i
IDENTIFIKASI GEN CYP2A6 ALEL *9 PADA SUKU TIONGHOA
NONPEROKOK DI INDONESIA DENGAN MENGGUNAKAN METODE
POLYMERASE CHAIN REACTION
SKRIPSI
Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat
Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.)
Program Studi Farmasi
Oleh:
Evelyn Angela Sibarani
168114042
FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS SANATA DHARMA
YOGYAKARTA
2019
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
i
IDENTIFIKASI GEN CYP2A6 ALEL *9 PADA SUKU TIONGHOA
NONPEROKOK DI INDONESIA DENGAN MENGGUNAKAN METODE
POLYMERASE CHAIN REACTION
SKRIPSI
Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat
Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.)
Program Studi Farmasi
Oleh:
Evelyn Angela Sibarani
168114042
FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS SANATA DHARMA
YOGYAKARTA
2019
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
iv
HALAMAN PERSEMBAHAN
Saya persembahkan karya ini untuk:
Tuhan Yesus
Keluarga tercinta
Almamater Universitas Sanata Dharma
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
vii
PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan kehadirat Tuhan Yang Maha Esa karena
atas berkat dan karunia-Nya, skripsi yang berjudul “Identifikasi Gen CYP2A6 Alel
*9 pada Suku Tionghoa Nonperokok di Indonesia dengan Menggunakan Metode
Polymerase Chain Reaction” dapat selesai tanpa adanya halangan yang berarti.
Berkat dukungan dan doa dari berbagai pihak, sehingga karya tulis ini dapat
terselesaikan sebagai salah satu syarat untuk memperoleh Gelar Sarjana Farmasi
(S.Farm) di Universitas Sanata Dharma Yogyakarta.
Keberhasilan dalam penulisan naskah skripsi ini tidak terlepas dari dukungan
berbagai pihak. Maka dengan segala kerendahan hati, penulis mengucapkan terima
kasih sebesar-besarnya kepada:
1. Ibu Dr. Christine Patramurti, Apt., selaku dosen pembimbing atas segala
ilmu, bimbingan, saran, dan nasihat berharga yang telah diberikan kepada
penulis.
2. Ibu Dr. Yustina Sri Hartini, Apt., selaku Dekan Fakultas Farmasi Universitas
Sanata Dharma.
3. Ibu Dr. Dewi Setyaningsih, Apt. selaku Dosen Pembimbing Akademik yang
senantiasa memberikan dukungan dan masukan yang membangun kepada
penulis.
4. Ibu Damiana Sapta Candrasari, M.Sc., selaku dosen penguji atas segala ilmu,
bantuan, kritik, dan saran yang membangun kepada penulis.
5. Bapak Maywan Hariono, Ph.D., Apt., selaku dosen penguji atas segala ilmu,
bantuan, kritik, dan saran yang membangun kepada penulis.
6. Seluruh Dosen Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma yang telah
memberikan tidak hanya ilmu pengetahuan melainkan juga nilai-nilai moral
yang berharga selama proses perkuliahan.
7. Bapak Kayat dan seluruh Laboran Fakultas Farmasi Universitas Sanata
Dharma yang dengan ketulusan hati selalu membantu dan berkontribusi
dalam hal sarana dan prasarana.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
ix
DAFTAR ISI
HALAMAN JUDUL ................................................................................................ i
HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING ..................................................... ii
HALAMAN PENGESAHAN SKRIPSI ................................................................ iii
HALAMAN PERSEMBAHAN ............................................................................ iv
LEMBAR PERNYATAAN KEASLIAN KARYA ................................................. v
LEMBAR PERNYATAAN PUBLIKASI ............................................................. vi
PRAKATA ............................................................................................................ vii
DAFTAR ISI .......................................................................................................... ix
DAFTAR TABEL .................................................................................................... x
DAFTAR GAMBAR ............................................................................................. xi
DAFTAR LAMPIRAN ......................................................................................... xii
INTISARI ............................................................................................................. xiii
ABSTRACT ......................................................................................................... xiv
PENDAHULUAN ................................................................................................... 1
METODE PENELITIAN ......................................................................................... 3
HASIL DAN PEMBAHASAN ................................................................................ 7
KESIMPULAN ...................................................................................................... 18
SARAN .................................................................................................................. 18
DAFTAR PUSTAKA ............................................................................................ 19
LAMPIRAN ........................................................................................................... 22
BIOGRAFI PENULIS ........................................................................................... 37
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
x
DAFTAR TABEL
Tabel I. Hasil elektroforesis produk PCR .............................................................. 17
Tabel II. Frekuensi alel CYP2A6*9 pada subjek uji suku Tionghoa nonperokok di
Indonesia ................................................................................................................ 33
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
xi
DAFTAR GAMBAR
Gambar 1. Hasil Analisis Kualitatif Isolat DNA dengan Menggunakan Teknik
Elektroforesis ......................................................................................................... 12
Gambar 2. Situs penempelan primer pada urutan basa nukleotida CYP2A6*1 .... 14
Gambar 3. Urutan basa nukleotida produk PCR gen CYP2A6*1 dan CYP2A6*9
(mutasi Single Nucleotide Polymorphism atau SNP ditunjukan dengan warna
kuning) ................................................................................................................... 14
Gambar 4. Elektrogram produk PCR yang terbentuk pada kondisi optimum dari
berbagai isolat DNA berbeda ................................................................................. 16
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
xii
DAFTAR LAMPIRAN
Lampiran 1. Ethical Clearance Penelitian ............................................................. 23
Lampiran 2. Go Taq Green Master Mix Certificate of Analysis ............................ 24
Lampiran 3. Usage Information of Go Taq Green Master Mix ............................. 25
Lampiran 4. Product Datasheet of DNA Ladders and Markers ............................ 26
Lampiran 5. Product Data Sheet of Primer Forward and Primer Reverse
CYP2A6*9 .............................................................................................................. 27
Lampiran 6. Usage Information of FavorPrep™ .................................................. 28
Lampiran 7. Hasil Kuisioner Subjek Uji ................................................................ 29
Lampiran 8. Pernyataan Persetujuan (Informed Consent) ..................................... 30
Lampiran 9. Lembar Informasi untuk Responden ................................................. 31
Lampiran 10. Permintaan Penggunaan Alat PCR Thermocycler LPPT UGM ...... 32
Lampiran 11. Perhitungan Jumlah Sampel ............................................................ 33
Lampiran 12. Data Subjek Uji ............................................................................... 34
Lampiran 13. Elektrogram Analisis Kualitatif Isolat DNA ................................... 35
Lampiran 14. Elektrogram Analisis Produk PCR .................................................. 35
Lampiran 15. Frekuensi Alel.................................................................................. 36
Lampiran 16. Biografi Penulis ............................................................................... 37
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
xiii
INTISARI
Jumlah perokok aktif di Indonesia terus meningkat setiap tahun. Hal tersebut
menyebabkan bertambahnya perokok pasif atau orang yang menghirup asap rokok
dari orang lain. Asap rokok mengandung banyak senyawa prokarsinogenik yang
dapat menginduksi kanker, salah satunya adalah tobacco-specific nitrosamines
(TSNA). TSNA dapat diubah menjadi senyawa aktifnya oleh enzim pemetabolisme
CYP2A6. CYP2A6 dapat mengalami polimorfisme dan salah satu bentuknya
adalah CYP2A6*9. Alel CYP2A6*9 mengalami polimorfisme satu nukleotida pada
TATA BOX (T-48G) di daerah promotor. Adanya alel CYP2A6*9 diketahui dapat
menyebabkan penurunan aktivitas metabolik TSNA sehingga dapat menurunkan
risiko kanker paru akibat paparan asap rokok. Tujuan dari penelitian ini adalah
untuk mengidentifikasi dan mengetahui frekuensi alel CYP2A6*9 pada subjek uji
nonperokok suku Tionghoa di Indonesia dengan menggunakan metode Polymerase
Chain Reaction (PCR). Penelitian ini dilakukan secara deskriptif observasional.
Sebanyak 30 subjek uji yang memenuhi kriteria inklusi dan eksklusi diambil sampel
darahnya kemudian diisolasi untuk mendapatkan isolat DNA. Hasil isolat DNA
kemudian dianalisis secara kualitatif dengan amplifikasi menggunakan metode
Polymerase Chain Reaction (PCR). Hasil dari penelitian ini menunjukkan bahwa
sebanyak 4 subjek atau 13,33% dari total subjek uji memiliki alel CYP2A6*9
sehingga dapat mengalami penurunan risiko kanker paru yang disebabkan oleh asap
rokok.
