produk olahan khas Sumatera

Barat yang terbuat dari susu kerbau dengan cara fermentasi alami pada suhu kamar

selama 2 hari (Sugitha, 1995). Dadih yang diproduksi masing-masing daerah berbeda



rasa dan aromanya hal ini dikarenakan bakteri potensial yang terdapat dalam dadih

tersebut berbeda. Adapun daerah di Sumatera Barat yang berpotensi untuk

memproduksi dadih yaitu daerah Alahan Panjang (Aia Dingin) Kabupaten Solok,

(Sitingkai) Kabupaten Agam, (Tanjung Bonai) Kabupaten Tanah Datar, (Kelurahan

Batu Payung Gadut) Kabupaten Limapuluh Kota, (Batang Panjang) Kabupaten

Sijunjung.

Tujuan penelitian adalah untuk mengetahui karakteristik molekuler dan

pengaruh pemberian dosis potensial probiotik BAL asal dadih Sitingkai terhadap

kolesterol daging itik Bayang pedaging. Hasil penelitian ini dapat memberikan

informasi ilmiah karakteristik molekuler bakteri potensial probiotik BAL asal dadih

Sitingkai untuk menurunkan kolesterol pada daging itik Bayang pedaging.

MATERI DAN METODE

Materi

Sampel dadih diperoleh dari Jorong Sitingkai Kanagarian Pasia Laweh

Kecamatan Palupuh Kabupaten Agam. Sedangkan ternak itik Bayang pedaging jantan

diperoleh dari Kecamatan Bayang Kabupaten Pesisir Selatan Sumatera Barat.

Penelitian ini dilakukan dengan metode eksperimen dengan rancangan acak lengkap

(RAL) pola 4 x 4, dimana ada 4 perlakuan dengan 4 kali ulangan dan setiap unit

terdapat 4 ekor itik Bayang. Perlakuan adalah dosis bakteri probiotik Weisella

paramesentroides yang diberikan pada itik Bayang yaitu Perlakuan A (sebagai

Kontrol), Perlakuan B (pemberian 1,27 x 107 CFU/g Weisella paramesentroides),

Perlakuan C (Pemberian 2,54 x 107 CFU/g Weisella paramesentroides), Perlakuan D



(pemberian 3,81 x 107 CFU/g Weisella paramesentroides), Kemudian dilakukan

isolasi dan karakteristik di laboratorium Teknologi Hasil Ternak serta untuk uji

biologis dilakukan di kandang penelitian.

Cara Kerja

a) Total Koloni BAL (Purwati et al., 2005)

Semua peralatan yang dibutuhkan seperti: cawan petri ( petridish), tabung reaksi,

erlenmeyer, tabung eppendorf , tip pipet mikro, hockey stick , disterilkan dalam

autoclave pada suhu 121ºC selama 15 menit dengan tekanan 15 lbs. Dipersiapkan

media preenrichment yaitu dengan melarutkan 7.05 g de Mann Rogosa Sharpe

(MRS) Broth (Merck) dalam 135 ml aquades untuk 3 sampel dan sampai

pengenceran 510

(Pembuatan secara umum adalah 52.2 g MRS Broth dalam 1 000

ml aquades). Selanjutnya dihomogenisasi dengan magnetic stirrer diatas hot-plate

pada suhu 100ºC, kemudian di autoclave (15 menit, 121ºC dan tekanan 15 lbs).

Dipersiapkan media MRS Agar dengan melarutkan 2.98 g MRS Agar dalam 45 ml

aquades (Pembuatan secara umum adalah 66.2 g MRS Agar dalam 1 000 ml

aquades), kemudian dihomogenisasi dengan magnetic stirrer , diatas hot plate pada

suhu 100ºC, lalu di autoclave, setelah agak dingin (± 55ºC) lalu dituang ke dalam 7

cawan petri masing-masing sebanyak ± 15 ml. Dengan menggunakan sendok steril

dan aluminium foil dadih ditimbang sebanyak 1 g, kemudian dilarutkan dengan 9 ml

larutan MRS Broth, lalu divortex sampai homogen. Hasil ini disebut pengenceran

110

. Hasil pengenceran tersebut diambil 1 ml dimasukkan ke dalam tabung reaksi

yang berisi 9 ml larutan MRS Broth, lalu divortex sampai homogen. Hasil



pengenceran ini disebut dengan pengenceran 210

, begitu seterusnya sampai pada

pengenceran 510

. Dari pengenceran 510

diambil 100 µl sampel dan ditanam

dengan metode spread pada petridish yang telah berisi media MRS Agar kemudian

diratakan dengan hockey stick yang sebelumnya telah diberi alkohol dan dibakar

dengan bunsen. Pekerjaan ini dilakukan dalam lamina flow dan di dekat bunsen.

