SINTESIS TURUNAN ARILAMIDA-2 DAN UJI AKTIVITAS IN VITRO
TERHADAP MATRIX METALLOPROTEINASE-9 (MMP-9) SEBAGAI
KANDIDAT ANTI-KANKER PAYUDARA
SKRIPSI
Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat
Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.)
Program Studi Farmasi
Oleh:
Benedictus Wisnu Putra Jati
NIM: 158114102
FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS SANATA DHARMA
YOGYAKARTA
2019
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
i
SINTESIS TURUNAN ARILAMIDA-2 DAN UJI AKTIVITAS IN VITRO
TERHADAP MATRIX METALLOPROTEINASE-9 (MMP-9) SEBAGAI
KANDIDAT ANTI-KANKER PAYUDARA
SKRIPSI
Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat
Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.)
Program Studi Farmasi
Oleh:
Benedictus Wisnu Putra Jati
NIM: 158114102
FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS SANATA DHARMA
YOGYAKARTA
2019
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
ii
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
iii
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
iv
HALAMAN PERSEMBAHAN
“Barangsiapa Ingin Mutiara Harus Berani Terjun
di Lautan yang Dalam” (Ir. Soekarno)
“Sesungguhnya aku ini adalah Hamba Tuhan,
terjadilah padaku menurut perkataanMu itu” (St.
Perawan Maria) (Lukas 1:38)
Karya ini saya persembahkan kepada
Tuhan Yesus Kristus
Bapak, Ibu, dan Keluarga tercinta
Teman-teman dan sahabat
Teman-teman Farmasi Angkatan 2015
Dan Almamaterku Universitas Sanata Dharma
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
v
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
vi
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
vii
PRAKATA
Puji Syukur penulis panjatkan kepada Tuhan Yang Maha Esa, karena atas
berkat dan rahmat-Nya, skripsi yang berjudul Sintesis Turunan Arilamida-2 dan Uji
Aktivitas In Vitro Terhadap Matrix Metalloproteinase-9 (MMP-9) Sebagai
Kandidat Anti-Kanker Payudara dapat diselesaikan dengan baik. Skripsi ini disusun
sebagai syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.) di Universitas
Sanata Dharma Yogyakarta.
Skripsi ini merupakan bagian dari penelitian Maywan Hariono, Ph.D., Apt.
yang didanai oleh Indonesian Toray Science Foundation (ITSF) 2017-2018 dengan
judul “Synthesis, enzymatic assay, and molecular modelling of purine derivatives
targeting hemopexin domain of matrix metalloproteinase-9 (PEX-9) in the
discovery of novel anti-breast cancer”.
Penulis juga ingin memberikan apresiasi yang besar kepada berbagai pihak
yang telah memberikan dukungan, bimbingan, dan bantuan dalam penyelesaian
naskah skripsi ini, tanpa mereka penulis tidak akan bisasampai pada tahap ini. Oleh
karena itu, peneliti ingin mengucapkan terimakasih yang besar kepada:
1. Ibu Dr. Yustina Sri Hartini, Apt. selaku Dekan Fakultas Farmasi Universitas
Sanata Dharma Yogyakarta.
2. Ibu Dr. Christine Patramurti, Apt. selaku Ketua Program Studi Farmasi
Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta.
3. Bapak Maywan Hariono, Ph.D., Apt. selaku dosen pembimbing skripsi yang
telah membimbing tim penelitian dengan sabar, selalu memberikan perhatian,
semangat, dukungan, motivasi, kritik, dan saran dari awal hingga akhir
penyusunan skripsi ini.
4. Ibu Phebe Hendra, M.Si., Ph.D., Apt. dan Ibu Dr. Erna Tri Wulandari, M.Si.,
Apt. selaku dosen penguji yang selalu memberikan semangat, kritik, dan saran
yang membangun untuk penulis menyelesaikan skripsi ini.
5. Bapak Christianus Heru Setiawan, M.Sc., Apt. selaku dosen pembimbing
akademik yang selalu memberikan motivasi, semangat, dan perhatian untuk
kemajuan penulis.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
viii
6. Bapak Matius Abdullah Chaidir dan Ibu Gertruda Tri Teguh Rahayu, S.Pd.
yang selalu memberikan dukungan, motivasi, semangat, dan doa untuk
mendampingi penulis menyelesaikan skripsi ini.
7. Teman-teman seperjuangan penelitian “Skripsi Kok Analog” Kevin, Krisna,
Ervan, Aldo, dan Sangga yang telah berjuang dan bekerja sama dengan penulis
melewati suka dan duka dalam menyelesaikan penelitian ini.
8. Sahabat tercinta “Dolan Squad” dan “Quebec” Aldo, Krisna, Retha, Bulin,
Inge, dan Masrud yang telah menjalani bersama masa suka dan duka dalam
dunia perkuliahan dalam tiga setengah tahun ini.
9. Teman dan keluarga Drug Discovery Research Group terutama para senior
Tito, Diana, dan Eko serta divisi penelitian dan pengembangan BEMF Farmasi
2017-2018 yang telah membantu penulis dalam penelitian ini.
10. Sahabat tercinta Almarhum Andreas Ardi Marwanto yang juga menjadi salah
satu motivasi penulis untuk masuk dalam dunia penemuan obat khususnya
kanker ini.
11. Aurel, Wanda, Laras, Rio, Echa, Dodo, Gilang, Ega, dan Vidan selaku sahabat
terbaik sejak kecil yang juga selalu hadir dalam jalinan persahabatan bersama
penulis.
12. Pak Parlan, Mas Kunto, Pak Wagiran, dan Mas Bimo selaku laboran yang
selalu membantu penulis dalam pelaksanaan penelitian.
13. Teman-teman kelas FSM C 2015 dan Angkatan 2015 yang memberikan
dinamika dan kenangan yang indah selama masa perkuliahan di farmasi.
14. Semua pihak yang tidak bisa penulis sebutkan satu persatu telah mendukung
penyelesaian naskah skrripsi ini.
Penulis menyadari masih terdapat banyak kekurangan dalam skripsi ini.
Oleh karena itu penulis sangat mengharapkan kritik, saran, dan masukan yang
membangun untuk perbaikan skripsi ini. Penulis berharap skripsi ini dapat
bermanfaat untuk pengembangan ilmu pengetahuan dan penelitian khususnya
dalam bidang farmasi penemuan obat. Terimakasih.