Kata kunci: CYP2A6*9, Polimorfisme, Tobacco-Specific Nitrosamines
(TSNA), Suku Tionghoa di Indonesia, Polymerase Chain Reaction (PCR)
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
xiv
ABSTRACT
The number of active smokers in Indonesia has been increasing up to now. It
leads to the increase of passive smoker or person who inhales cigarette smoke from
the active one. Cigarette smoke contains many procarcinogenic compounds which
can induce cancer. One of them is tobacco-specific nitrosamine (TSNA). TSNA can
be converted into its active compound by CYP2A6 metabolizing enzyme. CYP2A6
has a polymorphism with one of its forms is CYP2A6*9. CYP2A6*9 allele
undergoes one nucleotide polymorphism on the TATA BOX (T-48G) in the
promotor area. The presence of allele CYP2A6*9 is known to slowdown the
metabolic activity of TSNA associated with reducing the risk of lung cancer due to
the cigarette smoke exposure. The purpose of this study was to identify CYP2A6*9
alleles in Chinese non-smoker in Indonesia using the Polymerase Chain Reaction
(PCR) method and calculate its frequency. This research was descriptive
observational study. A total of 30 blood samples were collected from subjects who
met the inclusion and exclusion criteria and then isolated its DNA. Isolated DNA
products were analyzed qualitatively by amplification using Polymerase Chain
Reaction (PCR) method. The results of this study indicate that 4 subjects or 13,33%
of the total subjects have allele CYP2A6*9 which could reduce the risk of lung
cancer caused by cigarette smoke.
Keywords: CYP2A6*9, Polymorphism, Tobacco-Specific Nitrosamines (TSNA),
Chinese in Indonesia, Polymerase Chain Reaction (PCR)
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
1
PENDAHULUAN
Merokok merupakan salah satu faktor risiko utama terjadinya berbagai
penyakit dan merupakan penyebab kematian utama di dunia (Depkes RI, 2013).
Berdasarkan data WHO (2018), lebih dari 1 miliar orang di dunia mengkonsumsi
rokok dan lebih dari 7 juta orang tiap tahun meninggal akibat rokok. Data tersebut
melaporkan bahwa lebih dari 6 juta orang meninggal sebagai perokok aktif dan
890.000 orang sebagai perokok pasif (WHO, 2018). Indonesia merupakan salah
satu negara dengan prevalensi perokok terbesar di dunia. Jumlah perokok di
Indonesia pada tahun 2013 adalah 24,3% untuk perokok berat dan 5% untuk
perokok ringan (Depkes RI, 2013). Banyaknya jumlah perokok di Indonesia
berhubungan dengan peningkatan risiko beberapa jenis penyakit dan juga masalah
kesehatan.
Rokok mengandung berbagai senyawa toksik yang berbahaya bagi kesehatan
yang tidak hanya berdampak buruk baik bagi perokok aktif tetapi juga perokok
pasif. Perokok pasif adalah orang yang menghirup asap rokok dari perokok aktif.
Semakin sering terpapar asap rokok maka akan semakin tinggi juga risiko gangguan
kesehatan yang mungkin dialami oleh perokok pasif. Dengan demikian, semakin
banyak pengguna rokok di suatu negara maka semakin tinggi pula jumlah perokok
pasif di negara tersebut (Indrajati et al., 2017). Asap rokok mengandung 4000 bahan
kimia beracun dan tidak kurang dari 69 diantaranya bersifat karsinogenik atau dapat
menyebabkan kanker (Nurjanah et al., 2014).
Asap rokok mengandung banyak senyawa yang dapat menginduksi kanker,
seperti polisiklik aromatik hidrokarbon (PAH) dan tobacco-spesific nitrosamines
(TSNA) (Zhang et al., 2003). Beberapa TSNA yang berasal dari nikotin bersifat
prokarsinogenik (Hecth, 1999). TSNA terbagi menjadi beberapa jenis yaitu:
nitrosoanabasin (NAB), nitrosoanatabin (NAT), 4-(metilnitrosamin)-1-(3-piridil)-
1-butanon (NNK), N-nitrosonornikotin (NNN), 4-(metilnitrosamin)-1-(3-piridil)-
1-butanol (NNAL), 4-(metilnitrosamin)-4-(3-piridil)-1-butanol (iso-NNAL), dan 4-
(metilnitrosamin)-4-(3-piridil)-asam butirat (iso-NNAC) (Moldoveanu et al.,
2017). Dari beberapa jenis TSNA tersebut, 4-(metilnitrosamin)-1-(3-piridil)-1-
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
2
butanon (NNK) dan N-nitrosonornikotin (NNN) dipercaya berhubungan dengan
kanker yang disebabkan oleh penggunaan produk tembakau (Hecth, 1999).
Berdasarkan penelitian yang dilakukan (Cao et al., 2015), ditemukan bahwa
paparan asap rokok secara signifikan dapat meningkatkan risiko kanker paru.
Kanker paru adalah kanker yang paling umum terjadi di seluruh dunia (1,8 juta
kasus dan 1,6 juta kematian) dan umum dialami baik oleh perokok aktif maupun
pasif (Zhang et al., 2003; Hassan et al., 2018). Peningkatan risiko kanker paru
berhubungan dengan aktivitas enzim CYP2A6 (Hassan et al., 2018). Enzim
CYP2A6 adalah enzim yang dapat mengaktifkan TSNA prokarsinogenik yaitu
NNN dan NNK melalui α-hidroksilasi (Tanner dan Tyndale, 2017).
CYP2A6 memiliki beberapa bentuk polimorfi yang dapat mengakibatkan
terjadinya variasi ekspresi, stabilitas, dan fungsi dari enzim CYP2A6. Penyebab
terjadinya polimorfisme ini bervariasi, seperti Single Nucleotide Polymorphism
(SNP), delesi, duplikasi, konversi dan frameshift (Pharmvar, 2018). Perbedaan
aktivitas enzim CYP2A6 dapat dibagi menjadi tiga kelompok, yaitu: normal
metabolizers, slow metabolizers yang aktivitas metabolismenya 50% lebih lambat
dari normal metabolizers) dan poor metabolizers yang aktivitas metabolismenya
25% lebih lambat dari normal metabolizers) (Ingelman, 2001; Patramurti dan
Fenty, 2017).
CYP2A6*9 merupakan salah satu varian alel akibat polimorfisme gen yang
terjadi pada CYP2A6 dan masuk dalam kelompok slow metabolizers. Individu yang
memiliki alel CYP2A6*9 akan mengalami penurunan aktivitas enzim CYP2A6 dan
berdasarkan penelitian yang dilakukan oleh Fujieda et al. (2004), terjadi penurunan
risiko kanker paru pada individu yang memiliki alel CYP2A6*9 (Rossini et al.,
2008). Hal ini dikarenakan berkurangnya aktivasi senyawa prokarsinogenik seperti
nitrosamin yang terdapat dalam asap rokok (Hassan et al., 2018). Karena perannya
dalam memetabolisme senyawa prokarsinogenik tertentu, identifikasi alel ini dapat
bermanfaat bagi peningkatan kesehatan masyarakat dengan mengurangi efek
berbahaya terkait dengan rokok berdasarkan genotip tiap individu (Liu et al., 2011;
Dempsey et al., 2004).
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
3
Frekuensi CYP2A6*9 pada tiap populasi bervariasi. Populasi Asia
menunjukkan frekuensi tertinggi terhadap CYP2A6*9 yaitu mencapai 21% ( Luis
et al., 2017; Hassan et al., 2018). Berdasarkan penelitian yang dilakukan
sebelumnya terhadap populasi Asia Timur, ditemukan bahwa 15,7% populasi Cina
memiliki alel tersebut (Pitarque et al., 2001; Rossini et al., 2008). Suku Tionghoa
merupakan suku yang berasal dari Cina namun tinggal dan menetap di Indonesia
(BPS, 2011). Oleh karena itu, diperkirakan bahwa suku Tionghoa di Indonesia juga
memiliki alel CYP2A6*9 dengan frekuensi yang tinggi. Indonesia merupakan
Negara Asia dengan populasi suku Tionghoa mencapai 2,83 juta jiwa dari total
penduduk Indonesia yang berjumlah 236,73 juta jiwa menurut hasil sensus
penduduk tahun 2010 (Anonim, 2018).
Penelitian ini bertujuan untuk mengidentifikasi dan mengetahui frekuensi alel
CYP2A6*9 pada subjek uji nonperokok suku Tionghoa di Indonesia sehingga dapat
diketahui risiko kanker paru yang disebabkan oleh asap rokok pada populasi yang
diteliti tersebut. Metode yang digunakan dalam penelitian ini adalah Polymerase
Chain Reaction (PCR). PCR adalah suatu metode enzimatis untuk amplifikasi DNA
dengan cara in vitro (Fatchiyah et al., 2012). Produk hasil PCR yang didapatkan
kemudian akan dianalisis dengan metode elektroforesis.