Inokulum disimpan dalam anaerob jar lalu dimasukkan dalam inkubator selama 24

jam pada suhu 37ºC dan dilakukan pengkodean petridish dengan menandai masing-

masing petridish. Setelah 24 jam, koloni BAL yang tumbuh dilihat dengan

menggunakan alat quebec colony counter. Total koloni BAL/Colony Forming Unit

(CFU)/g dihitung dengan rumus sebagai berikut :

CFU/g = jumlah koloni BALl BeratSampe

xn Pengencera

x 11

b) Isolasi BAL dan Pewarnaan Gram (Purwati et al., 2005)

Semua peralatan yang dibutuhkan seperti: cawan petri, tabung reaksi,

erlenmeyer, tip pipet mikro, hockey stick , disterilkan dalam autoclave pada suhu

121ºC selama 15 menit dengan tekanan 15 lbs. Dipersiapkan media enrichment yaitu

dengan melarutkan 9.87 g MRS Broth dalam 189 ml aquades kemudian dipanaskan

sambil dihomogenisasi dengan hot plate – stirrer pada suhu 100ºC, lalu di autoclave

(15 menit, 121 ºC dan tekanan 15 lbs). Dipersiapkan media MRS Agar dengan

melarutkan 5.96 g MRS Agar dalam 90 ml aquades kemudian dipanaskan sambil

dihomogenisasi dengan hot plate – stirrer pada suhu 100ºC, lalu di autoclave, setelah

agak dingin (± 55ºC) dituang ke dalam masing-masing cawan petri sebanyak ± 15



ml. Menggunakan sendok steril dan aluminium foil dadih ditimbang sebanyak 1 g,

kemudian dilarutkan dengan 9 ml larutan MRS Broth dalam tabung reaksi, lalu

divortex sampai homogen. Hasil ini disebut pengenceran1

10

, dimasukkan ke dalam

anaerob jar , kemudian diinkubasi selama 24 jam dalam inkubator dengan suhu 37ºC.

Hasil 110

tersebut diambil 1 ml dimasukkan ke dalam tabung reaksi yang berisi 9 ml

larutan MRS Broth, lalu divortex sampai homogen. Hasil pengenceran ini disebut

dengan pengenceran 210

, begitu seterusnya sampai pada pengenceran 710

. Dari

pengenceran 710

diambil 100 µl sampel dan ditanam dengan metode spread pada

petridish yang telah berisi media MRS Agar, kemudian diratakan dengan hockey stick

yang sebelumnya disteril dengan alkohol dan dibakar dengan bunsen lalu diangin-

anginkan. Inokulum disimpan dalam anaerob jar kemudian diinkubasi dalam

inkubator selama 48 jam pada suhu 37ºC dan dilakukan pengkodean petridish dengan

menandai masing-masing petridish. Setelah 48 jam, single colony yang mencirikan

BAL yaitu bulat licin berwarna putih kekuningan dipindahkan ke media MRS Agar

untuk pemurnian koloni dengan metode streak yaitu dengan menggunakan jarum ose

kenudian diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37ºC. Koloni yang menciri BAL

dilakukan pewarnaan gram menurut prosedur Dwidjoseputro (1989) sebagai berikut :

1) Diambil biakan bakteri dan bakteri diratakan di atas kaca benda ( preparat ) yang

telah dibersihkan dengan alkohol, 2) lalu dikeringkan di atas bunsen atau alat

pengering, 3) ditetesi dengan zat warna kristal violet, 4) kemudian ditunggu selama 1

menit agar zat warna meresap oleh bakteri, 5) lalu dibilas dengan air mengalir dan

ditetesi dengan larutan iodin kompleks, kemudian ditunggu selama 1 menit, lalu



dibilas dengan air mengalir, 6) dicuci dengan alkohol dengan cara mencelupkan ke

dalam alkohol encer, 7) ditetesi dengan zat warna safranin, lalu ditunggu 30 detik, 8)

setelah itu dikeringkan dan diperiksa di bawah mikroskop dengan menggunakan

minyak celup (minyak inersi).

c) Resistensi Anti Mikroba BAL

Uji resistensi antimikroba BAL dilakukan terhadap lima bakteri uji yaitu

Eschericia coli NBRC 14237 , Staphylococcus aureus NBRC 13276 , Bacillus subtilis