Yogyakarta, 30 januari 2019
Penulis
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
ix
DAFTAR ISI
HALAMAN JUDUL ....................................................................................... i
HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING ............................................. ii
HALAMAN PENGESAHAN ......................................................................... iii
HALAMAN PERSEMBAHAN ..................................................................... iv
PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI ........................................... v
PERNYATAAN KEASLIAN KARYA ......................................................... vi
PRAKATA ...................................................................................................... vii
DAFTAR ISI ................................................................................................... ix
DAFTAR TABEL ........................................................................................... x
DAFTAR GAMBAR ...................................................................................... xi
DAFTAR LAMPIRAN ................................................................................... xii
ABSTRAK ...................................................................................................... xiii
ABSTRACT .................................................................................................... xiv
PENDAHULUAN .......................................................................................... 1
METODE PENELITIAN ................................................................................ 4
HASIL DAN PEMBAHASAN ....................................................................... 7
KESIMPULAN ............................................................................................... 18
SARAN ........................................................................................................... 18
UCAPAN TERIMAKASIH ............................................................................ 19
DAFTAR PUSTAKA ..................................................................................... 20
LAMPIRAN .................................................................................................... 23
BIOGRAFI PENULIS .................................................................................... 32
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
x
DAFTAR TABEL
Tabel I. Hasil uji kelarutan senyawa turunan arilamida-2 ....................... 10
Tabel II. Hasil spektrum 1H-NMR senyawa arilamida-2 ......................... 11
Tabel III. Hasil spektrum 13C-NMR senyawa arilamida-2 ........................ 14
Tabel IV. Hasil uji aktivitas in vitro senyawa turunan arilamida-2............ 18
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
xi
DAFTAR GAMBAR
Gambar 1. Struktur senyawa dan farmakofor penting (a) senyawa 2 (Dufour
et al. 2011), (b) senyawa 3c (Alford et al. 2017), (c) senyawa
arilamida-2 ................................................................................... 3
Gambar 2. Reaksi substitusi asil nukleofilik antara benzokain dan 3-
bromopropionil klorida dengan menggunakan piridin sebagai
katalis nukleofil. .......................................................................... 8
Gambar 3. Hasil spektrum 1H-NMR senyawa turunan arilamida-2 .............. 10
Gambar 4. Hasil spektrum 13C-NMR senyawa turunan arilamida-2 ............. 13
Gambar 5. Hasil spektrum inframerah (a) senyawa arilamida-2 (b)
benzokain (diadaptasi dari Anderson et al., 2004) ........................ 15
Gambar 6. Kromatogram (a) dan spektrum massa (b) turunan arilamida-2 .. 16
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
xii
DAFTAR LAMPIRAN
Lampiran 1. Dokumentasi hasil sintesis, dan profil KLT senyawa turunan
arilamida-2 ................................................................................ 23
Lampiran 2. Uji DAB-HCl ............................................................................ 25
Lampiran 3. Perhitungan bahan sintesis dan hasil rendemen senyawa
arilamida-2 ................................................................................ 26
Lampiran 4. Perbesaran puncak pada spektrum 1H-NMR ............................ 27
Lampiran 5. Usulan mekanisme fragmentasi molekul utuh dan base peak
senyawa arilamida-2 pada spektrometri massa ........................ 30
Lampiran 6. Desain well plate untuk uji aktivitas in vitro ............................ 31
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
xiii
ABSTRAK
Enzim MMP-9 diekspresikan secara tinggi pada kanker payudara dengan
permasalahan, inhibitor yang telah dirancang untuk enzim tersebut bersifat tidak
selektif sehingga menyebabkan efek samping yang merugikan. Pada penelitian ini
telah disintesis senyawa arilamida-2 sebagai penghambat MMP-9 yang dirancang
lebih selektif dengan menghambat hemopexin domain MMP-9 (PEX-9). Senyawa
arilamida-2 berhasil disintesis dengan mereaksikan benzokain dan 3-
bromopropionil klorida dengan katalisator piridin melalui mekanisme reaksi
substitusi nukleofilik asil. Senyawa hasil sintesis dilakukan uji organoleptis,
kelarutan, titik lebur, dan warna dengan DAB-HCl. Produk yang terbentuk berupa
serbuk berwarna putih, larut dalam etil asetat, kloroform, dan DMSO. Titik lebur
senyawa hasil sintesis adalah 116-124oC yang bereaksi negatif terhadap DAB-HCl
mengindikasikan gugus amina primer dari benzokain sudah tersubstitusi. Senyawa
hasil sintesis dipastikan strukturnya dengan menggunakan 1H-NMR, 13C-NMR,
FTIR, dan GC-MS. Spektrum 1H-NMR menunjukan proton etilen pada geseran
kimia 2-4 ppm dan karbon etilen pada 20-40 ppm untuk 13C-NMR. Gugus karbonil
amida dideteksi dengan FTIR muncul pada 1535 cm-1 sementara bobot molekul
senyawa hasil sintesis dideteksi dengan MS sebesar m/z 299. Hasil uji aktivitas in
vitro terhadap enzim MMP-9 menunjukan persentase penghambatan enzim MMP-
9 sebesar 36% yang berasosiasi dengan aktivitas rendah-sedang senyawa arilamida-
2 sebagai inhibitor MMP-9.
Kata kunci : Arilamida-2, kanker payudara, MMP-9, PEX-9, uji aktivitas in vitro
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
xiv
ABSTRACT
MMP-9 is highly expressed in breast cancer with the major issue, the
inhibitor which has been designed for the corresponding enzyme having non-
selective properties, therefore this causes some adverse drug reactions. In this study,
it has been synthesized arylamide-2 as MMP-9 inhibitor which is designed to be
more selective by inhibiting hemopexin domain of MMP-9 (PEX-9). Arylamide-2
was successfully synthesized by reacting benzocaine and 3-bromopropionyl
chloride using pyridine as the catalyst through the mechanism of acyl nucleophilic
substitution reactions. Synthesized compound was carried out by an organoleptic,
solubility, melting point, and color with DAB-HCl test. The product was formed as
a white powder which is soluble in ethyl acetate, chloroform, and DMSO. The
melting point of the synthetic product was measured at 116-124oC, while negatively
reacting with DAB-HCl indicating that primary amine has been substituted. The
synthesized compound structure was confirmed using 1H-NMR by showing
ethylene proton at 2-4 ppm whereas the ethylene-carbon appears at 20-40 ppm as
confirmed by 13C-NMR. The amide carbonyl group was indicated at 1535 cm-1 as
confirmed by FTIR while the molecular weight was detected using GC-MS by
showing m/z 299. The result showed that arylamide-2 was able to inhibit MMP-9
with percentage inhibition of 36% at 200 µg/ml concentration associating with its
potency as weak to moderate inhibitor of MMP-9 in searching of anti-breast cancer
candidate.
Keyword: Arylamide-2, breast cancer, MMP-9, PEX-9, in vitro activity bioassay
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
1
PENDAHULUAN
Kanker merupakan penyakit kedua penyebab utama kematian di dunia. Pada
tahun 2018, terdapat 18,1 juta kasus kanker baru di dunia. Kanker payudara
merupakan kasus yang paling sering terjadi pada wanita (World Health
Organization, 2018). Pada tahun 2013, kanker payudara merupakan salah satu
kanker dengan prevalensi tertinggi di Indonesia yaitu sebesar 0,5%. Daerah
Istimewa Yogyakarta merupakan provinsi dengan prevalensi kanker payudara
tertinggi yaitu sebesar 2,4% (Kementrian Kesehatan RI, 2016). Menurut World
Health Organization (2014), kematian akibat kanker payudara pada wanita di
Indonesia cukup tinggi yaitu sebesar 21,4%.
Kanker adalah penyakit yang ditandai dengan pertumbuhan sel yang tidak
normal dan tidak teratur yang disebabkan oleh mutasi genetik serta dapat
mengalami invasi dan penyebaran sel dari satu bagian tubuh ke bagian tubuh yang
lain. Metastasis menjadi penyebab utama kematian pada penderita kanker
(Pecorino, 2012). Menurut American Cancer Society (2018) metastasis sel kanker
ke organ-organ viseral seperti pankreas, kolon, dan paru-paru merupakan hal yang
paling membahayakan nyawa dengan memperpendek harapan hidup kurang dari 5
tahun pada 20% penderita kanker secara umum. Lebih daripada itu, metastasis
menyebabkan kematian pada 90% penderita kanker (Alford, 2017).
Pada tahun 2014, menurut penelitian yang dilakukan Yousef et al. (2014)
enzim Matrix Metalloproteinase 9 (MMP-9) diekspresikan tinggi pada sel kanker
payudara dibandingkan dengan sel payudara normal. Selain itu, ditemukan
overexpression MMP-9 pada kanker payudara jenis triple-negative dan Human
Epidermal Receptor Growth Factor Receptor 2 positive (HER 2-positive). Merdad
et al., (2014) juga mengemukakan bahwa MMP-9 diekspresikan tinggi pada 97,5
% penderita kanker payudara Infiltrating Ductal Carcinoma (IDC), serta pada 52-
62% penderita kanker payudara Human Epidermal Receptor (HER).
Enzim MMP-9 merupakan salah satu peptidase yang termasuk dalam
subfamilia dari enzim matrix metalloproteinase (MMP). MMP merupakan enzim
jenis zinc-dependent endopeptidase yang bekerja dengan mendegradasi protein
extracellular matrix (ECM). Di dalam tubuh manusia terdapat 23 jenis enzim MMP
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
2
yang diklasifikasikan kedalam 6 jenis subfamilia MMP berdasarkan spesifitasnya
terhadap substrat (collagenases, gelatinases, stromelysins, matrilysins, enamelysin,
membrane type MMPs) (Benson et al., 2013). MMP-9 tergolong ke dalam
subfamilia MMP gelatinase B karena substratnya adalah gelatin. Degradasi ECM
oleh MMP-9 sangat penting pada proses kanker untuk memicu proses angiogenesis
dan metastasis sel kanker yang dapat bermigrasi ke daerah tubuh yang lain
(Stankovic et al., 2010).
Melihat pentingnya peran enzim MMP pada kanker, beberapa industri
farmasi telah merancang beberapa obat yang memiliki sifat penghambatan pada
MMP (MMP inhibitors) yang diharapkan mampu menjadi salah satu terapi kanker.
Namun, sebagian besar obat tersebut gagal melewati uji klinis karena kurang
selektif sehingga menimbulkan efek samping yang besar. Sebagai contoh,
marimastat menimbulkan efek samping berupa nyeri muskoskeletal dan inflamasi
(Cathcart et al., 2015). Sebagian besar MMP memiliki struktur genomik yang sama
yaitu propeptide region, catalytic domain, linker peptide (hinge region), dan
hemopexin domain (Nagase et al., 2006). Kegagalan MMP inhibitors tersebut
karena sebagian besar obat yang telah dirancang sebagai MMP inhibitor memiliki
spesifisitas yang rendah (Vandenbroucke dan Libert, 2014). Hal ini disebabkan
obat-obat tersebut mentargetkan catalytic domain yang memiliki persamaan
sekuens asam-asam amino (homologi) yang tinggi pada sebagian besar MMP (43-
65%) (Dufour et al., 2011).