METODE PENELITIAN
Jenis Rancangan Penelitian
Penelitian ini merupakan penelitian deskriptif observasional. Pada penelitian
ini dilakukan penggambaran hasil polimorfisme gen CYP2A6 pada isolat DNA dari
populasi suku Tionghoa nonperokok di Indonesia tanpa adanya pemberian
perlakuan.
Bahan Penelitian
Primer forward: (5’-GATTCCTCTCCCCTGGAAC-3’) dan primer reverse:
(5’-GGCTGGGGTGGTTTGCCTTTA-3’) (Macrogen) (Yoshida, et al., 2003),
sampel darah 30 subjek uji nonperokok suku Tionghoa di Indonesia, promega Go
Taq Green Master Mix (taq DNA polymerase, dNTP, MgC12 dan buffer), kit DNA
isolasi (FavorPrep Genomic DNA Mini Kit (Blood/Cultured Cell)) yang terdiri dari
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
4
proteinase-K; FABG buffer; etanol; W1 buffer; wash buffer; dan elution buffer, 10X
Tris-Borate-EDTA (TBE) Buffer pH 8,3 Ultra Pure Grade (Vivantis), gel agarosa
(Vivantis), FluoroVue™ Nucleic Acid Gel Stain (Smobio), 1 Kb (0,25-10 kb) DNA
Ladder (Smobio), loading dye (bromophenol blue 25 mg; gliserol 3,3 mL; aqua pro
injection 6,7 mL), etanol absolut (Sigma Chemical Co., St. Louis), aqua pro
injection (Ikapharmindo).
Alat Penelitian
Thermal cycler (Perkin Elmer 2400), satu set elektroforesis horizontal (Sigma
Aldrich), UV Transilluminator (Fisher Scientific), microtubes 1,5 mL (Biologix),
disposable gloves, blue tip, yellow tip, white tip, mikropipet (Soccorex Swiss), hot
plate (Cimarec™ Thermo Scientific), neraca analitik digital dengan ketelitian
0,0001 g (Mattler Toledo), microsentrifuge (Fisher Scientific), spuit injeksi 3 mL
(Terumo), vacutainer K2 dengan kandungan EDTA 5,4 mg, PCR® Tubes
(Axygen), vortex (Fisher Scientific), peralatan gelas, kamera DSLR Canon.
Penentuan Kriteria Subjek Uji dalam Penelitian
Pada penelitian ini, kriteria subjek uji adalah suku Tionghoa asli minimal
sampai third degree relatives (kakek dan nenek orang Tionghoa asli) berjenis
kelamin laki-laki dan perempuan yang tidak merokok. Subjek uji yang dipilih tidak
menderita penyakit-penyakit yang dapat disebabkan oleh virus atau bakteri.
Pemilihan subjek uji dilakukan melalui wawancara secara langsung disertai
pengisian kuisioner oleh subjek uji yang sesuai dengan kriteria pada penelitian ini.
Subjek uji secara sadar dan tanpa paksaan menandatangani informed consent.
Penelitian ini dilakukan di Laboratorium Biokimia Fakultas Farmasi Sanata
Dharma Yogyakarta dengan memenuhi kode etik yang telah disetujui oleh Komisi
Etik Fakultas Kedokteran Universitas Kristen Duta Wacana.
Pengambilan Sampel Darah pada Subjek Uji
Pengambilan sampel darah pada 30 subjek uji dilakukan oleh perawat
professional. Sampel darah diambil dari pembuluh vena tiap subjek uji kemudian
ditampung dalam vacutainer K2 dengan kandungan EDTA 5,4 mg. Darah segar
yang diperoleh kemudian disimpan pada suhu ± 4oC sebelum dianalisis untuk
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
5
mencegah kerusakan sampel. Darah tersebut kemudian digunakan untuk
mengidentifikasi alel CYP2A6*9 pada subjek uji.
Isolasi DNA
Sampel darah berupa whole blood berjumlah 30 sampel yang diambil dari 30
subjek uji berbeda. Sebanyak 200 µL sampel darah disiapkan pada tabung
microcentrifuge tube 1,5 mL. Ditambahkan 20 µl Proteinase K dan 200 µl FABG
buffer ke dalam sampel kemudian dilakukan pencampuran dengan cara divorteks
sebentar. Setelah itu tube diinkubasi pada suhu 60°C selama 15 menit untuk
melisiskan sampel sambil dihomogenkan setiap 3 menit selama 30 detik. Kemudian
tahap selanjutnya adalah melakukan sentrifugasi pada kecepatan 10.000 rpm
selama 3 menit. Setelah itu dilakukan penambahan 200 µL etanol absolut dan
divorteks selama 30 detik. Setelah etanol absolut ditambahkan maka tahap
selanjtnya adalah melakukan sentrifugasi dengan kecepatan 10.000 rpm selama 30
detik. Dipasangkan kolom FABG pada collection tube dan pindahkan sampel dari
microcentrifuge tube 1,5 mL ke dalamnya kemudian lakukan sentrifugasi dengan
kecepatan 13.000 rpm selama 1 menit. Cairan yang terdapat dalam collection tube
kemudian dibuang. Kolom FABG kemudian dipasangkan pada collection tube baru
dan dilakukan pencucian kolom FABG dengan menambahkan 500 µL W1 Buffer
kemudian dilakukan sentrifugasi dengan kecepatan 13.000 rpm selama 1,5 menit.
Sisa cairan dalam kolom FABG kemudian dibuang. Kolom FABG kemudian dicuci
dengan menggunakan 750 µL wash buffer lalu disentrifugasi pada kecepatan
13.000 rpm selama 1,5 menit. Sisa cairan kemudian dibuang dan dilakukan
sentrifugasi 13.000 rpm selama 4 menit untuk mengeringkan kolom. Kolom FABG
kemudian dipasangkan pada elution tube dan ditambahkan 200 µL elution buffer ke
dalamnya. Diamkan selama 3 menit pada suhu ruang kemudian lakukan sentrifugasi
dengan kecepatan 13.000 rpm selama 3 menit untuk mengelusi DNA. Isolat DNA
kemudian disimpan pada suhu -20°C.
Analisis kemurnian isolat DNA
Elektroforesis menggunakan gel agarosa 1,0% dilakukan dengan melarutkan
250 mg agarosa dalam larutan 1x TBE sebanyak 25 mL lalu dipanaskan dengan hot
plate sampai mendidih sambil diaduk dengan magnetic stirrer hingga larut.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
6
Selanjutnya ditambahkan 2,5 µL nucleic acid gel stain dan diaduk hingga homogen.
Sebanyak 25 mL larutan kemudian dituangkan ke dalam cetakan gel yang telah
diberi sisiran pada tepi gel dan biarkan mengeras. Sisiran lalu dicabut setelah gel
mengeras sehingga akan terbentuk sumur-sumur. Gel kemudian ditempatkan ke
dalam gel tray elektroforesis yang telah berisi larutan buffer 1x TBE. Sebanyak 4,0
µL isolat DNA ditambahkan dengan 1,0 µL aquabidest kemudian dicampur dengan
loading dye sebanyak 1,0 µL. Campuran tersebut kemudian diambil sebanyak 6,0
µL dan dimasukkan ke dalam sumur-sumur pada gel dengan menggunakan
mikropipet. Salah satu sumur gel diisi dengan 100 bp DNA ladder sebanyak 3,0 µL
sebagai marker. Elektroforesis kemudian dilakukan dengan tegangan 100 Volt
selama 30 menit. Hasil elektroforesis kemudian dideteksi dibawah UV
transilluminator dan didokumentasikan dengan menggunakan kamera DSLR
Canon. Panjang pita DNA dapat diketahui dengan cara menarik garis lurus pada
masing-masing pita sampel DNA dengan posisi pita DNA ladder.
Amplifikasi Isolat DNA dengan Metode PCR
Dilakukan amplifikasi dengan menggunakan primer yang diadopsi dari
Yoshida et al. (2003) untuk mendapatkan fragmen DNA dari alel CYP2A6*9.
Primer yang digunakan berupa primer forward: 5’-GATTCCTCTCCCCTGGAAC-
3’ dan primer reverse: 5’-GGCTGGGGTGGTTTGCCTTTA-3’ dengan
konsentrasi masing-masing sebesar 100 pmol/µL. Amplifikasi DNA dengan
metode PCR dilakukan dengan menggunakan Promega Go Taq Green Master Mix.
