III. Struktur protein

Asam amino

Asam amino

Asam amino adalah asam organik yang mengandung gugus amina.

Sebagian besar asam amino ditemukan sebagai L--asam amino

Asam amino dalam air terionisasi membentuk ion zwitter.

Stereoisomer asam amino C asam amino adalah pusat kiral

karena semua asam amino, kecuali glisin, memiliki Casimetrik yang terikat pada empat gugus yang berbeda: Gugus karboksilat Gugus amino Gugus R Atom hidrogen

Empat gugus di atas terikat pada C dengan dua susunan ruang yang berbeda (enantiomer). asam amino merupakan senyawa aktif optik.

Asam amino pembentuk protein semuanya adalah L-stereoisomer

Konfigurasi absolut asam amino

Klasifikasi asam amino standar berdasarkan kepolaran gugus R

Nonpolar alifatik: Gly (G), Ala (A), Val (V), Leu (L), Ile (I), Pro (P)

Nonpolar aromatik:Phe (F), Tyr (Y), Trp (W)

Polar tidak bermuatan:Ser (S), Thr (T), Cys (C), Met (M), Asn (N), Gln (Q)

Bermuatan negatifAsp (D), Glu (E)

Bermuatan positifLys (K), Arg (R), His (H)

Asam amino nonpolar alifatik

Nonpolar aromatik

Polar tidak bermuatan

Jembatan disulfida

Asam amino bermuatan negatif

Asam amino bermuatan positif

Asam amino yang tidak standar

Asam amino yang tidak standar

Asam amino sebagai asam dan basa

Titrasi asam amino

(((( ))))1 21pI p p2 K K= += += += +

Titrasi asam amino

(((( ))))1 R1pI p p 3,222

K K= + == + == + == + =

Titrasi asam amino

(((( ))))R 21pI p p 7,592 K K= + == + == + == + =

Cincin imidazole His memiliki pKa 6,0. Bila His bergabung ke dalam protein pKa naik menjadi 6,5 7,5 (mendekati pH fisiologis). Oleh karena itu, His seringkali berperan dalam reaksi enzimatis yang melibatkan transfer proton.

Teknik Penelitian Biokimia

Analisis asam amino

Tes Ninhidrin: Reaksi uji asam amino Ninhydrin, (Triketohydrindane

hydrate) adalah pereaksi yang digunakan untuk mendeteksi amonia atau amina primer dan sekunder.

Bila bereaksi dengan gugus amina bebas akan memberikan warna biru/ungu.

Ninhidrin biasanya digunakan untuk mendeteksi sidik jari, karena amina yang tersisa dari peptida atau protein (amina terminal atau lisin) akan bereaksi dengan ninhydrin.

Semua asam amino memberi uji positif, kecuali prolin.

ninhidrin

Mekanisme reaksi test ninhydrin

Uji kwalitatif asam amino

merahHgNO3 dalam HNO3

Reaksi MillonTyr

merahNatrium nitroprusida dalam NH3 encer

Reaksi Nitroprusida

Cys

merah-naptanol dan natrium hipoklorit

Reaksi Sakaguchi

Arg

WarnaReagenNama reaksiAsam amino

Aminoacid analyzer

Kromatogram

Metode fluoresensi untuk analisis asam amino

Peptida

Ikatan peptida

OligopeptidaNama peptida dimulai dari residu ujung aminoTirosinilglisilglisilfenilalanilleusin atau Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu.

Polipeptida sebagai poliampolit

Stabilitas ikatan peptida

Hidrolisis ikatan peptida disukai secara energetika, tetapi reaksi ini berlangsung sangat lambat tanpa bantuan katalis.

Katalis hidrolisis ikatan peptida: Asam kuat, seperti HCl 6M. Protease: memotong ikatan peptida secara spesifik.

Protease

Protein

20 asam amino yang berbeda terpolimerasisi membentuk protein.

Protein memiliki urutan yang unik.

Urutan asam amino yang menyusun protein disebut struktur primer protein.

Beragamnya sifat kimia dan bentuk dari asam amino, mengakibatkan urutan asam amino (struktur primer) protein akan menentukan karakteristik kimia dan bentuk protein. Keduanya penting dalam menentukan fungsi dari protein.

