SKRIPSI
PADA FAKULTAS FARMASI ^ r
Retno Sari 058210491
Disetujui oleh Pembimbing
M I L I t ' ITBRPUSTAEAA* 1-W NITERS1TAS / lK L A N O « A ’ , S U R
A H A V A
Gunawan^ntirayanto Drs* Charoad Ahmad Sahid
ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga
Penelitian. ini dikerjakan atas kerja sama Sub Balai Pene litian
Hortikultura Malang dengan Laboratorium Bioteknolo- gi Farmasi
Fakultas Farmasi Universitas Airlangga
ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga
KATA PENGANTAR
Penelitian dengan judul " PERCOBAAN INISIASI KALUS DARI BEBSRAPA
DIOSCOREA SP. " setelah waktu yang cukup panjang, akhirnya dapat
diselesaikan. Meskipun hasil yang dicapai belum cukup memadai,
diharapkan dapat memberikan sumbangan bagi perkerabangan dan
kemajuan penelitian di bi dang bioteknologi terutama teknik kultur
jaringan tanaman obat.
Dengan memanjatkan puji syukur ke hadirat Tuhan Yang Maha Esa, kami
persembahkan apa yang telah dicapai bagi kemaduan ilmu
pengetahuan.
Ucapan terima kasih yang setulusnya kami sampaikan kepada :
Bapak Dr, Gunawan Indrayanto dan Bapak Drs. Charaad Ahmad Sahid
selaku dosen pembimbing,- yang telah banyak mera- berikan bimbingan
dan saran serta dorongan moril.
Bapak Ir. F. Kasijadi KS selaku Kepala Sub Balai Pe nelitian
Hortikultura Malang yang telah memberikan kesem- patan dan
fasilitas untuk melaukan penelitian di laborato ry um
Fisiologi.
Kepala Kebun /?aya Purv/odadi -Pasuruan beserta staf yang telah
banyak membantu dalam mendapatkan bahan peneli tian.
Para dosen Fakultas Farraasi Universitas Airiangga yang telah
memberikan saran dan dorongan moril
iii
Skripsi PERCOBAAN INISIASI KALUS... Retno Sari
Para staf Laboratorium Fisiologi Sub Balai Peneliti- an
Hortikultura Malang yang banyak memberikan bantuan se- lama
penelitian.
Tak lupa terima kasih yang sebesarnya kepada kedua orang tua dan
saudara-saudara kami yang banyak memberikan bantuan moril
materiil.
Surabaya, Desember 1987
DAFTAR ISI Halaraan
KATA PENGANTAR iii DAFTAR ISI ... - . . . . . . . . . . . . . . v
DAFTAR TABEL. .......................... - . viii DAFTAR GAMBAR
.................... . . . x DAFTAR L A M P I R A N
..........................xii- DAFTAR ISTILAH DAN SINGKATAN
.............. xiii- BAB
I. PENDAHULUAN 1 . Latar belakang ................. .....1
2. Tujuan Penelitian . . . . . . . k
II. TINJAUAN PUSTAKA 1. Kultur jaringan . . . . . . . . . 5 2.
Media kultur jaringan .................7 3. Kondisi lingkungan
kultur jaringan. 11 4. Kultur kalus dan karakteristiknya . 12 5.
Kultur jaringan sebagai sumber
metabolit sekunder . . . . . . 15
6. Produksi diosgenin dari kultur jaring an Dioscorea
sp.................. 18
7. Tinjauan uraum tanaman Dioscorea sp. 19 7.-1 Sistematika tanaman
Dioscorea sp. 19 7.2 Sifat-sifat tanaman Dioscorea sp. 20 7.3
Kandungan Dioscorea sp. . . . 21
III. METODOLOGI PENELITIAN 1. Bahan.............. .. 23
ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga
Halaman
1*1 Eksplan . . . . . . . . . . . . 23 1..2 Bahan kimia.
............... . 23 1.3 Agar .. . . . . . . . . • 23 1. if
Media............... 23
2.. Alat ......................... 2 if 3* Cara kerja .
............... . . Zk
3*1 Sterilisasi alat . . . . . . 2if 3.1.1 Alat gelas, alat logam
dan alu
minium foil 2if 3.1.2 Air suling................. .... 25 3*2
Pembuatan media 23 3*3 Penanaman eksplan. .. * . ... 23 3.4
Pemindahan kultur kalus. .- » .. 26 3.5 Pengamatan hasil .. .. ...
... 26 3.-5.1 Pemeriksaan makroskopis kalus . 26 3*5.2 Pengamatan
pertumbuhan kalus . 26 3-5.3 Pengolahan data . . . . . . . .
27
IV- HASIL PENELITIAN 1. Sterilisasi • $Q
2. Pembentukan kalus • .................31 3. Pemeriksaan
makroskopis kalus . 32 if. Hasil perhitungan............- .
36
V.. PEMEAHASAN..............................if 6 VI. KESIMPULAN
.................. . . . .- 50
III..
vi
Halajoan
vii
DAFTAR TABEL
1.. Komposisi kimiawi media Murashige - Skoog •• * » ». - *.
28
2. Rancangan kombinasi zat pengatur tumbuh untuk pembentukan kalus
Dioscorea sp. . 29
3* Cara sterilisasi yang digunakan terha- dap eksplan Dioscorea sp.