Volume akhir campuran adalah 25 µL yang terdiri dari Promega Go Taq Green
Master Mix 12,5 µL, primer forward 1,25 µL, primer reverse 1,25 µL, isolat DNA
5,0 µL, dan nuclease-free water 5 µL. Penentuan rentang suhu annealing dan
jumlah siklus amplifikasi berdasarkan pada hasil optimasi yang dilakukan oleh
Cindy (2017). Amplifikasi dilakukan dengan menggunakan mesin PCR (Thermal
cycler Perkin Elmer 2400). Kondisi PCR yang digunakan adalah sebagai berikut:
initial denaturasi pada suhu 94oC (3’); dilanjutkan dengan denaturasi pada suhu
94oC (30”); annealing pada suhu 60oC (30”); dan ekstensi pada suhu 70oC (25”).
Siklus amplifikasi tersebut dilakukan sebanyak 35 kali dan kemudian diakhiri
dengan final extension pada suhu 72oC (5’).
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
7
Analisis Produk PCR dengan Elektroforesis
Elektroforesis dilakukan untuk melihat hasil produk PCR dengan
menggunakan fase diam agarosa 1,5% yang telah ditambahkan dengan nucleic acid
gel stain 2,5 µL. Gel dicetak di dalam cetakan kemudian diberi sumuran dan
ditunggu hingga mengeras. Sumuran kemudian dilepaskan dan gel agarosa 1,5%
yang sudah mengeras diletakkan ke dalam gel tray elektroforesis. TBE 1x
dituangkan ke dalam gel tray elektroforesis hingga permukaan gel agarosa 1,5%
terendam. Setelah itu diambil sebanyak 5,0 µL produk PCR dan 1,0 µL loading dye
kemudian dihomogenkan dan diambil dengan menggunakan mikropipet sehingga
didapatkan volume akhir 6,0 µL. Campuran kemudian dimasukkan ke dalam
sumuran gel agarosa 1,5%. Pada salah satu sumuran diisi DNA ladder sebanyak 3,0
µL. Kemudian dilakukan elektroforesis dengan kondisi tegangan 100 Volt/cm dan
running dijalankan selama 30 menit. Hasil elektroforesis produk PCR kemudian
dilihat dengan menggunakan UV Transilluminator.
Analisis Hasil
Produk PCR yang terbentuk pada penelitian ini berada pada panjang pita 368
bp (Yoshida et al., 2003) dan didokumentasikan dengan menggunakan kamera
DSLR Canon. Terbentuknya hasil produk PCR berupa pita dengan panjang 368 bp
menunjukkan bahwa isolat DNA yang dianalisis memiliki alel CYP2A6*1.
Sedangkan apabila pada panjang 368 bp tidak ditemukan produk PCR, maka dapat
dinyatakan bahwa isolat DNA yang dianalisis memiliki alel CYP2A6*9. Frekuensi
dari subjek uji yang memiliki alel CYP2A6*9 dapat diperoleh melalui perhitungan
dengan menggunakan rumus:
Frekuensi CYP2A6 *1 =jumlah subjek uji dengan alel CYP2A6∗1
jumlah seluruh subjek uji x 100%
Frekuensi CYP2A6 *9 =jumlah subjek uji dengan alel CYP2A6∗9
jumlah seluruh subjek uji x 100%
HASIL DAN PEMBAHASAN
Tobacco-specific nitrosamines (TSNA) merupakan senyawa pemicu kanker
yang dapat didetoksifikasi oleh enzim pemetabolisme. TSNA dapat dikonversi
menjadi produk yang lebih larut dalam air untuk dikeluarkan dari tubuh manusia.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
8
Namun selama proses ini, senyawa reaktif nitrosamin dapat terbentuk menjadi zat
antara yang secara kovalen berikatan dengan sisi nukleofilik dalam DNA. Beberapa
TSNA seperti NNN dan NNK yang terdapat dalam asap rokok diaktivasi melalui
proses metabolik oleh enzim CYP2A6 yang kadarnya bervariasi di antara berbagai
jaringan dan jenis sel pada manusia (Zhang et al., 2003). NNK dan NNN yang
diaktifkan secara metabolik dapat menginduksi mutasi yang bersifat merusak pada
onkogen dan gen penekan tumor (Xue et al., 2014). Aktivasi metabolik NNK dan
NNN akan berakibat pada modifikasi DNA yang selanjutnya akan memicu kanker.
Tahap metabolisme penting yang terlibat dalam modifikasi DNA oleh senyawa-
senyawa prokarsinogen tersebut adalah α-Hidroksilasi (Hecht dan Hoffmann,
1988).
Gambar (1) Metabolit utama NNN hasil reaksi metabolisme CYP2A6 (Rossini, et al., 2008)
Gambar (2) Metabolit utama NNK hasil reaksi metabolisme CYP2A6 (Rossini, et al., 2008)
α-hidroxymethyl-NNK
α-methylenehidroxy-NNK
2’-hydroxy-NNN
5’-hydroxy-NNN
NNK
NNN
CYP2A6
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
9
Enzim CYP2A6 diketahui memiliki bentuk polimorfi yang tinggi dan
memiliki efek berupa penurunan, penghilangan atau justru peningkatan aktivitas
enzim. Saat ini terdapat 80 jenis alel CYP2A6 yang sudah berhasil diidentifikasi
dan salah satu diantaranya adalah alel CYP2A6*9 yang memiliki frekuensi tinggi
di populasi Asia khususnya Cina (Zhang et al., 2003). Pada penelitian ini dilakukan
analisis polimorfisme gen CYP2A6 yaitu dengan mengidentifikasi adanya alel
CYP2A6*9 pada subjek yang diuji. Dasar pemilihan alel CYP2A6*9 adalah karena
efeknya yang dapat menurunkan aktivitas metabolik dari enzim CYP2A6 sehingga
akan mempengaruhi risiko kanker paru yang disebabkan oleh asap rokok.
Karena perannya dalam memetabolisme senyawa karsinogenik tertentu,
identifikasi alel ini dapat bermanfaat bagi peningkatan kesehatan masyarakat
dengan memberikan informasi terkait efek berbahaya dari merokok yang
dipersonalisasi sesuai dengan genotip individu mereka (Liu et al., 2011; Dempsey
et al., 2004). Penelitian ini diharapkan dapat memberikan informasi terkait strategi
pencegahan penyakit kanker paru dan penyakit lain yang ditimbulkan oleh
nitrosamin dalam asap rokok yang jalur metabolismenya diperantarai oleh enzim
CYP2A6.
Penentuan Subjek Uji
Pada penelitian ini digunakan subjek uji suku Tionghoa asli minimal sampai
third degree relatives (kakek dan nenek merupakan suku Tionghoa asli) berjenis
kelamin laki-laki dan perempuan yang tidak merokok dan berdomisili di
Yogyakarta. Subjek uji yang digunakan adalah manusia dewasa yang bersedia,
mengerti manfaat penelitian, serta secara sadar menandatangani informed consent.
Subjek uji yang digunakan dalam penelitian ini berjumlah 30 orang dan menurut B-
Rao (2001), jumlah tersebut telah mencapai ukuran sampel minimum untuk
penelitian terkait studi polimorfisme genetik dengan dua alel yang terdeteksi.
Sehingga dengan jumlah 30 subjek uji yang digunakan dalam penelitian ini akan
mampu mendeteksi dua alel yaitu CYP2A6*1 dan CYP2A6*9 dengan probabilitas
yang tinggi. Subjek uji yang dipilih tidak menderita penyakit-penyakit yang
disebabkan oleh virus atau bakteri. Hal tersebut dilakukan agar saat uji dilakukan
bukan DNA virus atau bakteri yang terdapat dalam tubuh subjek uji yang terbaca.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
10
Isolasi DNA
Gen tersusun oleh suatu substansi yang disebut dengan deoxyribonucleic acid
atau yang biasa disingkat DNA. DNA merupakan material genetik yang diturunkan
dari generasi ke generasi berikutnya (Siswanto et al., 2016). Isolasi DNA dari
materi biologi merupakan tahapan utama dalam analisis molekular genomik. Proses
isolasi DNA memegang peran penting dalam amplifikasi dengan metode PCR.
Efisiensi PCR bergantung dari kemurnian dan konsentrasi dari hasil DNA yang
telah diisolasi (Florczak et al., 2017).
Isolasi DNA dilakukan dengan menggunakan sampel darah, karena darah
merupakan sumber DNA genomik manusia yang ideal (Gong dan Li, 2014). Sampel
darah yang diambil berupa whole blood yang mengandung baik sel-sel berinti (sel
darah putih) maupun sel-sel tidak berinti (sel darah merah) (Siswanto et al., 2016).
Tujuan dilakukannya isolasi DNA adalah untuk memurnikan dan memisahkan
DNA dari komponen lain dalam darah seperti sel darah merah, lemak, protein, dan
karbohidrat (Fatchiyah et al., 2012).