BTCCB 612, Salmonella tyhpiidan Lysteria monocytogenesis (Koleksi Pusat

Penelitian Kimia LIPI Bandung). Kultur BAL 3 ml disentrifuse dengan kecepatan 8

000 rpm selama 5 menit dengan suhu 4ºC, kemudian supernatannya digunakan untuk

resistensi antimikroba. Bakteri uji 200 μl yang sudah diremajakan kembali dalam

Nutrient Broth (NB) masing-masingnya dituang ke dalam 20 ml media Nutrient Agar

(NA) yang masih cair, suhu berkisar antara 40ºC, kemudian baru dituang ke dalam

cawan petri steril, dibiarkan selama 30 menit agar mengeras. Diletakkan kertas

cakram steril dengan pinset diatas NA tersebut kemudian diteteskan 20 μl supernatan

BAL dengan pipet mikro, lalu diletakkan juga antibiotic testing paper yaitu Penicillin

sebagai pembanding , kemudian diinkubasi pada suhu 37ºC secara anaerob.

Dilakukan pengamatan terhadap zona hambat dengan cara mengukur zona bening

yang berbentuk lingkaran pada jam ke- 24 dengan menggunakan mistar (Mustopa,

2009).



d) Isolasi Genomik DNA BAL, (Mustopa, 2009).

Diinokulasikan kultur BAL ke dalam 3 ml MRS Broth, kemudian diinkubasi 24

jam pada suhu 37°C. Diambil 1 ml yang telah tumbuh tersebut kemudian dipindahkan

ke tabung eppendorf dan disentrifugasi dengan kecepatan 10 000 rpm (4°C) 15 menit.

Didapat pellet dan supernatan, pellet digunakan untuk isolasi genomik DNA

sedangkan supernatan digunakan untuk uji resistensi anti mikroba BAL. Pellet

ditambah 500 µl Tris-EDTA (TE) (10 mM Tris-HCl, 1mM EDTA dan pH 7.6).

Ditambah lysozyme 40 µl dan inkubasi selama 1 jam dengan suhu 37°C. Setelah itu

ditambahkan 200 µl 10% SDS, NaCl 5M dan 80 µl CTAB 10% (sebelumnya, CTAB

10% sudah ditambah dengan 20 µl mercapetanol di dalam tabung eppendorf 1 ml).

Setelah itu dipanaskan pada suhu 68°C selama 30 menit (dibolak-balik setiap 10

menit), lalu didinginkan sebentar kemudian ditambahkan khloroform (100 %) (1 : 1

perbandingan bahan dengan volume sampel). Setelah itu disentrifugasi 10 000 rpm

(4°C) selama 15 menit, lalu supernatan yang bagian paling atas (bening) diambil dan

dipindahkan ke tabung eppendorf baru. Ditambahkan ethanol 100% (dingin)

sebanyak 1 kali volume sampel, campuran tersebut disentrifus 10 menit dengan

kecepatan 10 000 rpm (4°C). Supernatan dibuang, lalu tabung eppendorf dicuci

dengan ethanol 70% sebanyak 1/2 ml. Disentrifus selama 5 menit dengan kecepatan

10 000 rpm (4°C). Tabung eppendorf dimiringkan selama 1 jam di atas tisue sampai

cairannya kering, kemudian ditambahkan 27 µl ddH2O dan 3 µl RNAse, diinkubasi

setengah jam (37°C), disimpan di -20°C.



e) Reaksi 16S rRNA PCR, (Mustopa, 2009).

Isolasi genomik DNA dari koloni bakteri murni diamplifikasi dengan PCR.

Reaksi amplifikasi DNA dilakukan dalam Thermocycler Mupid-Exu dengan

menggunakan primer 8F (5’AGAGTTTGATCCTGGCTCAG) dan

1541R(5’AAGGAGGTGATCCAGCC). DNA template yang digunakan adalah 3 µl

dimasukkan ke dalam tabung eppendorf . Bahan-bahan untuk satu sampel dalam

reaksi PCR adalah 38,5 µl ddH2O, primer F dan R masing-masing 0.5 µl dan 2 µl 2.5

mM dNTP, taq-polymerase 0.5 µl dan 10 x buffer 5 µl dibuat dalam eppendorf 0.5

ml. Sebanyak 47 µl bahan di atas ditambahkan ke dalam tabung eppendorf DNA

template. Protokol PCR adalah sebanyak 35 siklus PCR ( predenaturasi 96°C selama

5 menit), (denaturasi 96°C selama 1 menit, annealing 55°C selama 1 menit),

(extension 72°C selama 3 menit dan final extension 72°C selama 7 menit). Produk

PCR dianalisa pada 1% gel agarose dan divisualisasi dengan ultraviolet illumination

setelah ditambah ethidium bromide 5 µl. Band DNA yang diperoleh pada agar

dipotong dan dipurifikasi dengan Promega Kit Protokol.

f) Gel Electrophoresis.

