Tes DNA adalah tes yang menggunakan bahan uji berupa DNA (Deoxyribose Nucleic
Acid) yang berguna salah satunya untuk menentukan identitas seseorang. Tes DNA ini
membutuhkan keterlibatan para ahli untuk meminimalisir risiko terjadinya kesalahan karena
human error. Hal ini lumrah karena tes DNA bukanlah jenis tes yang mudah, terlebih lagi tes
ini membutuhkan peralatan dengan proses yang rumit. Tes DNA akan menghasilkan sebuah
DNA fingerprinting. Ada empat tahapan dalam tes DNA secara garis besar, yaitu
pengisolasian DNA, pemotongan fragmen DNA, pemisahan fragmen-fragmen DNA, dan
visualisasi hasil yang didapat.
A. Tahap Isolasi DNA
Tahap pengisolasian DNA.... (bagiannya pipit ya dhu...)
B. Tahap pemotongan fragmen DNA (RFLP/ Restriction Fragment Lenght
Polymorphism)
Setelah mendapatkan DNA , tentunya para ahli bisa saja menggunakan keseluruhan
fragmen DNA tersebut dalam pengujian. Namun, dalam pengujian untuk mengetahui
identitas seseorang cukup dibutuhkan beberapa fragmen DNA saja. Oleh karena itu,
dibutuhkan suatu proses untuk melakukan pemotongan beberapa fragmen DNA. Proses ini
dinamakan RFLP (Restriction Fragment Lenght Polymorphism).
Proses restriksi atau pemotongan dilakukan dengan menggunakan enzim yang
spesifik. Enzim ini berasal dari bakteri yang dimodifikasi oleh para ahli di laboratorium.
Enzim ini akan memotong tulang punggung gula fosfat dari molekul DNA pada untaian atau
fragmen nukleotida yang spesifik. Enzim pertama yang dimurnikan dan dipelajari adalah
enzim yang disebut EcoR1. Nama enzim ini diambil dari nama genus dan nama spesies dari
bakteri darimana enzim ini berasal, yaitu bakteri Escherichia Coli atau E. Coli. Berikut ini
adalah untaian nukleotida spesifik yang dikenali oleh EcoR1.
5’----------------GAATTC----------------3’
3’----------------CTTAAG----------------5’
Gambar Restriksi Fragmen DNA
Enzim restriksi ini digunakan untuk memecah molekul DNA menjadi fragmen-
fragmen yang lebih kecil dengan ukuran yang spesifik. Berikut ini berupa tabel jenis-jenis
enzim yang telah ditemukan.
Enzim restriksi beserta untaian nukleotida yang dikenali
Enzim Restriksi Untaian Nukleotida yang Dikenali
BamHI 5’-G/GATCC-3’
3’-CCTAG/G-5’
HindIII 5’-A/AGCTT-3’
3’-TTCGA/A-5’
SalI 5’-G/TCGAC-3’
3’-CAGCT/G-5’
BgIII 5’-A/GATCT-3’
3’-TCTAG/A-5’
PstI 5’-CTGCA/G-3’
3’-G/ACGTC-5’
C. Metode PCR (Polymerase Chain Reaction)
Untuk meminimalisir terjadinya kesalahan pada pengambilan sampel DNA yang
ternyata hanyalah artefak atau spesimen yang didapat terlalu sedikit untuk proses identifikasi
DNA selanjutnya, maka digunakan metode PCR atau Polymerase Chain Reaction yang
merupakan proses penggandaan fragmen-fragmen DNA yang telah direstriksi tadi. Alat yang
disiapkan adalah sebuah tabung penguji dengan thermal cycler yang dapat mengubah suhu
dalam tabung sesuai dengan yang diatur oleh penguji untuk menyesuaikan jenis proses dalam
PCR ini yang tiap proses berlangsung dalam beberapa menit. Suhu tabung pada kondisi
pertama adalah 950 C, pada kondisi kedua adalah 500 C, dan pada kondisi ketiga adalah 720
C.
Sementara itu, bahan-bahan yang disiapkan adalah berupa fragmen-fragmen DNA
yang akan digandakan, DNA Polimerase, dan primer. Tahap-tahapnya adalah sebagai berikut.
Pada kondisi pertama setelah ketiga bahan dimasukkan ke dalam tabung, DNA yang terdiri
dari dua untai akan terpisah karena suhu yang sangat tinggi tersebut.