Prinsip utama dalam isolasi DNA ada tiga yakni penghancuran (lisis),
ekstraksi atau pemisahan DNA dari bahan padat seperti protein, serta pemurnian
DNA (Fatchiyah et al., 2012). Isolasi DNA dilakukan dengan menggunakan kit
DNA isolasi FavorPrep Genomic DNA Mini Kit (Blood/Cultured Cell). Untuk
memperoleh isolat DNA dari sampel darah, ada beberapa hal yang perlu dilakukan.
Tahapan pertama yaitu melisiskan atau menghancurkan sel darah merah yang tidak
mengandung DNA agar dapat dipisahkan dari sel darah putih. Penghancuran sel
darah merah tersebut dilakukan dengan menambahkan RBC lysis. Kemudian
dilakukan penambahan FABG buffer dan dilanjutkan dengan penambahan
Proteinase K untuk mendapatkan DNA yang murni dari kontaminan protein
(Fatchiyah et al., 2012).
Setelah pemurnian isolat DNA dari kontaminasi protein, maka dapat
dilanjutkan dengan penambahan etanol absolut yang bertujuan untuk memicu
dehidrasi DNA sehingga terjadi presipitasi karena sifatnya yang higroskopis. Isolat
DNA yang telah mengalami presipitasi kemudian ditambahkan dengan wash buffer
dan W1 buffer untuk menghilangkan sisa etanol yang terdapat dalam isolat DNA.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
11
Tahapan selanjutnya adalah melakukan penambahan elution buffer yang bertujuan
untuk mengelusikan DNA dan menjaga agar DNA tidak rusak (Asris, 2010). Isolat
DNA yang didapatkan kemudian disimpan pada suhu -20°C untuk mencegah
kerusakan DNA akibat pengaruh suhu. Isolat DNA yang diperoleh dapat dikatakan
baik apabila bersifat murni, belum mengalami degradasi, dan bebas dari
kontaminan (Patramurti et al., 2014). Kualitas isolat DNA dapat dilihat dan diuji
secara kualitatif dengan menggunakan teknik elektroforesis.
Analisis Kualitatif Isolat DNA
Hasil isolasi DNA dikatakan baik apabila didapatkan DNA yang murni dan
utuh. Penentuan kemurnian DNA merupakan suatu tahapan yang sangat diperlukan
dari serangkaian proses isolasi DNA. Hal ini dilakukan untuk melihat kontaminan
yang mungkin masih terdapat pada isolat DNA yang diperoleh. Analisis kualitatif
isolat DNA dilakukan dengan menggunakan loading dye yang bertujuan untuk
menambah densitas sampel sehingga dapat meresap ke dalam gel; memberikan
warna; memudahkan proses loading; serta memungkinkan estimasi jarak fragmen
DNA yang dimigrasi (Lee et al., 2012).
Analisis juga dilakukan menggunakan baku pembanding berupa DNA ladder
yang dimasukkan ke dalam salah satu sumuran dan berfungsi sebagai marker.
Analisis kualitatif isolat DNA dilakukan dengan menggunakan teknik
elektroforesis yang dijalankan pada kondisi kecepatan 100 Volt/cm selama 30
menit. Dalam proses ini, molekul DNA yang bermuatan negatif di bagian fosfat
pada pH netral akan bergerak ke arah positif dengan bantuan arus listrik (Patramurti
dan Fenty, 2017). Migrasi elektroforesis DNA melalui gel agarosa dipengaruhi oleh
faktor ukuran, konformasi molekul DNA, konsentrasi agarosa, arus listrik dan
temperatur (Fatchiyah et al., 2012).
Hasil elektroforesis yang didapatkan ditunjukan pada Gambar 1 dan
menunjukkan bahwa isolat DNA yang didapatkan memiliki pita tunggal (single
band) dengan intensitas pita bervariasi yaitu tebal dan tipis. Isolat DNA dengan pita
yang tebal menunjukan kadar DNA yang lebih besar, sedangkan pita yang tipis
menunjukan kadar yang lebih rendah (Lee et al., 2012). Panjang pita DNA dapat
diketahui dengan cara menarik garis lurus masing-masing pita sampel DNA dengan
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
12
posisi pita DNA marker (Patramurti dan Fenty, 2017). Panjang pita dari isolat DNA
yang dianalisis memiliki ukuran lebih dari 3000 bp. Isolat DNA yang diperoleh
kemudian disimpulkan bersifat murni, belum mengalami degradasi, bebas dari
kontaminan, namun memiliki konsentrasi yang rendah. Isolat DNA yang dianalisis
kemudian digunakan untuk proses amplifikasi dengan menggunakan metode PCR.
Gambar 1. Hasil Analisis Kualitatif Isolat DNA dengan Menggunakan Teknik Elektroforesis
Keterangan:
L : DNA Ladder
1-5 : Isolat DNA subjek uji
Kondisi elektroforesis : Fase diam menggunakan agarosa 1%; Fase gerak menggunakan larutan
TBE 0,1%; Kecepatan 100 Volt/cm selama 30 menit; Volume injeksi 6 µL
Amplifikasi Isolat DNA dengan Metode PCR
Amplifikasi isolat DNA dilakukan dengan metode Polymerase Chain
Reaction (PCR) yang merupakan suatu proses sintesis enzimatik untuk
mengamplifikasi nukleotida secara in vitro. Dasar siklus PCR yang utama adalah
siklus berulang 30-35 siklus meliputi: denaturation (denaturasi dua untai DNA
template menjadi untai tunggal); annealing (pengenalan/penempelan primer pada
DNA template); dan extension (proses polimerasi untuk pembentukan untai DNA
baru) (Fatchiyah et al., 2012).
Amplifikasi dilakukan dengan mesin PCR (Thermal cycler Perkin Elmer
2400) menggunakan Promega Go Taq Green Master Mix dengan kadar genomik
DNA masing-masing larutan kira-kira 50 ng dengan volume akhir 25 μL. Kondisi
Isolat DNA
3000 bp
L 1 2 3 4 5
250 bp
1000 bp
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
13
PCR yang digunakan mengadopsi dari penelitian yang dilakukan oleh Cindy (2017)
yaitu initial denaturation pada suhu 94oC (3’); kemudian dilanjutkan dengan
denaturation pada suhu 94oC (30”); annealing pada suhu 60oC (30”); extension
pada suhu 70oC (25”); dan final extension pada suhu 72oC (5’).
Suhu yang tinggi pada tahap denaturasi bertujuan agar terjadi pemisahan untai
ganda DNA menjadi untai tunggal (single strand). Kemudian pada tahap annealing
akan terjadi penurunan suhu yang bertujuan agar primer dapat menempel pada
DNA template yang akan digunakan untuk membuat salinan yang bersifat identik
dengan DNA template yang diinginkan. Tahap annealing merupakan tahap yang
sangat penting dan kritis karena apabila primer tidak menempel pada DNA template
target maka salinan DNA yang diinginkan tidak akan terbentuk. Pada tahap
ekstensi, enzim DNA polymerase akan memanjangkan DNA template target dan
membentuk salinan untai DNA yang komplementer (Joshi et al., 2011).
Amplifikasi dilakukan dengan menggunakan primer yang diadopsi dari
Yoshida et al. (2003) untuk mendapatkan fragmen DNA dari alel CYP2A6*9.
Primer yang digunakan untuk mengamplifikasi isolat DNA pada penelitian ini
berupa primer forward: 5’-GATTCCTCTCCCCTGGAAC-3’ dan primer reverse:
5’-GGCTGGGGTGGTTTGCCTTTA-3’. Primer forward akan mengamplifikasi
ekson 395 sampai dengan 376, sedangkan primer reverse akan mengamplifikasi
ekson 48 sampai 28. Primer tersebut nantinya akan menempel pada target pasang
basa nukleotida isolat DNA. Namun apabila subjek yang diuji memiliki alel
CYP2A6*9 maka tidak akan terjadi penempelan primer (Yoshida et al., 2003).
Alel CYP2A6*9 tidak akan menghasilkan produk PCR karena adanya
polimorfisme di TATA BOX yaitu perbedaan basa nukleotida antara CYP2A6*9
dengan CYP2A6*1. Perbedaan basa nukleotida tersebut mengakibatkan produk
dengan alel CYP2A6*9 tidak dapat diamplifikasikan (Yoshida et al., 2003). Situs
penempelan primer forward dan primer reverse pada sekuen urutan basa nukleotida
potongan gen CYP2A6*1 pada bagian yang diamplifikasi diilustrasikan pada
Gambar 2.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
14
Gambar 2. Situs penempelan primer forward dan reverse pada urutan basa nukleotida CYP2A6*1
Keterangan:
: arah penempelan primer forward
: arah penempelan primer reverse
Pada identifikasi alel CYP2A6*9 digunakan primer yang mengamplifikasi
dari alel CYP2A6*1 karena kedua alel ini hanya memiliki satu perbedaan basa
nukleotida yaitu akibat adanya SNP di T-48G (Yoshida et al., 2003). Perbedaan
basa ini dapat dilihat dengan mengurutkan urutan basa nukleotida dari kedua alel
dan ditunjukan pada Gambar 3.
