Post on 06-Jan-2016
III. Struktur protein
Asam amino
Asam amino
Asam amino adalah asam organik yang mengandung gugus amina.
Sebagian besar asam amino ditemukan sebagai L--asam amino
Asam amino dalam air terionisasi membentuk ion zwitter.
Stereoisomer asam amino C asam amino adalah pusat kiral
karena semua asam amino, kecuali glisin, memiliki Casimetrik yang terikat pada empat gugus yang berbeda: Gugus karboksilat Gugus amino Gugus R Atom hidrogen
Empat gugus di atas terikat pada C dengan dua susunan ruang yang berbeda (enantiomer). asam amino merupakan senyawa aktif optik.
Asam amino pembentuk protein semuanya adalah L-stereoisomer
Konfigurasi absolut asam amino
Klasifikasi asam amino standar berdasarkan kepolaran gugus R
Nonpolar alifatik: Gly (G), Ala (A), Val (V), Leu (L), Ile (I), Pro (P)
Nonpolar aromatik:Phe (F), Tyr (Y), Trp (W)
Polar tidak bermuatan:Ser (S), Thr (T), Cys (C), Met (M), Asn (N), Gln (Q)
Bermuatan negatifAsp (D), Glu (E)
Bermuatan positifLys (K), Arg (R), His (H)
Asam amino nonpolar alifatik
Nonpolar aromatik
Polar tidak bermuatan
Jembatan disulfida
Asam amino bermuatan negatif
Asam amino bermuatan positif
Asam amino yang tidak standar
Asam amino yang tidak standar
Asam amino sebagai asam dan basa
Titrasi asam amino
(((( ))))1 21pI p p2 K K= += += += +
Titrasi asam amino
(((( ))))1 R1pI p p 3,222
K K= + == + == + == + =
Titrasi asam amino
(((( ))))R 21pI p p 7,592 K K= + == + == + == + =
Cincin imidazole His memiliki pKa 6,0. Bila His bergabung ke dalam protein pKa naik menjadi 6,5 7,5 (mendekati pH fisiologis). Oleh karena itu, His seringkali berperan dalam reaksi enzimatis yang melibatkan transfer proton.
Teknik Penelitian Biokimia
Analisis asam amino
Tes Ninhidrin: Reaksi uji asam amino Ninhydrin, (Triketohydrindane
hydrate) adalah pereaksi yang digunakan untuk mendeteksi amonia atau amina primer dan sekunder.
Bila bereaksi dengan gugus amina bebas akan memberikan warna biru/ungu.
Ninhidrin biasanya digunakan untuk mendeteksi sidik jari, karena amina yang tersisa dari peptida atau protein (amina terminal atau lisin) akan bereaksi dengan ninhydrin.
Semua asam amino memberi uji positif, kecuali prolin.
ninhidrin
Mekanisme reaksi test ninhydrin
Uji kwalitatif asam amino
merahHgNO3 dalam HNO3
Reaksi MillonTyr
merahNatrium nitroprusida dalam NH3 encer
Reaksi Nitroprusida
Cys
merah-naptanol dan natrium hipoklorit
Reaksi Sakaguchi
Arg
WarnaReagenNama reaksiAsam amino
Aminoacid analyzer
Kromatogram
Metode fluoresensi untuk analisis asam amino
Peptida
Ikatan peptida
OligopeptidaNama peptida dimulai dari residu ujung aminoTirosinilglisilglisilfenilalanilleusin atau Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu.
Polipeptida sebagai poliampolit
Stabilitas ikatan peptida
Hidrolisis ikatan peptida disukai secara energetika, tetapi reaksi ini berlangsung sangat lambat tanpa bantuan katalis.
Katalis hidrolisis ikatan peptida: Asam kuat, seperti HCl 6M. Protease: memotong ikatan peptida secara spesifik.
Protease
Protein
20 asam amino yang berbeda terpolimerasisi membentuk protein.
Protein memiliki urutan yang unik.
Urutan asam amino yang menyusun protein disebut struktur primer protein.
Beragamnya sifat kimia dan bentuk dari asam amino, mengakibatkan urutan asam amino (struktur primer) protein akan menentukan karakteristik kimia dan bentuk protein. Keduanya penting dalam menentukan fungsi dari protein.
