Salomo Hutahean: Pola Ekspresi Calcium-Binding Protein (CaBP) S-100 di Jaringan Palatum…, 2004 USU Repository©2006
Salomo Hutahean: Pola Ekspresi Calcium-Binding Protein (CaBP) S-100 di Jaringan Palatum…, 2004 USU Repository©2006
RINGKASAN
Cacat celah langit-langit mulut (cleft palate/CP) adalah salah satu jenis cacat bawaan
yang sering dijumpai dalam masyarakat. Angka insidensinya -- umumnya dihitung
bersama-sama dengan bibir sumbing (cleft lip and palate) -- adalah tertinggi di dunia dari
antara seluruh jenis cacat bawaan yang dikenal, yakni sekitar 1 per 700 kelahiran. Melalui
percobaan-percobaan pada hewan-hewan mamalia telah dikenali sejumlah agensia toksik
yang memiliki kemampuan menginduksi cleft palate, yaitu fenitoin don diazepam
(obat-obatan antikonfulsi), alkohol, glukokortikoid, retinol, hadacidin, dioksin, nikotin dan
pelarut-pelarut organik yang biasa digunakan untuk industri. Hampir seluruh agensia
penginduksi cleft palate tersebut tergolong pada senyawa-senyawa yang aktif di sistem saraf
(memiliki aktivitas neurofarmaka), akan tetapi sejauh ini belum diketahui apa yang
mendasari kepekaan jaringan palatum embrio terhadap senyawa-senyawa neurofarmaka.
Menarik untuk diteliti kemungkinan adanya sel-sel khusus non-saraf di jaringan palatum
yang memiliki kemampuan merespon senyawa-senyawa neurofarmaka penginduksi cleft
palate.
Dalam penelitian ini dikaji secara imunohistokimiawi pola ekpresi calcium binding
protein S-100 di jaringan palatum embrio mencit sepanjang masa palatogenesis, sebagai
molekul yang diduga turut berperan dalam rangkaian respon jaringan palatum terhadap
senyawa-senyawa neurofarmaka penginduksi cleft palate.
Delapan ekor mencit (Mus musculus, L) bunting dipelihara pada kondisi
eksperimental don dikorbankan berturut-turut sejak hari ke-12 hingga hari ke-15
kebuntingan, kemudian diproses struktur craniofacialnya melalui metode parafin dan dibuat
irisan penampang
iii
Salomo Hutahean: Pola Ekspresi Calcium-Binding Protein (CaBP) S-100 di Jaringan Palatum…, 2004 USU Repository©2006
palatum (coronol section) setebal 6μ. Irisan-irisan yang diperoleh diproses secara
imunohistokimia dan selanjutnya diamati dengan mikroskop cahaya untuk memperoleh
gambaran pola ekspresi protein S-100 secara spatiotemporal.
Hasil imunohistokimia menunjukkan bahwa terdapat ekspresi protein S-100 di
jaringan palatum embrio mencit selama proses palatogenesis berlangsung. Pada awal
palatogenesis ekspresi cenderung berderajat sedang dan terdistribusi merata di seluruh bagian
palatum, ekspresi meningkat pada saat pertumbuhan horizontal bilah terutama di jaringan
mesenkim dan cenderung tetap tinggi hingga pasca fusi dengan pola distribusi memusat di
mesenkim sepanjang poros bilah.
Pola spesifik ekspresi S-100 di palatum embrio mengindikasikan keterlibatannya
dalam proses penutupan langit-langit mulut. Senyawa-senyawa aktif neurofarmakologis yang
kerjanya melalui mobilisasi calcium binding protein (CaBP) untuk fungsi eksositosis
neurotransmitter dapat menggangu ketersediaan protein CaBP S-100 untuk fungsi regulasi
ekspresi protein. Mekanisme tersebut menjelaskan kenyataan bahwa kebanyakan agensia
penginduksi cleft palate adalah senyawa aktif neurofarmakologis.
iv
Salomo Hutahean: Pola Ekspresi Calcium-Binding Protein (CaBP) S-100 di Jaringan Palatum…, 2004 USU Repository©2006
SUMMARY
Cleft palate syndromes are among the most common congenital malformation in
human, together with cleft lip (cleft lip and palate) occur in approximately 1 in 700 live
births.
In mammalian experimentation, cleft palate has been associated with numerous
environmental toxic substances, known as cleft palate inducer such as phenytoin and
diazepam (anticonvulsant dugs), alcohol, glucocorticoid, retinol, hadacidin, dioxin, tobacco
smokes, and industrial organic solvent. Interestingly, most of the cleft palate inducer posses
neuropharmacologic activity in adult. The mechanism that lead to sensitivity of non-neuronal
palatal tissue to those substances still unclear.
The aim of the present study was to investigate immunohistochemically the presence
and the pattern of distribution of calcium binding protein (CaBP) S-100 in mouse (Mus
musculus, L) palatal shelves during palatogenesis, to get the information about the functional
roles of this protein on palatal tissue sensitivity to neuropharmacologic substances.
Eight pregnant dams were maintained under experimental condition, and on days 12,
13, 14, and 15 of gestation (plug day = 0 day) 2 dams each were sacrificed for collecting the
fetuses. Coronal paraffin section (6μ) of craniofacial structure were stained
immunohistochemically for S-100 protein expression.
The result showed that, spatiotemporally there is a specific pattern of S-100 protein
expression in palatal tissue during palatogenesis. They were found and distributed evenly in
palatal tissue at the beginning of palatogenesis (GD12), but following the developmental
progress they
v
Salomo Hutahean: Pola Ekspresi Calcium-Binding Protein (CaBP) S-100 di Jaringan Palatum…, 2004 USU Repository©2006
localise most intensely in the messenchyme rather than epithelia (GD13). After palatal fusion
(GD14 and GD 15), the expression remained high in the middle of palate, forming a thick
line in the area of mesenchyme across the 2 fused palatal shelves.