*1 : GGATTCCTCTCCCCTGGAACCCCCAGATCCACAACTTTGGGGTGC
*9 : GGATTCCTCTCCCCTGGAACCCCCAGATCCACAACTTTGGGGTGC
*1 : ATTCTCACTCTCAGACCCCAAATCCAAAGCCCAAGTGCTCCCCTA
*9 : ATTCTCACTCTCAGACCCCAAATCCAAAGCCCAAGTGCTCCCCTA
*1 : TGCAAATATTCCAAACTCCTCAGTTCTACAGCTTATCTGTTGCCC
*9 : TGCAAATATTCCAAACTCCTCAGTTCTACAGCTTATCTGTTGCCC
*1 : CCTCCTAAATCCCACGCCCTGCGGCACCCCTCCTGAAGTACCACA
*9 : CCTCCTAAATCCCACGCCCTGCGGCACCCCTCCTGAAGTACCACA
*1 : GATTTAGTCTGGAGGCCCCCTCTCTGTTCAGCTGCCCTGGGGTCC
*9 : GATTTAGTCTGGAGGCCCCCTCTCTGTTCAGCTGCCCTGGGGTCC
*1 : CCTTATCCTCCCTTGCTGGCTGTGTCCCAAGCTAGGCAGGATTCA
*9 : CCTTATCCTCCCTTGCTGGCTGTGTCCCAAGCTAGGCAGGATTCA
*1 : TGGTGGGGCATGTAGTTGGGAGGTGAAATGAGGTAATTATGTAAT
*9 : TGGTGGGGCATGTAGTTGGGAGGTGAAATGAGGTAATTATGTAAT
*1 : CAGCCAAAGTCCATCCCTCTTTTTCAGGCAGTATAAAGGCAAACC
*9 : CAGCCAAAGTCCATCCCTCTTTTTCAGGCAGTAGAAAGGCAAACC
*1 : ACCCCAGCCG
*9 : ACCCCAGCCG
Gambar 3. Urutan basa nukleotida produk PCR gen CYP2A6*1 dan CYP2A6*9
(mutasi Single Nucleotide Polymorphism ditunjukan dengan warna kuning)
Keterangan:
*1 : Potongan urutan basa CYP2A6*1 (Gen Bank)
*9 : Potongan urutan basa CYP2A6*9 (Yoshida et al., 2003)
SNP
5’ 3’
GATT CCTC TCCC CTGG AAC TAAA GGCA AACC ACCC CAGCC
CTAA GGAG AGGG GACC TTG ATTT CCGT TTGG TGGG GTCGG
5’ 3’
Primer forward
Primer reverse
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
15
Alel CYP2A6*9 terbentuk akibat adanya Single Nucleotide Polymorphism
(SNP) di dalam TATA BOX di wilayah promotor CYP2A6 pada titik -48T> G dan
menghasilkan penurunan lebih dari 50% aktivitas enzimatik (Pitarque et al., 2001;
Yoshida et al., 2003). Ekspresi mRNA CYP2A6 akan menurun sehingga aktivitas
enzim akan menjadi lebih rendah (Tanner dan Tyndale, 2017). Hal tersebut
dikarenakan fungsi promotor yaitu sebagai pengatur ekspresi gen, tempat RNA
polimerase dan faktor transkripsi dapat berikatan (Hassan et al., 2018). Berdasarkan
penelitian yang dilakukan oleh Fujieda et al., (2004), terjadi penurunan risiko
kanker paru pada individu yang memiliki alel CYP2A6*9 (Rossini et al., 2008).
Analisis Produk PCR dengan Elektroforesis
Analisis produk PCR dilakukan dengan teknik elektroforesis dan
menggunakan alat UV Transilluminator. Produk PCR dari isolat DNA yang
memiliki alel CYP2A6*9 ditandai dengan tidak terekspresi atau tidak terbentuknya
pita pada hasil pembacaan produk PCR dengan menggunakan teknik elektroforesis.
Sebaliknya, produk PCR dari isolat DNA yang tidak memiliki alel CYP2A6*9 atau
yang memiliki alel CYP2A6*1 ditandai dengan terbentuknya pita tunggal dan tebal
pada posisi 368 bp. Terbentuk dan tidaknya produk ditentukan oleh spesifisitas
primer yang digunakan.
Pada Gambar 4 dapat dilihat bahwa terdapat pita yang terbentuk pada panjang
368 bp yang menunjukkan bahwa sampel DNA yang diuji memiliki alel CYP2A6*1
(wild type). Pada elektrogram juga ditunjukkan bahwa terdapat pita yang kosong
yang menunjukkan bahwa sampel tersebut mengalami polimorfisme dan dikatakan
memiliki alel CYP2A6*9. Hal tersebut dapat terjadi karena untaian DNA tidak
dapat diamplifikasi akibat adanya perbedaan basa nukleotida antara CYP2A6*1 dan
CYP2A6*9. Primer spesifik yang digunakan akan menempel pada DNA target dan
menghasilkan produk yang sesuai. Sedangkan primer yang mengamplifikasi
CYP2A6*1 tidak dapat melakukan annealing pada alel CYP2A6*9 karena
perbedaan basa yang terjadi.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
16
Gambar 4. Elektogram produk PCR yang terbentuk pada kondisi optimum
Keterangan:
L : DNA Ladder sebagai marker
22-28 : Produk PCR dari berbagai sampel isolat DNA yang berbeda
Kondisi elektroforesis : Fase diam menggunakan agarosa 1,5%; Fase gerak menggunakan
larutan TBE 0,1%; Kecepatan 100 Volt/cm selama 30 menit; Volume injeksi 6 µL
Polimorfisme gen CYP2A6 berhubungan dengan risiko kanker paru yang
diakibatkan oleh asap rokok karena fungsinya yang secara metabolik dapat
mengaktifkan NNN dan NNK (Rossini et al., 2008). Individu yang memiliki alel
CYP2A6*9 dapat mengalami penurunan risiko kanker paru yang disebabkan oleh
asap rokok (Fujieda et al., 2002; Xu et al., 2002). Hal tersebut dikarenakan
terjadinya penurunan aktivasi dari senyawa prokarsinogenik NNN dan NNK
melalui jalur metabolik yang dapat menginduksi kanker.
Penelitian ini mengamplifikasi isolat DNA dari 30 subjek uji dan data
menunjukkan bahwa sebanyak 26 subjek uji memiliki alel normal CYP2A6*1. Data
juga menunjukkan bahwa 4 subjek uji mengalami polimorfisme dan memiliki alel
CYP2A6*9. Berdasarkan perhitungan yang dilakukan, didapatkan data bahwa total
subjek yang diuji memiliki alel CYP2A6*9 dengan frekuensi yang tinggi yaitu
sebesar 13,33%. Dengan demikian maka dapat disimpulkan sebanyak 4 orang dari
total subjek yang diuji dapat mengalami penurunan risiko kanker paru yang
L 15 16 17 18 19 20 21
Produk PCR
368 bp
Tidak
terbentuk pita
250 bp
1000 bp
3000 bp
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
17
disebabkan oleh asap rokok. Data elektroforesis produk PCR yang dianalisis
disajikan dalam Tabel 1.
Tabel 1. Hasil elektroforesis produk PCR
Alel Subjek Uji Jumlah Subjek
CYP2A6*1/ CYP2A6*9 4
CYP2A6*1/ CYP2A6*1 26
Selain berperan dalam metabolisme nikotin dan senyawa prokarsinogenik,
enzim CYP2A6 juga berperan dalam metabolisme sekitar 3% senyawa obat seperti
letrozole, tegafur, coumarin, valproic acid, methoxyflurane, artesunate, disulfiram,
halothane dan fadrozole (Gurusamy dan Shewade, 2014). Salah satu contoh dari
pengaruh polimorfisme CYP2A6 terhadap metabolisme obat adalah terjadinya
peningkatan konsentrasi metabolit hepatotoksik dari asam valproat yaitu 4-ene-
VPA dan 2,4-diene-VPA. Kedua metabolit tersebut secara signifikan dapat
meningkatkan risiko kerusakan hati pada individu dengan alel yang termasuk dalam
golongan slow metabolizers (Zhao et al., 2017).