Hemopexin domain MMP-9 (PEX-9) memiliki perbedaan sekuens asam
amino dengan MMP yang lain dengan homologi sebesar 25-35% (Dufour et al.,
2011) yang menyebabkan masing-masing MMP spesifik terhadap substrat,
sehingga dapat dijadikan target untuk merancang MMP inhibitor yang selektif
(Piccard et al., 2007). Studi hemopexin domain pada MMP-9 (PEX-9) diperlukan
untuk pengembangan senyawa-senyawa yang lebih selektif. Alford et al. (2017)
telah melakukan penelitian terhadap PEX-9 dengan penemuan dan sintesis 14
senyawa aktif secara in silico dan in vitro. Senyawa yang paling aktif adalah
senyawa 3c dengan Kd = 320 nM. Penelitian Alford et al. (2017) tersebut
dilatarbelakangi oleh penelitian Dufour et al. (2011) yang sebelumnya telah
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
3
melakukan penelitian tentang PEX-9 dan menemukan 5 senyawa aktif berdasarkan
penapisan virtual dengan metode in silico, uji in vitro, dan uji in vivo pada tikus
yang telah diinduksi dengan sel kanker MDA-MDB 435 sehingga mengalami
karsinogenesis. Senyawa yang paling aktif adalah CID135415473
www.pubchem.ncbi.nlm.nih.gov yang dinamakan senyawa 2 dengan Kd = 2,2 μM.
Senyawa tersebut memiliki struktur relatif sederhana untuk disintesis sehingga
berpotensi untuk dikembangkan lebih lanjut. Gugus yang berperan dalam aktivitas
penghambatan PEX-9 adalah cincin planar yang memiliki interaksi dengan pocket
blade PEX-9 dan juga memiliki arilamida yang terhubung oleh rantai alkil untuk
berinteraksi di daerah permukaan pocket. Gambar 1(a) dan 1(b) menunjukkan
struktur senyawa 2 yang ditemukan oleh Dufour et al. (2011) dan Alford et al.
(2011).
(a)
(b)
(c)
Gambar 1. Struktur senyawa dan farmakofor penting (a) senyawa 2 (Dufour et al.
2011), (b) senyawa 3c (Alford et al. 2017), (c) senyawa arilamida-2.
Gugus difluorometoksi
Rantai alkil Cincin planar
Gugus Fluoro
Gugus arilamida Rantai alkil
Cincin planar
Gugus arilamida
Rantai alkil
Gugus arilamida
Gugus ester etil benzoat
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
4
Pada penelitian kali ini telah disintesis senyawa fragmen dari senyawa 2
dengan mengambil sebagian farmakofor yang penting, yang akan diberi nama
turunan arilamida-2. Farmakofor yang diadaptasi untuk disintesis ialah gugus
arilamida dan rantai alkil. Selain itu juga dilakukan modifikasi pada posisi para dari
cincin arilamida yaitu berupa ester etil benzoat. Struktur senyawa turunan
arilamida-2 dapat dilihat pada gambar 1(c). Senyawa akan disintesis dengan
mereaksikan benzokain dan 3-bromopropionil klorida dengan katalis piridin
melalui mekanisme reaksi substitusi nukleofilik asil (SNA). Kemudian senyawa
turunan arilamda-2 tersebut akan diuji aktivitasnya terhadap enzim MMP-9 secara
in vitro. Penelitian ini diharapkan dapat menambah jumlah senyawa penghambat
PEX-9 yang diharapkan aktif dan selektif sebagai kandidat anti-kanker payudara.
METODE PENELITIAN
Bahan
Bahan kimia yang digunakan dalam penelitian kecuali dinyatakan lain
bermutu analisis yang disuplai dari Sigma Aldrich dan Merck. Bahan-bahan untuk
sintesis meliputi: benzokain mutu farmasetis (ethyl 4-aminobenzoate), 3-
bromopropionil klorida mutu pro analisis, piridin mutu pro analisis, natrium
karbonat mutu teknis (Na2CO3), plat kromatografi lapis tipis (KLT) silika gel GF254,
pelarut organik sebagai fase gerak (n-heksana dan etil asetat) mutu pro analisis, dan
4-dimetilano benzaldehid HCl (DAB-HCl) mutu pro analisis. Bahan-bahan untuk
elusidasi struktur meliputi: pellet kalium bromide mutu pro analisis untuk FTIR dan
pelarut kloroform-D (CDCl3) pro analisis untuk NMR. Bahan-bahan untuk uji
aktivitas in vitro bermutu pro analisis meliputi: Kit enzim MMP-9 terdiri dari enzim
MMP-9 terliofilisasi, substrat peptide, dapar, peptida NNGH sebagai kontrol
positif, gliserol untuk rekonstitusi enzim, dan dimetilsulfoksida (DMSO) sebagai
pelarut sampel.
Alat
Pada tahap sintesis alat-alat yang digunakan meliputi: timbangan analitik
(Mettler Toledo®), pompa vakum (GAST model DOA-P504-BN), oven (Memmert
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
5
GmbH + Co.KG), labu alas bulat (pyrex), pengaduk magnetik, lempeng panas,
drupple plate, seperangkat alat uji titik lebur (Mettler Toledo®), lampu UV254, dan
alat gelas pada umumnya. Ala-alat yang digunakan pada elusidasi struktur meliputi:
kromatografi gas-spektrofotometer inframerah (GC-MS-QP2010S SHIMADZU),
spektrometer nuclear magnetic resonance (Bruker 700 MHz dan 176 MHz), dan
spektrometer massa. Alat-alat untuk uji in vitro meliputi: pipet mikro (Eppendorf),
micro well plate 96, pipet tips, inkubator, vortex, ELISA Tecan Infinite 200 PRO
microplate reader fluorescence.
Prosedur Penelitian
Sintesis Senyawa Arilamida-2 (Diadaptasi dari Arifiyanto, 2001)
Dalam labu alas bulat dimasukkan benzokain sebanyak 3,59 mmol (0,59 g)
kemudian ditambahkan piridin sebagai katalisator sebanyak 3,59 mmol (0,28 g ;
0,29 mL). Campuran diaduk selama 10 menit pada suhu kamar. 3-bromopropionil
klorida ditambahkan tetes demi tetes sebanyak sebanyak 4,00 mmol (0,41 mL).
Campuran diaduk kembali selama 30 menit hingga tebentuk padatan. Padatan
disaring kemudian dinetralkan dengan Na2CO3 10% dan dicuci dengan akuades
untuk menghilangkan sisa piridin, NaCl, dan CO2 sebagai produk samping. Serbuk
hasil sintesis kemudian dihitung rendemennya.
Uji Organoleptis
Senyawa hasil sintesis dideterminasi bentuk dan warnanya.
Uji Kelarutan
Senyawa hasil sintesis diletakkan pada tabung reaksi kemudian ditetesi
perlahan-lahan dengan kloroform, etil asetat, DMSO, etanol, air, n-heksana, dan
aseton hingga larut dan ditentukan kategori kelarutannya berdasarkan Farmakope
Indonesia V.
Rekristalisasi
Senyawa hasil sintesis ditetesi perlahan-lahan hingga tepat larut
menggunakan pelarut kloroform dan diuapkan perlahan-lahan hingga terbentuk
kristal.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
6
Uji Warna dengan DAB-HCl
Senyawa hasil sintesis diletakan di drupple plate kemudian ditetesi DAB-
HCl. Perubahan warna dilihat dan dibandingkan dengan benzokain.
Kromatografi Lapis Tipis (KLT)
Serbuk hasil sintesis diuji kemurniannya dengan KLT menggunakan tiga
sistem fase gerak hasil orientasi yaitu n-heksana: etil asetat 1:3; 2:2; 3:1 (diadaptasi
dari metode Adhipandito, 2017) dan didapat fase gerak dengan pemisahan terbaik
yaitu n-heksana: etil asetat 3:1. Serbuk hasil sintesis dilarutkan dalam etil asetat dan
ditotolkan pada fase diam plat silika gel GF254 kemudian dieluasi dengan fase gerak
terpilih. Bercak dideteksi dibawah lampu UV254.
