CUANTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS, MÉTODO DE BIURET.

INTRODUCCIÓN

Las proteínas ocupan un lugar de máxima importancia entre las

moléculas constituyentes de los seres vivos (biomoléculas).

Prácticamente todos los procesos biológicos dependen de la

presencia o la actividad de este tipo de moléculas (Berg et al,

2008).

Determinar la concentración de proteínas en una muestra

biológica es una técnica de rutina básica cuando se aborda un

esquema de purificación de una proteína concreta, cuando se

quiere conocer la actividad específica de una preparación

enzimática, para el diagnóstico de enfermedades, así como

para muchos otros propósitos. Existen diferentes métodos para

la cuantificación de proteínas. Muchos de estos métodos se

basan en: a) la propiedad intrínseca de las proteínas para

absorber luz en el UV, b) para la formación de derivados

químicos, o c) la capacidad que tienen las proteínas de unir

ciertos colorantes (Segal, 2005).

La reacción de biuret es una reacción coloreada (violeta)

debida a la formación de un complejo de Cu en un medio

alcalino en compuestos que poseen más de un enlace peptidico,

como las proteinas (Cambell et al, 2006):

Figura 1: Reacción de Biuret.

La curva de patrón es un método de química analítica empleado

para medir la concentración de una sustancia en una muestra

por comparación con una serie de elementos de concentración

conocida. Se basa en la existencia de una relación en

principio lineal entre un carácter medible (por ejemplo la

absorbancia en los enfoques de espectrofotometría) y la

variable a determinar (la concentración). Para ello, se

efectúan diluciones de unas muestras de contenido conocido y

se produce su lectura y el consiguiente establecimiento de

una función matemática que relacione ambas; después, se lee

el mismo carácter en la muestra problema y, mediante la

sustitución de la variable independiente de esa función, se

obtiene la concentración de esta. Se dice pues que la

respuesta de la muestra puede cuantificarse y, empleando la

curva patrón, se puede interpolar el dato de la muestra

problema hasta encontrar la concentración (Harris, 2003)

OBJETIVO GENERAL

Aplicar un método colorimétrico para determinar la

concentración de proteína en una muestra problema.

OBJETIVOS PARTICULARES

- Aprender el manejo del espectrofotómetro y su aplicación

en los métodos colorimétricos.

- Aprender el empleo de una curva patrón para la

determinación de la cantidad de moléculas presentes en

una muestra, en este caso de proteínas.

- Determinar la concentración de proteínas en una muestra

de leche, utilizando el método de Biuret.

HIPÓTESIS

Si se mide la absorbancia a 540 nm de una muestra coloreada

con el reactivo de Biuret ésta será proporcional a la

concentración de proteína de dicha muestra.

MATERIAL Y MÉTODO

Primero, se dispuso a tomar la caseína y macerar con ayuda

de un mortero con pistilo, después se peso para ocupar 0.1g

para una solución de 1:10, al no disolverse bien se le

agregaron gotas de hidróxido de sodio hasta llegar a la

homogenación deseada, también se realizo la solución de leche

0.05ml para una solución 1:20 y se disolvieron en agua; Al

mismo tiempo se calentaba agua hasta llegar a una temperatura

de 500C a 550C.

A continuación, se separaron 24 tubos de ensaye en dos

grupos de 12 “A y B” los seis primeros se utilizaron para

obtener la curva patrón y los otros seis para obtener la

curva problema esto en los dos grupos, el tubo 1 se ocupó

como blanco, al tubo 2 0.1ml, al 3 0.2ml, al 4 0.4ml, al 5

0.8ml, al 6 1.0ml de albumina sérica bovina (BSA) con

concentración de 10 mg/ml, respectivamente.

En seguida, los tubos 7 con 0.25ml y 8 con 0.5ml de caseína,

el 9 con 0.25ml y el 10 con 0.5ml de sobrenadante, el 11 con

0.25 ml y el 12 con 0.5ml de leche diluida, (todo esto

obtenido en la práctica anterior); a todos los tubos se les

agrego Cloruro de Sodio al 0.9% con diferente cantidad de

2.9ml al 2, 2.8ml al 3, 2.6ml al 4, 2.2ml al 5 y 2ml al 6.

Para tener una solución de 3ml y reactivo de Biuret con la

misma cantidad de 3 ml, así logramos una solución de 6ml, se

homogenizo la solución por medio de un agitado tipo vortex.

(Solamente al tubo 1 se le agregaron 3 ml de reactivo de

biuret y 3 ml de NaCl)

Después de tener todos los tubos con la solución se colocaron

en un vaso de precipitados de 1000 ml con agua caliente y se

dejaron durante 10 minutos aproximadamente (hasta lograr

tonalidades de azul cielo a violeta), al termino del tiempo

se colocaron en agua a temperatura ambiente, hasta lograr que

se enfriara la solución.