Struktur primer miogobin
Dari gen ke protein (sintesis protein in vivo)
Dari gen ke protein
Sel mengkode informasi tentang urutan asam amino untuk membuat protein dari urutan asam nukleat.
Urutan asam nukleat ini disebut kode genetika. Asam nukleat adalah polimer dari 4 nukleatida,
sedangkan protein adalah polimer dari 20 asam amino yang berbeda. Konsekuensinya: Satu nukleotida tidak dapat mewakili satu asam amino. Juga
dua nukleotida tidak mencukupi untuk mengkode seluruh asam amino, karena hanya dihasilkan 16 kombinasi (24 = 16).
Pada kenyataanya ada 3 nukleotida yang mengkode satu asam amino (34 = 64 kombinasi). Karena hanya ada 20 asam amino, maka satu asam amino dapat dikode oleh lebih dari satu kombinasi tiga nukleotida (triple codon).
Kode genetika
Translasi
Post translational modification
Sintesis peptida in vitro
Teknik Penelitian Biokimia
Penentuan urutan asam amino protein
Reduksi ikatan disulfida
Reaksi Edman
Fragmentasi protein oleh protease
Struktur 3-dimensi protein
Empat tingkat struktur protein
Struktur ikatan peptida
Karakter ikatan rangkap dari ikatan peptida membuat atom C, N, H, O hampir koplanar (sebidang).
Konformasi ikatan peptida
Konformasi trans lebih disukai dibanding cis, karena meruahnya gugus R.
Pengecualian untuk urutan X-Pro, dimana X adalah asam amino lain selain Pro Konformasi cis lebih disukai.
Rotasi rantai polipeptida
Rotasi yang diperbolehkan hanya disekitar ikatan NCdan CC=O.Sudut putaran ikatan NCdisebut .Sudut putaran ikatan CC=O disebut .
Penentuan sudut dan Sudut dihedral dibentuk oleh atom Ci, Ni+1, Ci+1, Ci+1. Sudut diheral dibentuk oleh atom Ni+1, Ci+1, Ci+1, Ni+2. Konvensi: Rotasi searah jarum jam memberikan sudut dihedral
positif, bila berlawanan negatif.
Ci
Ci+1
i i+1 i+2
Ni+1
Ni+2
Ramachandran plot
Rotasi ikatan peptida memberikan berbagai tipe struktur sekunder
Struktur sekunder protein
-heliks -sheet turn
Alpha heliks
Struktur -heliks
Deskripsi struktur heliks Struktur heliks dikarakterisasi oleh
parameter berikut: Repeat (c) adalah jarak paralel
dengan sumbu heliks dimana struktur tepat berulang. Jumlah residu per repeat dinyatakan dengan m. Nilai mselalu bilangan bulat!
Pitch (p) adalah jarak paralel dengan sumbu heliks dimana heliks membuat satu putaran. Jumlah residu per putaran adalah n. Bila nbilangan bulat, maka m = n p = c.
Rise (h) adalah jarak paralel dengan sumbu heliks untuk jarak antar residu. Sehingga h = c/m atau p = n h
Sumbu heliks
Repeat,c
Pitch,p
Rise,h
Deskripsi struktur heliksBentuk ideal dari heliks dengan memvariasikan jumlah residu per putaran (n).
Parameter -heliks: Repeat (c) = 18 dengan lima kali putaran (turn). Jumlah residu per putaran (n) = 3,6 res/turn. Rise (h) = 0,15 nm/res. Pitch (p) = n h = 3,6 res/turn 0,15 nm/res = 0,54 nm/turn
Polat ikatan hidrogen dalam berbagai tipe heliks
Right and left handed heliks = bayangan cermin
Urutan asam amino menentukan kestabilan -heliks Tidak semua polipeptida dapat membentuk -heliks.
Adanya interaksi tambahan antar gugus samping asam amino turut mempengaruhi kestabilan -heliks. Polipeptida yang banyak memiliki residu
bermuatan sejenis sulit membentuk -heliks yang stabil.