Uji Titik Lebur
Senyawa hasil sintesis dimasukan kedalam pipa kapiler kemudian
dimasukan ke dalam alat pengukur titik lebur. Suhu diatur 85-150oC kemudian
senyawa diamati suhu saat pertama kali melebur hingga semua habis. Jarak lebur
didokumentasikan.
Elusidasi Struktur
Senyawa hasil sintesis dielusidasi strukturnya menggunakan NMR, FTIR,
dan GC-MS yang dilakukan di Fakultas MIPA UGM, Sleman, DIY dan Institut
Farmasetikal dan Nutrasetikal, Malaysia dengan metode standar yang sudah
dilakukan di masing-masing tempat tersebut.
Uji aktivitas in vitro
Kit enzim MMP-9 terdiri dari enzim MMP-9 yang terliofilisasi, substrat
fluorescence resonance energy transfer (FRET)-based MMP-9, dapar uji MMP-9,
dan NNGH inhibitor sebagai kontrol positif yang didapatkan dari Biovision. Enzim
yang terliofilisasi direkonstitusi dengan 110 µL gliserol 30% dalam deionised
water. Enzim yang sudah terekonstitusi dilarutkan dalam 550 µL dapar dan siap
digunakan untuk pengujian. Senyawa sampel disiapkan dengan cara dilarutkan
dalam DMSO dengan konsentrasi akhir 200 µg/mL di dalam 96-microwell plate.
Konsentrasi akhir DMSO dalam wellplate tidak lebih dari 2%. Setiap well berisi 44
µL dapar untuk uji senyawa hasil sintesis dan 45 µL dapar untuk kontrol negatif, 1
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
7
µL senyawa hasil sintesis, 5 µL enzim, dan 50 µL substrat, desain well plate untuk
uji in vitro dapat dilihat pada lampiran 6. Sampel dicampurkan dengan buffer dan
enzim dan diinkubasi pada suhu 37ºC selama 30 menit. Substrat (40 µM) sebanyak
50 µL ditambahkan ke dalam campuran tersebut dan diinkubasi kembali pada suhu
37ºC selama 60 menit. Fluorosensi dibaca menggunakan ELISA Tecan Infinite 200
PRO microplate reader fluorescence dengan panjang gelombang eksitasi 325 nm
dan emisi 393 nm dan dihitung persentase penghambatan enzim MMP-9 dengan
rumus:
1 −𝐵𝑎𝑐𝑎𝑎𝑛 𝑓𝑙𝑢𝑜𝑟𝑒𝑠𝑒𝑛𝑠𝑖 𝑠𝑒𝑛𝑦𝑎𝑤𝑎 ℎ𝑎𝑠𝑖𝑙 𝑠𝑖𝑛𝑡𝑒𝑠𝑖𝑠 − 𝑏𝑙𝑎𝑛𝑘𝑜
𝐵𝑎𝑐𝑎𝑎𝑛 𝑓𝑙𝑢𝑜𝑟𝑒𝑠𝑒𝑛𝑠𝑖 𝑘𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙 𝑛𝑒𝑔𝑎𝑡𝑖𝑓 − 𝑏𝑙𝑎𝑛𝑘𝑜 𝑥 100%
HASIL DAN PEMBAHASAN
Senyawa arilamida-2 disintesis dengan farmakofor cincin arilamida yang
dihubungkan oleh rantai alkil. Penelitian ini akan mengeksplorasi gugus para cincin
arilamida yaitu OCF2 pada senyawa 2 yang memiliki karakteristik electron
donating group (EDG) pada gugus OC-R dan electron withdrawing group (EWG)
pada gugus difluoro dengan penambahan gugus ester etil benzoat. Gugus ester etil
bezoat mewakili karakter gugus electron withdrawing group (EWG).
Sintesis Senyawa Arilamida-2
Metode sintesis senyawa arilamida-2 pada penelitian ini mengadaptasi dari
metode Arifiyanto (2001). Bamane et al. (2011). White et al. (2012). Reaksi yang
terjadi pada proses sintesis turunan arilamida-2 adalah substitusi nukleofilik asil
antara benzokain dan 3-bromopropionil klorida dengan katalisator piridin
(Montalbetti et al., 2005). Reaksi ini berlangsung antara gugus nukleofil NH2 pada
benzokain menggantikan gugus pergi -Cl yang berikatan dengan gugus karbon asil
pada 3-bromopropionil klorida (McMurry, 2016). Produk utama yaitu senyawa
arilamida-2 dan produk samping reaksi berupa asam klorida (HCl). Mekanisme
reaksi disajikan pada gambar 2.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
8
Gambar 2. Reaksi substitusi asil nukleofilik antara benzokain dan 3-
bromopropionil klorida dengan menggunakan piridin sebagai katalis nukleofil.
Reaksi berlangsung selama 30 menit hingga terbentuk produk yang diduga
arilamida-2. Hal ini dibuktikan dengan nilai Rf pada profil KLT untuk benzokain
sebesar 0,62 dan senyawa yang diduga arilamida-2 sebesar 0,36 dengan fase gerak
n-heksana: etil asetat (3:1) yang disajikan pada Lampiran 1a menunjukkan hasil
sintesis mempunyai noda yang berbeda dari bahan awal sintesis (benzokain).
Produk awal hasil sintesis yang dihasilkan berupa padatan berwarna putih disajikan
pada Lampiran 1b. Produk awal sintesis dinetralkan dan dilakukan pencucian
dengan Na2CO3 dan akuades untuk menghilangkan NaCl, CO2 dan sisa piridin, pH
yang diukur setelah pencucian adalah 7. Senyawa hasil sintesis setelah pencucian
dan pengeringan berbentuk serbuk dan berwarna putih disajikan pada Lampiran 1c.
Hasil rendemen dari senyawa arilamida-2 sebanyak 81,48%, yang
perhitungan rendemennya disajikan pada lampiran 3. Rendemen yang dihasilkan
cukup tinggi karena sebagian besar 3-bromopropionil klorida hampir habis bereaksi
dengan benzokain. Hal ini dikarenakan gugus klorida pada 3-bromopropionil
klorida merupakan gugus pergi yang baik (Zhang et al., 2009) dan piridin mampu
mengkatalisis reaksi dengan baik (Montalbetti et al., 2005), sehingga memudahkan
serangan nukleofilik yang dilakukan oleh benzokain. Rekristalisasi serbuk hasil
sintesis menggunakan pelarut kloroform, namun dilakukan setelah pengujian titik
lebur. Rekristalisasi pada senyawa hasil sintesis berhasil dilakukan karena
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
9
kloroform memiliki titik didih yang rendah yaitu sebesar 62oC (Pubchem, 2019)
sehingga mudah menguap sempurna (volatile).
Uji warna dengan reagen DAB-HCl pada hasil sintesis ditujukan untuk
memastikan senyawa arilamida-2 telah terbentuk. Senyawa dengan gugus amina
primer akan bereaksi dengan DAB-HCl membentuk basa Schiff yang berwarna
jingga, sedangkan yang tidak memiliki gugus amina primer tidak akan bereaksi
(Adegoke, 2011). Senyawa arilamida-2 tidak bereaksi dengan DAB-HCl
membentuk warna jingga karena gugus amina primernya sudah tersubstitusi
menjadi amida. Mekanisme reaksi DAB-HCl dengan benzokain disajikan pada
Lampiran 2a, sedangkan hasil uji warna berupa produk warna jingga disajikan pada
Lampiran 2b.
Senyawa arilamida-2 dilakukan uji titik lebur yang bertujuan untuk melihat
kemurnian dengan membandingkan titik lebur dari senyawa hasil sintesis (produk)
dan bahan awal (benzokain). Hasil yang diperoleh pada penelitian 3 kali replikasi
yaitu pada rentang titik lebur di antara 119-127ºC, 114-124 ºC, dan 116-122 ºC
dengan rata-rata 116-124oC. Senyawa dikatakan murni secara titik lebur jika
memiliki rentang lebur sebesar 0,5-1,5oC (Mohrig et al., 2014). Hasil tersebut
berbeda dengan benzokain yang memiliki titik lebur 88-90ºC (Sigma Aldrich,
2019). Hasil uji titik lebur menunjukkan bahwa senyawa hasil sintesis belum murni
secara titik lebur. Hal ini dapat diatasi dengan pemurnian menggunakkan
kromatografi kolom, KLT preparatif, dan rekristalisasi. Rekristalisasi sudah
dilakukan namun karena keterbatasan alat uji titik lebur belum dapat dilakukan.