Setelah di PCR 3 μl DNA ditambah dengan 5 μl loading dying buffer

dielektroforesis pada 1 000 voltase selama 40 menit pada 1 % gel agarose dalam

0.5xTBE. Sebagai marker digunakan 1 kb DNA ladder (Takara). Gel kemudian

diletakkan di dalam wadah ditambah lagi dengan TBE sampai terendam serta zat

warna ethidium bromide (5 µl) direndam sambil digoyang dengan shacker (Rocker,



NB-104) selama 30 menit. Gel kemudian dilihat di bawah lampu UV (Mustopa,

2009).

g) Purifikasi DNA dengan Promega Kit Protocol, (Mustopa, 2009).

Band DNA dipotong dari gel agarose. Dimasukkan gel ke dalam tabung

eppendorf dan ditambah 300 µl nucleuse free water , kemudian diletakkan di

waterbath pada 60°C selama 10 menit. Dimasukkan sampel pada kolom QIAquick

dan disentrifugasi 10 000 rpm selama 45 detik pada suhu ruang. Ditambahkan 700 µl

membrane wash solution dan disentrifugasi 10 000 rpm selam 1 menit pada suhu

ruang. Ditambahkan lagi 700 µl membrane wash solution dan disentrifugasi lagi 10

000 rpm selama 1 menit pada suhu ruang. Dipindahkan kolom QIAquick pada 1.5 ml

tabung eppendorf baru dan ditambah elusi (30 µl nuclease free water ) pada bagian

tengah kolom QIAquick . Ditunggu 1 menit, kemudian dipindahkan ke dalam tabung

eppendorf baru dan disentrifugasi 10 000 rpm selama 2 menit, lalu disimpan pada

suhu – 20°C.

h) Analisis Data Sekuensing

Analisis data sekuensing dilakukan dengan menggunakan program software

DNA star. Untuk analisa sequence alignment , dilakukan dengan membandingkan

sekuens yang diperoleh (query) dengan yang telah ada pada Gene Bank dengan data

base searches NCBI internet site (http//www.ncbi.nlm.nih.gov) menggunakan

BLAST ( Basic Local Alignment Search Tool ), selanjutnya untuk melihat

kekerabatannya dilanjutkan dengan Clustal W (Mustopa, 2009).



i) Pemberian Weisel la paramsentr oides pada Itik Bayang

Stok kultur ( glicerol stock ) bakteri probiotik Weisella paramsentroides dari

dadih ditumbuhkan dalam media MRS Broth dan diinkubasi pada suhu 37

0

C dalam

shaker inkubator selama 24 jam. Setelah 24 jam, kultur disentrifus selama 5 menit

dengan kecepatan 12 000 rpm. Lalu dibuang supernatannya dan dibilas dengan air

saline (NaCl 0,10%). Kemudian diatur sampai Optical Density (ODλ=580) dan

absorban menunjukkan 0. Sampel ini yang diberikan pada itik Bayang sesuai dengan

perlakuan. Pemberian Weisella paramesentroides pertama kali diberikan setelah itik

Bayang beradaptasi dikandang selama 10 hari kemudian diberikan lagi pemberian

tahap kedua selang 10 hari kemudian. 10 hari setelah pemberian yang kedua itik atau

itik berumur 2 bulan dipotong untuk analisa kadar kolesterol dagingnya.

j) Kolesterol Daging Itik Bayang

Cara ekstraksi bahan untuk analisis kadar kholesterol menurut Plummer (1978):

Sampel diambil sebanyak 1 g, dimasukkan ke dalam tabung reaksi kemudian

tambahkan 10 ml Aceton Etanol. Pelarut Aceton Etanol dengan sampel diuapkan

didalam waterbath pada suhu 60˚C sehingga volume pelarut separuh dari volume

awal atau diuapkan selama 15 menit. Pelarut yang tinggal disaring dengan

menggunakan kertas Whatman 41. Residu sampel dilarutkan kembali dengan Aceton

Etanol sebanyak 5 ml, kemudian diuapkan kembali pada suhu 60˚C selama 10 menit.

Pelarut yang tersisa disaring dan diulang sekali lagi. Hasil ekstraksi dipanaskan di

dalam waterbath pada suhu 60˚C sehingga volume pelarut yang tertinggal adalah 1

ml. Larutan ekstraksi ini kemudian dianalisa kadar kolesterolnya.