. . . . . . . 30
if. Pembentukan kalus dari eksplan Dioscorea sp. pada media MS
dengan pe- nambahan zat pengatur tumbuh .. .. .. «. 31
5. Waktu tumbuh kalus dari eksplan Dioscorea pentaphvlla L. . . . .
. . . . 32
6. Waktu tumbuh kalus dari eksplan Dioscorea batatas Decne. . . . .
. . 32
7. Pemeriksaan makroskopis kalus Dioscorea pentaphylla L. • . .. ..
33
8. Pemeriksaan makroskopis kalus Dioscorea batatas Decne. 3k
9. Indeks Pertumbuhan (IP) kalus Dioscorea •pentaphylla L. . .. ..
. .. 36
10. Contoh perhitungan persamaan regresi dari data Indeks
Pertumbuhan rata-rata dan v/aktu (kalus Dioscorea pentaph.ylla L.
pada media KD^) . ............ 38
viii
11. Indeks Pertumbuhan (IP) kalus Dioscorea batatas
Decne.............. /+1
12. Waktu duplikasi (td) kalus Dioscorea pentaphylla L. . . . .
45
13* Waktu duplikasi (t ) kalus Dioscorea batatas Decne. . . . . . .
. 45
No. Teks Halaman
DAFTAR GAMBAR
1. Kurva pertumbuhan kalus .. «. .. - » l*f 2. Terjadinya
organogenesis pada kalus ^ Dioscorea pentaphvlla L.. pada
media
(A) KD1# (B) KD3 . ............... 3k
3. Kalus Dioscorea batatas Decne yang di- tanam pada media (A) KD^;
(B) KD^ pada minggu XV............. .. . 33
if. Sel-sel kalus Dioscorea pentaphvlla L.. ( pembesaran 50 X -
35
5. Grafik log Indeks Pertumbuhan rata-rata terhadap waktu (hari)
dari kalus Dioscorea pentaphvlla L. . ..... 37
6a. Persamaan regresi dari grafik log Indeks Pertumbuhaa rata-rata
terhadap waktu dari kalus Dioscorea pentaphvlla L* pada media (A)
KD^ (B) kd7 ..... . . . . 39
6b. Persamaan regresi dari grafik log Indeks Pertumbuhan rata-rata
terhadap waktu dari kalus Dioscorea pentaphvlla L. pada media (C)
KDg (D) . * . » • .- .• • zo
7.. Grafik log Indeks Pertumbuhan rata-rata terhadap waktu (hari)
dari kalus Dioscorea bat at as Decne.. .. .. .. .. *. 1+2.
8a. Persamaan regresi dari grafik log Indeks Pertumbuhan rata-rata
terhadap waktu dari kalus Dioscorea batatas Decne pada media (A)
KDej (B) KDrj Zj-3
x
8b.
No,
Persamaan regresi dari grafik log Indeks Pertumbuhan rata-rata
terhadap waktu dari kalus Dioscorea batatas Decne pada media (C)
KDg (D) kdx0. . . . . . . * . ,
Teks Halaman
DAFTAR LAMPI RAN
2. Dioscorea esculenta (Lour) Burk . .. .. .. 57
3* Dioscorea pentaphvlla L. .. . . . . 4- Dioscorea batatas Decne .
. . . . . . . 59
Gambar 1. Dioscorea h i Dennst .. .. .. .. ., £0 2. Dioscorea
esculenta (Lour) Burk. . . . . 61 3* Dioscorea pentaphvlla L.- . .
. . . . 62 4* Dioscorea batatas Decne. •• .. .. - .. .• 63
Tabel Hasil penimbangan bobot basah. kalus Dioscorea pentaphvlla L.
dalsun gram . . 64
Hasil penimbangan bobot basah kalus Dioscorea batatas Decne dalam
gram . 65
No. Teks Halaman.
DAFTAR ISTILAH DAN SINGKATAN
BA benzylaminopurine; BAP 2,4 D 2,4 - dichlorophenoxyacetic acid
Eksplan potongan jaringan; organ yang diguna-
kan untuk memulai kultur jaringan Friable rapuh IP Indeks
Pertumbuhan IAA indole-3-acetic acid Kalus suatu massa meristematik
yang tak ter
deferensisi dari sel tanaman yang ter bentuk pada kondisi in
vitro
MS Murashige and Skoog NAA -naphthaleneacetic acid Subkultur
pemindahan aseptik dari bagian suatu
kultur pada media t, waktu duplikasi
xiii
DAFTAR ISTILAH DAN SINGKATAN
BA 2,if D Eksplan
Friable IP IAA Kalus
MS NAA Subkultur
b enzylaminopurine; BAP 2,if - dichlorophenoxyacetic acid potongan
jaringan; organ yang diguna- kan untuk memulai kultur jaringan
rapuh Indeks Pertumbuhan indole-3-a.cetic acid suatu massa
meristematik yang tak ter deferensisi dari sel tanaman yang ter
bentuk pada kondisi in vitro Murashige and Skoog ck
-naphthaleneacetic acid pemindahan aseptik dari bagian suatu kultur
pada media waktu duplikasi
xiii
1
menguntungkan. merupakan sebab dilaksanakannya Program Keluarga
Berencana Nasional. Salah satu sasaran. Pro gram Keluarga
Berencana yakni sasaran langsung merupa- kan usaha menurunkan
tingkat kelahiran melalui pema- kaian kontrasepsi. Hasil yang
dicapai pada pelaksana- an Program Keluarga Berencana cenderung
mengalami pe- ningkatan (1). Pencapaian peserta Keluarga Berencana
aktif secara nasional hingga tahun 1985/1986 sebesar 50,4 % dari
jumlah pasangan usia subur dengan. penggu- naan obat kontrasepsi
mencapai lebih dari 60 % (2)* Obat kontrasepsi banyak digunakan
karena. pemakaiannya mudah, praktis, efektif dan aman. untuk jangka
lama.