Selain uji organoleptis, warna, dan titik lebur, uji kelarutan juga dilakukan terutama
untuk menentukan pelarut yang akan digunakan dalam spektroskopi. Hasil uji
kelarutan senyawa arilamida-2 ditunjukkan pada Tabel I. Berdasarkan hasil uji
kelarutan, senyawa hasil sintesis larut dalam kloroform, etil asetat, dan DMSO
sehingga memiliki sifat kelarutan semi polar.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
10
Tabel I. Hasil uji kelarutan senyawa turunan arilamida-2
Pelarut Senyawa Arilamida-2 Perbandingan Kategori
Kelarutan FI V
n-heksana sangat sukar larut 1: 1000
Kloroform larut 1:30
Etil asetat larut 1:20
Aseton agak sukar larut 1:60
Etanol agak sukar larut 1:100
Air sangat sukar larut 1:1000
DMSO larut 1:30
Elusidasi Struktur
Spektrometri Resonansi Magnetik Inti
Elusidasi struktur dilakukan dengan pelarut kloroform berdasarkan hasil uji
kelarutan yang dilakukan terhadap senyawa hasil sintesis. Selain itu, kloroform juga
tidak akan mengganggu pada pembacaan sinyal karena sinyal senyawa diprediksi
berbeda dengan sinyal kloroform. Spektrum 1H-NMR disajikan pada Gambar 3.
Gambar 3. Hasil spektrum 1H-NMR senyawa arilamida-2
X
Y
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
11
Tabel II. Hasil spektrum 1H-NMR senyawa arilamida-2
Proton Geseran
kimia (ppm)
Integrasi Splitting J Coupling
Constant
(Hz)
HA 1,39 3 triplet 7,7
HB 2,85 dan 2,98 2 triplet of
triplet
6,3 dan 6,3
HC 3,71 dan 3,89 2 triplet of
triplet
6,3 dan 6,3
HD 4,30 2 quartet 7,7
HE 7,61 2 doublet 7,7
HF 8,02 2 doublet 7
Pelarut (X) 7,26 - singlet -
H2O (Y) 1,60 - singlet -
Sinyal pada geseran kimia 1,39 ppm (integrasi 3) (J = 7,7 Hz) merupakan
sinyal dari proton HA. Integrasi menunjukkan jumlah proton pada atom yang
dikenai gelombang radio. Integrasi yang muncul sudah sesuai dengan teori karena
jumlah proton pada HA berjumlah 3. Sinyal yang muncul sudah sesuai berdasarkan
teori hukum pencacahan proton yaitu n+1 dengan n adalah jumlah proton tetangga
yang tidak ekivalen secara kimia, sehingga sinyal yang muncul berupa triplet
karena memiliki dua proton tetangga pada lingkungan kimia yang berbeda.
Perbesaran sinyal HA disajikan pada Lampiran 4a.
Sinyal pada geseran kimia 2,85 ppm (intergrasi 2) (J= 6,3 Hz) dan 2,98 (J=
6,3 Hz) ppm merupakan sinyal dari proton HB, sedangkan geseran kimia 3,71 ppm
(integrasi 2) (J= 6,3 Hz) dan 3,89 ppm (J= 6,3 Hz) merupakan sinyal dari proton
HC. Kedua sinyal tersebut menunjukkan proton pada rantai etilen yang fleksibel dan
seharusnya muncul sebagai triplet. Namun, hasil percobaan berupa triplet of triplet.
Hal ini dapat disebabkan oleh proton pada etilen bersifat free rotatable sehingga
pada sudut tertentu proton yang terikat pada atom C yang sama memiliki
lingkungan kimia yang berbeda, hal ini menyebabkan setiap proton mengenali
tetangganya sebanyak dua kali sehingga muncul dua triplet. Kejadian ini dipastikan
dengan jumlah integrasi dua triplet tersebut sebanding dengan 2 proton. Proton HC
memiliki geseran kimia yang lebih jauh dari proton HB karena berdekatan dengan
gugus halogen (Br) yang lebih bersifat elektronegatif (menarik elektron kulit
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
12
terluarnya) daripada gugus karbonil amida yang berdekatan dengan HB sehingga
membuat HC kurang terlindungi dari medan magnet luar (de-shielded) (Anderson,
2004). Perbesaran sinyal HB dan HC disajikan pada Lampiran 4b dan 4c.
Sinyal pada geseran kimia sekitar 4,30 ppm (integrasi 2) (J= 7,7 Hz)
merupakan sinyal dari proton HD. Sinyal yang muncul sudah sesuai berdasarkan
teori yaitu muncul berupa quartet karena memiliki tiga proton tetangga pada
lingkungan kimia yang berbeda. Geseran kimia proton HD bergeser pada ppm yang
lebih jauh daripada proton HA yang merupakan proton tetangganya karena proton
HD berikatan langsung dengan atom O yang elektronegatif sehingga cenderung
menarik elektron atom C pada HD dan membuat HD kurang terlindungi dari medan
magnet luar (de-shielded) serta mengubah orientasi spin-nya untuk bergeser pada
ppm yang lebih jauh. Perbesaran sinyal HD disajikan pada Lampiran 4d.
Sinyal pada geseran kimia 7,00 – 9,00 ppm merupakan daerah proton
aromatik (Silverstein et al., 2005). Sinyal yang muncul pada geseran kimia tersebut
adalah dua sinyal berbeda, yaitu pada geseran kimia sekitar 7,61 ppm dan 8,02 ppm.
Perbesaran pada geseran kimia tersebut ditunjukkan pada Lampiran 4e dan 4f.
Sinyal pada geseran kimia 7,61 ppm (integrasi 2) (J= 7,7 Hz) merupakan proton
HE, sedangkan sinyal 8,02 ppm, (integrasi 2) (J= 7 Hz) merupakan proton HF.
Proton HE lebih terlindungi (shielded) daripada proton HF karena berada di
lingkungan kimia dekat dengan gugus NH yang memiliki elektronegativitas lebih
rendah daripada gugus C=O karbonil yang dekat dengan proton HF (Anderson,
2004). Sinyal yang muncul pada kedua proton tersebut sudah sesuai dengan teori
yaitu berupa sinyal doublet karena hanya memiliki satu proton tetangga pada
lingkungan kimia berbeda. Pada geseran 7,26 pm merupakan sinyal X yaitu sinyal
dari pelarut kloroform sedangkan sinyal Y geseran kimia 1,60 ppm yang merupakan
sinyal H2O (Fulmer et al., 2010).
Kemudian dilakukan juga uji 13C-NMR dan hasilnya disajikan pada Gambar
4. Hasil 13C-NMR memuat hanya informasi geseran kimia atom C dengan isotop
13 karena kelimpahan isotop 13C yang rendah di alam (1,1%) (Anderson, 2004).
Berdasarkan hasil percobaan, geseran kimia pada 20,0-40,0 ppm (Vollhardt dan
Schore, 2014) menunjukan sinyal dari atom C alkil bromida, hal ini sudah sesuai
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
13
dengan hasil penelitian yaitu pada daerah tersebut terdapat 1 sinyal pada geseran
kimia 39,6 ppm menunjukkan atom CC pada rantai alkil (gugus etilen). Sementara
atom CB pada geseran kimia 26,7 ppm merupakan C etilen (alkil sekunder) yang
sesuai dengan hasil empiris terletak pada daerah geseran kimia 20,0-30,0 ppm
(Vollhardt dan Schore, 2014). Atom CB lebih terlindungi daripada CC karena atom
CC berikatan dengan atom Br yang merupakan penarik elektron yang lebih kuat
daripada gugus karbonil (C=O) amida yang berikatan dengan atom CB. Geseran
kimia pada 5,0-20,0 ppm (Vollhardt dan Schore, 2014) menunjukan sinyal dari
atom C metil (alkil primer), hal ini sudah sesuai dengan hasil penelitian bahwa pada
geseran kima tersebut muncul 1 sinyal yang menunjukan atom CA dari rantai etil
ester pada 14,4 ppm. Sementara CD pada sinyal 60,9 ppm merupakan atom C yang
berikatan langsung dengan atom O ester yang sesuai berdasarkan hasil empiris
muncul pada geseran kimia 50,0-90,0 ppm (Vollhardt dan Schore, 2014). Atom CA
lebih terlindungi daripada atom CD karena atom CD berikatan langsung dengan atom
O ester yang merupakan gugus penarik elektron.