Polipeptida yang memiliki gugus R besar seperti Ser, Thr, dan Leu akan sukar membentuk -heliks.
Adanya dua residu bermuatan berlawanan pada jarak 3 residu dapat menstabilkan -heliks.
Gugus-gugus aromatik pada jarak 3 residu juga dapat menstabilkan -heliks.
Dipol dielektrik dari ikatan peptida ditransmisikan sepanjang -heliks, sehingga secara keseluruhan -heliks adalah dipol. Ujung amino bermuatan parsial positif dan ujung karboksilat bermuatan parasial negatif. Adanya asam amino bermuatan positif didekat ujung amino akan mendestabilkan -heliks
-heliks sebagai dipol
Representasi -heliks
-sheet
Antiparallel -sheet
Parallel -sheet
Representasi -sheet
-turn
-turn
Tipe -turn
Secondary structure propensities
-keratin
-keratin kaya akan residu-residu hidrofobik Phe, Ile, Val, Met dan Ala.
-heliks keratin
-keratin
-keratin memiliki struktur yang kuat karena:
Terdiri dari multi -heliks yang tergabung membentuk struktur superheliks.
Antar rantai -heliks juga distabilkan oleh ikatan disulfida.
Kolagen Kolagen banyak ditemukan
di jaringan penghubung, seperti tulang dan kornea mata.
Kolagen terdiri dari 35% Gly, 11% Ala, dan 21% Pro dan Hyp.
Urutan asam amino kolagen umumnya adalah perulangan tiga peptida Gly-X-Pro atau Gly-X-Hyp, dimana X adalah asam amino mana saja.
Struktur primer kolagen
Struktur heliks kolagen
Silk fibroin
Struktur tersier protein
Struktur tersier terbentuk dari pengemasan struktur sekunder
Tertiary Structure and Functional Diversity :Different Folding for Different Functions
Protein kehilangan struktur dan fungsinya bila terdenaturasi
Native(N)
Terdenaturasi(D)
Suhu DenaturanpH
G
N
D
Urutan asam amino menentukan struktur tersier dari protein
Afinson tahun 1957 memperlihatkanbahwa RNAse A dapat didenaturasi dandirenaturasi kembali ke struktur native.
Struktur tersier tidak rigid
Struktur tersier tidak rigid
Bentuk struktur tersier: fibrous dan globular
Fibrous Globular
Pola pengemasan struktur sekunder motif
Pola pengemasan struktur sekunder dalam protein
Pola pengemasan struktur sekunder dalam protein
-helical protein
-sheet protein
/ protein
+ protein
Struktur kwaterner protein
Supramolekul
Folding protein
Struktur primer protein menentukan struktur tersier dan kuaterner protein
Pelipatan (folding) polipeptida berlangsung dengan cepat dan bertahap
Di dalam e. coli struktur tersier fungsional dengan panjang 100 residu dapat terbentuk dalam waktu 5 detik.
Bila dimulai dari struktur random, diperlukan waktu 1050 tahun untuk mencoba berbagai kombinasi hingga tercapai struktur native.
Karena folding berlangsung sangat cepat, maka proses folding tidak mungkin sepenuhnya berlangsung dengan tahapan yang acak.
Proses folding tidak spontan
Proses folding tidak spontan
Struktur Chaperon
SS
Protein disulfide isomerase
Fungsi PDI: mereduksi dan mereoksidasiikatan disulfida.
PDIS|S
PDI bentukteroksidasi
SHii
SHii
PDISH
S
S SHii
PDISH
SH
PDI bentuktereduksi
Penyakit yang disebabkan olehkesalahan folding protein
Protein prion
Amiloid Fibril
Amyloid fibrils are insoluble aggregates that result from the self assembly of partially unfolded proteins. Regardless of the native structure of the precursor proteins, the predominant secondary structure in the fibrillar form is beta. Proteins that form amyloids in vivo are associated with diseases, such as Alzheimer's and CJD
Peptida beta-amiloid
Turunan dari protein membran Struktur native dari peptida beta-amiloid
Struktur agregat beta-amiloid
Amyloid plaque
Teknik penelitian biokimia
Teknik isolasi dan pemurnian protein
Tujuan pemurnian protein Untuk memisahkan satu protein dari campuran
kompleks protein-protein lain (seperti ekstrak jaringan), tetapi tetap menjaga fungsi biologisnya. Fungsi biologis dari protein dapat dijaga dengan
mengontrol pH, suhu dan kekuatan ion (konsentrasi garam).