The pattern indicate that S-100 protein may play a role in mesenchymal cell
migration and concilidation, probably through regulation function of S-100 protein on
microtubula and other contractil protein, so facilitating palatal shelves horizontal growth and
subsequent palatal closure. Protein S-100 may also play a central role in cleft palate
phenomenon, since most of the known cleft palate inducer have neuropharmacological
activity with the potential to disturb pattern of CaBP S-100 expression in developing palate.
vi
Salomo Hutahean: Pola Ekspresi Calcium-Binding Protein (CaBP) S-100 di Jaringan Palatum…, 2004 USU Repository©2006
DAFTAR ISI
Hlm
LEMBAR IDENTITAS DAN PENGESAHAN ................................................. ii
RINGKASAN ..................................................................................................... iii
SUMMARY .........................................................................................................v
PRAKATA ......................................................................................................... vii
DAFTAR ISI ......................................................................................................viii
DAFTAR TABEL ............................................................................................... ix
DAFTAR GAMBAR . ..........................................................................................x
I. PENDAHULUAN.............................................................................................1
II. TINJAUAN PUSTAKA ..................................................................................4
III. TUJUAN DAN MANFAAT PENELITIAN .................................................9
IV. METODE PENELITIAN ..............................................................................9
V. HASIL DAN PEMBAHASAN ......................................................................14
VI. KESIMPULAN .............................................................................................19
DAFTAR PUSTAKA . ........................................................................................20
viii
Salomo Hutahean: Pola Ekspresi Calcium-Binding Protein (CaBP) S-100 di Jaringan Palatum…, 2004 USU Repository©2006
DAFTAR TABEL
Hlm
Tabel 1. Bagan alir prosedur kerja imunohistokimia
untuk protein S-100 ....... . 13
Tabel 2. Pola ekspresi spatiotemporal protein S-100 di jaringan
palatum embrio mencit (Mus musculus, L) . ....... . 14
ix
Salomo Hutahean: Pola Ekspresi Calcium-Binding Protein (CaBP) S-100 di Jaringan Palatum…, 2004 USU Repository©2006
DAFTAR GAMBAR
Hlm
Gambar 1. Pola ekspresi protein S-100 di jaringan palatum
pada tingkat perkembangan hari hari ke-13 ....................................... 15
kebuntingan.
Gambarl 2. Pola ekspresi protein S-100 di jaringan palatum……………………...17
pada tingkat perkembangan hari hari ke-14
kebuntingan.
x
Salomo Hutahean: Pola Ekspresi Calcium-Binding Protein (CaBP) S-100 di Jaringan Palatum…, 2004 USU Repository©2006
I. PENDAHULUAN
Cacat celah langit-langit mulut (cleft palate) adalah salah satu jenis cacat bawaan
yang sering dijumpai dalam masyarakat. Angka insidensinya, dihitung bersama-soma dengan
bibir sumbing (cleft lip and palate), adalah tertinggi di dunia dari antara seluruh jenis cacat
bawaan yang dikenal, yakni sekitar 1 per 700 kelahiran (Kerrigan, dkk., 2000). Di Indonesia
cleft lip and palate adalah salah satu dari 4 jenis cacat bawaan yang paling sering dijumpai
(Kadri dkk., 1995).
Penanganan cleft palate sampai soot ini dilakukan melalui tindakan operasi yang
membutuhkan biaya besar (Tsukada don Taniguchi, 1993). Menurut Czeizel (2001) pilihan
paling rasional penanganan masalah ini adalah pencarian upaya-upaya preventif yang
ditujukan pada penekanan angka insidensi cacat yang tinggi. Akan tetapi hal tersebut belum
dapat dilakukan karena pengembangannya masih menunggu informasi-informasi dasar yang
berkaitan dengan seluk-beluk proses embriologis perkembangan palatum (palatogenesis) don
mekanisme kerjo agensia-agensia penginduksi cleft palate yang sangat beragam.
Induksi cleft palate bersifat multifaktor. Selain faktor predisposisi genetik, faktor
paparan terhadap agensia toksik dari lingkungan selama masa kehamilan juga memegang
peranan besar. Beberapa diantar agensia toksik penginduksi cleft palate telah dikenali, yaitu
fenitoin don diazepam (obat-obatan antikonfulsi), alkohol, glukokortikoid, retinol, hadacidin,
dioksin, nikotin don pelarut-pelarut organik yang biasa digunakan untuk industri.
Masing-masing agensia bekerja dengan mekanisme berbeda mengganggu tahap spesifik
proses palatogenesis embrio (Wyzynski don Beaty, 1996).
1
Salomo Hutahean: Pola Ekspresi Calcium-Binding Protein (CaBP) S-100 di Jaringan Palatum…, 2004 USU Repository©2006
Beragamnya faktor penginduksi cleft palate mengakibatkan pengembangan upaya
pencegahan menjadi sangat kompleks karena menuntut dikembangkannya sejumlah upaya
yang spesifik terhadap tiap-tiap faktor penginduksi. Oleh karena itu salah satu strategi yang
akan besar manfaatnya bagi pengembangan upaya pencegahan cleft palate di masa
mendatang adalah mencari kesamaan dalam mekanisme kerja di antara seluruh atau sebagian
besar faktor penginduksi sehingga kompleksitas permasalahan dapat disederhanakan.
Dalam kaitan itu salah satu faktor yang menarik untuk dikaji adalah terdapatnya
kesamaan aktivitas pada agensia-agensia penginduksi cleft palate. Hampir seluruh agensia
penginduksi cleft palate memiliki aktivitas neurofarmakologi (Zimmerman dan Wee, 1984).
Berdasarkan kenyataan tersebut Zimmerman dan Wee (1984) mengemukakan dugaan bahwa
induksi cleft palate mungkin melibatkan gangguan sekresi neurotransmitter dan transduksi
signal di jaringan saraf, mengingat target organ aksi senyawa neurofarmokologik adalah pada
sel-sel neuron di otak. Akan tetapi pada percobaan kultur organ palatum in vitro induksi cleft
palate ternyata dapat berlangsung meskipun jaringan sudah terpisah dari sistem saraf pusat.
Dengan demikian induksi cleft palate tidak mensyaratkan keterlibatan sistem saraf pusat dan
itu berarti kemungkinan terdapat sel-sel khusus non-saraf di jaringan palatum sendiri yang
memiliki kemampuan merespon senyawa-senyawa neurofarmakologik penginduksi cleft
palate.
Respon sel terhadap senyawa neurofarmokologik adalah terutama berupa osilasi kadar
ion kalsium (Ca2+) di dalam sel yang mempengaruhi sekresi neurotransmitter (Thayer dkk.,
2002). Tetapi pada sisi lain, influx Ca2+, pada sel-sel tertentu dapat mengaktifkan Calcium-
2
Salomo Hutahean: Pola Ekspresi Calcium-Binding Protein (CaBP) S-100 di Jaringan Palatum…, 2004 USU Repository©2006
Binding Protein (CaBP). CaBP teraktivasi, dalam bentuk kompleks senyawa dengan ion
Ca2+ memiliki kemampuan meregulasi mitosis dan mempengaruhi ekpresi sejumlah gen
(Swanson dkk., 1997; Tamascovic dkk., 2003) .