Obat kontrasepsi yang digunakan merupakan hormon steroid. Sebagai
bahan baku hormon steroid yang se- ring digunakan adalah diosgenin,
stigma sterol, hek- sogenin, asam empedu dan jenis alkaloid steroid
yang diperoleh dari tanaman. Kebutuhan akan hormon steroid makin
meningkat sejalan dengan bertambahnya jumlah penduduk disamping
sejalan dengan kemajuan teknik ca- ra sintesa hormon steroid.
Dengan makin meningkatnya kebutuhan akan hormon steroid maka dalam
beberapa ta-
ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga
2
hun kemungkinan. akan kekurangan bahan untuk sumber bahan baku
hormon steroid, Oleh karenanya perlu di- kembangkan metode untuk
mendapatkan bahan .-baku hor- mon steroid disamping pemanfaatan.
dan pengembangan sumber daya alam (3)..
Dari hasil pertemuan ilmiah di Meksiko tahun 1975 diketahui sebagai
sumber bahan baku steroid yang; pa ling banyak diproduksi adalah
diosgenin (3)* Dios- genin merupakan metabolit sekunder yang
diteraukan pada jenis tanaman Dioscorea. Tanaman Dioscorea di
Indonesia terdapat lebih dari 1+0 jenis, baik yang sengaja ditanam
majipun yang tumbuh liar.
Untuk mendapatkan senyawa/metabolit sekunder dari tanaman pada
umumnya dapat dilakukan dengan bu- didaya tanaman. Kesulitan dalam
produksi metabolit sekunder disebabkan oleh semakin berkurangnya
sumber bahan alam yang tersedia, biaya produksi yang mahal,
kesulitan ekonomis dan teknis penanaman (k)* Kemaju- an bidang
bioteknologi membuka kemungkinan-kemung- kinan baru dalam produksi
metabolit sekunder yaitt dengan teknik kultur jaringan. Dengan
t-eknik kultur jaringan diperoleh keuntungan antara lain: senyawa
berguna diproduksi pada kondisi terkontrol, bebas dari pengaruh
mikroba dan insekta, tidak tergantung iklim dan letak geografis
(5).
Hasil penelitian yang dilakukan oleh 'Rokem et, al.
ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga
3
menunjukkan produksi diosgenin mencapai 7,8 % dari kultur jaringan
Dioscorea deltoidea. Sejumlah jenis lain dari Dioscorea seperti
Dioscorea composita. Dioscorea floribunda. Dioscorea glandulosa
telah di- teliti kemampuannya untuk memproduksi diosgenin jika
ditanara pada kultur suspensi sel (6)* Dari peneliti an yang
dilakukan Tjondronegoro dkk., beberapa jenis Dioscorea yaitu
Dioscorea bulbifera. Dioscorea hispida. Dioscorea esculenta
diketahui ke mampuannya memproduksi diosgenin jika ditanam pada
media kultur jaringan (?)•
Dengan dasar penelitian yang telah dilakukan ma- ka dapat
dikembangkan produksi diosgenin dengan tek- nik kultur jaringan
guna mencukupi kebutuhan bahan baku pembuatan hormon steroid.
Dengan teknik kultur jaringan tahap awal yang harus -dilakukan
adalah pena- naman eksplan (potongan jaringan) pada media yang
sesuai dimana akan dihasilkan suatu massa yang tak terdeferensiasi
disebut kalus* Kultur kalus diketa hui mampu memproduksi metabolit
sekunder. Untuk men- dapatkan hasil yang optimal dalam produksi
metabolit sekunder menurut Keinstein diperlukan cara induksi kalus
dari tanaman antara lain dengan pembuatan kul tur dari tanaman,
optimasi media untuk pertumbuhan kultur yang haik, tanpa
memperhatikan kemampuannya dan lain-lain (8).
ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga
k
Dari kultur kalus, kalus yang terbentuk dapat di- subkulturkan
dengan memindahkan ke.'dalam media;, baru atau untuk produksi dalam
jumlah besar dipindahkan ke- dalam kultur suspensi atau kultur
fermentor* Kultur kalus untuk produksi dalam jumlah besar kurang
meng- untungkan karena tumbuhnya relatif lambat. Tetapi, se- bagai
tahap awal untuk mencapai kultur suspensi atau kultur fermentor,
harus diketahui terlebih dahulu ke- mampuan pembentukan kalus dari
suatu tanaman dan media yang sesuai untuk pertumbuhan kalus
sebagaimana dike- mukakan Heinstein (5,9>10), Dengan demikian
dapat di- lakukan penelitian lebih lanjut mengenai kandungannya dan
keuntungannya untuk dikembangkan dengan teknik kultur
jaringan.