Analisis kolesterol dengan metode Warna Enzimatik (SHM, 2000) : Sebanyak

1 ml reagent (kit) kolesterol dipipetkan ke dalam tabung reaksi kemudian

ditambahkan serum atau hasil ekstraksi sebanyak 0.01 ml. Larutan kemudian

diinkubasi selama 20 menit di dalam waterbath pada suhu 37˚C sehingga warna

larutan berubah menjadi warna lembayung. Pembuatan blanko: 1 ml kit kolesterol

dipipetkan ke dalam tabung reaksi. Blanko dibuat sebagai pembanding. Setiap satu

analisa dibuatkan satu seri blanko. Blanko dimasukkan ke dalam sel spektrofotometer

setelah diarahkan pada panjang gelombang 520 nm, setelah angka dimonitor

menunjukkan angka 0 dimasukkan sampel yang akan dibaca. Kadar kolesterol

merupakan angka yang terbaca di monitor spektrofotometer.

HASIL DAN PEMBAHASAN

Dadih Jorong Sitingkai Kecamatan Palupuh Kabupaten Agam

Pengambilan sampel dilakukan di Jorong Sitingkai Kecamatan Palupuh

Kabupaten Agam. Daerah Sitingkai merupakan daerah penghasil dadih di Kabupaten

Agam, dadih dari Sitingkai biasanya di jual langsung oleh peternak ke Bukittinggi.

Adapun cara pembuatan dadihnya adalah: Kerbau diperah, sebelumnya ambing

kerbau dibersihkan, kemudian pada saat pemerahan, kerbau diberi pakan berupa

rumput liar (asal tidak beracun), susu ditampung menggunakan teko air, kemudian

susu disaring sebanyak 0.25 l, kemudian baru ditambah starter berupa dadih yang

telah jadi sebanyak 5 sendok makan. Kemudian bambu ditutup menggunakan plastik

bening, diikat dengan karet gelang dan disimpan dalam peti terbuat dari kayu di suatu

ruangan dan diperam selama 3 hari.



Total Koloni Bakteri Asam Laktat

Dari hasil penelitian didapatkan total koloni BAL yang dihitung dengan

rumus CFU/g adalah 2.31 x 10

8

CFU/g, total koloni ini lebih tinggi bila dibandingkan

dengan penelitian Sugitha et al, (1997) dengan rata-rata koloni bakteri adalah 3.33 x

105 – 121 x 10

5 koloni per ml bakteri dadih yang dibuat dalam tabung plastik dengan

penambahan starter Streptococcus lactis. Jumlah total koloni pada dadih dari

Sitingkai ini telah sesuai dengan kriteria FAO/WHO (2001), karena sebagai pangan

probiotik total koloni BAL yang dihasilkan berada pada jumlah 106 – 10

8 CFU/g.

Isolasi Bakteri Asam Laktat dan Pewarnaan Gram

Pada waktu melakukan isolasi BAL dari dadih Sitingkai secara konvensional

didapatkan koloni BAL yang berwarna putih kekuningan pada MRS Agar dengan

pengenceran 10-7

. Hal ini sesuai dengan penelitian Purwati et al . (2005) bahwa koloni

BAL pada media MRS agar berwarna putih kekuningan seperti pada Gambar 1.

Gambar 1. Penampakan Koloni BAL 10-7 pada Medium MRS Agar

Tahap selanjutnya dilakukan pemurnian sampai dua kali pemurnian untuk

bakterial stock yang akan digunakan untuk uji selanjutnya, untuk pewarnaan gram,

koloni yang dipilih adalah koloni yang masih muda berumur ± 18 jam. Tujuannya

adalah agar bakteri tidak terlalu tua untuk diuji, karena Menurut Unus (2005) jika

Koloni

BAL



bakteri terlalu tua maka bakteri akan cenderung menyerap warna safranin (merah)

sehingga akan dinyatakan gram negatif walaupun bakteri tersebut adalah bakteri gram

positif.

Hasil isolasi BAL dan pewarnaan gram dari dadih Sitingkai adalah Gram

Positif (+) dengan Morfologi batang ( Bacill), hal ini sesuai dengan pernyataan Unus

(2005) yang menyatakan bahwa bakteri gram positif akan mengambil warna crystal

violet yang berwarna ungu walaupun sudah dicuci dengan alkohol dan ketika diberi

safranin yang berwarna merah, bakteri tersebut tetap akan berwarna ungu sedangkan

warna merah menunjukkan bakteri gram negatif. Selain itu hal ini juga sesuai dengan

penelitian Sujaya, et al , (2008) bahwa isolat yang teridentifikasi sebagai

Lactobacillus sp, Weissella sp dan Leuconostoc sp mempunyai bentuk sel batang.

BAL yang diisolasi dari dadih ada berbentuk batang seperti Lactobacillus sp dan

berbentuk bulat seperti Pediococcus sp dan Enterococcus sp.

