Post on 15-Apr-2017
AUTHORED BY : IQBAL TAUFIQQURRACHMAN 1
C17 Terapi Gen
Lecture Notes : SGBM
Theme : Diagnosis Molekular dan Terapi Gen
Oleh : Alida Harahap
A. Pendahuluan
Diagnosis molekular sangat baru (up to date) tapi sebetulnya
sudah sejak awal tahun 1990 telah digunakan untuk alat bantu
diagnosis baik untuk penyakit genetik maupun penyakit infeksi. Di
dalam kelainan genetik ada macam-macam yang bisa dideteksi
dengan molekuler antara lain keganasan (pasti ada kelainan
molekuler seperti mutasi), penyakit bawaan (inherited disease),
identitas (identifikasi korban kecelakaan), dan farmakogenetik
(ketidakberhasilan terapi bukan hanya karena obatnya salah dan
cara minum obatnya salah tapi juga karena metabolisme obatnya
di dalam tubuh salah yang diakibatkan oleh defek genetik).
B. Diagnosis Molekuler
Deteksi Mutasi, dapat menggunakan metode-metode berikut :
- PCR-RFLP
Memperbanyak suatu segmen dan segmennya dipilih oleh
peneliti. Setelah diperbanyak, dilihat apakah segmen itu
diperbanyak atau tidak jika diperbanyak maka itu terjadi mutasi
semetara jika tidak diperbanyak berarti tidak ada mutasi. Hal ini
dapat dilakukan untuk deteksi sickle-cell anemia (terjadi mutasi
rantai β tepatnya di asam amino glutamin yang harusnya GAG
menjadi GTG sehingga asam aminonya berubah menjadi valin).
Maka saat diberikan enzim restriksi yang disebut Mst II yang
terjadi mutasi akan terjadi pemotongan hasil PCR tadi.
- Oligo specific probe
Dilakukan dengan memperbanyakan DNA, kemudian dilihat di
bagian mana bagian yang akan bermutasi (berikan pelacak).
Jika diberikan oligo mutant dan menempel maka ada mutasi
tapi jika tidak menempel maka tidak ada mutasi.
- ARMS (Amplification Refractory Mutation System)
- Real time PCR for quantitation
Untuk sampel yang digunakan dapat diambil dari :
- Peripheral blood/ord blood lymphocyte
- Vili choriales
AUTHORED BY : IQBAL TAUFIQQURRACHMAN 2
C17 Terapi Gen
- Amniotic fluid
- Circulating nucleic acid
- Dan lain-lain
Deteksi mutasi tidak harus mendeteksi dari organ yang
mengalami mutasi. Hal ini dikarenakan zigot mengalami mitosis
(tiap membelah, DNA bereplikasi sehingga anakan memiliki DNA
yang sama). Pada suatu tahapan, zigot akan membentuk plasenta
dan membentuk fetus. Plasenta tidak membentuk individu
sementara fetus membentuk individu. Jadi dapat dikatakan tiap sel
memiliki DNA yang sama sehingga dapat digunakan sampel dari
mana saja untuk mendeteksi penyakit genetik dan mutasi.
Semua gen terdapat di tiap sel tetapi tidak semua gen
diekspresikan oleh suatu sel. Jika kelainan genetik misalnya ada di
otot, jika ingin diketahui apakah ini inheirited atau tidak dapat
digunakan sampel dari limfosit, tapi jika ingin mendeteksi besar
kecilnya penyakit harus melihat sel ototnya.
DNA dari fetus pada usia-usia tertentu ada yang masuk ke
sirkulasi ibu, tetapi untuk mengetahui suatu penyakit masih sulit
karena DNA ibu juga ikut bersikulasi. Jika ingin mengetahui ada
penyakit embolism di paru dapat digunakan sampel RNA karena
paru-paru sangat khas dalam mengekspresikan RNA.
Tujuan dari pengaplikasian diagnosis molekular antara lain
untuk membedakan diagnosis, menentukan gen pembawa dari
keluarga maupun populasi, prenatal diagnosis, dan presymptomatic
diagnosis. Berikut penjelasan lebih lanjut :
1. Diferensiasi Tes Diagnostik
Contoh penyakit X-linked muscular dystrophies yang
merupakan ada kerusakan neurologis. Contoh lain adalah
Fragile X syndrome (gejala klinis yang paling terlihat adalah
retardasi mental) di mana retardasi mental juga banyak penyakit
seperti itu, maka perlu dilakukan diagnosis molekular.
2. Deteksi Gen Pembawa di Keluarga dan Populasi
- Keluarga
Contohnya adalah Congenital Adrenal Hyperplasia (bayi
lahir akan kekurangan garam) yang disebabkan defisiensi
enzim 21-hidroksilase sehingga tidak terbentuk kortisol
(membantu keseimbangan garam di tubuh) dan harus
dilakukan enzyme replacement therapy. Selain itu dilakukan
tes pranatal untuk mempersiapkan saat kelahiran untuk
AUTHORED BY : IQBAL TAUFIQQURRACHMAN 3
C17 Terapi Gen
menyuntikan kortisol pada bayi yang kekurangan enzim
hidroksilase. Jika tidak ditangani dengan cepat akan
meningkatkan kadar testosteron jadi jika bayi perempuan
akan mengalami firilasi di mana klitorisnya berbentuk penis.