1.2 Tujuan penelitian Penelitian yang dilakukan bertujuan:
1. Menumbuhkan kalus dari tanaman Dioscorea sp. pada media buatan
Murashige - Skoog dengan penam- bahan zat pengatur tumbuh
tertentu.
2. Mengetahui gambaran pertumbuhan kalus Dioscorea sp«- dalam
bentuk grafik log Indeks Pertumbuhan rata- rata terhadap waktu,
pada beberapa kombinasi kon- sentrasi zat pengatur tumbuh*
3. Mengetahui waktu duplikasi kalus Dioscorea sp. pada beberapa
kombinasi konsentrasi zat pengatur tumbuh.
ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga
5
11*1 Kultur jaringan Kultur jaringan dapat didefinisikan sebagi
ba-
gian atau jaringan yang telah dipindahkan dari tanam- an. asalnya
dan ditumbuhkan dalam keadaan steril pada suatu media buatan, dan
sel-selnya mampu tumbuh dan mengadakan pembelahan (5).
Kultur jaringan didasari oleh teori sel Schwann dan Schleiden yang
menyatakan bahwa sel hewan dan sel tumbuhan merupakan satuan
biologis terkecil yang mampu melakukan aktivitas hidup seperti
metabolisme, reproduksi dan tumbuh. T.H. Morgan mengemukakan sifat
totipotensi dari suatu sel dimana sel mampu berkem**. bang menjadi
organisme. Pendapat tersebut menjadi salah satu dasar berkembangnya
teknik kultur jaring an (8,9). Teknologi kultur jaringan tanaman
dapat di- bagi dalam lima kelas berdasarkan bahan yang diguna- kan
(9) :
a. Kultur kalus b. Kultur sel c. Kultur organ d. Kultur meristem
dan morfogenesis e. Kultur protoplast Sel-sel tanaman dari semua
jenis dapat dikul-
BAB II
6
turkan secara aseptik pada media nutrisi. Kultur dimulai dengan
penanaman eksplan yang telah diste- rilkan pada media agar.. Dalam
dua sampai empat ming- gu, tergantung dari jenis tanaman, suatu
massa sel tak terorganisasi terbentuk yang disebut kalus. Kalus
dapat disubkulturkan tak terbatas dengan me- mindahkan ke dalam
media baru. Waktu yang diperlu- kan untuk mendapatkan jaringan
kalus sangat berva- riasi tergantung jenis tanaman, asal eksplan
dan komposisi nutrisi media (9).
Keuntungan teknik kultur jaringan dibandingkan teknik konvensional
antara lain (6,9) : 1. Kondisi dapat dikontrol, sehingga dapat
dihasil-
kan produksi tertentu yang diinginkan. 2.. Bebas pengaruh mikroba
dan insekta. 3- Dapat ditanam dimana saja, 'tidak tergantung
pada
letak geografis dan iklim,. Dengan keuntungan teknik kultur
jaringan, maka
dapat dikeaibangkan imtuk-tiijuan. (4*5')‘ 1- Produksi
senyawa-senyawa tertentu yang berguna
dalam bidang farmasi/medis. 2. Eiotransforaasi senyav/a-senyav/a
tertentu menja-
di senyav;a yang dapat digunakan dalam bidang f annasi/me di
s.
3.. Produksi senyawa-senyawa spesifik. if. Seleksi starin-strain
tanaman unggul untuk dip a-
ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga
7
kai pada bidang pertanian dan hortikultura. 5. Multiplikasi tanaman
secara cepat dan seragam.
XI*2 Media kultur jaringan Komposisi dari media kultur memegang
peranan
penting dalam keberhasilan kultur jaringan. Ada be berapa macam
media kultur jaringan antara lain : me dia Murashige - Skoog, B^,
White, Heller, Gamborg et. al., Gautheret, Hildebrandt et. al. yang
pada dasar- nya sama, dengan modifikasi pada komposisi dan jum lah
komponennya dimafta disesuaikan dengan tujuan penelitian (1 1
)*.
Media standar kultur jaringan terdiri dari komposisi yang seimbang
antara makroelemen dan mi- kroelemen, vitamin, sumber karbon dan
energi, se- nyawa organik, sumber nitrogen dan zat pengatur tumbuh*
Penambahan bahan organik seperti air kela* pa, sari buah (tomat,
semangka, jeruk), ekstrak tanaman (ekstrak ragi dan gandum) dan
protein hi- drolisat dapat merangsang terjadinya pembelahan sel
(9,11,12)..
Komponen media kultur jaringan pada dasarnya terdiri dari: 1.
Sumber karbon seperti sukrosa, glukosa, frukto-
sa, laktosa. Dari percobaan beberapa macam kar- bohidrat, sukrosa
merupakan karbohidrat terbaik untuk sel tanaman, airaana hampir
semua kultur
ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga
8
menunjukkan pertumbuhan optimal*. Sukrosa biasa ditambahkan pada
konsentrasi 20.000 - 45.000 mg/1 (5,12,13).