Protein S-100 adalah calcium-binding protein yang diekpresikan terutama di otak
tetapi juga di beberapa jaringan lain turunan krista neuralis. Protein S-100 meregulasi
ekspresi gen-gen yang mengkode protein vimentin, keratin, annexin, myosin, tropomyosin,
serta proteinprotein mikrotubula. Oleh karena protein-prptein target regulasi S-100 tersebut
bekerja menentukan migrasi, adhesi, dan diferensial sel, maka protein S-100 diperkirakan
penting peranannya dalam morfogenesis (Ikura dkk., 2002).
Pola ekpresi S-100 di jaringan palatum sejauh ini belum diketahui. Mengingat secara
embriologis sebagian struktur palatum adalah turunan krista neuralis (D'Amico-Martel dkk
dalam Zimmerman dan Wee, 1984), diduga terdapat kelompokan sel di jaringan fersebut
yang mengekpresikan protein S-100. Sel-sel seperti itu diperkirakan berfanggungjawab
merespon influx Ca2+ akibat aksi senyawa neurofarmakologik di jaringan palatum, oukan
dalam bentuk sekresi neurotransmitter melainkan dalam bentuk perubahan ekpresi gen-gen
yang penting dalam palatogenesis.
Dalam penelitian ini akan dikaji secara imunohistokimiawi ekpresi gen S-100 pada
tingkat protein di jaringan palatum embrio mencit sepanjang masa palatogenesis untuk
mengetahui apakah ferdapaf pola ekpresi spesifik yang bersesuaian dengan tahap-tahap
genting proses penutupan palatum embrio. Hasil penelitian diharapkan dapat menjelaskan
dasar kerja senyawa-senyawa neurofarmakologik menginduksi cleft palate.
3
Salomo Hutahean: Pola Ekspresi Calcium-Binding Protein (CaBP) S-100 di Jaringan Palatum…, 2004 USU Repository©2006
II. TINJAUAN PUSTAKA
1. Perkembangan Palatum Embrio (Palatogenesis)
Pai'atum pada mamalia adalah struktur langit-langit mulut yang membatasi rongga
nasofaring dengan rongga mulut. Secara anatomi palatum dibedakan antara palatum keras
(palatum durum) yang menempati wilayah anterior don pal.atum lunak (palatum mole) yang
menempati wilayah posterior langit-langit mulut. Sedangkan dari sudut perkembangannya
palatum dibedakan antara palatum pertama (primary palate) dengan palatum kedua
(secondary palate) (Ferguson, 1988). Dalam penelitian ini yang dimaksudkan sebagai
perkembangan palatum (palatogenesis) adalah proses pembentukan palatum kedua.
Agar diperoleh struktur langit-langit mulut yang menutup sempurna, palatogenesis
harus berhasil melampaui 4 tahapan perkembangan. Keempat tahapan itu Ddalah:
pertumbuhan awal bilah palatum (initial palatal shelves growth), pertumbuhan seperti
mendaki (shelves elevation), pertumbuhan (horizontal shelves growth), don fusi (palatal
fusion) (Ferguson, 1988).
Pertumbuhan awal palatum dimulai dari terbentuknya tonjolan bilateral dari sisi
dalam dinding maksila. Pada awalnya pertumbuhan bilah terjadi secara vertikal dengan
kedua ujung bilah mengarah ke dasar mulut. Pada tahap berikutnya ujung-ujung bilah
palatum akan tumbuh menaik seperti mendaki hingga menempatkan diri di atas punggung
lidah yang sedang berkembang. Faktor kunci keberhasilan tahap ini adalah sintesis don
distribusi spesifik matriks ekstrasel hialuronan di jaringan palatum yang diregulasi oleh
protein EGF don TGF-β1. Pertumbuhan mendaki hanya membutuhkan waktu yang singkat
yaitu beberapa menit hingga jam. Setelah itu bilah palatum yang kini sudah menempati posisi
di atas lidah akan tumbuh soling mendekat secara horizontal dari kedua arah hingga terjadi
kontak
4
Salomo Hutahean: Pola Ekspresi Calcium-Binding Protein (CaBP) S-100 di Jaringan Palatum…, 2004 USU Repository©2006
antara kedua ujungnya. Horizontal growth mensyaratkan keajegan proses mitosis di jaringan
palatum yang melibatkan ekpresi proteinprotein pembelahan dari keluarga cyclin. Kontak
antara 2 ujung bilah palatum pada tahap akhir palatogenesis memicu serangkaian proses yang
diarahkan pada keberhasilan fusi membentuk struktur sinambung yang kokoh menutup
sempurna langit-langit mulut. Sebelum kontak terjadi bilah palatum telah memiliki struktur
histologi yang khas, yaitu jaringan mesenkim sebagai struktur tubuh bilah palatum don
jaringan epitel melapisi sisi luarnya. Kontak terjadi antara epitel aspek medial (Medial Edge
Epithelium/MEE) dari kedua bilah palatum yang berhadapan (Ferguson, 1998; Kerringan
dkk., 2000). Setelah kontak, sebagian epitel mengalami kematian sel selektif (Shapiro don
Sweney dalam Kerrigan dkk., 2000), sebagian bermigrasi ke aspek oral don nasal bilah
(Bittencourt don Bolognese, 2000), don sisanya bertransdiferensiasi menjadi mesenkim
(Kaartinen, dkk., 1997), sehingga pertemuan antar kedua ujung bilah yang tadinya
diperantarai oleh sel epitel berubah menjadi hubungan antar mesenkim yang lebih kokoh.
Pada manusia seluruh kejadian tersebut berlangsung antara minggu ke-7 hingga ke-12
kehamilan, sedangkan pada mencit percobaan sekitar hari ke-10 hingga ke-14 kebuntingan
(Kerrigan dkk., 2000).
Selama palatogenesis, pembelahan, diferensiasi don kematian sel, adhesi don migrasi
sel, gerakan morfogenesis, don sintesis senyawa matriks berlangsung silih berganti. Runtutan
proses harus berlangsung tahap demi tahap dengan pengaturan yang ketat oleh ekpresi gen-
gen secara selektif. Gangguan ekspresi gen, demikian juga gangguan oleh agensia toksis pada
salah satu tahapan perkembangan dapat menyebabkan hambatan penutupan palatum sehingga
muncul cacat cleft palate. (Kerrigan dkk., 2000).