Pemurnian dapat dianggap sebagai deretan tahap fraksinasi yang dirancang sedemikian rupa sehingga: Protein yang diinginkan terisolasi secara ekslusif
pada satu fraksi dan dengan good yield. Sebagain besar kontaminan berada pada fraksi yang
lain
Tahap pertama pemurnian protein
Tahap pertama di dalam setiap pemurnian protein adalah pengembangan pengujian spesifik dari protein target.
Pengujian spesifik dapat didasarkan pada karakteristik dari protein target, seperti Aktivitas enzimatik Aktivitas imunologi Karakteristik fisik (misalnya massa molekul, sifat-sifat
spektroskopik dan lain-lain) Secara ideal, pengujian haruslah
Specific (you don't want a false positive) Rapid (you don't want to wait a week for the results) Sensitive (you don't want to consume all your sample in order to
assay it) Quantitative (you need an accurate way to measure the quantity of
your protein at each step in the purification)
Parameter pengontrol
Parameter yang harus dikontrol selama pemurnian:
1. Volume sampel total.2. Protein sampel total (dapat diketahui dari serapan
pada = 280 nm.3. Unit aktivitas dari protein yang diinginkan.
Dari parameter di atas dapat diperoleh informasi tentang:
1. % yield untuk setiap tahap pemurnian2. Aktivitas spesifik dari protein yang diinginkan
(unit/mg protein total)3. Peningkatan kemurnian pada setiap tahap
Kemurnian vs Yield
Dalam merancang skema pemurnian harus dipertimbangkan antara kemurnian dengan yield Contoh, mungkin merupakan hal yang mudah
untuk mendapatkan kemurnian 90% dengan yield yang bagus.
Tetapi, kemungkinan merupakan hal yang sukar untuk meningkatkan kemurnian beberapa persen lagi tapi masih dengan yield bagus.
Bila protein akan digunakan untuk menentukan urutan asam amino, kemurnian 90% mungkin masih dapat diterima. Tetapi bila akan digunakan untuk material klinis, maka target kemurnian haruslah 99.99+%.
Diagram Alir Pemurnian Protein
Sampel TeknikPemisahan
Fraksinasi
Singkirkan Gabungkan Fraksi2Murni?
Ulangi dengan teknik pemisahan lain
hingga murni
AdaAktivitas?Tidakada
Ada Periksakemurnian
Tidak
Ya
Analisa lanjutan
Uji Aktivitas
Tahap I: Penyiapan ekstrak kasar
Sel mikroba ataujaringan
Pecah sel, jaringanAtau organ
Blender,Homogenizer,Sonication,Pressure
Pelet dari sel yang masih utuh,organel, mebran, protein membran
Protein yang terlarutdalam air
Sentrifuga
Sentrifugasi
Tahap II: Pemisahan
Denaturasi selektif terhadap temperatur, pH dan pelarut organik
Ketahanan terhadap stres lingkungan
Kromatografi afinitasIkatan dengan molekul kecilKromatografi penukar ionMuatan (titik isoelektrik)
Size-exclusion chromatographyUkuran
Pengendapan dengan garam, pelarut organikKelarutan
MetodeKarakteristik acuan
Prinsip pemisahan berdasarkan kelarutan protein
Kelarutan protein
Distribusi residu hidrofilik (polar bermuatan atau tidak) dan hidrofobik (non-polar) pada permukaan molekul protein adalah sifat yang menentukan kelarutan protein dalam berbagai pelarut.
Meskipun residu hidrofobik cenderung terkubur di dalam interior dari protein, tetapi sejumlah tertentu residu hidrofobik juga ada pada permukaan dan melakukan kontak langsung dengan pelarut.