2* Makroelemen anorganik Nutrisi makroelemen anorganik yang
terutama di- butuhkan untuk pertumbuhan meliputi : 'IT, P, Mg, S,
K, Ca, Cl*. Nitrogen dibutuhkan dalam jumlah besar, diberikan dalam
bentuk ion nitrat dan atau amonium,. Magnesium dan Sulfur diberikan
da lam bentuk MgSO^. 7 1 0.. Kalium dibutuhkan dalam jumlah besar
pula, diberikan dalam bentuk KC1, KNO^, atau KH PO .. Penambahan
CaCl ,. 2 H^O dan Ca(N0^)2 4 ^ 0 atau bentuk garam lainnya untuk
memenuhi kebutuhan kalsium. Sedangkan klorida berada dalam bentuk
KC1 atau CaC^. Fosfor ber- ada dalam bentuk Nal^PO^. H20 atau
KI^PO^ (9).
3.- Mikroelemen Dibutuhkan oleh sel tanaman dalam jumlah kecil.
Nutrisi mikroelemen yang diperlukan sel tanaman tihggi adalah Cu,
Zn, Mn, Fe, Bo, dan Mo. Bebe rapa media juga mengandung Co dan I
(9)*'
4- Vitamin Vitamin diperlukan dalam jumlah kecil. Mempunyai fungsi
mengkatalisa sistem ensim. Tiamin r.ierupa- kan vitamin esensial
yang diperlukan hampir se- mua kultur jaringan tanaman. Asam
nikotinat dan
ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga
9
piridoksin merangsang pertumbuhan, Mio - inositol ditambahkan pada
beberapa media dengan konsentra- si 100 mg/1 , dimaksudkan sebagai
faktor pertum buhan. Vitamin lain yang biasa digunakan adalah asam
para aminobensoat, asam askorbat, biotin, kholin, sianokobalamin,
as§m folat dan riboflavin (9,13).
5. Zat pengatur tumbuh Zat pengatur tumbuh yang digunakan untuk
kebanyak- an kultur jaringan terutama kultur kalus adalah auksin
dan sitokinin. Auksin mempunyai peranan antara lain terhadap
pengembangan sel, penbentuk- an kalus dan pertumbuhan akar.
Sitokinin mempunyai peranan dalam proses pembelahan sel (14).
Termasuk dalam kelompok auksin yang sering digunakan untuk
keperluan kultur jaringan adalah IAA, 2,/+ D, NAA, sedangkan
sitokinin adalah kinetin, BA dan zea- tin.
V/eier et. al. meneliti pertumbuhan tobacco pith tissue culture
dengan menggunakan auksin dan sitokinin dalam berbagai
perbandingan. Pada kon- sentrasi sitokinin lebih besar dari auksin
memper- lihatkan stimulasi pertumbuhan tunas dan daun. Sebalikr.ya
jika konsentrasi sitokinin lebih kecil dari auksin mengakibatkan
stimulasi pertumbuhan akar. Pada keadaan dimana konsentrasi kedua
-
ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga
10
nya berimbang maka pertumbuhan tunas, daun dan akar berimbang juga.
Pada konsen.trasi sitokinin sedang (intermediet) dan auksin rendah
akan ter- bentuk kalus (14)« 2,4 D lebih potensial daripa- da IAA
dan NAA. Kalus dapat terbentuk dari bebe- rapa eksplan pada
konsentrasi 2,4 D kurang dari 0 ,1 mg/1 ., meski beberapa jaringan
membutuhkan 5 - 1 0 mg/1 untuk merangsang pembelahan sel. Un tuk
pembentukan kalus penambahan 2,4 D 0,2 - 2 mg/1 cukup eSektif untuk
semua jaringan. tanaman. Sitokinin ditambahkan dengan konsentrasi
0,5 - 2 mg/1 (9).
6. Asam amino dan bahan organik konrpleks Asam amino jarang
ditambahkan dalam media kultur jaringan kecuali glisin* Jika
diperlukan media diperkaya dengan kasein hidrolisat atau asam ca-
samino* Penggunaan ekstrak alam seperti ekstrak ragi, ekstrak
gandum dan sari buah dapat memban- tu. Sebagai contoh pertumbuhan
in vitro dari eksplan beberapa jenis Citrus sangat dirangsang
dengan penambahan sari jeruk pada media (9)- Pemilihan media
tergantung pada jenis tanaman,
jaringan atau organ yang ditanam serta tujuan pene litian. Jika
telah dilakukan penelitian yang berha- sil dari suatu tanaman, cara
terbaik adalah dengan mempergunakan metode yang digunakan pada
penelitian
ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga
11
II.3 Kondisi lingkungan kultur jaringan (13) 1.- Temperatur
Menuru'UDe Capite, temperatur optimum beberapa kultur jaringan
lebih tinggi dibandingkan tanam an. asalnya tetapi menurut Riker
dan Hildebrandt sama dengan tanaman. asalnya. Secara umum kultur
jaringan tanaman akan tumbuh baik pada tempera tur 20 - 28°C
dengan temperatur optimal 26 - 27°C. Tetapi beberapa kultur
jaringan. tanaman tidak mengalami kerusakan pada temperatur 5 -
10°C.