Gambar 4. Hasil spektrum 13C-NMR senyawa arilamida-2
Geseran kimia 110,0-160,0 ppm (Vollhardt dan Schore, 2014) adalah
rentang atom-atom C pada cincin benzena. Hal ini sudah sesuai dengan hasil
penelitian yang menunjukan geseran kimia pada rentang tersebut dengan
munculnya 4 sinyal yaitu 118,9 ppm, 126,4 ppm, 130,9 ppm, dan 141,5 ppm yang
berkorespondensi dengan atom CE, CF, CG, dan CH pada cincin arilamida. Atom CE
X
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
14
lebih terlindungi daripada atom CG karena posisi CE lebih dekat pada gugus NH
yang memiliki elektronegativitas lebih rendah daripada C=O ester yang dekat
dengan atom CE (Anderson, 2004). Atom CH lebih tidak terlindung daripada CF
diduga akibat CH berikatan langsung dengan NH dan C=O amida yang merupakan
gugus elektronegatif, sedangkan CF tidak berikatan langsung dengan atom O
karbonil yang elektronegatif sehingga masih terlindungi oleh ikatan dengan atom C
karbonil (Anderson, 2004). Geseran kimia 150,0-180,0 ppm (Silverstein et al.,
2005) ppm merupakan rentang dari atom C karbonil amida dan ester. Hasil
penelitian menunjukan hasil yang sesuai yaitu terdapat dua sinyal atom CI ester dan
CJ amida pada geseran kimia 166,1 ppm dan 167,9 ppm. Sinyal X pada geseran
kimia 77,0 ppm merupakan sinyal dari pelarut kloroforom (Fulmer et al., 2010).
Tabel III. Hasil spektrum 13C-NMR senyawa arilamida-2
Karbon Geseran kimia (ppm)
CA 14,4
CB 26,7
CC 39,6
CD 60,9
CE 118,9
CF 126,4
CG 130,9
CH 141,5
CI 166,1
CJ 167,9
Pelarut (X) 77
Spektrofotometri Inframerah
Elusidasi struktur dilanjutkan dengan menggunakan instrumen
spektrofotometer inframerah. Tujuan elusidasi struktur dengan spektrofotometer
inframerah adalah untuk mengidentifikasi gugus-gugus fungsional pada senyawa
hasil sintesis. Gugus fungsional yang memiliki momen dipol yang tinggi sangat
efektif menyerap radiasi inframerah sehingga menyebabkan ikatannya bervibrasi
baik secara mengulur (stretching) dan menekuk (bending) (Supratman, 2010). Hasil
elusidasi struktur senyawa hasil sintesis serta perbandingannya dengan bahan awal
(benzokain) dan keberadaan gugus fungsionalnya pada spektroskopi IR disajikan
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
15
pada gambar 5. Berdasarkan spektrum inframerah yang dihasilkan, terdapat pita
pada bilangan gelombang (ῡ) 1500 cm-1 yang menunjukan gugus C karbonil (C=O).
C=O tersebut merupakan C=O amida pada 1535 cm-1, sedangkan pada 1689 cm-1
menunjukan C=O ester. Keberadaan gugus C=O amida tersebut diperkuat dengan
adanya pita kembar yang satu ujungnya melebar pada daerah 3371 cm-1 dan 3464
cm-1 yang diduga merupakan gugus NH amida. Senyawa hasil sintesis diprediksi
sudah terbentuk dengan dukungan daerah sidik jari pada 500-1500 cm-1 yang sudah
berbeda dengan benzokain sebagai bahan awal sintesis.
(a)
(b)
Gambar 5. Hasil spektrum inframerah (a) senyawa arilamida-2 (b) benzokain
(diadaptasi dari Anderson et al., 2004)
HN-C=O R-O-C=O
C=O
daerah
sidik jari
daerah
sidik jari
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
16
Kromatografi Gas-Spektrometri Massa
Senyawa dielusidasi struktur dengan menggunakan kromatografi gas-
spektrometer massa yang bertujuan untuk menentukan bobot molekul dari senyawa
baru hasil sintesis (Anderson, 2004). Kromatografi gas bertujuan untuk memastikan
kemurnian senyawa hasil sintesis, ditandai dengan hasil kromatogram satu puncak.
Kromatografi gas dilakukan pada senyawa hasil sintesis karena berdasarkan sifat
fisika kimia senyawa dari hasil uji titik lebur menunjukkan titik lebur senyawa hasil
sintesis <200oC sehingga dapat diaplikasikan pada kromatografi gas dengan suhu
detektor 300oC. Hasil percobaan menunjukan bahwa senyawa hasil sintesis sudah
murni secara kromatografi gas ditunjukan dengan munculnya satu puncak pada
kromatogram (Rt 37 menit). Hasil kromatografi gas disajikan pada gambar 6(a).
(a)
(b)
Gambar 6. Kromatogram (a) dan spektrum massa (b) turunan arilamida-2
Pada gambar hasil spektrum massa (gambar 6(b)) terjadi perekaman
senyawa utuh hasil sintesis dengan isotop atom Br 79 g/mol yaitu sebesar m/z 299
pada spektrum paling kanan. Pola fragmentasi base peak (pola fragmentasi tertinggi
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
17
dan stabil) pada spektrum tersebut memiliki massa relatif per ion sebesar m/z 120.
Mekanisme fragmentasi tersebut dapat dilihat pada lampiran 5a dan 5b.
Uji Aktivitas In Vitro
Pada uji aktivitas in vitro, MMP-9 direaksikan dengan substrat peptida
untuk memutus ikatan peptidanya. Substrat merupakan peptida yang dihubungkan
gugus fluorofor (Aminometil kumarin) (Niccoloti, 2012) yang akan diputus ikatan
peptidanya oleh MMP-9 sehingga gugus fluorofornya terlepas dan terbaca
fluoresensinya sebagai aktivitas enzim. Kontrol positif pada pengujian ini adalah
peptida NNGH (Arg-Arg-Gly-His) (Biovision, 2019).
Pengujian in vitro pada arilamida-2 menunjukan persentase penghambatan
aktivitas enzim sebesar 36% pada konsentrasi 200 µg/mL. Pada konsentrasi ini,
senyawa arilamida-2 termasuk dalam kategori aktivitas rendah-sedang (Aderogba
et al., 2013) sehingga masih dapat dioptimasi konsentrasinya untuk mengetahui
kemungkinan aktivitas yang lebih baik. Namun, akibat keterbatasan sumber daya
(bahan baku) hal tersebut tidak dapat dilakukan dan disarankan untuk penelitian
selanjutnya. Optimasi konsentrasi dapat dilakukan hingga ≤ 500 µM (batas aktivitas
IC50) untuk memberikan aktivitas yang baik (Zu, et al., 2013), jika lebih dari itu
maka dapat dilakukan optimasi kembali strukturnya. Aktivitas yang rendah-sedang
dari senyawa arilamida-2 dapat disebabkan karena arilamida-2 hanya mengambil
satu karakteristik gugus pada posisi para cincin arilamida senyawa 2 Dufour et al.
2011 yaitu EWG (ester etil benzoat). Aktivitas arilamida-2 secara strukturnya dapat
ditingkatkan melalui optimasi struktur dengan penambahan gugus berkarakter EDG
seperti -NH-R, -NH-Ph, dan -Ph (McMurry, 2016). Tabel hasil uji aktivitas in vitro
disajikan pada tabel IV.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
18
Tabel IV. Hasil uji aktivitas in vitro
Aktivitas enzim = rata-rata/32332 x 100%, Penghambatan enzim = 100 – aktivitas enzim
KESIMPULAN
Senyawa turunan arilamida-2 dapat disintesis dari benzokain dan 3-
bromopropionil klorida melalui reaksi substitusi nukleofilik asil (SNA) dengan
katalisator piridin berupa serbuk putih, larut dalam etil asetat, kloroform, dan
DMSO, memiliki jarak lebur 116-124oC serta memiliki aktivitas penghambatan
kategori rendah-sedang terhadap MMP-9 secara in vitro sebesar 36 % pada
konsentrasi 200 µg/mL.
SARAN
Penelitian ini merupakan skrining awal untuk uji aktivitas in vitro sehingga
konsentrasi sampel masih dapat dioptimasi lagi untuk mendapatkan nilai persentase
penghambatan enzim yang lebih representatif. Optimasi konsentrasi sampel tidak
lebih dari 500 µM. Jika lebih dari itu, untuk meningkatkan aktivitasnya struktur
senyawa perlu dioptimasi dan didesain ulang dengan mempertimbangkan hubungan
struktur dan aktivitas.