5
Salomo Hutahean: Pola Ekspresi Calcium-Binding Protein (CaBP) S-100 di Jaringan Palatum…, 2004 USU Repository©2006
2. Cacat Celah Langit-langit Mulut (Cleff Palate)
Cacat celah langit-langit (cleft palate) termasuk salah satu jenis cacat bawa lahir
yang sering dijumpai di masyarakat. Berdasarkan data yang dikumpulkan oleh Kadri dkk.
(1995) sejak tahun 1991 hingga 1994 dari 14 Rumah Sakit di 11 propinsi di Indonesia cacat
celah langitlangit dan celah bibir (cleft palate and lip) ditempatkan sebagai salah satu dari 4
jenis cacat bawaan yang paling sering dijumpai dari seluruh kejadian kecacatan yang
ditemukan. Bahkan menurut Kerrigan dkk. (2000) cleft palate and lip menempati urutan
tertinggi dari seluruh jenis cacat bawa lahir yang dikenal pada penduduk dunia dengan angka
rata-rata 1 kejadian per 700 kelahiran.
Cleft palate adalah manifestasi dari gangguan yang terjadi di salah satu titik
sepanjang proses palatogenesis. Kerrigan dkk. (2000) menyatakan bahwa walaupun
gangguan perkembangan dapat menimpa palatogenesis pada sebarang tahap, tetapi tahap
paling genting adalah shelves elevation dan palatal fusion.
Penanganan cleft palate yang dilakukan saat ini umumnya adalah melalui tindakan
operasi. Tsukada dan Taniguchi (1993) menggambarkan prosedur operasi untuk koreksi cleft
palate sebagai operasi yang mungkin mahal dan lama, karena tergantung pada derajat
keparahannya, seringkali operasi harus dilakukan bertahap (multiple sureries) antara lain
untuk mengoreksi kelainan anatomi palatum dan faring, mengupayakan agar penutupan
langit-langit sempurna tidak hanya sebagai pemisah fisik antara rongga mulut dengan
nasofaring tetapi juga sebagai tempat artikulasi lidah untuk mencapai kemampuan berbicara
yang baik, mencegah gangguan pertumbuhan maksila, memperbaiki fungsi pendengaran dan
memperbaiki posisi pertumbuhan geligi. Dalam keadaan seperti itu permasalahan morfologis
dan fungsional organ pasca operasi masih
6
Salomo Hutahean: Pola Ekspresi Calcium-Binding Protein (CaBP) S-100 di Jaringan Palatum…, 2004 USU Repository©2006
sering muncul, karena perkembangan struktur-struktur tersebut pada umumnya sudah
mencapai tingkat kedewasaan organ. Oleh karena itu upaya preventif menjadi pilihan
tindakan paling rasional dalam menekan angka kejadian cacat bawa lahir. Upaya preventif
seperti itu membutuhkan informasi tentang agensia potensial penginduksi cacat don
mekanisme induksi cacat (Czeizel, 2001).
Agensia potensial penginduksi cleft palate sangat beragam jenisnya. Pada manusia
telah dipastikan obat-obatan antikonfulsi fenitoin don diazepam, kelebihan vitamin A,
konsumsi alkohol, rokok don paparan selama kehamilan terhadap pelarut-pelarut organik don
bahan-bahan kimia pertanian sebagai agensia potensial (Wyzynski dan Beaty, 1996). Selain
itu, pada mamalia coba di laboratorium glukokortikoid, dioksin, hadacidin, dan beberapa
senyawa pencemar lainnya telah terbukti sebagai agensia potensial penginduksi cleft palate
(Shah dkk., 1991; Abbott, dkk., 1994; 1998a; 1998b; Bennet dkk., 1997) .
Walaupun beragam jenisnya, terdapat juga kesamaan di antara agensia-agensia
penginduksi cleft palate. Hampir seluruh agensia penginduksi cleft palate yang dikenal
memiliki aktivitas biologis utama di otak (neurofarmakologis). Mekanisme kerja
senyawa-senyawa neurofarmakologis menimbulkan efek di luar sistem saraf, dalam hal ini di
jaringan palatum, belum sepenuhnya dapat dijelaskan. Zimmermann don Wee (1984)
menduga kemungkinan adanya sel-sel non-neuronal tetapi memiliki aktivitas seperti sel
neuron mensintesis don mensekresikan neurotransmitter di jaringan palatum. Dikatakan,
sebagaimana sel neuron maka sel-sel non-neuron di palatum juga merespon
senyawa-senyawa neurofarmakologik, dan induksi cleft palate berkaitan dengan perubahan
yang ditimbulkan oleh aksi neurotransmitter hasil sekresi sel non-neural yang terpicu di
palatum.
7
Salomo Hutahean: Pola Ekspresi Calcium-Binding Protein (CaBP) S-100 di Jaringan Palatum…, 2004 USU Repository©2006
Dugaan tersebut diperkuat oleh Hagiwara dkk. (2003) dengan menunjukkan adanya ekpresi
GABA di sel-sel non-neuron di palatum.
3. Calcium-Binding Protein S-100
Senyawa neurofarmakologik pada umumnya bekerja melalui interaksinya dengan
protein selaput sel yang bekerja sebagai gerbang kaslium. Interaksi tersebut mempengaruhi
konformasi protein gerbang sehingga influx Ca2+ ke dalam sel berubah menyebabkan
keseimbangan kadar Ca2+ intra dan ekstrasel juga berubah. Perubahan kadar Ca2+
mendorong pelepasan vesikuli berisi senyawa neurotransmitter secara eksositosis sebagai
efek utama senyawasenyawa neurofarmakologik (Thayer dkk., 2002). Pada sisi lain,
tergantung pada ada tidaknya calcium-binding protein (CaBP) spesifik di dalam sel,
perubahan dari Ca2+ dapat mengaktivasi CaBP untuk meregulasi ekspresi gen-gen yang
berada di bawah pengaruhnya (Ikura dkk., 2002). Pada sistem yang sedang dalam proses
perkembangan, seperti pada sel-sel embrio, aktivasi CaBP dapat mengubah ekspresi gen-gen
kunci dalam mitosis dan diferensiasi sehingga mempengaruhi morfogenesis secara
keseluruhan (Swanson dkk., 1997).
Protein S-100 adalah CaBP dari subfamili EF-hand yang ekspresinya terutama
adalah di otak dan di struktur-struktur lain turunan krista neuralis (Maki dkk., 2002; Ulfig,
2002, Daub, dkk., 2003). Hingga saat ini telah dikenali 20 tipe protein S-100 dengan target
kerja yang beragam, meliputi transduksi signal, diferensiasi sel, progresi sel tumor, dan
regulasi motilitas sel, tetapi secara keseluruhan bekerja dengan dasar mekanisme yang sama
meregulasi ekspresi gen spesifik setelah diaktivasi perubahan kadar Ca2+ di sitosol.