Struktur primer miogobin

Dari gen ke protein (sintesis protein in vivo)

Dari gen ke protein

Sel mengkode informasi tentang urutan asam amino untuk membuat protein dari urutan asam nukleat.

Urutan asam nukleat ini disebut kode genetika. Asam nukleat adalah polimer dari 4 nukleatida,

sedangkan protein adalah polimer dari 20 asam amino yang berbeda. Konsekuensinya: Satu nukleotida tidak dapat mewakili satu asam amino. Juga

dua nukleotida tidak mencukupi untuk mengkode seluruh asam amino, karena hanya dihasilkan 16 kombinasi (24 = 16).

Pada kenyataanya ada 3 nukleotida yang mengkode satu asam amino (34 = 64 kombinasi). Karena hanya ada 20 asam amino, maka satu asam amino dapat dikode oleh lebih dari satu kombinasi tiga nukleotida (triple codon).

Kode genetika

Translasi

Post translational modification

Sintesis peptida in vitro

Teknik Penelitian Biokimia

Penentuan urutan asam amino protein

Reduksi ikatan disulfida

Reaksi Edman

Fragmentasi protein oleh protease

Struktur 3-dimensi protein

Empat tingkat struktur protein

Struktur ikatan peptida

Karakter ikatan rangkap dari ikatan peptida membuat atom C, N, H, O hampir koplanar (sebidang).

Konformasi ikatan peptida

Konformasi trans lebih disukai dibanding cis, karena meruahnya gugus R.

Pengecualian untuk urutan X-Pro, dimana X adalah asam amino lain selain Pro Konformasi cis lebih disukai.

Rotasi rantai polipeptida

Rotasi yang diperbolehkan hanya disekitar ikatan NCdan CC=O.Sudut putaran ikatan NCdisebut .Sudut putaran ikatan CC=O disebut .

Penentuan sudut dan Sudut dihedral dibentuk oleh atom Ci, Ni+1, Ci+1, Ci+1. Sudut diheral dibentuk oleh atom Ni+1, Ci+1, Ci+1, Ni+2. Konvensi: Rotasi searah jarum jam memberikan sudut dihedral

positif, bila berlawanan negatif.

Ci

Ci+1

i i+1 i+2

Ni+1

Ni+2

Ramachandran plot

Rotasi ikatan peptida memberikan berbagai tipe struktur sekunder

Struktur sekunder protein

-heliks -sheet turn

Alpha heliks

Struktur -heliks

Deskripsi struktur heliks Struktur heliks dikarakterisasi oleh

parameter berikut: Repeat (c) adalah jarak paralel

dengan sumbu heliks dimana struktur tepat berulang. Jumlah residu per repeat dinyatakan dengan m. Nilai mselalu bilangan bulat!

Pitch (p) adalah jarak paralel dengan sumbu heliks dimana heliks membuat satu putaran. Jumlah residu per putaran adalah n. Bila nbilangan bulat, maka m = n p = c.

Rise (h) adalah jarak paralel dengan sumbu heliks untuk jarak antar residu. Sehingga h = c/m atau p = n h

Sumbu heliks

Repeat,c

Pitch,p

Rise,h

Deskripsi struktur heliksBentuk ideal dari heliks dengan memvariasikan jumlah residu per putaran (n).

Parameter -heliks: Repeat (c) = 18 dengan lima kali putaran (turn). Jumlah residu per putaran (n) = 3,6 res/turn. Rise (h) = 0,15 nm/res. Pitch (p) = n h = 3,6 res/turn 0,15 nm/res = 0,54 nm/turn

Polat ikatan hidrogen dalam berbagai tipe heliks

Right and left handed heliks = bayangan cermin

Urutan asam amino menentukan kestabilan -heliks Tidak semua polipeptida dapat membentuk -heliks.

Adanya interaksi tambahan antar gugus samping asam amino turut mempengaruhi kestabilan -heliks. Polipeptida yang banyak memiliki residu

bermuatan sejenis sulit membentuk -heliks yang stabil.

