7/17/2019 fismiktugas

http://slidepdf.com/reader/full/fismiktugas 1/1

5. Teknik yang digunakan untuk menguji

membran menargetkan dan penyisipan

Teknik yang digunakan untuk menguji

penargetan dan penyisipan membran dapat

dijelaskan secara in vivo dan in vitro. Teknik ini

digunakan sebelum mempelajari dan

menggambarkan membran protein secara intensif 

Pendekatan genetik digunakan untuk 

mengidentifikasi sensitive- suhu dan sekresi sensitif 

-dingin yang dapat merusak mutan E. coli dan

menghasilkan beberapa gen Sec. Contohnya, pada

mutasi sensitif- suhu menghasilkan Sec a dan secY

dan mutasi sensitif – dingin menghasilkan secE,

sec, sec! dan sec" . Seca, SecE,dan protein SecY

 berfungsi untuk ekspor protein dan yang Sec, Sec!

dan Sec" memfasilitasi ekspor.

Untuk menguji reaksi kinetic dalam penyisipan

membran, dilakukan secara percobaan in vivo

pulse-chase. translokasi Membran dari

domain hidrofilik dapat diuji dengan

menambahkan protease sel-sel E. coli yang telah

diobati dengan lisoim untuk  

mengkonversikannya ke spheroplasts. !al ini

memungkinkan"kses protease ke permukaan luar

membran dalam.

sistem vitro telah dikembangkan oleh Muller dan

#och untuk mempelajari kebutuhan protein

dalam penargetan dan penyisipan membran

protein. $endekatan in vitro digunakan untuk 

mengidentifikasi protein yang berfungsi sebagai

perantara dalam penyisipan membran dengan

metode m%&" ' cross-linking.

alam pendekatan ini, sebuah m#$% dipotong

 pengkodean protein membran yang dihasilkanyang

tidak memiliki terminasi kodon yang biasanya

melepaskan protein dari ribosom dan protein berhenti

sintesis.

(leh karena itu, dengan menggunakan

pendekatan m%&" dipotong, semua ukuran

protein membran yang baru akan tetap sama

ditambatkan ke ribosom sebagai peptidil-t%&".

)ika vesikel terbalik membran protein dapat

terjebak dalam proses penyisipan membrane.

&uller dan 'och untuk mempela(ari

kebutuhan protein untuk protein menargetkan

dan membran penyisipan. Sistem ini melibatkan

transkripsi dan translasi sistem sel-bebas di

mana Seca ) SEC*, !!+, .S #$% dan !tsY

 benar-benar habis oleh studi subfractionationluas /01. Puri- fied Seca, SEC*, !!+, !tsY

dan .S #$% dapat ditambahkan ke sistem

untuk menyelamatkan kekurangan faktor protein

) #$%. Selain itu, vesikel membran terbalik 

yang telah habis dari SecE atau komponen

membran lainnya dapat ditambahkan.

&enargetkan untuk membran dapat diperiksa

menggunakan alat tes membran flotasi.

Penyisipan protein membran men(adi terbalik 

vesikel membran dapat diu(i oleh generasi

fragmen tahan protease karena fragmen

dimasukkan men(adi membran-dilindungi.

Pendekatan lain in vitro yang kuat dalam

mengidentifikasi protein yang memediasi

membran penyisipan adalah truncat- ed m#$% )

cross-linking metode /21. alam pendekatan

ini, sebuah m#$% dipotong pengkodean protein

membran adalah gener-

diciptakan yang tidak memiliki terminasi kodon

yang biasanya melepaskan protein dari ribosom

dan protein berhenti sintesis. 3leh karena itu,

dengan menggunakan pendekatan m#$%

dipotong, semua ukuran protein membran yang

 baru lahir yang sama tetap ditambatkan ke

ribosom sebagai peptidil-t#$%. 4ika terbalik 

vesikel membran ditambahkan ke sistem

ter(emahan, protein membran dapat ter(ebak 

dalam proses &embran penyisipan. *ifunctional

agen silang dapat ditambahkan pada tahap ini

untuk kovalen menghubungkan protein

membran protein terdekat yang mengkatalisismembran protein penyisipan /51. Pendekatan

ini menun(ukkan bah6a membran yang baru

lahir teins pro berinteraksi dengan bakteri

komponen S#P !!+ dalam sitosol dan dengan

SecYE dan YidC dalam membran 70//5/81.