Sejumlah protein yang penting dalam morfogenesis telah diketahui sebagai target regulasi S-
8
Salomo Hutahean: Pola Ekspresi Calcium-Binding Protein (CaBP) S-100 di Jaringan Palatum…, 2004 USU Repository©2006
100 seperti vimentin, tubulin, annexin, keratin, tropomyosin, dan proteinprotein mikrotubula.
Protein-protein tersebut aktif dalam proses morfogenesis (Ikura dkk., 2002).
III. TUJUAN DAN MANFAAT
Terdapat dua tujuan yang ingin dicapai melalui penelitian ini :
1. Menentukan ekspresi calcium-binding protein S-100 di jaringan palatum embrio
mencit.
2. Memperoleh gambaran polo ekspresi calcium-binding protein S100 secara
spatiotemporal di jaringan palatum dan kaitannya dengan tahapan genting penutupan
langit-langit mulut selama palatogenesis.
Sedangkan manfaat yang diperoleh dari penelitian ini berkaitan dengan pencarian
upaya menekan angka insidensi cleft palate masih memerlukan informasi tentang seluk-beluk
proses palatogenesis dan kerentanannya terhadap berbagai agensia. Kontribusi penelitian ini
adalah dalam memberi data mikroanatomis tentang pola ekpresi calcium-binding protein
S-100 di jaringan palatum yang diperkirakan mendasari respon jaringan terhadap
agensia-agensia neurofarmakologik penginduksi cleft palate.
IV. METODE PENELITIAN
1. Sampel Embrio
Hewan percobaan yang digunakan adalah mencit (Mus musculus). Mencit bunting
diperoleh dengan cara menempatkan 3 ekor mencit betina dara estrus dalam satu kandang
dengan seekor mencit jantan fertil semalaman. Apabila pada keesokan harinya
9
Salomo Hutahean: Pola Ekspresi Calcium-Binding Protein (CaBP) S-100 di Jaringan Palatum…, 2004 USU Repository©2006
dijumpai sumbat vagina maka had itu ditetapkan sebagai hari ke-0 kebuntingan. Delapan
ekor hewan bunting yang diperoleh dengan cara tersebut dipelihara di dalam kandang
pemeliharaan dan diberikan pakan dan air minum secara ad libitum.
Berturut-turut sejak hari ke-12 hingga hari ke-15 kebuntingan, masing-masing 2
induk dikorbankan. Induk mencit dibedah dan embrio diangkat dan ditempatkan di dalam
larutan fisiologis lalu sebanyak 2 embrio dari masing-masing induk diambil secara acak
sebagai sampel. Dengan cara ini diperoleh embrio sampel sebanyak 16 dari 4 tingkat usia
perkembangan yang berbeda (kebuntingan hari ke-12, 13, 14, dan ke-15). Selanjutnya
struktur craniofactial dari masing-masing embdo sampel diisolasi don difiksasi di dalam
formalin 10%.
2. Pembuatan Irisan Berparafin
Pekerjaan dilakukan mengikuti Drury don Wallington (1976). Setelah fiksasi
palatum embrio sampel dicuci di dalam larutan alkohol 70% berkali-kali lalu didehidrasi
dengan cara merendam berturut-turut di dalam alkohol 80, 90, 95% don akhirnya di dalam
alkohol absolut. Alkohol dilepas dengan cara merendam organ di dalam toluol. Infiltrasi
parafin ke dalam organ dilakukan di dalam oven. Organ dipindah berturut-turut dari
campuran toluol dan parafin (3 : 1, lalu 1 : 1 dana akhirnya 2 kali di dalam parafin murni).
Setelah itu parafin cair dituang ke dalam kotak cetakan dari kertas dan organ ditanam dengan
posisi berdiri dengan bagian anterior berada di bagian dasar kotak. Irisan penampang palatum
(coronal section) dibuat menggunakan mikrotom dengan ketebalan 6μ dan selanjutnya
palatum direkatkan di atas kaca benda.
3. Imunohistokimia Protein S-100
Untuk memperoleh data pola ekpresi protein S-100 di jaringan palatum dilakukan
pekerjaan imunohistokimia. Pekerjaan dilakukan
10
Salomo Hutahean: Pola Ekspresi Calcium-Binding Protein (CaBP) S-100 di Jaringan Palatum…, 2004 USU Repository©2006
mengikuti petunjuk pada kit imunohistokimia dari perusahaan (SIGMA). Komponen yang
tersedia pada kit adalah: antibodi sekunder (anti rabbit IgG berkonjugat Horse Radish
Preroxidase / HRP), reagen peroksidase, buffer substrat, kromogen AEC (3-amono-9-
ethylcarbazole), don H202. Antibodi primer (rabbit anti-mouse S-100) dipesan terpisah
(SIGMA).
Dua slide (irisan jaringan) palatum dari masing-masing embrio sampel dihilangkan
parafinnya dengan cara merendam slide di larutan xilol (2 kali, masing-masing 15 menit).
Setelah itu jaringan dihidrasi dengan cara mencelup-celupkan slide ke dalam seri
larutan-larutan alkohol dengan konsentrasi menurun (100, 95, 80, 70, 50, 30%), untuk
selanjutnya direndam di dalam akuades selama 2 menit. Kemungkinan adanya gangguan
peroksidase endogenous jaringan dihilangkan dengan cara diinaktivasi menggunakan H202
3% (selama 10 menit). Selanjutnya slide dicuci dengan akuades berkali-kali dan kemudian
ditetesi blocking agent dan dibiarkan selama 20 menit. Sebagai blocking agent digunakan
Bovine Serum Albumin (BSA) 5 %. Setelah itu sisa BSA di slide dibuang dan tanpa dicuci
jaringan langsung ditetesi dengan antibodi terhadap protein S-100 (antibodi primer) don
diinkubasikan semalaman di dalam wadah yang dibuat lembab dengan uap air (humidified
chamber) yang disimpan di dalam lemari pendingin dengan suhu 8 OC. Keesokan harinya
slide dicuci beberapa kali dan selanjutnya ditetesi dengan antibodi sekunder berkonjugat
HRP, dan diinkubasikan selama 30 menit di dalam humidified chamber. Setelah itu slide
dicuci beberapa kali dengan akuades lalu ditetesi dengan substrat peroksidase dan
diinkubasikan selama 15 menit. Pada saat inkubasi ini reagen substrat dicampurkan (terdiri
dari akuades + buffer substrat + kromogen AEC + H202). Setelah inkubasi 15 menit di
substrat peroksidase berlalu, slide dicuci dan ditetesi dengan reagen
11
Salomo Hutahean: Pola Ekspresi Calcium-Binding Protein (CaBP) S-100 di Jaringan Palatum…, 2004 USU Repository©2006
substrat yang baru dicampurkan tadi dan dibiarkan selama 10 menit. Selanjutnya slide dicuci
lagi beberapa kali dengan akuades lalu diberi pewarna Hematoksilin Meyer. Caranya adalah
dengan merendam slide di dalam larutan pewarna selama 1 menit dan selanjutnya mencuci
slide tersebut di air mengalir selama 20 menit. Pencucian di air mengalir (air PAM, bukan
akuades) perlu dilakukan untuk memunculkan warna biru pada jaringan. Setelah itu slide
ditempatkan sesaat di antara 2 lembar kertas saring untuk menghilangkan kelebihan air yang
ada pada jaringan, untuk selanjutnya ditetesi dengan mounting medium dan ditutup dengan
gelas penutup. Untuk mounting medium tidak digunakan bahan berbasis minyak (balsam
kanada atau entellan), tetapi gliserol-gelatin yang berbasis air untuk menghindari pelunturan
warna kromogen AEC. Jaringan selanjutnya diamati di bawah mikroskop, penilaian tingkat
ekpresi ditentukan secara semikuantitatif melalui perbedaan intensitas warna yang timbul.