Polipeptida yang memiliki gugus R besar seperti Ser, Thr, dan Leu akan sukar membentuk -heliks.

Adanya dua residu bermuatan berlawanan pada jarak 3 residu dapat menstabilkan -heliks.

Gugus-gugus aromatik pada jarak 3 residu juga dapat menstabilkan -heliks.

Dipol dielektrik dari ikatan peptida ditransmisikan sepanjang -heliks, sehingga secara keseluruhan -heliks adalah dipol. Ujung amino bermuatan parsial positif dan ujung karboksilat bermuatan parasial negatif. Adanya asam amino bermuatan positif didekat ujung amino akan mendestabilkan -heliks

-heliks sebagai dipol

Representasi -heliks

-sheet

Antiparallel -sheet

Parallel -sheet

Representasi -sheet

-turn

-turn

Tipe -turn

Secondary structure propensities

-keratin

-keratin kaya akan residu-residu hidrofobik Phe, Ile, Val, Met dan Ala.

-heliks keratin

-keratin

-keratin memiliki struktur yang kuat karena:

Terdiri dari multi -heliks yang tergabung membentuk struktur superheliks.

Antar rantai -heliks juga distabilkan oleh ikatan disulfida.

Kolagen Kolagen banyak ditemukan

di jaringan penghubung, seperti tulang dan kornea mata.

Kolagen terdiri dari 35% Gly, 11% Ala, dan 21% Pro dan Hyp.

Urutan asam amino kolagen umumnya adalah perulangan tiga peptida Gly-X-Pro atau Gly-X-Hyp, dimana X adalah asam amino mana saja.

Struktur primer kolagen

Struktur heliks kolagen

Silk fibroin

Struktur tersier protein

Struktur tersier terbentuk dari pengemasan struktur sekunder

Tertiary Structure and Functional Diversity :Different Folding for Different Functions

Protein kehilangan struktur dan fungsinya bila terdenaturasi

Native(N)

Terdenaturasi(D)

Suhu DenaturanpH

G

N

D

Urutan asam amino menentukan struktur tersier dari protein

Afinson tahun 1957 memperlihatkanbahwa RNAse A dapat didenaturasi dandirenaturasi kembali ke struktur native.

Struktur tersier tidak rigid

Struktur tersier tidak rigid

Bentuk struktur tersier: fibrous dan globular

Fibrous Globular

Pola pengemasan struktur sekunder motif

Pola pengemasan struktur sekunder dalam protein

Pola pengemasan struktur sekunder dalam protein

-helical protein

-sheet protein

/ protein

+ protein

Struktur kwaterner protein

Supramolekul

Folding protein

Struktur primer protein menentukan struktur tersier dan kuaterner protein

Pelipatan (folding) polipeptida berlangsung dengan cepat dan bertahap

Di dalam e. coli struktur tersier fungsional dengan panjang 100 residu dapat terbentuk dalam waktu 5 detik.

Bila dimulai dari struktur random, diperlukan waktu 1050 tahun untuk mencoba berbagai kombinasi hingga tercapai struktur native.

Karena folding berlangsung sangat cepat, maka proses folding tidak mungkin sepenuhnya berlangsung dengan tahapan yang acak.

Proses folding tidak spontan

Proses folding tidak spontan

Struktur Chaperon

SS

Protein disulfide isomerase

Fungsi PDI: mereduksi dan mereoksidasiikatan disulfida.

PDIS|S

PDI bentukteroksidasi

SHii

SHii

PDISH

S

S SHii

PDISH

SH

PDI bentuktereduksi

Penyakit yang disebabkan olehkesalahan folding protein

Protein prion

Amiloid Fibril

Amyloid fibrils are insoluble aggregates that result from the self assembly of partially unfolded proteins. Regardless of the native structure of the precursor proteins, the predominant secondary structure in the fibrillar form is beta. Proteins that form amyloids in vivo are associated with diseases, such as Alzheimer's and CJD

Peptida beta-amiloid

Turunan dari protein membran Struktur native dari peptida beta-amiloid

Struktur agregat beta-amiloid

Amyloid plaque

Teknik penelitian biokimia

Teknik isolasi dan pemurnian protein

Tujuan pemurnian protein Untuk memisahkan satu protein dari campuran

kompleks protein-protein lain (seperti ekstrak jaringan), tetapi tetap menjaga fungsi biologisnya. Fungsi biologis dari protein dapat dijaga dengan

mengontrol pH, suhu dan kekuatan ion (konsentrasi garam).