- Populasi
Biasanya dilakukan untuk pencarian gen pembawa
pada penurunan autosomal resesif. Paling banyak adalah
kasus thalasemia, tapi akan sulit karena ada dua ratus
macam mutasi tapi dapat dideteksi dengan melihat gejala
hematologi seperti jumlah Hb, ukuran sel darah merah,
anemia, dan lain-lain. Tapi jika screening pada penyakit
yang hanya satu mutasi seperti fibrosis sistik dapat dilakukan
dengan mudah.
3. Prenatal Diagnosis
Tidak semua penyakit harus dilakukan prenatall diagnosis.
Harus dilihat terlebih dahulu apakah penyakit yang diidap harus
memiliki prognosis jelek dan tidak bisa diobati. Awalnya
thalasemia masuk ke kategori tersebut, namun sekarang pasien
thalasemia dapat hidup sampai usia 70 tahun tergantung dari
kerajinan untuk melakukan transfusi, pengurangan besi, dan lain
sebagainya.
4. Presymptomatic Diagnosis
Dilakukan jika gejala baru terlihat saat dewasa. Contohnya
thalasemia-α berat (terjadi delesi empat) tapi masih bisa hidup
di intrauteri tapi bentuknya tidak baik. Tetapi saat lahir akan
meninggal. Jika telah diketahui maka harus menghentikan
kehamilan karena dapat mengakibakan komplikasi kehamilan
pada ibu tinggi jadi dapat membahayakan nyawa ibu. Tapi
sekarang telah ditemukan transfusi intrauteri tapi tetap saja
setelah lahir akan membutuhkan transfusi terus menerus.
5. Newborn Screening
Salah satu contohnya adalah PKU (Phenylketonuria) dan ini
merupakan penyakit defek metabolisme sejak lahir. Terjadi
mutasi di gen pengkode enzim phenylalanine hydroxylase
untuk mengubah phenylalanine menjadi tirosin. Sehingga ada
penumpukan phenylalanine yang bersifat toksik bagi saraf
AUTHORED BY : IQBAL TAUFIQQURRACHMAN 4
C17 Terapi Gen
sehingga dapat mengakibatkan retardasi mental. Jadi saat bayi
baru lahir harus dicek berikut :
1. Jumlah TSH (memengaruhi kecerdasaan)
2. PKU
3. G6PD
C. Maternal Inheritance
Penurunan mutasi DNA bukan hanya lewat nukleus tetapi juga
bisa melalui mitokondria. Tetapi ada perbedaan di mana
mitokondria diturunkan secara maternal (hanya ibu). Selain itu, DNA
mitokondria memiliki banyak kopi dan berbeda tiap sel, tingkat
mutasi tinggi, dan dapat dibedakan menjadi heteroplasmi dan
homoplasmi.
Ada dua macam penurunan mutasi DNA mitokondria antara
lain germline dan somatik. Berikut beberapa contoh penurunan
germline (melalui ayah dan ibu) yang biasanya membuat
kelumpuhan antara lain MELAS (Myopathy Encephalopathy
Lactic Acidosis Stroke like episode) dan LHON (Leber’s
Hereditary Optic Neurophaty).
D. Penanganan Penyakit Genetik
1. Cara Konvensional
- PKU dilakukan penghilangan fenilalanin dari dietnya
- Congenital Adrenal Hyperplasia dan Congenital
Hypothyroidisme dapat dilakukan hormone replacement
- Hemofilia A yang ditambahkan faktor VIII (tapi saat
beberapa kali terapi, sistem imun akan membentuk anti
faktor VIII sehingga memblok fungsi faktor VIII), jika
thalasemia dilakukan transfusi darah (sulit karena harus
Gambar 17.1 Maternal Inheritance of Mitochondrial DNA Mutations
AUTHORED BY : IQBAL TAUFIQQURRACHMAN 5
C17 Terapi Gen
mengurangi besi dan menghilangkan faktor penginfeksi)
dan intinya cara ini disebut protein replacement
- Hypercholesterolemia (herediter) yaitu gangguan pada
reseptor LDL maka dapat diberikan dengan pemberian obat
untuk merendahkan kadar kolesterol
- Defisiensi G6PD defisiensi (kemampuan antioksidan turun)
sehingga jika diberikan obat tertentu, sel darah merah akan
lisis jadi harus dihindari minum obat tapi G6PD ini dapat
melindungi manusia dari malaria berat, tapi tetap buruknya
jika diberikan obat malaria maka sel darah merah akan rusak
sehingga mengakibatkan terjadinya anemia
2. Terapi Gen
Intinya memperbaikin gen yang rusak tapi sulit dilakukan
karena tidak stabil jadi setelah diperbaiki ternyata dapat kembali
terjadi mutasi. Tujuan utamanya adalah memperoleh gen yang
normal dan tetap bisa diekspresikan karena sering sudah
dinormalkan suatu gen yang defek tapi tidak bisa diekspresikan.
Gene therapy ini dapat dilakukan dengan dua cara yaitu di
germline (sebelum pembuahan diubah) tapi ini jangan
digunakan karena bisa membuat apapun yang kita bisa dan di
sel somatik (mengubah kelainan sel somatik). Prinsipnya :
a) Ambil darah pasien Kultur darah Koreksi
Dimasukkan in vivo
b) Buat gen di luar Sintesis gen Dimasukkan in vivo
Untuk bisa melakukan terapi gen, kita harus mengetahui
karakteristik gen, harus bisa mengkloning dan kontrol regionya,
harus mengidentifikasi target sel atau jaringan yang benar, dan
kendaraan atau vektor yang benar (virus atau vektor lainnya).