Pola ekpresi S-100 diamati secara spatiotemporal di daerah mesenkim dan di daerah epitel
wilayah oral, medial dan nasal palatum. Derajat kepositipan ditentukan sebagai: tidak
dijumpai ekspresi (-), ekspresi rendah (+), ekspresi sedang (++), dan ekspresi tinggi (+++).
Pada saat optimasi dilakukan, ekspresi S-100 yang diperoleh sangat lemah,
diperkirakan antigen terselubungi akibat penggunaan fiksatif formalin. Untuk itu teknik
Antigen Retrieval menggunakan microwave oven diterapkan (Shan-Rong Shi, dkk., 2001).
Caranya adalah dengan menempatkan slide yang sudah dideparafinasi dan dihidrasi ke dalam
larutan natrium sitrat (pH 6,0) dan dididihkan di dalam microwave oven selam 20 menit.
12
13
Salomo Hutahean: Pola Ekspresi Calcium-Binding Protein (CaBP) S-100 di Jaringan Palatum…, 2004 USU Repository©2006
Salomo Hutahean: Pola Ekspresi Calcium-Binding Protein (CaBP) S-100 di Jaringan Palatum…, 2004 USU Repository©2006
V. HASIL DAN PEMBAHASAN
Hasil imunohistokimia menunjukkan bahwa terdapat ekspresi protein S-100 di
jaringan palatum embrio mencit selama proses palatogenesis berlangsung. Data
semikuantitatif polo ekspresi yang diamati di sejumlah wilayah anatomis palatum pada 4
tingkat perkembangan yang berbeda dirangkumkan di dalam Tabel 2. Rinciannya adalah
sebagai berikut.
Pada palatum embrio tingkat perkembangan hari ke-12 kebuntingan, ekspresi protein S-100
telah dijumpai merata di seluruh bagian palatum dengan derajat kepositipan sedang (++).
Tabe12. Pola ekspresi spatiotemporal protein S-100 di jaringan palatum embrio mencit
(Mus musculus, L).
Wilayah anatomis palatum yang diamati Tingkat Perkembangan embrio (kebuntingan hari ke-)
12 13 14 15 Epitel palatum Aspek nasal ++ + - -
Aspek medial ++ + fusi fusi Aspek oral ++ + + +
Mesenkim paltum Sisi luar aspek oral ++ ++ ++ ++ Sisi luar aspek oral ++ ++ + + Poros ++ ++ +++ +++ Ujung bilah ++ ++ Fusi Fusi Pangkal aspek nasal ++ +++ +++ +++ Pangkal aspek oral ++ + + +
Keterangan: (-): tidak dijumpai ekspresi; (+); ekspresi rendah;
(++); ekspresi sedang; (+++): ekspresi tinggi .
Posisi kedua bilah palatum pada tingkat perkembangan ini telah melampaui proses tumbuh
menaik (shelves elevation) dan mulai tumbuh horizontal. Ekspresi protein S-100 berderajat
sedang yang dijumpai di palatum sejak masa awal perkembangannya bersesuaian dengan
asal-usul jaringan palatum sebagai turunan sel-sel krista neuralis
14
yang bermigrasi pada tahap dini perkembangan embrio (D'Amico Martel dkk dalam
Zimmerman dan Wee, 1984). Peran khusus protein S100 yang bersifat keruangan tidak
teramati pada tingkat perkembangan ini karena ekspresi terdistribusi secara merata di seluruh
bagian palatum.
Pada palatum embrio tingkat perkembangan hari ke-13 kebuntingan, dijumpai
perubahan pola ekspresi. Ekspresi di jaringan epitel, yang diamati di aspek oral, media, dan
nasal palatum, cenderung berkurang (+) sedangkan di jaringan mesenkim tetap
Gambar 1. Pola ekspresi protein S-100 di jaringan palatum pada fngkat perkembangan
hari-hari ke-13 kebuntingan. Lokasi ekspresi warna merah) spesifik di
bilah palatum (b p) ; (l) = lidah; (+++) - ekspresi yang tinggi di mesenkim
pangkal palatum aspek nasal.