Resistensi Anti Mikroba Bakteri Asam Laktat

Uji resistensi anti mikroba BAL dilakukan terhadap lima bakteri uji yaitu

Eschericia coli NBRC 14237 , Staphylococcus aureus NBRC 13276 , Bacillus subtilis

BTCCB 612, Salmonella tyhpii dan Lysteria monocytogenesis. Adapun hasil uji

resistensi anti mikroba yang telah dilakukan terhadap ke-5 bakteri patogen dapat

dilihat pada Tabel. 1.



Tabel 1. Pengamatan Resistensi Anti Mikroba BAL terhadap 5 Bakteri Patogen pada

Waktu 24 Jam

Isolat BAL BakteriPatogen

L. monocytogenes B. subti li s S. aureus E.coli S.typhi i

BAL dadih Sitingkai - + ++ - ++

Keterangan : Zona Hambat (mm) : ++ = 8-14 mm; + = 1-7 mm; - = tidak memiliki

zona hambat.

Dilihat dari Tabel 1, BAL dadih Sitingkai mempunyai zona hambat yang

terbaik terhadap S. aureus dan Salmonella tyhpii dengan nilai zona hambat berkisaran

8-14 mm, sedangkan terhadap bakteri B. subtilis kisaran nilai 1-7 mm selanjutnya

tidak mampu menghambat pertumbuhan bakteri L. Monocytogenes dan E. coli.

Identifikasi Bakteri Asam Laktat dengan 16S rRNA

Amplifikasi gen 16S rRNA dengan PCR

Setelah dilakukan isolasi BAL dan uji resistensi, kemudian dilanjutkan

dengan amplifikasi gen 16S rRNA dengan PCR 35 siklus untuk menentukan genus

dan spesies BAL secara akurat. Hal ini sesuai dengan penelitian Mustopa (2009) yang

menyatakan dalam 16S rRNA menggunakan primer: 8 F:

AGAGTTTGATCCTGGCTAG dan primer 1541 R: AAGGAGGTGATCCAGCC

dapat menghasilkan genus dan spesies yang spesifik. Gambar 2 berikut ini merupakan

gambar hasil amplifikasi gen 16S rRNA.



2 kb

1500 bp1 kb

M Isolat Dadih Sitingkai

Gambar 2. Hasil Amplifikasi Gen 16S rRNA

Pada Gambar 2 terlihat hasil elektroforesis menunjukkan kegiatan PCR yang

telah dilakukan berhasil mengamplifikasikan daerah gen 16S rRNA. Hal ini dapat

dilihat dengan munculnya fragmen produk PCR dengan ukuran 1500 base pare (bp)

(1.5 kilo bite (kb)) yang merupakan ukuran yang diharapkan dengan menggunakan

kombinasi primer 8 F : GAGTTTGATCCTGGCTCAG untuk arah forward dan

primer 1541 R : AAGGAGGTGATCCAGCC untuk arah reverse. Dari gambar 2

dapat dilihat bahwa intensitas fragmen yang dihasilkan cukup tinggi dan layak

digunakan untuk kegiatan sekuensing pada tahap berikutnya. Dimana terlihat jelas

band yang terbentuk dan tidak ditemukan smear.

Analisis Sekuen Gen 16S rRNA Isolat dari Dadih

Proses sekuensing gen 16S rRNA yang diperoleh dari kegiatan amplifikasi

dilakukan oleh Vivantis Syah Alam Selangor Malaysia. Sekuensing dilakukan secara

two road direction menggunakan primer yang sama dengan amplifikasi gen 16S



rRNA dengan PCR. Hasil data sekuensing yang diperoleh dari isolat diedit

menggunakan software DNASTAR (Madison Wisconsin-USA). Total nukleotid gen

16S rRNA yang berhasil tersekuen 1 037 bp. Sementara gen 16S rRNA yang

teramplifikasi dengan PCR berjumlah 1 500 bp Jadi dapat dilihat bahwa belum

tersekuensingnya seluruh nukleotid yang pada daerah 16S rRNA. Sekuen yang telah

di edit akan disimpan dalam bentuk Notepad untuk tahap analisis BLAST NCBI.

Berdasarkan pembandingan isolat BAL dadih Sitingkai dengan ukuran 1 500

bp (1.5 kb) dengan Gen Bank memiliki persentase kesamaan tertinggi sebesar 99%

dengan Weissella pharamesenteroides, dimana nilai maksimum 1323, nilai total 1531

dan kesamaan sekuen DNA dengan Gen Bank data sebesar 93% serta nilai eror 0,0

atau tidak ada. Hal ini berbeda dengan penelitian Hosono et al. (1989) dalam Pato

(2003) bahwa BAL yang disolasi dari dadih adalah Lactobacillus brevis,

Streptococcus faecalis, Leuconostoc mesentroides dan Lactococcus lactis. Berbeda

juga dengan Soomro dan Masud (2006), melakukan isolasi BAL dari dadih Pakistan

dan berhasil mengisolasi Lactobacillus sp, Lactococcus sp dan Streptococcus sp.