Posteriormente se realizo la cuantificación de la solución

por medio de un espectrofotómetro a 540 nm de los tubos A y

B, entre cada medición se lavaban las celdas; al tener todas

las mediciones se dispuso a realizar la curva obtenida.

RESULTADOS

Los valores de absorbancia obtenidos con el espectrofotómetro

a 540 nm para cada una de las 12 soluciones se muestran a

continuación (solamente se muestran los tubos A y no los

duplicados):

Tabla 1: Valores de absorbancia de cada una de las muestras.

TuboNo. Solución * Proteína

(mg)

Absorbancia

a 540 nm1 3 ml NaCl, 0 Blanco2 0.1 ml BSA y 2.9 ml NaCl 1 0.0343 0.2 ml BSA y 2.8 ml NaCl 2 0.0714 0.4 ml BSA y 2.6 ml NaCl 4 0.1425 0.8 ml BSA y 2.2 ml NaCl 8 0.277

6 1 ml BSA y 2 ml NaCl 10 0.3457 0.25 ml caseína y 2.75 ml

NaCl¿? 0.079

8 0.5 ml caseína y 2.5 ml NaCl

¿? 0.198

9 0.25 ml sabrenadante y 2.75ml NaCl

¿? 0.221

10 0.5 ml sobrenadantey 2.5 mlNaCl

¿? 0.240

11 0.25 ml leche diluida y 2.75 ml NaCl

¿? 0.044

12 0.5 ml leche diluida y 2.5 ml NaCl

¿? 0.068

*A todas las soluciones se agregaron 3 ml del reactivo de Biuret.

Con los valores de la tabla anterior, tubos dos a seis, se

realizó la gráfica 1, de la curva patrón de proteína,

obtenida por el método de regresión lineal de mínimos

cuadrados; donde las abscisas (x) representan la

concentración en mg de proteína, y las ordenadas (y) los

valores de la absorbancia de cada concentración.

Figura 2: Curva patrón de proteína.

La determinación de la cantidad de proteína en las muestras

problema, tubos siete a doce, se obtuvo con el valor de la

absorbancia obtenida por el espectrofotómetro para cada

muestra (tabla 1), mediante la interpolación de estos valores

en la curva patrón (figura 3) y despejado los valores

respectivos de x de la ecuación de la recta (y= mx + b) tal

como se muestra a continuación (tabla 2):

Figura 3: interpolación de los valores de absorbancia de las muestras problemas en la curva patrón.

De acuerdo a la figura anterior, la cantidad aproximada de

proteína en las muestras problema, de la siete a la doce,

seria: 2.35, 5.7, 6.2, 6.9, 1.05 y 1.9 mg, respectivamente.

La determinación de la cantidad de proteína en las muestras

problema despejando los valores de “x” de la ecuación de la

recta (y = 0.0344X +0.0017) quedaría:

Tabla 2: determinación de la cantidad de proteína utilizandola ecuación de recta.

Tubo No.

Absorbancia (y) a 540 nm

Proteína (mg)

7 0.079 2.218

8 0.198 5.7069 0.221 6.37510 0.240 6.92711 0.044 1.22912 0.068 1.927

Tomando en cuenta los factores de disolución, por cada

mililitro de muestra se obtiene la siguiente tabla:

Tabla 3: Concentración de proteína en las muestras problema.

Tubo No.

Proteína (mg)

Factor de disolución

Proteína (mg/ml)

7 2.218 4x100 887.28 5.706 2x100 1141.29 6.375 4x10 22510 6.927 2x10 138.5411 1.229 4x20 98.3212 1.927 2x20 77.08

A continuación se resumen los resultados finales en la

siguiente tabla:

Tabla 4: resultados finales de la concentración de proteína

Tubo No.

Solución *Proteín

a (mg)

Proteína

(mg/ml)

Absorbancia

a 540 nm

1 3 ml NaCl, 0 0 Blanco2 0.1 ml BSA y 2.9 ml NaCl 1 10 0.0343 0.2 ml BSA y 2.8 ml NaCl 2 10 0.0714 0.4 ml BSA y 2.6 ml NaCl 4 10 0.1425 0.8 ml BSA y 2.2 ml NaCl 8 10 0.2776 1 ml BSA y 2 ml NaCl 10 10 0.3457 0.25 ml caseína y 2.75 ml

NaCl 2.218887.2 0.079

8 0.5 ml caseína y 2.5 ml NaCl 5.706 1141.2 0.1989 0.25 ml sabrenadante y 2.75

ml NaCl 6.375225 0.221

10 0.5 ml sobrenadantey 2.5 ml NaCl 6.927

138.54 0.240

11 0.25 ml leche diluida y 2.75 ml NaCl 1.229

98.32 0.044

12 0.5 ml leche diluida y 2.5 mlNaCl 1.927

77.08 0.068

*A todas las soluciones se agregaron 3 ml del reactivo de

Biuret.