pada tingkat sedang hingga tinggi (++ hingga +++). Ekspresi yang tinggi terutama dijumpai
di bagian pangkal bilah aspek nasal. Pada
15Salomo Hutahean: Pola Ekspresi Calcium-Binding Protein (CaBP) S-100 di Jaringan Palatum…, 2004
USU Repository©2006
Salomo Hutahean: Pola Ekspresi Calcium-Binding Protein (CaBP) S-100 di Jaringan Palatum…, 2004 USU Repository©2006
tingkat perkembangan ini bilah palatum telah menyelesaikan sebagian besar proses
pertumbuhan horizontalnya sehingga kedua ujung bilah sudah berada dalam posisi
berdekatan untuk berfusi. Dari pola ekspresi seperti ini diperkirakan bahwa, baik sel-sel yang
mengekspresikan maupun sel-sel sasaran kerja utama protein S-100 di palatum adalah
komponen jaringan mesenkim. Tumbuh horizontal bilah palatum adalah salah satu proses
genting palatogenesis yang harus berlangsung dengan laju tumbuh tertentu agar dicapai
ukuran panjang yang cukup untuk mempertemukan kedua ujung bilah pada saat masa untuk
berfusii tiba. Proses tumbuh ini membutuhkan sinkronisasi proliferasi don migrasi sel,
sintesis senyawa matriks ekstrasel, don pengaturan arah tumbuh (Ferguson, 1988). Dalam hal
ini kerja protein S-100 diperkirakan berkaitan dengan perannya sebagai faktor mitogenik don
sebagai faktor peregulasi ekspresi protein-protein kontraktil seperti tubulin, tropomyosin,
myosin, vimentin, don sitokeratin (Ikura, dkk., 2002). Khusus untuk ekspresi tinggi yang
ditemukan di pangkal bilah aspek nasal, diperkirakan berkaitan dengan kontrol arah tumbuh
bilah melalui kerja protein-protein kontraktil. Kontrol arah tumbuh bilah ini sangat perlu
mengingat kedua bilah palatum tumbuh menjulur di dalam rongga dengan ujung-ujung bebas
dan hanya ditopang oleh struktur bagian pangkalnya. Pengamatan histologis menunjukkan
sel-sel mesenkim di daerah pangkal bilah aspek nasal tersusun rapi dengan arah sejajar
dengan sumbu bilah.
Pada palatum embrio tingkat perkembangan hari ke-14 kebuntingan, perubahan polo
ekspresi terus berlanjut. Di jaringan epitel ekspresi yang rendah (+) masih terlihat di epitel
bilah aspek oral, sedangkan di aspek nasal tanda-tanda adanya ekspresi sudah tidak dijumpai
sama sekali. Sementara itu epitel medial (Mid Edge Epithelium /MEE) tidak dapat lagi
diamati karena bilah-bilah telah berfusi.
16
Sementara itu, perubahan pola ekspresi yang lebih tegas terlihat di jaringan mesenkim. Ada
kecenderungan peningkatan (+++) dan pemusatan ekspresi di mesenkim yang membangun
tubuh bilah
Gambar 2. Pola ekspresi protein S-100 di jaringan palatum pada tingkat
perkembangan hari-hari ke-14 kebuntingan. Lokasi ekspresi tinggi
memusat di mesenkim membentuk garis merah sepanjang poros
palatum ( ); (l) = lidah; nf = rongga nasofaring; of = rongga
orofaring.
palatum, sehingga terlihat sebagai garis tebal horizontal di sepanjang poros bilah yang sudah
berfusi. Sebaliknya, tingkat ekspresi di mesenkim sisi luar bilah aspek oral cenderung
menurun (+). Pola ekspresi yang dijumpai pada embrio tingkat perkembangan hari ke-14
17Salomo Hutahean: Pola Ekspresi Calcium-Binding Protein (CaBP) S-100 di Jaringan Palatum…, 2004
USU Repository©2006
Salomo Hutahean: Pola Ekspresi Calcium-Binding Protein (CaBP) S-100 di Jaringan Palatum…, 2004 USU Repository©2006
kebuntingan ini terlihat tidak berubah lagi pada embrio tingkat perkembangan hari ke-15
kebuntingan.
Pada perkembangan hari hari ke- 14 dan hari ke-15 kebuntingan fusi telah
berlangsung, kedua ujung bilah telah menyatu dan lapisan epitel medial sebagian mengalami
kematian (Kerrigan, dkk., 2000) dan sebagian lagi telah bertransdiferensiasi menjadi
mesenkim (Kaartinen, dkk., 1997) sehingga padanya tidak mungkin lagi dilakukan
pengamatan adanya ekspresi. Meskipun ujung-ujung bilah palatum telah berfusi masih tetap
diperlukan kondisi spesifik untuk mempertuhankan fusi agar tetap sinambung dan tidak
terlepas kembali akibat tenaga regangan yang timbul ketika struktur-struktur kepala tumbuh
membesar. Diperkirakan kondisi seperti ini memerlukan kerja protein-protein kontraktil,
mikrotubula, protein-protein tautan sel seperti desmin yang dibangun oleh regulasi protein
S-100 pasca fusi yang ditunjukkan oleh pola khas ekspresinya yang cenderung meningkat
dan memusat di sepanjang poros palatum.
Ekspresi protein S-100 yang dijumpai spesifik di jaringan palatum dan berfluktuasi
secara spatiotemporal mengisyaratkan bahwa, pada hewan mencit protein S-100 turut
berperan dalam proses palatogenesis yang bermuara pada keberhasilan penutupan
langit-langit mulut embrio. Dengan demikian segala macam faktor yang dapat mengubah
pola ekspresi tersebut dapat menggangu keberhasilan palatogenesis dan berpotensi
menginduksi cleft palate.
Dalam kaitan itulah penjelasan tentang faktor penentu apa yang berada di balik
kenyataan bahwa sebagian besar agensia penginduksi cleft palate tergolong senyawa aktif
neurofarmakologis dapat diberikan. Pada palatogenesis normal, terdapat pola ekspresi
protein S100 dengan derajat dan sebaran yang berfluktuasi bersesuaian dengan
perkembangan palatum. Gangguan terhadap pola ekspresi ini dapat
18
Salomo Hutahean: Pola Ekspresi Calcium-Binding Protein (CaBP) S-100 di Jaringan Palatum…, 2004 USU Repository©2006
mempengaruhi keberhasilan pertumbuhan bilah palatum dan akhimya mempengaruhi
keberhasilan penutupan langit-langit mulut. Berbagai macam senyawa aktif
neurofarmakologis yang mekanisme kerjanya berlangsung melalui osilasi kalsium,
diperkirakan dapat mengubah derajat don pola ekspresi protein CaBP S-100 di palatum,
kemungkinan melalui pengalihan sebagian daripadanya untuk fungsi eksositosis
neurotransmitter sehingga mengganggu fungsi regulasi ekspresi gen (Swanson, dkk., 1997).
Jika pengaruh senyawa-senyawa tersebut memasuki palatum pada saat-saat genting dari
perkembangannya maka induksi cleft palate dapat terjadi.
VI. KESIMPULAN
1. Protein S-100 telah diekspresikan di jaringan palatum mencit (Mus musculus, L) pada
masa awal palatogenesis dengan kecenderungan ekspresi berderajat sedang dan
terdistribusi merata di seluruh bagian palatum, ekspresi meningkat pada soot
pertumbuhan horizontal bilah terutama di jaringan mesenkim dan cenderung tetap
tinggi hingga pasca fusi dengan pola distribusi memusat di mesenkim sepanjang poros
bilah.
2. Pola spesifik ekspresi S-100 di palatum embrio mengindikasikan keterlibatannya
dalam proses penutupan langit-langit mulut.