Karena perannya tersebut, maka polimorfisme yang terjadi pada CYP2A6
juga akan berdampak pada perbedaan metabolisme dan efek obat untuk tiap
individu. Walaupun penderita dengan penyakit yang sama diberikan obat dan dosis
yang serupa, namun efek yang diterima dapat berbeda untuk tiap individunya.
Perbedaan respon tersebut bahkan justru dapat menimbulkan efek samping atau
efek toksik pada individu tertentu. Dengan kata lain, suatu obat dapat bersifat
manjur dan aman pada seseorang, tetapi untuk orang lain obat itu bisa saja tidak
memberikan efek terapi atau malah akan menimbulkan efek yang tidak diinginkan.
Tujuan terapi pada dasarnya adalah untuk mendapatkan efek menguntungkan
sebesar mungkin dan efek merugikan sekecil mungkin (Alsanosi et al., 2014). Oleh
karena itu dibutuhkan paradigma baru dalam terapi obat untuk meningkatkan
keberhasilan terapi dan menghindari efek samping maupun efek toksik dari obat
berdasarkan profil genetik penderita. Dalam dunia pengobatan, penggabungan
ranah penelitian mengenai genom dan farmakologi telah menciptakan studi baru
yaitu farmakogenomik (Kurth, 2000).
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
18
Farmakogenomik memiliki manfaat yang luar biasa dalam bidang
pengembangan obat dan terapeutik karena dapat memberikan informasi terkait
perbedaan respon tiap individu terhadap obat. Tujuan penerapan farmakogenomik
dalam terapi obat adalah untuk memberikan pengobatan secara prediktif, preventif,
dan personal dengan aplikasi data genomik dalam praktik klinis. Hal tersebut dapat
membantu para peneliti dalam memahami keadaan genetik kausatif untuk efek
farmakokinetik dan farmakodinamik yang berubah dari suatu obat melalui penilaian
profil genetik individu dalam hubungannya dengan kovariat klinis dan lingkungan
(Gurusamy dan Shewade, 2014).
KESIMPULAN
Hasil amplifikasi isolat DNA subjek uji suku Tionghoa nonperokok yang
dianalisis dengan metode elektroforesis menunjukkan bahwa terdapat 4 subjek uji
yang memiliki alel CYP2A6*9 dengan frekuensi sebesar 13,33%. Subjek uji yang
memiliki gen CYP2A6*9 tersebut dapat mengalami penurunan aktivitas metabolik
terhadap TSNA sehingga berdampak pada penurunan risiko kanker paru yang
disebabkan oleh asap rokok.
SARAN
1. Peneliti menyarankan agar selanjutnya dilakukan penelitian dengan subjek uji
berbeda yaitu pada suku lain di Indonesia dengan jumlah yang lebih besar dan
tipe alel yang berbeda.
2. Peneliti menyarankan agar ilmu farmakogenomik khususnya bagi farmasis
dapat terus dikembangkan mengingat peran pentingnya dalam pengembangan
obat dan peningkatan kualitas hidup pasien.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
19
DAFTAR PUSTAKA
Alsanosi, S., Skiffington, C., Padmanabhan, S., 2014. Pharmacokinetic
Pharmacogenomics. Handbook of Pharmacogenomics and Stratified
Medicine. University of Glasgow UK, 341-344.
Anonim, 2018. Suku Bangsa di Indonesia.
https://id.wikipedia.org/wiki/Suku_bangsa_di_Indonesia, diakses pada
tanggal 14 April 2019 pukul 20.28 WIB.
Asris, 2010. Definisi Isolasi DNA dan Manfaat Isolasi DNA.
http://asris07.student.ipb.ac.id, diakses pada tanggal 1 September 2019 pukul
21.19 WIB.
Badan Pusat Statistik, 2011. Kewarganegaraan, Suku Bangsa, Agama dan Bahasa
Sehari-hari Penduduk Indonesia. Indonesia: Jakarta.
B-Rao, C., 2001. Sample Size Considerations in Genetic Polymorphism Studies.
Human Heredity, 52, 191-200.
Cao, S., Yang, C., Gan, Y., Lu, Z., 2015. The Health Effects of Passive Smoking:
An Overview of Systematic Reviews Based on Observational
Epidemiological Evidence. PLOS ONE, 10(10), 1–12.
Cindy, 2017. Optimasi dan Validasi Kondisi Polymerase Chain Reaction pada
Identifikasi CYP2A6*9. Skripsi. Universitas Sanata Dharma, 3-10.
Dempsey, D., Tutka, P., Jacob, P., Allen, F., Schoedel, K., Tyndale, R. F., 2004.
Nicotine metabolite ratio as an index of cytochrome P450 2A6 metabolic
activity. Clin Pharmacol Ther, 64–72.
Departemen Kesehatan Republik Indonesia, 2013. Riset Kesehatan Dasar 2013,
http://www.litbang.depkes.go.id/sites/download/rkd2013/Laporan_Riskesda
s2013.PDF, diakses pada tanggal 14 April 2019 pukul 22.38 WIB.
Fatchiyah, Widyarti, S., Arumningtyas, E. L., Permana, S., 2012. Buku Praktikum
Teknik Analisis Biologi Molekuler, 1–49.
Florczak, S., et al., 2017. Review Article: DNA Isolation Method from Human
Blood with MasterPure DNA Purification Kit™, World Scientific News, 69-
76.
Fujieda, M., Yamazaki, H., Dosaka-Akita, H., et al., 2002. Genetic polymorphism
of CYP2A6 and lung cancer risk in Japanese smokers, Drug Metabolism
Reviews, Vol. 11, 890-894.
Gong, R., dan Li, S., 2014. Extraction of Human Genomic DNA from Whole Blood
Using a Magnetic Microsphere Method, International Journal of
Nanomedicine, 3781-3789.
Gurusamy, U., Shewade, D., 2014. Pharmacogenomics in India. Handbook of
Pharmacogenomics and Stratified Medicine, 1037-1046.
Hassan, M.M., Darwish, A., Abd Elaziz, S. H. , Ezzeldin, N., El-Lebedy, D., Saad-
Hussein, A., El Bastawisy, A., 2018. Association of Genetic Polymorphisms
CYP2A6*2 rs1801272 and CYP2A6*9 rs28399433 with Tobacco-Induced
lung Cancer: Case-Control Study in an Egyptian Population. BMC Cancer,
18(1), 1–9.
Hecht, S., 1999. Tobacco Smoke Carcinogens and Lung Cancer. JNCI: Journal of
the National Cancer Institute, Vol. 91, No. 14, 1194-1210.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
20
Indrajati, T.B., Istiarti, T., Kusumawati, A., 2017. Faktor-faktor Yang Berhubungan
Dengan Praktik Ibu Dalam Mencegah Paparan Asap Rokok Pada Balita
Perokok Pasif. Jurnal Kesehatan Masyarakat, 5, 1123–1132.
Ingelman, S. M., Oscarson, M., Dalya, K., Garte, S., Nebert, D. W., 2001. Human
Cytochrome P-450 (CYP) Genes: a Web Page for the Nomenclature of
Alleles. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev, 10(12), 1307–8.
Kurth, Janice, H., 2000. Pharmacogenomics: Future Promise of a Tool for
Identifying Patient at Risk. Drugs Information Journal. Vol. 3. 223-227.
Liu, T., David, S. P., Tyndale, R. F., Wang, H., Zhou, Q., Ding, P., et al., 2011.
Associations of CYP2A6 genotype with smoking behaviors in southern
China. Addiction. 85–94.
Luis, A., Flores, L., Rubio, G. P., Valencia, R. F., 2017. Review Article:
Distribution of Polymorphic Variants of CYP2A6 and Their Involvement in
Nicotine Addiction. EXCLI Journal, 174–196.
McDonagh, E. M., Wassenaar, C., David, S. P., Tyndale, R. F., Altman, R. B.,
Whirl-Carrillo, M., Klein, T. E., 2012. Pharm GKB Summary.
Pharmacogenetics and Genomics, 22(9), 695–708. Moldoveanu, S. C., Zhu. J., Qian, N., 2017. Analysis of Traces of Tobacco-Specific
Nitrosamines (TSNAs) in USP Grade Nicotine, E-Liquids, and Particulate
Phase Generated by the Electronic Smoking Devices. Contributions to
Tobacco Research, Vol. 7, No. 6.
Nurjanah, Kresnowati, L., Mufid, A., 2014. Gangguan Fungsi Paru Dan Kadar
Cotinine Pada Urin Karyawan Yang Terpapar Asap Rokok Orang Lain.
Jurnal Kesehatan Masyarakat, 10(5), 43–52.