Sampel Fluoresensi Rata-
rata
Aktivitas
enzim
(%)
Penghambatan
enzim
(%) ±SD R1 R2 R3
Blanko 9683 9349 9217 9416 0 0
Kontrol
negatif
32989 33687 30321 32332 100 0
Turunan
arilamida-2
23807 25072 23946 24275 64 36±3,03
Kontrol
positif
(peptida
NNGH)
5946 5946 7898 6597 0 100±4,92
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
19
UCAPAN TERIMA KASIH
Penulis berterima kasih kepada Indonesia Toray Science Foundation (ITSF)
2017-2018 atas dukungan dana untuk penelitian ini.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
20
DAFTAR PUSTAKA
Adegoke, O.A. 2011. Analytical, Biochemical, and Synthetic Application of para-
dimethylaminobenzaldedid. International Journal of Pharmaceutical
Sciences Review and Research. 11(2):17-29.
Aderogba, M.A., Ndhlala, A.R., Rengasamy, K.R.R., dan Staden J.V.S. 2013.
Antimicrobial and Selected In Vitro Enzyme Inhibitory Effectsof Leaf
Extracts, Flavonols and Indole Alkaloids Isolated from Croton
menyharthii. Molecules.18:12633-12644.
Adhipandito, C. F. 2017. Sintesis Analog Purin (FFUSD-001) dan Studi In Silico
Terhadap Matrix Metalloproteinase-9 (MMP-9) Hemopexin Domain
sebagai Kandidat Anti-Kanker Payudara. Skripsi. Universitas Sanata
Dharma.
Anderson, R.J., Bendell, D.J., dan Groundwater P.W., 2004. Organic Spectoscopic
Analysis. Royal Society of Chemistry. London. United Kingdom.
Arifiyanto, A. 2001. Pengaruh Penambahan Basa Natrium Hidroksida dan Piridin
dalam Sintesis Benzoilanilida. Skripsi. Universitas Sanata Dharma.
Alford, V.M., Kamath, A., Ren, X., Kumar, K., Gan, Q., Awwa, M. et al. 2017.
Targeting the Hemopexin-like Domain of Latent Matrix
Metalloproteinase-9 (proMMP-9) with a Small Molecule Inhibitor
Prevents the Formation of Focal Adhesion Junctions. ACS Chemical
Biology.12: 1 - 44.
American Cancer Society. 2018. Global Cancer: Facts & Figures 2018. American
Cancer Society Inc., Atlanta.
Bamane, V., Rakholiya, V.K., Chitre, T.S. 2011. Application of schotten-baumann
reaction: synthesis of sometetrahydroquinoline-3-carbohydrazide
derivatives. Heterocyclic Letters. 1(3): 263-268.
Benson, C.S., Babu, S.D., dan Radhakrishna, S. 2013. Expression of matrix
metalloproteinases in human breast cancer tissues. Disease Markers.
34: 395 – 405.
Biovision. 2019. MMP-1 Inhibitor Screening Kit (Fluorometric).
https://www.biovision.com/mmp-1-inhibitor-screening-kit-
fluorometric.html. Diakses tanggal 12 Februari 2019.
Dirjen POM. 2014. Farmakope Indonesia Edisi V. Jakarta, Kementrian Kesehatan
Republik Indonesia.
Dufour, A., Sampson, N.S., Li, J., Kuscu, C., Rizzo, R.C., DeLeon, J.L. et al. 2011.
Small-Molecule Anticancer Compounds Selectively Target the
Hemopexin Domain of Matrix Metalloproteinase-9. Cancer Research.
71(14): 4977 - 4988.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
21
Fulmer, G.R., Miller, A.J.M., Sherden, N.H. Gottlieb, H.E., Nudelman, A., Stoltz
B. M., Bercaw J.E., dan Goldberg K.I. 2010. NMR Chemical Shifts of
Trace Impurities: Common Laboratory Solvents, Organics, and Gases
in Deuterated Solvents Relevant to the Organometallic Chemist.
Organometallics. 29: 2176–2179.
Kementerian Kesehatan RI. 2016. Infodatin (Pusat Data dan Informasi
Kementerian Kesehatan RI): Stop Kanker. Jakarta, Kementerian
Kesehatan RI.
McMurry, J., 2016. Organic Chemistry, 9th Edition. Cengage Learning.
Massachusetts. USA.
Merdad, A., Karim, S., Schulten, H.J., Dallol, A., Buhmeida, A., Al-Thubaity, F. et
al. 2014. Expression of Matrix Metalloproteinases (MMPs) in Primary
Human Breast Cancer: MMP-9 as a Potential Biomarker for Cancer
Invasion and Metastasis. Anticancer Research. 34: 1355 – 1366.
Mohrig, J.R., Alberg, D.G., Hofmeister, G.E., Schatz, P.F., dan Hammond, C.N.
2014. Laboratory Techniques in Organic Chemistry: Supporting
Inquiry-Driven Experiments, 4th Edition. W. H. Freeman and Company.
New York. USA.
Montalbetti, C.A.G.N., dan Falque, V., 2005. Amide bond formation and peptide
coupling. Tetrahedron. 61: 10827 - 10852.
Nagase, H., Visse, R., dan Murphy, G. 2006. Structure and function of matrix
metalloproteinases and TIMPs. Cardiovascular Research. 69: 562 -
573.
Nicolotti, O., Catto, M., Giangreco, I., Barletta, M., Leonetti, F., Stefanachi, A. et
al. 2012. Design, synthesis and biological evaluation of 5-hydroxy, 5-
substituted pyrimidine-2,4,6-triones as potent inhibitors of gelatinases
MMP-2 and MMP-9. European Journal of Medicinal Chemistry. 58:
368-376.
Pecorino, L. 2012. Molecular Biology of Cancer: Mechanisms, Targets, and
Therapeutics. 3rd Edition. Oxford University Press. Oxford. United
Kingdom.
Piccard, H., Van den Steen, P.E., dan Opdenakker, G., 2007. Hemopexin domains
as multifunctional liganding modules in matrix metalloproteinases and
other proteins. Journal of Leukocyte Biology. 81: 870 - 892.
Pubchem.2019. Chloroform. https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov. Diakses tanggal 12
Februari 2019.
Pubchem.2019. CID135415473. https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov. Diakses
tanggal 18 Januari 2019.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
22
Sigma Aldrich. 2019. Benzocaine. https://www.sigmaaldrich.com. Diakses tanggal
20 Januari 2019.
Silverstein, R.M., Webster, F.X., dan Kiemle, D.J. 2005. Spectrometric
Identification of Organic Compound. 7th Edition. John Wiley & Sons,
Inc. Hoboken. USA.
Stankovic, S., Konjevic, G., Gopcevic, K., Jovic, V., Inic, M., dan Jurisic, V., 2010.
Activity of MMP-2 and MMP-9 in sera of breast cancer patients.
Pathology - Research and Practice. 206 (4): 241 - 247.
Supratman, U. 2010. Elusidasi Struktur Senyawa Organik. Widya Padjajaran.
Bandung. Indonesia.
Vandenbroucke, R.E., dan Libert, C., 2014. Is there new hope for therapeutic matrix
metalloproteinase inhibition?. Nature Reviews Drug Discovery. AOP.
Publikasi online 7 November 2014. Diakses tanggal 15 November
2018.
Vollhardt, P., dan Schore, N. 2014. Organic Chemistry: Structure and Function. 7th
Edition. W.H. Freeman and Company. New York. USA.
White, T.D., Berglund, K.D., Groh, J.M., Johnson, M.D., Miller, R.D., dan Yates,
M.H. 2012. Development of a Continuous Schotten−Baumann Route to
an Acyl Sulfonamide. Org. Process Res. Dev.16: 939−957.
World Health Organization. 2014. Cancer Country Profiles: Indonesia. Geneva,
WHO Press.
World Health Organization. 2018. Latest global cancer data: Cancer burden rises
to 18.1 million new cases and 9.6 million cancer deaths in 2018.
Geneva, WHO Press.
Yousef, E.M., Tahir, M.R., St-Pierre, Y., dan Gaboury, L.A. 2014. MMP-9
expression varies according to molecular subtypes of breast cancer.
BMC Cancer. 14 (609): 1 – 12.
Zhang, L., Wang, X.J., Wang, J., Grinberg, N., Krishnamurthy, D.K., dan
Senanayake, C.H. 2009. An improved method of amide synthesis using
acyl chlorides. Tetrahedron Letters. 50 (24): 2964 - 2966.
Zu, T., Cao, S., Su, P.C., Patel, R., Shah, D., Chokshi, H.B., Szukala, R. et al. 2013.
Hit Identification and Optimization in Virtual Screening: Practical
Recommendations Based Upon a Critical Literature Analysis. J. Med.