3. Senyawa-senyawa aktif neurofarmakologis yang kerjanya melalui mobilisasi calcium
binding protein (CaBP) untuk fungsi eksositosis neurotransmitter dapat menggangu
ketersediaan protein CaBP S-100 untuk fungsi regulasi ekspresi protein. Mekanisme
tersebut menjelaskan kenyataan bahwa kebanyakan agensia penginduksi cleft palate
adalah senyawa aktif neurofarmakologis.
19
Salomo Hutahean: Pola Ekspresi Calcium-Binding Protein (CaBP) S-100 di Jaringan Palatum…, 2004 USU Repository©2006
DAFTAR PUSTAKA
Abbott, B.D., T.R. Longsdon, T.S. Wilke. 1994. Effects of Methanol on Embryonic Mouse
Palate in Serum-Free Organ Culture. Teratology 49 : 122 - 134.
Abbot, B.D., M.R. Probst, G.H. Perdew, A.R. Buckalew. 1998x. Ah Receptor, ARNT,
Glucocorticoid Receptor, EGF Receptor, EGF, TGF-a, TGF-ail, TGF-(i2, TGF-(33,
Expression in Human Embryonic Palate and Effect of 2, 3, 7, 8-
Tetrachlorodibenzo-p-dioxin (TODD). Teratology 58: 30-43.
Abbott, B.D., C.D. Adamson, R.M. Pratt. 1998b. Retinoic Acid Alters EGF Receptor
Expression During Palatogenesis. Development 102: 833 - 867.
Bennet, G.D., F. Lou, J.A. Calvin, R.H. Finnel. 1997. Phenytoin-Induced Teratogenesis: A
Molecular Basis for The Observed Developmental Delay During Neurulation.
Epilepsia 38: 415 - 423.
Bittencourt, M.A.V., A.M. Bolognese. 2000. Epithelial alterations of secondary palate
formation. Braz DentJ. 11(2): 117- 126.
Czeizel, A.E. 2001. Primary Prevention of Congenital Abnormalities. Cong Anom, 41: 124 -
125.
Daub, B.M. Schroeter, G. Pfitzer, V. Ganikevich. 2003. Expression of members of the
S-100 Ca2+- binding protein family in guinea-pig smooth muscle. Cell Calcium
33(1): 1 - 10.
Drury, R.A.B., E.A. Wallington. 1976. Charleton's Histological Technique. Oxford Univ.
Press.
Ferguson, M.W.J. 1988. Palate Development. Development 103 (Suppl): 41 - 60.
Hagiwara N, Katarova Z, Siracusa LD, Brilliant MH. 2003. Nonneuronal expression of the
GABA (A) beta 3 subunit gene is required for normal palate development in mice.
Dev Biol 2003 Feb 1; 254 (1): 93- 101.
20
Salomo Hutahean: Pola Ekspresi Calcium-Binding Protein (CaBP) S-100 di Jaringan Palatum…, 2004 USU Repository©2006
ikura, M., M. Osawa, J.B. Ames. 2002. The role of calcium binding protein in the control of
transcription: structure to function. Bioessays 24 (7) : 625 - 636.
Kaartinern, V., Xiao-Mei Cui, N. Heisterkamp, J. Goffen, dan C.F. Shuler. 1997.
Transforming Growth Factor-~3 Regulates Transdifferentiation of Medial Edge
Epihelium during Palatal Fusion and Associated Degradation of the Basement
Membrane. Developmental Dynamics 2009: 255 - 260.
Kadri, N., S. Ismael, N. raid, A. Surjono, A. Harianto, I. Mustajab. 1995. Congenital
Malformations and Deformations in Provincial Hospitals in Indonesia. Cong-Anom.
35: 411 - 423.
Kerrigan, J.J., J.P. Mansell, A. Sengupta, N, Brown, J.R. Sandy. 2000. Palatogenesis and
potential mechanism for clefting. J.R. Coll. Surg. Edinb., 45: 351 - 353.
Maki, M., Y. Kitaura, H. Satih, S. Ohkouchi, H. Shibata. 2003. Structure, function and
molecular evolution of the penta-EF-hand Ca2+ -binding protein. Biochim Biophys
Acta 4; 1600 (1-2): 51 - 60.
Marti nez-Alvarez, C., C. Tudeta, J. Perez Miguelsanz, S. O'Kane, J. Puerta, M.W. Ferguson.
2000. Medial edge epithelial cell fate during palatal fusion. Dev Biol 220 (2): 343 -
357.
Shah, R.M., R. Shuing, G. Benkhaial, A.V. Young, D. Burdett. 1991 b. Genesis of
Hadacidine-Induced Cleft Palate in Hamster: Morphogenesis, Electron Microscopy,
and Determination of DNA Synthesis, CAMP, and Enzyme Acid Phosphatase. The
American Journal of Anatomy 192: 55 - 68.
Swanson, A.G., A.P. Arkin, J. Ross. 1997. An endogenous calcium oscillator may control
early embryonic division. PNAS USA 94: 1 194 - 1 199.
Tamascovic, R. S.J. Bischel, H. Rogniayx, M.R. Stegert, B.A. Hemmings. 2003, Mechanism
of Ca2+ -mediated regulation of NDR protein kinase through autophosphorilation
and phosphorilation by an upstream kinase. J Biol Chem 278 (9): 6710- 6718.
Thayer, S.A., Y.M. Usachev, W.J. Pottorf. 2002. Modulation Ca2+ clearence from neurons.
Front Biosci 7: d1255- 1279.
21
Salomo Hutahean: Pola Ekspresi Calcium-Binding Protein (CaBP) S-100 di Jaringan Palatum…, 2004 USU Repository©2006
Tsukada, S., W. Tanaguchi. 1993. Clinical Aspects of Cleft Lip and Palate Patient Treated at
Kanazawa Medical University Hospital from 1974 to 1993. Cong Anom. 33: 345 -
355.
Ulfig, N. 2002. Calcium-binding protein in the human brain development. Adv Anat
Embryol Cell Biol 165: 111-IX, 1 - 92.
Wyzinsky, D.F., dan T.H. Beaty. 1996. Review of the Role of Potensial Teratogens in the
Origin of Human Non-Syndromic Oral Clefts. Teratology 53: 309 - 317.
Zimmerman, E.F., E.L. Wee. 1984. Role of neurotransmitter in palate development. In:
Current topics in developmental biology, vol 19, ed. By: Zimmerman, E.F.
ACAdemic press, Orlando Florida. Pp. 37 - 63.
22
Top Related