DISCUSIÓN

De acuerdo a los resultados finales (tabla 4) obtenidos en la

determinación de la concentración de proteína en las muestras

de caseína, sobrenadante y leche diluida, que aunque no son

los esperados, pues, la concentración de proteínas tendría

que ser mayor en la leche diluida que en el sobrenadante y

los valores de la concentración de cada muestra problema

iguales entre sí, no se descarta este método de

cuantificación de proteínas, pero es recomendable utilizar

los materiales de laboratorio correctos para hacer las

diluciones y ser precisos, mas aun exactos, en la medición de

volúmenes.

El sobrenadante consiste en una suspensión a la cual se le ha

eliminado la mayor cantidad de proteínas contenidas en la

leche, por lo que su concentración de proteína tendría que

ser mejor que el de la leche pura.

CONCLUSIÓN

Efectivamente, aplicando el método Biuret se puede determinar

la concentración de proteína en una o varias muestras

problema, que resultan al interpolar los valores de

absorbancia en una curva patrón originada a partir de

concentración de proteína conocida.

BIBLIOGRAFÍA

Berg, J.M.; John, L.T.; Lubert, S. (2008) Bioquímica. 2ª ed. Reverté, Barcelona.

Segal, C. (2005) Manual de prácticas de biología molecular de la célula. Editorial publidisia. Cambell, P.N.; Smith, A.d.; Peters, T.J. (2006)Bioquímica ilustrada: bioquímica y biología molecular en la era posgenómica.Masson, España.

Harris, D.C. (2003). Quantitative chemical analysis. San Francisco: W.H. Freeman.

ANEXO (CUESTIONARIO)1.- describa que es el espectrofotómetro y para que sirve.

Sirve para calcular las concentraciones de las distintas

sustancias en función de la absorción del color. Técnicas de

bioquímica y biología moleculas.freifelder David. Editorial

reverte.2003

2.- mencione que es un espectro de absorción y las diferentes

longitudes de onda del espectro.

La espectroscopia de absorción es la medida de la cantidad de

luz absorbida por un compuesto en función de la longitud de

onda de la luz. En general, se irradia una muestra con una

fuente de luz y se mide la cantidad de luz transmitida a

varias longitudes de onda, utilizando un detector y

registrando el fenómeno en una grafica. Técnicas de

bioquímica y biología moleculas.freifelder David. Editorial

reverte.2003

3.- defina con sus propias palabras que es una curva patrón.

Son las medidas conocidas en orden ascendente que sirven de

guía para ajustar una solución problema.

4.- cuales son las ventajas y las desventajas, de emplear los

reactivos de biuret para cuantificar proteínas explique.

Dentro de las ventajas del reactivo de Biuret es que es

bastante específico para proteínas, muestra pocas

interferencias y es barato. Y la desventaja es que es poco

sensible.

5.- mencione cual es la razón de que en el método de biuret

la absorbancia de una proteína se lea a una longitud de 540

nm.

El color violeta característico se presenta a esa longitud la

cual se da por la coordinación de un átomo de cobre con

cuatro átomos de nitrógeno. El complejo se basa en la

desprotonación de los grupos amida para formar el enlace con

el cobre (II) o por el establecimiento de un enlace

coordinado entre el metal y los pares de electrones libres de

los átomos de oxigeno y de nitrógeno del péptido. Técnicas de

bioquímica y biología moleculas.freifelder David. Editorial

reverte.2003

6.- explique si una curva patrón puede ser empleada para

cuantificar sustancias diferentes a las proteínas y cual

seria la diferencia con estas.

7.- ¿Cuál es la finalidad de utilizar un tubo como blanco?

Mencione si siempre se utiliza agua como blanco.

Tomar la medida de la cual parte la curva patrón, no siempre

se utiliza agua como blanco, si no una mezcla concentrada de

la sustancia con la cual se esta trabajando. Técnicas de

bioquímica y biología moleculas.freifelder David. Editorial

reverte.2003

8.-realice una curva patrón con los datos de absorbancia y

proteína obtenidos en una determinación hipotética:

Se realizo una solución estándar de albúmina (10mg/ml).

Los valores de absorbancia referidos se determinaron por

duplicado.

9.-con los datos obtenidos en el ejemplo anterior, determina

la ecuación de la recta que representa la curva patrón.