2. Cahaya Kultur suspensi tanaman umumnya tumbuh dengan
pencahayaan. redup, meskipun Torrey dan Reinert melaporkan bahwa
kecepatan tumbuh dalam keadaan gelap maupun terang untuk jaringan
tanaman ada- lah sama. Blakerly dan Stewart melaporkan penca
hayaan pada kultur jaringan Haplopannus gravilis menghasilkan
kultur yang kompak dan kultur yang tumbuh dalam gelap bersifat
rapuh. Untuk merang- sang pertumbuhan kalus yang optimum, kultur
seba- iknya diletakkan di tempat gelap#
ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga
12
3- pH Pada umumnya pH yang menguntungkan untuk pertum buhan kultur
jaringan antara 5>0 - 6,5. White menyatakan. pH optimal adalah
Beberapa media kultur ditambah dengan buffer phosphat karena selama
sterilisasi dan selama waktu pertumbuhan pH dapat berubah. Namun
penambahannya sangat ter- batas karena pada konsentrasi tinggi akan
meng- hambat pertumbuhan. kultur.
4. Aerasi dan agitasi Aerasi merupakan faktor penting untuk
kekuatan pertumbuhan dari kebanyakan kultur suspensi ta naman.
Aerasi dan agitasi yang memuaskan dicapai pada kultur yang tumbuh
dalam carboys dengan me- lewatkan udara melalui fritted tube atau
open ended glass tubing* Pengaduk magnjetik digunakan untuk
menambah agitasi pada banyak tipe wadah kultur.
II.4 Kultur kalus dan karakteristiknya Kultur jaringan tanaman yang
paling umum adalah
kultur kalus, dimana merupakan suatu massa yang tak terdeferensiasi
dari sel tanaman (13). Pada mulanya kalus diketahui terbentuk
akibat adanya luka pada jaringan tanaman dimana pada kondisi
menguntungkan akan menutup luka dan mencegah infeksi mikroorganis-
me. Penelitian yang dilakukan oleh White kemudian
ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga
13
Gautheret dan Nobecourt di tahun 1930' an membukti- kan bahwa kalus
dapat terbentuk dari jaringan ta naman yang diisolasi.. Kalus
dapat dihasilkan dari semua bagian tanaman (15). Cara yang umum'
adalah dengan menanam bagian tanaman yang steril pada me-.., dia
kultur yang sesuai. Pemberian zat pengatur turn- buh pada
konsentrasi tertentu akan merangsang pem- bentukan kalus. Kultur
kalus dapat ditumbuhkan pada media padat dan media cair (13)*
Kalus dari jenis tanaman yarig berbeda bervari- asi dalam tekstur,
kerapuhan dan warna.. Kultur ja ringan batang Citrus grandis
mempunyai kalus berv/ar- na putih, kompak dan bernodul dengan
pertumbuhan yang lambat, sedang kalus yang rapuh pertumbuhannya
cepat. Pada kultur jaringan batang Plumbago, Heble et. al.
mengamati adanya pemisahan dari beberapa lini sel yang mempunyai
perbedaan kemampuan tumbuh, morfologi dan pigmentasi. Kalus
berpigmen hijau tum- buh lebih baik dibawah cahaya daripada pada
keadaan gelap. Pigmentasi dipengaruhi konsentrasi gula, ada nya
amiliuiii terlarut, defisiensi nitrogen, temperatur, cahaya dan
auksin eksogen (1 1 )*
Kalus yang terdiri dari sel-sel parenkim yang seragam sangat
jarang, kecuali pada Agave dan Bp_s_a. Tergantung dari sumber/asal
kalus, nutrisi media, dan interval waktu subkultur. Sel-sel kalus
terdiri
ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga
14
dari tipe sel yang berv.ariasi ukuran danbentuk, isi sel dan
ketebalan dinding selnya (1 1 ).
Kalus tumbuh selama periode waktu tertentu, bi- asanya selama dua
minggu sampai kira-kira tiga bulan. Pada akhirnya akan dicapai
ukuran optimum dan per tumbuhan akan menurun, Hal tersebut
disebabkan makin
j*
berkurangnya nutrisi atau dehidrasi media, terben- ttiknya
metabolit beracun, habisnya oksigen sel inti jaringan (12). Kurva
pertumbuhan kalus selalu meng- hasilkan bentuk n S Kecepatan
pertumbuhan menca- pai maksimal setelah fase linier dan menjadi
konstan pada fase stationer (Gambar 1) (9,16).
Gambar 1, Kurva pertumbuhan kalus
ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga
15
Produksi metabolit sekunder dalam kultur sel berkait- an erat
dengan kurva pertumbuhan kalus, karena (17) : 1. Pembentukan
metabolit paralel dengan pertumbuhan
sel. 2* Pembentukan metabolit diperlambat sampai pertum
buhan berhenti. 3* Pembentukan metabolit terjadi setelah lag
phase.
II.5 Kultur jaringan sebagai sumber metabolit sekunder Dengan
keberhasilan pertumbuhan in vitro dari
jaringan tanaman pada tahun 1930 an maka studi ter hadap kultur
jaringan berkembang pesat. Teknik kul tur jaringan tanaman membuka
kemungkinan baru dalam usaha menemukan produk-produk berguna dari
tanaman obat untuk keperluan industri (18,19)»
Produk yang telah diidentifikasi terdapat pada kultur jaringan
tanaman. antara lain steroid, terpe noid, sapogenin, alkaloid,
karbohidrat, ensim, fla- vonoid, tanin, asam amino, glikosida, zat
pengatur tumbuh, pigmen, senyawa fenol dan asam organik (19)*
Adanya aktivitas mikroba fjuga telah diteliti (18).. Kultur
jaringan mungkin memproduksi senyawa-senyawa yang sama/identik
dengan tanaman induknya dan atau senyawa-senyawa yang lain sama
sekali (5). Bahkan mungkin tidak mampu memproduksi senyawa spesifi*
da-
ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga
16
biokomia yang diperlukan* 3.- Pembentukan struktur sel tertentu. 4-
Perubahan lokalisasi substrat dan ensim.
