TUGAS BIOTEKNOLOGI
Dyah Kesuma Ramadhani
06111009014
1. Apa kelebihan dari Agrobacterium tumafaciens sehingga bisa menyelipkan DNA/ gen asing
ke organisme lainnya dan bagaimana mekanismenya?
JAWAB
Agrobacterium tumefaciens adalah bakteri patogen pada tanaman yang banyak digunakan
untuk memasukkan gen asing ke dalam sel tanaman untuk menghasilkan suatu tanaman
transgenik. Secara alami, A. tumefaciens dapat menginfeksi tanaman dikotiledon melalui
bagian tanaman yang terluka sehingga menyebabkan tumor mahkota empedu (crown gall
tumor). Bakteri yang tergolong ke dalam gram negatif ini memiliki sebuah plasmid besar
yang disebut plasmid-Ti yang berisi gen penyandi faktor virulensi penyebab infeksi bakteri ini
pada tanaman. Untuk memulai pembentukan tumor, A. tumefaciens harus menempel
terlebih dahulu pada permukaan sel inang dengan memanfaatkan polisakarida asam yang
akan digunakan untuk mengkoloniasi/menguasai sel tanaman. Selain tanaman dikotiledon,
tanaman monokotiledon seperti jagung, gandum, dan tebu telah digunakan untuk
memasukkan sel asing ke dalam genom tanaman. Agrobacterium diisolasi dari tanaman yang
terinfeksi Crown Gall. Tumor Crown Gall adalah jaringan tanaman yang pertumbuhannya
tidak terdiferensiasi akibat adanya interaksi antara tanaman-tanaman yang rentan dengan
strain virulen Agrobacterium tumefaciens.
Gb. 1 Tumor Crown Gall yang disebabkan oleh Agrobacterium tumafaciens
Dari banyak teknik transfer gen yang berkembang, teknik melalui media vector A.
tumefaciens paling sering digunakan untuk metransformasi tanaman, terutama tanaman
kelompok dikotil. Bakteri ini mampu mentransfer gen kedalam genom tanaman melalui
eksplan baik yang berupa potongan daun (leaf disc ) atau bagain lain dari jaringan tanaman
yang mempunyai potensi beregenerasi tinggi.
Gen yang ditransfer terletak pada plasmid Ti (tumor inducing ). Segmen spesifik DNA plasmid
Ti disebut T-DNA (transfer DNA ) yang berpindah dari bakteri ke inti sel tanaman dan
berintegrasi kedalam genom tanamn. Karena A. tumefaciens merupakan patogen tanaman
maka Agrobacterium sebagai vektor yang digunakan untuk transformasi tanaman adalah
bakteri dari jenis plasmid Ti yang dilucuti virulensinya (disarmed), sehingga sel tanaman yang
ditransformasi oleh Agrobacterium dan yang mampu beregenerasi akan membentuk suatu
tanaman sehat hasil rekayasa genetik. Teknik transformasi melalui media vektor
Agrobacterium pada tanaman dikotil telah berhasil dengan baik tetapi sebaliknya tidak
umum digunakan pada tanaman monokotil. Namun beberapa peneliti telah melaporkan
bahwa beberapa strain Agrobacterium berhasil metransformasi tanaman monokotil seperti
jagung dan padi.
Dasar dari transformasi genetik oleh Agrobacterium adalah transfer dan integrasi T-DNA ke
dalam genom di dalam inti sel tanaman. T-DNA adalah suatu bagian pada tumor inducing (Ti)
plasmid yang terdapat di dalam sel Agrobacterium. Ti-plasmid berukuran sekitar 200-800
kbp dan T-region (T-DNA)nya sendiri berukuran sekitar 10% nya (10-30 kbp). T-region ini
dibatasi oleh dua sekuen pembatas (border) yaitu right border dan left border yang
mengapit T-region. Bagian lain dari Ti-plasmid yang tidak kalah pentingnya adalah vir-region
yang mengandung sejumlah gen-gen virulen (virA, virB, virC, virD, virE, virF,virG dan virH)
yang berfungsi didalam proses transfer T-DNA ke dalam sel tanaman.
Gb. 2 Daerah virulensi pada Ti plasmid
Proses transformasi dimulai dengan melekatnya Agrobacterium pada sel tanaman. Kejadian
awal ini dimediasi oleh gen-gen yang berlokasi pada kromosom bakteri (gen chvA, chvB dan
att). Langkah berikutnya adalah terinduksinya gen-gen pada vir-region oleh suatu signal
yang spesifik didalam sel bakteri sehingga dihasilkan produk dari expresi gen-gen virulen
untuk memproses T-DNA dan mentransfernya dari dalam sel bakteri. Prosesing dan transfer
T-DNA dimediasi oleh berbagai protein yang dikode pembentukannya oleh gen-gen virulen.
Prosesing T-DNA dimulai dari suatu kejadian memproduksi T-DNA untai tunggal yang disebut
T-strand yang ditransfer ke dalam sel tanaman. Kejadian ini dimediasi oleh produk dari
genvirD1 dan virD2 yang berfungsi memotong T-DNA di bagian left border dan right border.