Patramurti, C., Fenty, 2017. Studi Genotipe Sitokrom P450 2A6 Alel CYP2A6 * 4
dan CYP2A6 * 9 pada Subyek Uji Perokok Suku Jawa Indonesia (Genotyping
Study of Cytochrome P450 2A6 Alel CYP2A6 * 1 and CYP2A6 * 9 among
Javanese Indonesian Smokers). Jurnal Ilmu Kefarmasian Indonesia, 15(1),
50–56.
Patramurti, C., Nurrochmad, A., Martono, S., 2014. Polymorphism of Cytochrome
P450 2A6 (CYP2A6*1 and CYP2A6*4) Among Javanese Indonesian
Smoker and Non Smoker. Indonesian Journal of Pharmacy, 26(1), 11.
Pharmvar, 2018. https://www.pharmvar.org/gene/CYP2A6 diakses pada tanggal 14
April 2019, pukul 20.30 WIB.
Pitarque, M., Richter, O., Oke, B., Berkkan, H., Oscarson, M., Ingelman-Sundberg,
M., 2001. Identification of a single nucleotide polymorphism in the TATA
box of the CYP2A6 gene: Impairment of Promoter Activity. Biochem
Biophys Res Commun, 55–60.
Rossini, A., Mattos, R., Felipe, L., Pinto, R., 2008. Review: CYP2A6
Polymorphisms and Risk for Tobacco-Related Cancers. Pharmacogenomics,
1737–1752.
Siswanto, J., Tiara, B., Putricahya, E., Panggalo, L., dan Yuniani, L., 2016. Isolasi
DNA pada Sampel Darah Tepi dan Swab Buccal pada Bayi Penderita ROP:
Perbandingan Hasil Uji Konsentrasi dan Indeks Kemurnian. Sari Pediatri,
18(4), 270-278.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
21
Tanner, J. A., Tyndale, R. F., 2017. Variation in CYP2A6 activity and personalized
medicine. Journal of Personalized Medicine, 7(4), 1–29.
WHO, 2018. Tobacco. http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs339/en/,
diakses pada tangggal 19 April 2019 pukul 21.50 WIB.
Xu et al., 2001. An In Vivo Pilot Study Characterizing the New CYP2A6*7, *8,
and *10 alleles. Biochemical and Biophysical Research Communications.
Vol. 290.
Xue, J., Yang, S., Seng, S., 2014. Mechanisms of cancer induction by tobacco-
specific NNK and NNN. Cancers, 6(2), 1138–1156.
Yoshida, R., Nakajima, M., Watanabe, Y., Kwon, J. T., Yokoi, T., 2003. Genetic
Polymorphisms in Human CYP2A6 Gene Causing Impaired Nicotine
Metabolism. Br J Clin Pharmacol, 54(5), 511–7.
Zhang, et al., 2003. Inhibition of Human Liver Microsomal (S)-Nicotine Oxidation
by (−) Menthol and Analogues. Chemical Research in Toxicology, 16(8),
988–993.
Zhao, M., Zhang, T., Li, G., Qiu, F., Sun, Y., Gao, L., 2017. Associations of
CYP2C9 and CYP2A6 Polymorphisms with the Concentrations of Valproate
and its Hepatotoxin Metabolites and Valproate-Induced Hepatotoxicity.
Basic Clin Pharmacol Toxicol, 121(2), 138-143.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
24
Lampiran 2. Go Taq Green Master Mix Certificate of Analysis
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
25
Lampiran 3. Usage Information of Go Taq Green Master Mix
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
26
Lampiran 4. Product Datasheet of DNA Ladders and Markers
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
27
Lampiran 5. Product Datasheet of primer forward and primer reverse CYP2A6*9
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
32
Lampiran 10. Permintaan Penggunaan Alat PCR Thermocycler LPPT UGM
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
33
Lampiran 11. Perhitungan Jumlah Sampel
Persamaan untuk menentukan jumlah sampel minimal pada penelitian ini diacu dari
penelitian yang dilakukan oleh B-Rao (2001), sebagai berikut:
Nmin ≥ log (1 - π) / 2 log (1 - fmin)
Keterangan:
Nmin : jumlah sampel minimal
π : probabilitas alel utama
fmin : probabilitas alel minor
Penelitian ini akan mendeteksi dua bentuk polimorfisme gen CYP2A6 yaitu alel
CYP2A6*1 sebagai alel utama dan alel CYP2A6*9 sebagai alel minor. Sehingga
dengan demikian, nilai π dan fmin untuk kedua alel tersebut adalah π = 0,95 dan fmin
= 0,05 (B-Rao, 2001). Sehingga dapat disimpulkan bahwa jumlah sampel minimal
yang diperlukan untuk penelitian ini berdasarkan persamaan tersebut adalah:
Nmin = log (1 - π) / 2 log (1 - fmin)
= log (1 – 0,95) / 2 log (1 – 0,05)
= 28,89 29 orang
Penelitian ini menggunakan subjek uji sebanyak 30 orang dan dengan demikian
telah memenuhi persyaratan jumlah sampel minimal untuk penelitian polimorfisme
genetik.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
34
Lampiran 12. Data Subjek Uji
Subjek Uji Genotip
1T CYP2A6*1/*1
2T CYP2A6*1/*1
3T CYP2A6*1/*1
4T CYP2A6*1/*1
5T CYP2A6*1/*1
6T CYP2A6*1/*1
7T CYP2A6*1/*1
8T CYP2A6*1/*1
9T CYP2A6*1/*1
10T CYP2A6*1/*9
11T CYP2A6*1/*1
12T CYP2A6*1/*1
13T CYP2A6*1/*1
14T CYP2A6*1/*1
15T CYP2A6*1/*1
16T CYP2A6*1/*1
17T CYP2A6*1/*9
18T CYP2A6*1/*1
19T CYP2A6*1/*9
20T CYP2A6*1/*1
21T CYP2A6*1/*1
22T CYP2A6*1/*1
23T CYP2A6*1/*1
24T CYP2A6*1/*1
25T CYP2A6*1/*1
26T CYP2A6*1/*1
27T CYP2A6*1/*9
28T CYP2A6*1/*1
29T CYP2A6*1/*1
30T CYP2A6*1/*1
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
35
Lampiran 13. Elektrogram Analisis Kualitatif Isolat DNA
Lampiran 14. Elektrogram Analisis Produk PCR
L 1 2 3 4 5 6 7 L 8 9 10 11 12 13 14
L 1 2 3 4 5
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
36
Lampiran 15. Frekuensi Alel
Frekuensi CYP2A6 *1 =jumlah subjek uji dengan alel CYP2A6∗1
jumlah seluruh subjek uji x 100 %
= 26
30 x 100 %
= 86,67 %
Frekuensi CYP2A6 *9 =jumlah subjek uji dengan alel CYP2A6∗9
jumlah seluruh subjek uji x 100 %
= 4
30 x 100 %
= 13,33 %
L 15 16 17 18 19 20 21
21
L 22 23 24 25 26 27 28
L 29 30
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
37
BIOGRAFI PENULIS
Penulis bernama lengkap Evelyn Angela Sibarani lahir
di Nabire pada tanggal 1 September 1998. Penulis
merupakan anak kedua dari pasangan Lamhotman
Sibarani dan Nona Mallisa. Penulis menempuh
pendidikan di TK Pertiwi VIII Nabire (2002-2003), SD
YPPK St. Petrus Nabire (2010-2013), SMA Negeri 1
Nabire (2013-2016), kemudian melanjutkan pendidikan
Sarjana S1 di Fakultas Farmasi Universitas Sanata
Dharma Yogyakarta pada tahun 2016. Penulis pernah
menjabat sebagai Ketua UKF DNA Dance Crew USD (2017-2018). Selama masa
kuliah, penulis turut berpartisipasi dalam beberapa unit kegiatan kampus seperti
UKF DNA Dance Crew USD (2016-2019), UKF PSF Veronika (2016), UKF
Herbal Garden Team (2016), UKF Badminton USD (2016), UKF Basket USD
(2016), dan UKF PCC (2016). Penulis juga aktif dalam berbagai kepanitiaan seperti
menjadi CO divisi Acara Osteo Day (2017), CO divisi Teater Titrasi (2018),
anggota divisi Perkap dalam acara Pharmacy Performance (2017-2018), anggota
divisi Acara dalam acara CBIA (2017), dan berbagai kegiatan kampus lainnya.
Penulis juga turut mengambil peran sebagai asisten dosen praktikum Kimia Dasar
(2018-2019), Biokimia (2018), Kimia Organik (2017), dan Farmasi Fisika (2017-
2018). Penulis juga diberikan kepercayaan menjadi ketua kelas FSM A 2016 dan
telah menjabat sejak tahun 2016 hingga 2019.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
Top Related