+Polar
nonpolar
Gaya elektrostatik antar molekul protein
Kelarutan adalah hasil dari interaksi polar dengan pelarut, interaksi ionik dengan garam, dan beberapa sebagai hasil gaya tolak-menolak antar molekul dengan muatan yang sama.
Prinsipnya protein akan mengendap bila gaya tolak-menolak antar protein tidak cukup besar untuk mencegah terjadinya penggabungan. Misalnya pada kondisi: Kekuatan ion rendah Banyaknya residu hidrofobik di
permukaan Pada titik mendekati isoelektrik
+++
+++
++
-
++
pH > pI pH < pIpH pI
I.E.P pH
K
e
l
a
r
u
t
a
n
Efek kekuatan ion pada kelarutan protein
Dalam rentang kekuatan ion antara 0-0,5 M, bertambah-nya kelarutan (pada pH dan suhu tertentu) dengan bertambahnya konsentrasi garam dikenal dengan sebutan salting in.
Pada konsentrasi garam tinggi kelarutan protein akan menurun kembali akibat terjadinya peristiwa salting out.
Salting out sangat bergantung pada hidrofobisitas dari protein , sedangkan salting in sangat bergantung pada distribusi muatan dan interaksi polar dengan pelarut.
K
e
l
a
r
u
t
a
n
Konsentrasi garam
pH =pI
pH mendekati pI
Garam salting out Garam yang efektif
menyebabkan salting out pada konsentrasi tinggi adalah garam dengan anion multicharge, seperti ion sulfat, fosfat, sitrat.
Urutan kefektifan anion: SCN-< ClO4- < NO3- < Br- < Cl- < asetat- < SO42- < PO43-
Kation yang efektif:NH4+ > K+ > Na+
Garam yang potensial:amonium, kalium dan natrium sulfat, fosfat, dan sitrat.
Pertimbangan dalam pemilihan garam : Harga per kilogram Kelarutan Kalor larutan Kerapatan larutan
Kelebihan amonium sulfat: Kelarutannya bervariasi
sedikit pada temperatur 0-30 oC
Konsentrasi jenuhnya ~4 M
Kerapatan jenuh = 1,235 g cm-3
Pengendapan dengan ammonium sulfat
Kelarutan ammonium sulfat pada 20oC adalah 533 g/L. Untuk membuat larutan stok amonium sulfat jenuh (1,425 L; 4,05 M), 761 g harus ditambahkan ke dalam 1 L air. Kerapatan jenuhnya adalah 1761/1425 = 1,235 g cm-3.
Larutan lain dapat dibuat dengan rumus berikut:(a) Bila ingin membuat Larutan M2 dari larutan M1
g = 533(M2 M1) / (4.05 0.3M2)(b) Bila ingin membuat larutan dengan %S2 dari %S1:
g = 533(S2 S1) / (100 0,3S2)Asumsi bahwa 100% jenuh adalah 4,05 M.
Ammonium sulfat memiliki sedikit sifat asam, sehingga 50 mM buffer (misalkan fosfat) harus ditambahkan.
Keuntungan yang paling penting dari fraksinasi amonium sulfat dibanding teknik lain adalah menawarkan kestabilan yang tinggi pada protein yang diendapkan. Juga dapat menghambat aktivitas protease.
% of saturation of (NH4)2SO4
%
o
f
p
r
o
t
e
i
n
p
r
e
c
i
p
i
t
a
t
i
n
g
Soluble at100%saturation
Fraksinasi dengan amonium sulfat
Kesimpulan: Good recovery, tetapi faktor kemurnian tidak bagus seperti pada percobaan pertama, Bila kemurnian dianggap penting coba 48-65%
3.0352540
107515
0-4848-65
65
Third trial
2.4323830
6904
0-4545-70
70
Second TrialKesimpulan: enzim banyak mengendap pada konsentrasi 40-60%, coba 45-70%
2.81.0
25223221
462322
0-4040-6060-80
80
First trial
Purification factor
Percent protein precipitated
Percent enzyme
precipitated
Percent saturation range
Faktor kemurnian = aktivitas spesifik dari fraksi dibagi dengan aktivitas spesifik sampel awal.
Pemilihan konsentrasi (NH4)2SO4terbaik untuk fraksinasi
Pada [(NH4)2SO4] 30%, Aktivitas protein target cukup tinggi dan sekitar 80% protein target mengendap.