Dengan adanya perbedaan kondisi dan lingkungan denganrtanaman
asalnya maka ada kemungkinan kultur jaringan mempunyai profil
metabolit sekunder yang berbeda sekali dengan tanaman asalnya baik
kuanti- tatif maupun kualitatif. Beberapa kultur suspensi yang
mempunyai kandungan senyawa alam lebih tinggi dibandingkan tanaman
asalnya adalah Coleus blumei ( 12 % asam rosmarinat ), Catharanthus
roseus ( 0,8 % serpentin ), Dioscorea deltoidea ( 7,8 % di- osgenin
), Solanum aviculare ( 3 % asam betulinat ). Senyawa-senyawa yang
diproduksi pada kultur jaringan tetapi tidak pada tanaman asalnya
atau sedikit seka li antara lain : eduline dari Ruta graveolens.
luci- dine dari Morinda citrifolia, paniculidis dari Andrographis
paniculata* 3-metilpurpurin dari Digitalis lanata. Shikonin, suatu
zat yang dipakai sebagai obat luka telah berhasil diproduksi secara
industri dengan teknik kultur jaringan dari tanaman
ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga
17
Cara untuk meningkatkan produksi metabolit se kunder adalah dengan
optimasi media kultur jaringan, optimasi kondisi dari
bioreaktor/fermentor, penam- bahan prekursor atau elisitor pada
media, biotrans- formasi dan seleksi strain.yang berproduktivi'tas
tinggi. Untuk mencari strain-strain yang mampu mem produksi
metabolit sekunder tertentu dalam jumlah besar dilakukan seleksi
strain. Cara seleksi yang dikemukakan Heinstein merupakan perbaikan
cara-cara terdahulu, Secara ringkas cara Heinstein antara la in
(22) : 1. Pembuatan kultur tanaman. 2* Optimasi media untuk
pertumbuhan kultur yang ba-
ik tanpa memperhatikan kemaunpuannya. 3. Mengembangkan metoda untuk
menginduksi pemben
tukan metabolit sekunder. Dalam hal mendapatkan metabolit sekunder
dengan
teknik kultur jaringan agar mempunyai nilai ekonomis, maka
diperlukan beberapa kriteria yang harus dipe- nuhi (2 1) : 1.
Konsentrasi produk harus lebih besar dari tanam-
asalnya. 2. Bahan dasar tanaman utuh untuk isolasi sangat su-
ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga
18
kar diperoleh. 3* Produk biotransformasi dari bahan dasar yang
mu-
rah dan proses biotransformasi tidak dapat lewat cara kimia atau
mikroorganisme.
4* Untuk produksi senyawa kimia yang sukar sekali diperoleh pada
tanaman asalnya seperti interme- diet biosintesa, ensim-ensim
tertentu.
II. 6 Produksi diosgenin dari kultur jaringan Dioscorea Pada
umumnya tanaman jenis Dioscorea mengandung
diosgenin 4 - 3 % bo bothering (22). Kaul dan Staba pada tahun 1968
pertama kali mengisolasi diosgenin dari kultur kalus Dioscorea
deltoidea. Dihasilkan diosgenin dengan konsentrasi mendekati 1 %
bobot ke- ring. Dari penelitian lebih lanjut, kultur secara normal
tumbuh dalam kultur suspensi dengan adanya 2,4 D 1 mg/1. Sedang
tanpa 2,4 D setelah 11 minggu kandungan diosgenin berkurang sampai
sepertiga jum- lah normal* Dengan penambahan kolesterol produksi
diosgenin meningkat menjadi 2,3 % bobot kering (18, 19). Dari hasil
penelitian Rokem et. el. mengenai kultur jaringan Dioscorea
deltoidea dicapai kadar diosgenin 7,8 % bobot kering (6). Kultur
jaringan Dioscorea s.ylvatica mengandung diosgenin 1,2 % bobot
kering (11), Diosgenin juga telah diisolasi dari kul tur jaringan
D.composita. D. floribunda, D. tokoro D. sniculiflora (18)*
ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga
19
Dari kultur jaringan D. deltoidea dilaporkan biosintesa diosgenin
berlabel jika jaringan diberi 4 C1^ dan 26 kolesterol. Juga telah
diisolasi diosgenin radioaktif, yonogenin dan tokorogenin da ri
kultur kalus D. tokoro dengan pemberian sikloar- tenol radioaktif,
kolest-5-en,3 £,16 ,2 6 triol dan kolest-5-en,3 J5,16,22,26 tetrol
(18)..
Penelitian yang dilakukan Tjondronegoro dkk. terhadap beberapa
jenis Dioscorea. menunjukkan adanya diosgenin dari ekstrak kalus D.
bulbifera. D. hispida dan D. esculenta. Analisa kuantitatif dari
ekstrak kalus D. bulbifera pada media dengan penambahan NAA dan BAP
mempunyai kandungan diosgenin lebih tinggi (0 ,4 %) daripada dengan
2 ,4 D (0,2.%) (7). Tal dan Golberg melaporkan bahwa amonium dan
sitrat dibutuhkan untuk pertumbuhan dan pembentukan diosgenin.