Salah satu produk yaitu molekul VirD2 tetap melekat secara kovalen pada 5’ end dari T-
strand dan membentuk apa yang disebut T-complex yang masih setengah jadi. Pembentukan
T-complex ini dilaporkan berfungsi untuk menjaga T-DNA dalam perjalanannya menuju inti
sel tanaman inang. Tahap akhir dari transformasi genetik oleh Agrobacterium adalah
integrasi T-DNA ke dalam genom sel tanaman inang.
Agrobacterium tumefaciens adalah bakteri tanah yang dapat menyebabkan penyakit tumor
pada beberapa tanaman. Bakteri menginfeksi melalui bagian yang luka pada batang
tanaman dan mengakibatkan tumor pada daerah sekitar akar dan batang tanaman.
Penyebab pembentukan tumor bukan berasal dari bakteri itu sendiri tetapi dari plasmid
yang dikenal dengan plasmid Ti. Ukuran DNA plasmid Ti cukup besar, berkisar antara 140-
235 kb (1 kb = 1000 pasang basa). Selama menginfeksi, sebagian kecil dari DNA plasmid Ti
Gb. 3 Tahapan dasar pada proses transformasi oleh Agrobacterium tumafaciens
(15-30 kb), disebut T-DNA, ditransfer kedalam inti sel tanaman dan tersisipi kedalam DNA
inti sel tanaman. Dari sini T-DNA sudah terintegrasi dan stabil terpelihara dalam genom sel.
T-DNA membawa gen yang bertangung jawab terhadap pembentukan tumor dan sintesa
asam amino yang dikenal sebagai opine. Gen-gen yang bertanggungjawab untuk transfer T-
DNA juga terdapat dalam plasmid Ti yang disebut gen-gen virulen (gen vir). Infeksi
Agrobakterium memerlukan jaringan tanaman yang luka karena gen vir dapat terinduksi
oleh senyawa fenolik yang dilepaskan ole sel-sel tanaman yang terluka.
Daerah ini merupakan potongan DNA berukuran relatif pendek berisi urutan 25 pasang basa
yang berulang. Setiap potongan DNA yang tersisipi diantara kedua batas T-DNA akan
ditransfer dan diintegrasikan kedalam genom tanaman. Oleh karena itu plasmid Ti
merupakan vektor yang sangat cocok untuk mengintroduksi gen-gen asing ke dalam sel
tanaman.
2. Jelaskan mekanisme buatan lainnya dari teknik DNA rekombinan!
JAWAB
1. TEKNIK PLASMID/ Membuat insulin dengan bantuan E. coli
Plasmid adalah gen yang melingkar tepat pada sel bakteri, tak terikat pada kromosom.
Teknik plasmid adalah penggunaan plasmid sebagai vektor dalam teknologi DNA
rekombinan, misalnya pada bakteri penghasil insulin.
Gb. 4 Mekanisme penyisipan Agrobacterium tumafaciens untuk menghasilkan tanaman transgenik
Insulin adalah hormon yang mengubah glukosa menjadi glikogen, dan berfungsi
mengatur kadar gula darah bersama hormon glukagon. Kekurangan insulin karena cacat
genetik pada pankreas, menyebabkan seseorang menderita diabetes melitus (kencing
manis) yang berdampak sangat luas terhadap kesehatan, mulai kebutaan hingga
impotensi.
Sebelum ditemukan teknik sintesis insulin, hormon ini hanya bisa diperoleh dari
ekstraksi pankreas babi atau sapi, dan sangat sedikit insulin bisa diperoleh. Setelah
ditemukan teknik sintesis insulin di bidang bioteknologi inilah, harga insulin bisa ditekan
dengan sangat drastis sehingga bisa membantu para penderita diabetes melitus.
Pada proses pembuatan insulin ini, langkah pertama adalah mengisolasi plasmid dari E.
coli. Plasmid adalah salah satu bahan genetik bakteri yang berupa untaian DNA
berbentuk lingkaran kecil. Selain plasmid, bakteri juga memiliki kromosom. Keunikan
plasmid ini adalah: ia bisa keluar-masuk ‘tubuh’ bakteri, dan bahkan sering
dipertukarkan antar bakteri. Langkah kedua, plasmid yang telah diisolir dipotong pada
segmen tertentu menggunakan enzim restriksi endonuklease. Sementara itu DNA yang
di isolasi dari sel pankreas dipotong pada suatu segmen untuk mengambil segmen
pengkode insulin. Pemotongan dilakukan dengan enzim yang sama. DNA kode insulin
tersebut disambungkan pada plasmid menggunakan bantuan enzim DNA ligase. Hasilnya
adalah kombinasi DNA kode insulin dengan plasmid bakteri yang disebut DNA
rekombinan.