Dengan demikian BAL yang di isolasi dari dadih Sitingkai sama dengan BAL dari

susu kuda liar Sumbawa seperti penelitian Sujaya et al . (2008) yaitu bakteri Weissella

pharamesenteroides yang mempunyai bentuk sel batang pendek.

Selain itu berdasarkan diagram filogenetik bakteri isolat Dadih asal Sitingkai

memiliki kekerabatan yang dekat dengan Weisella paramesentroides strain ZJ9 dan

Weisella paramesentroides strain TRJ. 1,4. namun isolat BAL dadih Sitingkai

memiliki kekerabatan yang jauh dengan Weisella paramesentroides strain NRIC.

Seperti terlihat dalam gambar 3.



Gambar 3. Gambar Filogenetik dari BAL Isolat Dadih Sitingkai terhadap Bakteri

Weisella paramesentroides

Kadar Kolesterol Daging Itik

Rataan kolesterol daging itik Bayang dengan pemberian probiotik Weisella

paramesentroides selama penelitian dapat dilihat pada Tabel 2.

Tabel 2. Rataan Kolesterol Daging Itik Bayang dengan Pemberian Probiotik Weisella

paramesentroides

Perlakuan Kadar Kolesterol daging itik

Bayang (mg/dl)

Kontrol (Tanpa Perlakuan/Placebo) 43,75a

A1 (1 ml Weisella paramesentroides) 29,75



Keterangan : superskrip yang berbeda pada kolom yang sama menunjukkan perbedaan yang sangat nyata (P<0,01)

Dari analisis statistik dapat disimpulkan bahwa pemberian probiotik Weisella

paramesentroides sangat nyata menurunkan kadar kolesterol daging itik Bayang,

namun pemberian dosis yang berbeda tidak memeberikan pengaruh yang signifikan

terhadap kolesterol daging itik. Pemberian 1 ml Weisella paramesentroides telah

nyata menurunkan kolesterol daging itik Bayang sebesar 32%, hal ini berbeda dengan



Kurnia (2011) yang memberikan 2 ml Lactococcus plantarum dari blondo untuk

menurunkan kolesterol telur ayam.

Penurunan kolesterol terjadi karena terhambatnya sintesa dari kolesterol sebab

adanya probiotik dalam usus mengakibatkan terhambatnya kerja enzim Hydroxi

Metyl Glutaryil-KoA reduktase (HMG-KoA reduktase) yang berperan dalam

pembentukan mevalonat dalam proses sintesis kolesterol sehingga tidak terbentuknya

kolesterol. Sesuai dengan Voet et al. (1999) menyatakan penurunan kolesterol terjadi

karena senyawa yang dihasilkan mikrobia berkompetisi dengan HMG-KoA untuk

berikatan dengan enzim HMG-KoA reduktase.

KESIMPULAN DAN SARAN

Kesimpulan

Dari penelitian yang dilakukan disimpulkan bahwa BAL yang diisolasi dari

dadih Sitingkai Kabupaten Agam adalah bakteri Weisella paramesentroides.

Pemberian 1,27 x 107

CFU/g probiotik Weisella paramesentroides nyata menurunkan

kadar kolesterol daging itik Bayang sebesar 32%.

Saran

Disarankan pada peneliti selanjutnya pemberian probiotik pada itik Bayang

hendaknya juga dilakukan pada pada itik Bayang betina untuk megetahui dosis

optimal menurunkan kadar kolesterol telur itik. Selain itu juga perlu dilakukan

pemurnian dan karakterisasi bakteriosin yang dihasilkan Weisella paramesentroides.



Ucapan Terima Kasih

Penulis menyampaikan terima kasih dan penghargaan yang setinggi-tingginya

kepada Direktorat Penelitian dan Pengabdian Kepada Masyarakat Direktorat

Pendidikan Tinggi Kementerian Pendidikan Nasional Republik Indonesia dengan

Nomorkontrak: 135/UN16/PL/2011 dan Pelaksana Program Penelitian Hibah

Pascasarjana Tahun Anggaran 2011, dengan Nomor kontrak :

394/SP2H/PL/Dit.litabmas/IV/2011 yaitu Prof. Drh. Hj. Endang Purwati, MS, Ph.D.