10.- basándose en la curva patrón y la ecuación de la línea

recta, determine la cantidad de proteína en MG/ml de las

siguientes muestras, cuyos valores de absorbancia se indican

11.- elabore una lista de 5 compuestos que se podrían

cuantificar empleando una curva patrón, y menciona que

importancia tiene determinar la cantidad de dichos

compuestos.

a) inmunoglobulinas. Mal funcionamiento inmunológico

b) hemoglobina. Una concentración baja produce anemia.

c) insulina. Una concentración baja produce diabetes.

d) fibrilinas. La falta de esta produce deformación en los

huesos.

e) seroalbumina. Su falta produce deformaciones.

Bioquimica.berg Jeremy.editorial reverte.2008

2.6.2. Análisis del modelo SIPara analizar el modelo SI (2.17), dado por las ecuaciones (2.21) y (2.23), consideramos sus ecuaciones limites respectivamente dado por:

El modelo limite (2.24), N(t) es constante k= y(2.24) se reduce a una unica ecuación

Asi el modelo SI (2.17) es dado por la unica ecuación (2.25).El equilibrio de (2.23) es la solucion constante de (2.25), satisfaciendo

Asi, esta en equilibrio(libre de enfermedad), y haytambien un equilibrio endémico dado por:

El lado izquiero de (2.26) es una funcion en

El cual es monótona decreciente, donde

cuando y

Y 0 cuando Así (2.25) tiene el unico equilibrio libre de enfermedadsi

Si , alli hay un único equilibrio endémico determinadopor (2.26).Teorema 2.6.1 El modelo SI (2.17) tiene un único equilibrio asintóticamente estable. El equilibrio libre de enfermedad es asintóticamente estable si dado por (2.27) y el equilibrioendémico es asintóticamente estable si , dado por (2.26).Prueba

a)El equilibrio libre de enfermedad es asintóticamente estable. Tenemos la ecuación característica del equilibrio libre de enfermedad

, para

(2.28)Observar que

Ya que < , para las raíces de esta

ecuación característica están en el semiplano izquiero si , Si , allí hay una raíz real positiva de (2.28) y así el equilibrio de enfermedad libre es inestable.

b) El equilibrio endémico dado por (2.26). Linealizando (2.25), para este equilibrio

tenemos

De donde la expresión característica resulta

o también

Para , y usando la parte a) tenemos

que

asi por transitividad tenemos

y seguimos de esta estimación y (2.26) que (2.29) no tiene raíces en , es decir

para (2.29)

Asi en el equilibrio endémico es asintóticamente estable, si

2.6.2.1. Estabilidad GlobalAlgunas cuestiones previas.Para obtener una relación analógica con (2.7) entre el numero reproductor básico , el periodo de vida medio Ly la edad media de infección A, tenemos

1. El Número reproductor básico para periodo de vida exponencialPara obtener una relación entre ,A y L como en (2.7) combinamos (2.26) con (2.27)

de donde

Para un periodo de vida exponencial , con y

se reduce a la estimación clásica (2.7).

Observación 2Un resultado al reemplazar en las relaciones (2.26) y (2.27) produce lo siguiente

a) Para el equilibrio endémico dado por (2.26)

para , tenemos que

El cual corresponde al equilibrio endémico, como lo habíamos afirmado por observación 1 parte b).

b) Para el numero reproductor basico dado por (2.27)

Lo cual para métodos de simulación del modelo SI, permite controlar el valor de

2. El número reproductor básico para un periodo de vida fijo.Para otra elección de periodo de vida exponencial

, la relación puede ser bastante diferente. Por ejemplo para un periodo de vida fijo

Nosotros podemos obtener una fórmula para como (2.30)

Luego en (2.30) resulta

donde

Asi Asi puede ser aproximado por una función de ,

pero esta función particular de depende de .

La integral es minimizada no negativa, por la

función no decreciente con fijo, por la función

Esto se cumple ya que cada perturbación de esta función

mantenida fijo, debe incrementarse el

instante . Asi

También tenemos

Luego (2.30) implica

Por tanto

Para toda elección de la función de supervivencia

Si definimos , entonces (2.31) toma la forma

Sin embargo, la proporción de puede ser

arbitrariamente grande. Veamos para la elección de la función de supervivencia

, para ε>0 (2.32)Tenemos

por (2.30), tenemos

Asi, la elección (2.32) para produce y este

puede ser hecho arbitrariamente grande, eligiendo suficientemente pequeño. En lo que sigue, probaremos que la estabilidad asintótica tanto para el equilibrio libre de enfermedad como el equilibrio endémico del modelo SI(2.17) es global.Teorema 2.6.2 (Estabilidad Global)

PruebaPara probar este resultado, usaremos el Teorema 1.5.4, con una ligera modificación. Si (1.38) es reemplazado por

con dicha modificación, se puede verificar que

(a) El equilibrio libre de enfermedad de (2.23) es estable asintótico global si En (2.23) probaremos que