Dialisis
Kromatografi Gel Filtrasi
Kromatografi penukar ion
Kromatografi afinitas
Kromatogram
Elektroforesis
q Ze
f f = == == == =
= mobilitas molekulZ = jumlah muatan molekule = muatan elektron/protonf = koefisien gesekan
Material gel dan denaturan
Elektroforegram
Isoelectric focusing: penentuan pI
Elektroforesis dua dimensi
Elektroforegram
Memonitor hasil pemurnian
2
1
2
1
Aktivitas totalAktivitas spesifik (U/mg) =
mg protein
A% Yield 100%
A
ASTingkat kemurnian
AS
= = = =
====
Memeriksa tingkat kemurnian protein
Kuantifikasi Protein
Destruktif-1 gMetode Kjeldahl
Non-destruktif28010 gWarburg-Christian
595
562
750
330 & 554
Max (nm)
Destruktif1 gBioinchoninic Acid (BCA)Destruktif1 gBradford
Destruktif1 gLowry
Destruktif100 gBiuret
SifatLimitMetode
Metode Kjeldahl Metode Kjeldahl digunakan
untuk menentukan jumlah nitrogen total.
Metode ini dapat dibagi menjadi tiga tahap: PenguraianOrganik N + H2SO4 (NH4)2SO4+ H2O + CO2 Distilasi(NH4)2SO4 + 2NaOH
2NH3(g) + Na2SO4 + H2O TitrasiNH3 + H3BO3 NH4+:H2BO3-
+ H3BO32NH4H2BO3- + H2SO4 (NH4)2SO4 + 2H3BO3
Perhitungan N total 1 mol N 1 mol NH3 1
mol asam 1.0 mol HCl 14 g N Bila A ml asam dengan
konsentrasi B diperlukan untuk menetralkan amoniak, maka
N total = (14 x A x B)/1000 gram
Jumlah protein dimana nitrogen berasal =
(14/1000) x A x B x (100/16) gram
Metode Biuret
Prinsip: Cu2+membentuk kompleks dengan ikatan C-N dari protein, menghasilkan warna ungu. Kompleks memiliki serapan maksimum pada panjang gelombang 330 dan 545 nm.
Zat-zat pengkelat logam, seperti EDTA dapat mengganggu pengujian.
NH2
CNC
NH2
O
O
NH2C
NC
NH2
O
O
NH2
CNC
NH2
O
O
NH2C
NC
NH2
O
O
Cu2+
Metode Lowry
Metode Lowry didasarkan pada reaksi Biuret dan reduksi arsenomolybdate reagent (Folin reagent) menghasilkan warna biru. Intensitas warna dapat diukur pada 750 nm.
Dua reaksi pembentukan warna:Reaksi 1Cu2+ + ikatan peptida kompleks Cu1+-ikatan peptida
warna ungu-biru.Reaksi 2Folin + kompleks Cu1+-ikatan peptida Folin tereduksi
warna biru hijau Zat-zat pengkelat logam, seperti EDTA dapat
mengganggu pengujian.
Metode BCA (Bioinchoninic Acid)
Prinsip reaksi:Protein + Cu2+ + OH- Cu1+
Cu1+ + 2 BCA Cu1+/BCA chromophore (562 nm).
N
N-O2C
-O2C
N
N CO2-
CO2-
N N
HO2C CO2H
BCA reagent
BCAProtein + Cu2+
OH-, H2O
Cu+
Metode Bradford
Prinsip:Interaksi protein dengan zat warna akan menyebabkan pergeseran Max dari zat warna.Contoh:Commasie blue G-250 memiliki Max = 465 nm.Pada saat berinterasi dengan protein Max = 595 nm
SO3-NCH3
CH3CH3
N
CH3
NH
H3CH2CO SO3-Commasie blue G-250
Metode Warburg-Christian
Prinsip: Metode ini didasarkan pada absorbansi Tyr and Trp pada 280 nm.
A280 = l [protein]
Molar absorptivitas () harus ditentukan baik secara eksperimen maupun melalui perhitungan.