Pemurnian dapat dianggap sebagai deretan tahap fraksinasi yang dirancang sedemikian rupa sehingga: Protein yang diinginkan terisolasi secara ekslusif

pada satu fraksi dan dengan good yield. Sebagain besar kontaminan berada pada fraksi yang

lain

Tahap pertama pemurnian protein

Tahap pertama di dalam setiap pemurnian protein adalah pengembangan pengujian spesifik dari protein target.

Pengujian spesifik dapat didasarkan pada karakteristik dari protein target, seperti Aktivitas enzimatik Aktivitas imunologi Karakteristik fisik (misalnya massa molekul, sifat-sifat

spektroskopik dan lain-lain) Secara ideal, pengujian haruslah

Specific (you don't want a false positive) Rapid (you don't want to wait a week for the results) Sensitive (you don't want to consume all your sample in order to

assay it) Quantitative (you need an accurate way to measure the quantity of

your protein at each step in the purification)

Parameter pengontrol

Parameter yang harus dikontrol selama pemurnian:

1. Volume sampel total.2. Protein sampel total (dapat diketahui dari serapan

pada = 280 nm.3. Unit aktivitas dari protein yang diinginkan.

Dari parameter di atas dapat diperoleh informasi tentang:

1. % yield untuk setiap tahap pemurnian2. Aktivitas spesifik dari protein yang diinginkan

(unit/mg protein total)3. Peningkatan kemurnian pada setiap tahap

Kemurnian vs Yield

Dalam merancang skema pemurnian harus dipertimbangkan antara kemurnian dengan yield Contoh, mungkin merupakan hal yang mudah

untuk mendapatkan kemurnian 90% dengan yield yang bagus.

Tetapi, kemungkinan merupakan hal yang sukar untuk meningkatkan kemurnian beberapa persen lagi tapi masih dengan yield bagus.

Bila protein akan digunakan untuk menentukan urutan asam amino, kemurnian 90% mungkin masih dapat diterima. Tetapi bila akan digunakan untuk material klinis, maka target kemurnian haruslah 99.99+%.

Diagram Alir Pemurnian Protein

Sampel TeknikPemisahan

Fraksinasi

Singkirkan Gabungkan Fraksi2Murni?

Ulangi dengan teknik pemisahan lain

hingga murni

AdaAktivitas?Tidakada

Ada Periksakemurnian

Tidak

Ya

Analisa lanjutan

Uji Aktivitas

Tahap I: Penyiapan ekstrak kasar

Sel mikroba ataujaringan

Pecah sel, jaringanAtau organ

Blender,Homogenizer,Sonication,Pressure

Pelet dari sel yang masih utuh,organel, mebran, protein membran

Protein yang terlarutdalam air

Sentrifuga

Sentrifugasi

Tahap II: Pemisahan

Denaturasi selektif terhadap temperatur, pH dan pelarut organik

Ketahanan terhadap stres lingkungan

Kromatografi afinitasIkatan dengan molekul kecilKromatografi penukar ionMuatan (titik isoelektrik)

Size-exclusion chromatographyUkuran

Pengendapan dengan garam, pelarut organikKelarutan

MetodeKarakteristik acuan

Prinsip pemisahan berdasarkan kelarutan protein

Kelarutan protein

Distribusi residu hidrofilik (polar bermuatan atau tidak) dan hidrofobik (non-polar) pada permukaan molekul protein adalah sifat yang menentukan kelarutan protein dalam berbagai pelarut.

Meskipun residu hidrofobik cenderung terkubur di dalam interior dari protein, tetapi sejumlah tertentu residu hidrofobik juga ada pada permukaan dan melakukan kontak langsung dengan pelarut.

+Polar

nonpolar

Gaya elektrostatik antar molekul protein

Kelarutan adalah hasil dari interaksi polar dengan pelarut, interaksi ionik dengan garam, dan beberapa sebagai hasil gaya tolak-menolak antar molekul dengan muatan yang sama.