Selanjutnya, DNA rekombinan yang terbentuk disisipkan kembali ke sel bakteri. Bila
bakteri E. coli berbiak, maka akan dihasilkan koloni bakteri yang memiliki DNA
rekombinan. Setelah tumbuh membentuk koloni, bakteri yang mengandung DNA
rekombinan diidentifikasi menggunakan probe. Probe adalah rantai RNA atau rantai
tunggal DNA yang diberi label bahan radioaktif atau bahan fluorescent dan dapat
berpasangan dengan basa nitrogen tertentu dari DNA rekombinan. Pada langkah
pembuatan insulin ini probe yang digunakan adalah ARNd dari gen pengkode insulin
pankreas manusia. Untuk memilih koloni bakteri mana yang mengandung DNA
rekombinan, caranya adalah menempatkan bakteri pada kertas filter lalu disinari dengan
ultraviolet. Bakteri yang memiliki DNA rekombinan dan telah diberi probe akan tampak
bersinar. Nah, bakteri yang bersinar inilah yang kemudian diisolasi untuk membuat
strain murni DNA rekombinan. Dalam metabolismenya, bakteri ini akan memproduksi
hormon insulin.
2. TEKNIK HIBRIDOMA/ Pembuatan Antibodimonoklonal dari sel kanker dan sel limfosit
Teknik hibridoma adalah teknik pembuatan sel yang dihasilkan dari fusi antara sel B
limfosit dengan sel kanker. Sifat dari sel hibridoma ini adalah imortal. Dalam percobaan
yang umum dilakukan, proses pembuatan sel hibridoma dilakukan dengan
menggunakan sel mieloma NS-1 dan sel limpa dari mencit.
Proses pembuatan dari sel hibridoma :
a. proses imunisasi dengan menggunakan antigen tertentu yang disuntikan ke
dalam tubuh mencit (Mus musculus)*
b. sel B-limfosit mencit akan merespon antigen sehingga terbentuk antibodi .
c. pemisahan sel B-limfosit yang sudah mengandung antibodi dari organ limpa
mencit
d. sel B-limfosit kemudian difusikan dengan sel kanker immortal menghasilkan
sel hibridoma
e. fusi sel hibridoma ini dilakukan dengan membuat membran sel menjadi
lebih permeabel sehingga kedua sel bisa menyatu
f. sel hibridoma kemudian diklon pada kultur sel sehingga dihasilkan banyak sel
yang memiliki anti bodi tertentu sehingga dikenal dengan antibodi monoklonal
yang bisa disimpan lama dalam keadaan dibekukan
GB. 5 Teknik hibridoma menggunakan mencit
3. TERAPI GENETIK
Terapi gen adalah suatu teknik terapi yang digunakan untuk memperbaiki gen-gen
mutan (abnormal/cacat) yang bertanggung jawab terhadap terjadinya suatu penyakit.
Pada awalnya, terapi gen diciptakan untuk mengobati penyakit keturunan (genetik) yang
terjadi karena mutasi pada satu gen, seperti penyakit fibrosis sistik. Penggunaan terapi
gen pada penyakit tersebut dilakukan dengan memasukkan gen normal yang spesifik ke
dalam sel yang memiliki gen mutan. Terapi gen kemudian berkembang untuk mengobati
penyakit yang terjadi karena mutasi di banyak gen, seperti kanker. Selain memasukkan
gen normal ke dalam sel mutan, mekanisme terapi gen lain yang dapat digunakan adalah
melakukan rekombinasi homolog untuk melenyapkan gen abnormal dengan gen normal,
mencegah ekspresi gen abnormal melalui teknik peredaman gen, dan melakukan mutasi
balik selektif sehingga gen abnormal dapat berfungsi normal kembali.
4. KLONING
Kloning adalah penggunaan sel somatik makhluk hidup multiseluler untuk membuat satu
atau lebih individu dengan materi genetik yang sama atau identik.
Ada beberapa langkah dasar dalam Kloning Gen yaitu sebagai berikut :
a. Suatu frakmen DNA yang mengandung gen yang akan diklon diinsersikan pada
molekul DNA sirkular yang di sebut sektor untuk menghasilkan chimoera atau
molekul DNA rekombiner.
b. Vektor bertindak sebagai wahana yang membawa gen masuk kedalam sel tuan
rumah (host) yang biasanya berupa bakteri, walaaupun sel-sel jenis lain dapat di
gunakan.
Gb. 6 Terapi gen
c. Didalam sel host, vektor mengadakan replikasi menghasilkan banyak kopi atau
turunan yang identik, baik vektornya sendiri maupun gen yang dibawanya.
d. Ketika sel host membelah, kopi molekul DNA rekombinasi diwariskan pada
progeni dan terjadi replikasi vektor selanjutnya.
e. Setelah terjadi sejumlah besar pembelahan sel, maka dihasilkan koloni atau
klonsel host yang identik
f. Tiap-tiap sel dalam klon mengandung satu kopi atau lebih molekul DNA
rekombinasi dengan demikian dikatakan bahwa gen yang dibawa oleh molekul
rekombinasi telah diklon.
GB. 7 Kloning pada domba dolly
Top Related