Pada kondisi kedua setelah pemisahan kedua untai DNA, maka primer akan
melakukan inisiasi untuk tahap replikasi. Primer adalah fragmen DNA pendek yang
sebelumnya telah dibuat oleh para ahli yang berfungsi sebagai cetakan urutan basa
nukleotida. Inisiasi yang dilakukan oleh primer adalah dengan menempatkan dirinya pada
fragmen DNA yang sesuai panjangnya.
Kondisi ketiga yaitu berperannya DNA polimerase dalam melakukan penggandaan
dengan membuat primer mengikuti urutan basa nukleotida dari DNA single-stranded yang
telah terpisah tadi. DNA polimerase yang digunakan saat ini berasal dari bakteri yang salah
satunya adalah bakteri Thermus aquaticus, sejenis bakteri yang hidup saat musim semi yang
panas sehingga enzimnya masih stabil meskipun ada pemanasan yang tinggi. Nama enzim
tersebut adalah Taq Polymerase.
Gambar PCR
D. Tahap pemisahan fragmen-fragmen DNA yang berbeda (Elektroforesis)
Fragmen-fragmen DNA yang berbeda-beda setelah dipotong akan bercampur satu
sama lain dalam wadah pemotongan. Oleh karena itu, fragmen-fragmen yang mengkode
gen yang berbeda-beda tersebut harus dipisahkan untuk dapat melakukan identifikasi
lebih lanjut. Pemisahan tersebut dilakukan dengan cara elektroforesis. Elektroforesis
adalah teknik pemisahan molekul seluler berdasarkan atas ukurannya Teknik ini
menggunakan arus listrik yang dialirkan melalui suatu medium seperti gel agarosa.
Gambar Agarose Gel Electrophoresis
Peralatan dan bahan yang dibutuhkan adalah buffer, gel yang terbuat dari agarosa
(jenis polisakarida yang berasal dari rumput laut), wadah, dan baterai. Yang pertama
dilakukan adalah melarutkan gel agarosa di dalam buffer. Proses pelarutan ini dibantu
dengan pemanasan, misalnya dengan menggunakan oven gelombang mikro sehingga
dapat larut lebih baik. Gel yang dalam kedaan masih panas ini masih berbentuk cair
sehingga dapat dibuat cetakan untuk tempat DNA nantinya.
Cetakan dibuat dengan menggunakan lembaran Perspex tipis yang dibentuk
menyerupai sisir. Sisir tersebut ditancapkan pada salah satu ujung gel yang masih cair.
Dengan demikian, pada waktu gel memadat dan sisir diambil terbentuklah lubang-lubang
kecil. Gel agarosa yang sudah terbentuk kemudian dimasukkan ke dalam suatu tangki
yang berisi buffer yang sama seperti yang digunakan pada saat membuat gel agarosa.
Buffer yang biasa digunakan adalah triasetat-EDTA (TAE) atau tris-borat-EDTA (TBE).
Setelah gel agarosa dan buffer siap, DNA-DNA yang akan diidentifikasi
dimasukkan ke dalam lubang-lubang. Tiap lubang mengandung fragmen-fragmen DNA
dari individu yang berbeda. Selanjutnya adalah pemasangan baterai dimana kutub negatif
(katode) berada sejajar dan lebih dekat dengan lubang tempat DNA. Sementara itu, kutub
positif (anode) ditempatkan pada ujung tangki yang lain. Hal ini dilakukan karena DNA
merupakan senyawa bermuatan negatif akibat adanya gugus fosfat yang membentuknya.
Jika arus listrik dialirkan melalui medium gel agarosa dan DNA pada tangki, maka
fragmen-fragmen DNA akan berpindah dan mengalir melalui medium gel menuju ujung
gel pada sisi tangki yang dekat dengan kutub positif.
Kecepatan gerak molekul tersebut tergantung pada rasio muatan terhadap
massanya dan bentuk molekulnya. Fragmen-fragmen DNA yang lebih kecil berpindah
lebih cepat daripada yang lebih besar sehingga fragmen-fragmen DNA yang berbeda
terpisah.
E. Visualisasi
Hasil dari elektroforesis sebenarnya dapat divisualisasikan dengan merendam gel
yang DNA di dalamnya telah dielektroforesis dalam larutan etidium bromida. Etidium
bromida akan mengnterkalasi (menyisip ke dalam) DNA. Etidium bromida akan
memendarkan sinar ultraviolet. Jika gel disinari dengan ultraviolet dari bawah, maka akan
tampak gambar berupa pita-pita pada gel. Pita-pita tersebut adalah molekul-molekul atau
fragmen-fragmen DNA yang telah terpisah.