Prinsipnya protein akan mengendap bila gaya tolak-menolak antar protein tidak cukup besar untuk mencegah terjadinya penggabungan. Misalnya pada kondisi: Kekuatan ion rendah Banyaknya residu hidrofobik di

permukaan Pada titik mendekati isoelektrik

+++

+++

++

-

++

pH > pI pH < pIpH pI

I.E.P pH

K

e

l

a

r

u

t

a

n

Efek kekuatan ion pada kelarutan protein

Dalam rentang kekuatan ion antara 0-0,5 M, bertambah-nya kelarutan (pada pH dan suhu tertentu) dengan bertambahnya konsentrasi garam dikenal dengan sebutan salting in.

Pada konsentrasi garam tinggi kelarutan protein akan menurun kembali akibat terjadinya peristiwa salting out.

Salting out sangat bergantung pada hidrofobisitas dari protein , sedangkan salting in sangat bergantung pada distribusi muatan dan interaksi polar dengan pelarut.

K

e

l

a

r

u

t

a

n

Konsentrasi garam

pH =pI

pH mendekati pI

Garam salting out Garam yang efektif

menyebabkan salting out pada konsentrasi tinggi adalah garam dengan anion multicharge, seperti ion sulfat, fosfat, sitrat.

Urutan kefektifan anion: SCN-< ClO4- < NO3- < Br- < Cl- < asetat- < SO42- < PO43-

Kation yang efektif:NH4+ > K+ > Na+

Garam yang potensial:amonium, kalium dan natrium sulfat, fosfat, dan sitrat.

Pertimbangan dalam pemilihan garam : Harga per kilogram Kelarutan Kalor larutan Kerapatan larutan

Kelebihan amonium sulfat: Kelarutannya bervariasi

sedikit pada temperatur 0-30 oC

Konsentrasi jenuhnya ~4 M

Kerapatan jenuh = 1,235 g cm-3

Pengendapan dengan ammonium sulfat

Kelarutan ammonium sulfat pada 20oC adalah 533 g/L. Untuk membuat larutan stok amonium sulfat jenuh (1,425 L; 4,05 M), 761 g harus ditambahkan ke dalam 1 L air. Kerapatan jenuhnya adalah 1761/1425 = 1,235 g cm-3.

Larutan lain dapat dibuat dengan rumus berikut:(a) Bila ingin membuat Larutan M2 dari larutan M1

g = 533(M2 M1) / (4.05 0.3M2)(b) Bila ingin membuat larutan dengan %S2 dari %S1:

g = 533(S2 S1) / (100 0,3S2)Asumsi bahwa 100% jenuh adalah 4,05 M.

Ammonium sulfat memiliki sedikit sifat asam, sehingga 50 mM buffer (misalkan fosfat) harus ditambahkan.

Keuntungan yang paling penting dari fraksinasi amonium sulfat dibanding teknik lain adalah menawarkan kestabilan yang tinggi pada protein yang diendapkan. Juga dapat menghambat aktivitas protease.

% of saturation of (NH4)2SO4

%

o

f

p

r

o

t

e

i

n

p

r

e

c

i

p

i

t

a

t

i

n

g

Soluble at100%saturation

Fraksinasi dengan amonium sulfat

Kesimpulan: Good recovery, tetapi faktor kemurnian tidak bagus seperti pada percobaan pertama, Bila kemurnian dianggap penting coba 48-65%

3.0352540

107515

0-4848-65

65

Third trial

2.4323830

6904

0-4545-70

70

Second TrialKesimpulan: enzim banyak mengendap pada konsentrasi 40-60%, coba 45-70%

2.81.0

25223221

462322

0-4040-6060-80

80

First trial

Purification factor

Percent protein precipitated

Percent enzyme

precipitated

Percent saturation range

Faktor kemurnian = aktivitas spesifik dari fraksi dibagi dengan aktivitas spesifik sampel awal.

Pemilihan konsentrasi (NH4)2SO4terbaik untuk fraksinasi

Pada [(NH4)2SO4] 30%, Aktivitas protein target cukup tinggi dan sekitar 80% protein target mengendap.