Chem. 1: 1-55.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
23
LAMPIRAN
Lampiran 1. Dokumentasi hasil sintesis, dan profil KLT senyawa turunan
arilamida-2
Lampiran 1a. Hasil KLT sintesis senyawa turunan arilamida-2 yang menunjukkan
2 noda yang berbeda, yaitu benzokain (A) dengan nilai Rf 1 0,62 dan senyawa
arilamida-2 (B) dengan nilai Rf 2 0,36 . Fase gerak yang digunakan adalah n-
heksana : etil asetat (3:1). Deteksi di lampu UV254.
Lampiran 1b. Foto dari tahap sintesis senyawa arilamida-2 setelah dilakukan
proses pengadukan selama 30 menit.
2
1
A
B
Rf 1 = 0,62
Rf 2 = 0,36
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
24
Lampiran 1c. Hasil sintesis senyawa arilamida-2 setelah dilakukan penetralan pH
dan kemudian dikeringkan.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
25
Lampiran 2. Uji DAB-HCl
Lampiran 2a. Mekanisme reaksi antara benzokain dengan DAB-HCl yang
membentuk basa Schiff yang berwarna jingga.
Lampiran 2b. Hasil uji DAB-HCl dengan benzokain (A) dan senyawa turunan
arilamida-2 (B). Pembentukan basa Schiff ditandai dengan warna jingga.
A B
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
26
Lampiran 3. Perhitungan bahan sintesis dan hasil rendemen senyawa arilamida-2
Perhitungan bahan:
1. Benzokain digunakan 3,59 mmol = 0,00359 mol
Berat molekul = 165 g/mol
0,00359 mol x 165 g/mol = 0,59 g
2. Piridin digunakan 3,59 mmol = 0,00359 mol
Berat molekul = 79,1 g/mol
Massa jenis = 0,982 g/mL
0,00359 mol x 79,1 g/mol = 0,284 g : 0,982 g/mL = 0,29 mL
3. 3-bromopropionil klorida digunakan 4 mmol = 0,004 mol
Berat molekul = 171,418 g/mol
Massa jenis = 1,701 g/mL
0,004 mol x 171,418 g/mol = 0,686 g : 1,701 g/mL = 0,41 mL
Reaksi Stoikiometri:
Benzokain + 3-bromopropionil klorida Arilamida-2 + HCl
3,59 mmol 4,00 mmol
3,59 mmol 3,59 mmol 3,59 mmol 3,59 mmol
0,41 mmol 3,59 mmol 3,59 mmol
Massa teoritis arilamida-2 = 3,59 mmol x 300 mmol/mg
= 1077 mg =1,08 g
Hasil rendemen:
Senyawa arilamida-2 = 0,88 g
1,08 g x 100%
= 81,48%
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
27
Lampiran 4. Perbesaran puncak pada spektrum 1H-NMR
Lampiran 4a. Perbesaran sinyal HA pada geseran kimia 1,39 ppm menunjukan
splitting triplet dengan integrasi 3 dan nilai J coupling constant yaitu 7,7 Hz.
Lampiran 4b. Perbesaran sinyal HB pada geseran kimia 2,85 ppm dan 2,98 ppm
menunjukan splitting triplet of triplet dengan integrasi 2 dan nilai J coupling
constant yaitu 6,3 Hz.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
28
Lampiran 4c. Perbesaran sinyal HC pada geseran kimia 3,71 ppm dan 3,89 ppm
menunjukan splitting triplet of triplet integrasi 2 dan nilai J coupling constant yaitu
6,3 Hz.
Lampiran 4d. Perbesaran sinyal HD pada geseran kimia 4,36 ppm menunjukan
splitting quartet integrasi 2 dan nilai J coupling constant yaitu 7,7 Hz.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
29
Lampiran 4e. Perbesaran sinyal HE pada geseran kimia 7,61 ppm menunjukan
splitting doublet integrasi 2 dan nilai J coupling constant yaitu 7,7 Hz.
Lampiran 4f. Perbesaran sinyal HF pada geseran kimia 8,02 ppm menunjukan
splitting doublet integrasi 2 dan nilai J coupling constant yaitu 7 Hz.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
30
Lampiran 5. Usulan mekanisme fragmentasi molekul utuh dan base peak turunan
arilamida-2 pada spektrometri massa
Lampiran 5a. Usulan pola fragmentasi molekul utuh m/z 299
Lampiran 5b. Usulan pola fragmentasi base peak m/z 120
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
31
Lampiran 6. Desain well plate untuk uji aktivitas in vitro
Keterangan:
B : dapar
KP : senyawa kontrol positif (peptida NNGH)
TA2 : turunan arilamida-2
C : senyawa lain
E : enzim MMP-9
S : substrat enzim MMP-9
Angka : volume (mikroliter/µl)
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A B100 B100 B100 B45
E5
S50
B45
E5
S50
B45
E5
S50
B44
KP_1
E5
S50
B44
KP_1
E5
S50
B44
KP_1
E5
S50
B44
C_1
E5
S50
B44
C_1
E5
S50
B44
C_1
E5
S50
B B44
TA2_1
E5
S50
B44
TA2_1
E5
S50
B44
TA2_1
E5
S50
B44
C_1
E5
S50
B44
C_1
E5
S50
B44
C_1
E5
S50
B44
C_1
E5
S50
B44
C_1
E5
S50
B44
C_1
E5
S50
B44
C_1
E5
S50
B44
C_1
E5
S50
B44
C_1
E5
S50
C B44
C_1
E5
S50
B44
C_1
E5
S50
B44
C_1
E5
S50
B44
C_1
E5
S50
B44
C_1
E5
S50
B44
C_1
E5
S50
B44
C_1
E5
S50
B44
C_1
E5
S50
B44
C_1
E5
S50
B44
C_1
E5
S50
B44
C_1
E5
S50
B44
C_1
E5
S50
D B44
C_1
E5
S50
B44
C_1
E5
S50
B44
C_1
E5
S50
B44
C_1
E5
S50
B44
C_1
E5
S50
B44
C_1
E5
S50
B44
C_1
E5
S50
B44
C_1
E5
S50
B44
C_1
E5
S50
B44
C_1
E5
S50
B44
C_1
E5
S50
B44
C_1
E5
S50
E B44
C_1
E5
S50
B44
C_1
E5
S50
B44
C_1
E5
S50
B44
C_1
E5
S50
B44
C_1
E5
S50
B44
C_1
E5
S50
B44
C_1
E5
S50
B44
C_1
E5
S50
B44
C_1
E5
S50
B44
C_1
E5
S50
B44
C_1
E5
S50
B44
C_1
E5
S50
F B44
C_1
E5
S50
B44
C_1
E5
S50
B44
C_1
E5
S50
B44
C_1
E5
S50
B44
C_1
E5
S50
B44
C_1
E5
S50
B44
C_1
E5
S50
B44
C_1
E5
S50
B44
C_1
E5
S50
B44
C_1
E5
S50
B44
C_1
E5
S50
B44
C_1
E5
S50
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
32
BIOGRAFI PENULIS
Penulis skripsi dengan judul “Sintesis Turunan
Arilamida-2 dan Uji Aktivitas In Vitro terhadap Matrix
Metalloproteinase-9 (MMP-9) Sebagai Kandidat Anti-
Kanker Payudara” bernama lengkap Benedictus Wisnu
Putra Jati. Penulis merupakan anak sulung dari pasangan
Matius Abdullah Chaidir dan Gertruda Tri Teguh
Rahayu. Penulis lahir di Sleman, 13 Nopember 1996.
Pendidikan formal penulis diawali di TK Kanisius
Sorowajan (2002-2003), SD Kanisius Sorowajan (2003-
2009), SMP Pangudi Luhur 1 Yogyakarta (2009-2012),
dan SMA Kolese De Britto (2012-2015). Pendidikan
dilanjutkan hingga perguruan tinggi di Fakultas Farmasi Universitas Sanata
Dharma Yogyakarta. Penulis terlibat dalam beberapa kegiatan organisasi dan
kepanitiaaan, antara lain Bendahara Drug Discovery Research Group tahun 2017-
2019, koordinator divisi Perlengkapan dan Ketua kegiatan DESA MITRA 2016 dan
2017, anggota dan koordinator divisi Konsumsi kegiatan TITRASI 2016 dan 2017,
serta menjadi asisten praktikum mata kuliah Kimia Organik (2018) dan Kimia
Dasar (2018). Penulis juga terlibat dalam beberapa perlombaan tingkat nasional
antara lain sebagai peserta PICS 2017 di Institut Teknologi Bandung dan peserta
Poster Competition CADD 2018 di Bali. Penulis juga aktif mengikuti kegiatan
Drug Discovery Research Group yang bergerak memfasilitasi mahasiswa/i Farmasi
Sanata Dharma menekuni bidang penemuan obat baru.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
Top Related