Akan tetapi, bentuk visualisasi ini belum memberikan informasi mengenai
identitas pemilik sampel karena belum diketahui lokasi fragmen-fragmen DNA yang
ingin diketahui untuk melihat VNTR (Variable Number Tandem Repeat). Oleh karena
itu, dibutuhkan satu proses visualisasi lain. Salah satunya adalah metode Southern
Blotting. Sebelum metode Southern Blotting dilakukan, dua untai DNA harus dipisahkan
terlebih dahulu dengan menggunakan proses denaturasi.
Metode Southern Blotting ini dimulai dengan meletakkan gel diantara bahan-
bahan berikut ini. Mulai dari dasar, yang paling bawah adalah larutan alkali, lalu di
atasnya ditempatkan sponge, dan barulah ditaruh gel agarosa dengan fragmen-fragmen
DNA yang telah terpisah. Di atas gel, ditaruh membran nitroselulosa yang di atasnya
ditaruh benda penyerap seperti handuk. Setelah bahan-bahan tersebut tersusun, peristiwa
selanjutnya adalah pemisahan dua untai DNA menjadisatu untai. Hal ini dilakukan agar
DNA dapat berpasangan dengan probe. Untai DNA terpisah karena DNA mengalami
denaturasi akibat DNA yang berada dalam lingkungan alkali.
Proses selanjutnya adalah pemindahan fragmen-fragmen DNA dari gel ke
membran nitroselulosa. Prosesnya kurang lebih seperti kapilaritas. Pergerakan cairan
terjadi dari bawah ke atas, sehingga DNA akan difiltrasi oleh membran nitroselulosa dan
menempel padanya sementara cairan dan material lain akan melewati filter tersebut lalu
diserap oleh bahan penyerap yang berada di bagian teratas.
Gambar Southern Blotting
Setelah DNA ditransfer dari gel ke membran nitroselulosa, membran dicuci
dengan probe (penanda). Probe sebenarnya adalah pasangan DNA single-stranded
yang telah diberi label. Untuk pelabelan secara radioaktif, label yang dapat digunakan
adalah fluorofor. Pada saat pencucian, probe akan berikatan dengan DNA single-
stranded pasangannya tersebut.
Gambar Visualisasi ikatan antara DNA single-strand dengan probe
Selanjutnya, membran nitroselulosa dengan DNA dan probe yang telah dilabel
di taruh di antara sumber radioaktif dan film. Dengan sinar-X yang dipancarkan
padanya, maka akan tercetak gambaran DNA yang tepat berpasangan dengan
probenya dalam X-Ray film tersebut.
Gambar X-Ray Film hasil tes DNA
SHS, DNA Structure, Replication, and Markers, citit (27 April 2011)
Available from:
http://shs.westport.k12.ct.us/forensics/10-dna/dna_intro.htm
Danmarks Tekniske Universitet, Commonly Used Methods for the Characterisation of
DNA Sequences, 2000, cited (28 April 2011)
Available from:
http://www.cbs.dtu.dk/staff/dave/roanoke/genetics980211.html
Albert, dkk, Southern Blotting : Gel Transfer, 2004, cited (28 April 2011)
Available from:
http://www.accessexcellence.org/RC/VL/GG/ecb/southern_blotting.php
The National Health Museum, Polymerase Chain Reaction (PCR), 2009, cited (27
April 2011)
Available from: http://www.accessexcellence.org/RC/VL/GG/polymerase.php
The National Health Museum, Restriction Enzyme - Action of EcoRI, 2009, cited (28
April 2011)
Available from: http://www.accessexcellence.org/RC/VL/GG/restriction.php
Thomas C., dkk.,Genetic Witness: Forensic Uses of DNA Tests, U.S. Government
Printing Office: Washington DC, 1990 p.9-15
Joseph J.T., Katherine J.D., & Robert L.C., General Organic and Biochemistry, 5th
ed, McGraw-Hill: United States, 2007, p.696-706
Robert R.W., Molecular Biology, 3th ed, McGraw-Hill: United States, 2005, p.73-105
Triwibowo Y., Biologi Molekuler, Erlangga: Jakarta, 2005, p.35-37