Dialisis

Kromatografi Gel Filtrasi

Kromatografi penukar ion

Kromatografi afinitas

Kromatogram

Elektroforesis

q Ze

f f = == == == =

= mobilitas molekulZ = jumlah muatan molekule = muatan elektron/protonf = koefisien gesekan

Material gel dan denaturan

Elektroforegram

Isoelectric focusing: penentuan pI

Elektroforesis dua dimensi

Elektroforegram

Memonitor hasil pemurnian

2

1

2

1

Aktivitas totalAktivitas spesifik (U/mg) =

mg protein

A% Yield 100%

A

ASTingkat kemurnian

AS

= = = =

====

Memeriksa tingkat kemurnian protein

Kuantifikasi Protein

Destruktif-1 gMetode Kjeldahl

Non-destruktif28010 gWarburg-Christian

595

562

750

330 & 554

Max (nm)

Destruktif1 gBioinchoninic Acid (BCA)Destruktif1 gBradford

Destruktif1 gLowry

Destruktif100 gBiuret

SifatLimitMetode

Metode Kjeldahl Metode Kjeldahl digunakan

untuk menentukan jumlah nitrogen total.

Metode ini dapat dibagi menjadi tiga tahap: PenguraianOrganik N + H2SO4 (NH4)2SO4+ H2O + CO2 Distilasi(NH4)2SO4 + 2NaOH

2NH3(g) + Na2SO4 + H2O TitrasiNH3 + H3BO3 NH4+:H2BO3-

+ H3BO32NH4H2BO3- + H2SO4 (NH4)2SO4 + 2H3BO3

Perhitungan N total 1 mol N 1 mol NH3 1

mol asam 1.0 mol HCl 14 g N Bila A ml asam dengan

konsentrasi B diperlukan untuk menetralkan amoniak, maka

N total = (14 x A x B)/1000 gram

Jumlah protein dimana nitrogen berasal =

(14/1000) x A x B x (100/16) gram

Metode Biuret

Prinsip: Cu2+membentuk kompleks dengan ikatan C-N dari protein, menghasilkan warna ungu. Kompleks memiliki serapan maksimum pada panjang gelombang 330 dan 545 nm.

Zat-zat pengkelat logam, seperti EDTA dapat mengganggu pengujian.

NH2

CNC

NH2

O

O

NH2C

NC

NH2

O

O

NH2

CNC

NH2

O

O

NH2C

NC

NH2

O

O

Cu2+

Metode Lowry

Metode Lowry didasarkan pada reaksi Biuret dan reduksi arsenomolybdate reagent (Folin reagent) menghasilkan warna biru. Intensitas warna dapat diukur pada 750 nm.

Dua reaksi pembentukan warna:Reaksi 1Cu2+ + ikatan peptida kompleks Cu1+-ikatan peptida

warna ungu-biru.Reaksi 2Folin + kompleks Cu1+-ikatan peptida Folin tereduksi

warna biru hijau Zat-zat pengkelat logam, seperti EDTA dapat

mengganggu pengujian.

Metode BCA (Bioinchoninic Acid)

Prinsip reaksi:Protein + Cu2+ + OH- Cu1+

Cu1+ + 2 BCA Cu1+/BCA chromophore (562 nm).

N

N-O2C

-O2C

N

N CO2-

CO2-

N N

HO2C CO2H

BCA reagent

BCAProtein + Cu2+

OH-, H2O

Cu+

Metode Bradford

Prinsip:Interaksi protein dengan zat warna akan menyebabkan pergeseran Max dari zat warna.Contoh:Commasie blue G-250 memiliki Max = 465 nm.Pada saat berinterasi dengan protein Max = 595 nm

SO3-NCH3

CH3CH3

N

CH3

NH

H3CH2CO SO3-Commasie blue G-250

Metode Warburg-Christian

Prinsip: Metode ini didasarkan pada absorbansi Tyr and Trp pada 280 nm.

A280 = l [protein]

Molar absorptivitas () harus ditentukan baik secara eksperimen maupun melalui perhitungan.