Kepada Ibu Prof. Dr. Sumaryati Syukur, M.Sc, selaku pembimbing I dan Ibu Prof.

Drh. Hj. Endang Purwati, MS, PhD selaku pembimbing II, kepada Bapak Dr. H.

Adlis Santoni, Prof. Dr. Admin Alif, M.Sc, Prof. Dr. Abdi Dharma, M.Sc yang telah

banyak memberikan bimbingan, pengarahan dan ilmu pengetahuan yang sangat

berarti bagi penulis.

Daftar Pustaka

Abdulrahim, S.M., M.S.Y. Haddadin, E.A.R. Haslamoun dan R.K. Robinson. 1996.

The influence of Lactobacillus achidophillus and bacitracin on layer

performance of chickens and cholesterol content of plasma and egg yolk.

British poultry. Sci.37:341-346.

Kusmiati dan Malik, A. 2002. Aktivitas Bakteriosin dari Bakteri Leuconostocmesenteroides Pbac1 pada Berbagai Media.

Kusumawati, N; Bettysri, L J; Siswa S; Ratihdewanti dan Hariadi. 2003. Seleksi

Bakteri Asam Laktat Indigenous sebagai Galur Probiotik dengan

Kemampuan Menurunkan Kolesterol. Journal Mikrobiologi Indonesia. Vol.

8(2): 39-43

Kurnia.Y.T. 2011. Pengaruh pemberian probiotik Lactococcus plantarum asal blondo

terhadap performans dan kualitas telur ayam petelur. Thesis Pasca Sarjana

Universitas Andalas, Padang.

Mustopa, A. 2009. Koleksi Protokol Laboratorium Virologi Molekuler. Pusat

Penelitian Bioteknologi. Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia, Bogor.



Pato, U. 2003. Potensi bakteri asam laktat yang diisolasi dari dadih untuk

menurunkan resiko penyakit kanker.Jurnal Natur Indonesia.Vol. 5 No.2

Hal.162-166.

Purwati, E., S. Syukur, dan Z. Hidayat. 2005. Lactobacillus sp. Isolasi dariBiovicophitomega sebagai Probiotik. Di dalam Proceeding Lembaga

Ilmu Pengetahuan Indonesia, Jakarta 24 -25 Januari 2005.

Samudra, R dan H. Arif. 2008. Warna kulit, lemak abdomen dan lemak karkas itik

alabio ( Anas plathyrhincosnborneo) jantan akibat pemberian azolla dalam

ransum. Animal Production Jurnal.hlm164-167.

Setiabudi. 2011. Daftar kontrol makanan dan kandungan kolesterolnya. www.

Metasolusisehat.com.

SHM. 2000. Prosedur Reagensia Kimia Klinik. PT. Segara Husada Mandiri, Jakarta

Soomro, A. H dan T. Masud. 2007. Protein Pattern and plasmid profile of lactic acid

bacteria isolated from dahi, a traditional fermented milk product of pakistan.

Journal of Food Technol. Biotechnol . 45 (4) 447 – 453.

Sugitha, I. M. 1995. Olahan susu kerbau tradisional Minang, manfaat, kendala dan

prospeknya dalam era industrialisasi Sumatera Barat. Seminar Sehari

Teknologi Hasil Ternak Fakultas Peternakan. Universitas Andalas, Padang.

Sugitha, I. M., Allismawita, E. Martinelly, Y. Heryandi dan Yuherman. 1997.

Kandungan vitamin A dan kadar lemak pada dadih dalam tabung plastik

dengan starter Streptococcus lactis. Laporan Penelitian. Departemen

Pendidikan dan Kebudayaan Universitas Andalas Lembaga Penelitian,

Padang.

Sujaya, N., Y. Ramona., P. N. Widarini., P. N. Suarini., U. M. I. Dwipayanti, A. K.

Nocianitri dan W. Y Nursini. 2008. Isolasi dan karakterisasi bakteri asam

laktat dari kuda Sumbawa. Jurnal Veteriner Vol. 9. No. 2 Edisi Juni 2008.

Fakultas Teknologi Pertanian Universitas Udayana, Bali.

Unus, S. 2005. Mikrobiologi Dasar. Papas Sinar Sinanti, Jakarta.

Voet, D., J.G. Voet dan C.W. Pratt. 1999. Fundamentals of Biochemistry. Brisbane:

John Willey and Sons.

Identifikasi Molekuler Dan Pengaruh Pemberian Potensial Probiotik Bakteri Asam Laktat Bal Asal Dadih...

Documents

Transcript of Identifikasi Molekuler Dan Pengaruh Pemberian Potensial Probiotik Bakteri Asam Laktat Bal Asal Dadih...