Produksi diosgenin maksimum pada N yang tinggi. Pada konsentrasi NH
NO- 2,2 g/1 diperoleh 12,7 g. sel kering/liter. Jenis dan
konsentrasi gula juga menentukan kandungan diosgenin. Dengan
penambah an sukrosa 15 g/ 1 diperoleh 3,8 % diosgenin sesudah 21
hari dalam batch culture. Galaktosa pada konsen trasi 10 mg/ 1
menghasilkan diosgenin yang lebih tinggi dari penggunaan 30 rog/1
sukrosa (23)*
II.7 Tinjauan umun tanaman Dioscorea sp. II.7*1 Sistematika tanaman
Dioscorea sp. (24,25)
ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga
20
II.7
Divisi : Spermatophyta Anak divisi : Angiospermae K e 1 a s :
Monocotyledoneae Bangsa : Idliales S u k u : Dioscoreaceae M a. c g
a : Dioscorea J e a i s : Dioscorea sp.. Suku Dioscoreaceae dikenal
sebagai jenis ubi-ubian. Terdiri dari 10 marga yang terdi ri dari
lebih kurang 650 jenis, Tersebar lu- as di daerah tropik dan
subtropik. Tanaman Dioscorea di Indonesia terdapat lebih dari 40
jenis, baik yang sengaja ditanam atau tumbuh liar*
,2 Sifat-sifat tanaman Dioscorea (24»25j26,27) Habitus : herba
tahunan, tumbuh menjalar
atau membelit. Didalam tanah mem- bentuk tubera, satu atau banyak,
adakalanya tumbuh tubera di ke- tiak.
Batang : tumbuh dari tubera, membelit, kadang bersayap atau
berduri.
D a u n : tunggal kadang-kadang majemuk, berhadapan, berseling atau
ter sebar. Pada umumnya berbentuk jantung.
ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga
21
Bunga : beraturan* selalu berkelamin satu, berumah satu. Daun +.-
tenda bunga 6, dalam lingkar- an masing-masing 3 pada pang- kal
kerapkali melekat. Bunga jantan: benang sari 6, semua fertil atau
berkurang 3 men- jadi staminodia* Bunga beti- na: bakal buah
tenggelam, kerapkali beruang 3> bakal biji 2 per ruang, tangkai
pu- tik 1 bercabang 3*
B a a h : buah kotak atau buah buni de ngan 3 lobus, bersayap,
mem- buka pada waktu masak, biji 1 samjxai 2 tiap sel datar pa da
bagian atas atau meling- kar, beralbumin.
11.7*3 Kandungan Dioscorea sp. Kandungan tanaman Dioscorea sp.
sangat ber- variasi tergantung jenisnya. Tubera terutama mengandung
air 60 - 80 %, disamping karbohi- drat 23 protein 2 %, sejumlah
kecil vita min B, C, dan karoten. Selain itu tubera mengandung
senyawa glikosida saponin, sterol, tanin, trigliserida dan
komponen-komponen
ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga
22
asam fenolat. Diosgenin pada umumnya terda- pat pada tan am an
Dioscorea. Kandungan dios genin berbeda pada tiap organ tanaman.
Pa- iLittg-'banyak terdapat pada umbi, menyusul ba- gian dekat umbi
dan*'terns berkurang mender j kati pucuk batang (7,24*26).
ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga
23
111,1 Bahan III..1..1 Eksplan
Eksplan berasal dari daun Dioscorea hispida Dennst., Dioscorea
esculenta (Lour) Burk., Dioscorea batatas Decne yang diperoleh dari
Kebun Raya Purwodadi dan telah diketahui identitasnya, dan
Dioscorea pentaphvlla L.. yang diperoleh dari daerah Surabaya, yang
determinasinya telah dilakukan sesuai dengan buku Flora of Java
(25).-
111.1.2 Bahan kimia Bahan kimia yang digunakan adalah produksi E.
Merck Darmstadt dengan derajat " pro analisa M kecuali disebutkan
lain. Bahan pen- steril yang digunakan adalah Regular Klorox
mengandung 5*25 % Natrium hipoklorit, pro duksi The Clorox
Company, Oakland..
111.1.3 Agar Agar yang digunakan adalah agar batangan me- rek " AA
" yang diperoleh dari pasar Klojen, Malang.
111.1.4 Media Media yang digunakan adalah media standar
BAB III
24
Murashige-Skoog (Tabel 1) dengan penambah an zat pengatur tumbuh
pada berbagai kom- binasi konsentrasi (Tabel 2),
III-2 Alat Alat yang digunakan pada penelitian : - Laminar air flow
cabinet Pharmeq Lab..'' - Otoklaf 25 liter (American Portable
Autoclave WAF Co Inc.)
- pH meter Fisher - Monopan balance - Gelas beker - Cawan petri -
Erlenmeyer - Gelas ukur - Pipet volum - Pinset - Pisau scalpel -
Lampu spiritus - Botol bermulut lebar (diameter 3*5 cm, tinggi 7
cm. )
III.3 Cara kerja III.3-1 Sterilisasi alat
III.3.1.1 Alat gelas, alat logam dan alumi nium foil. Dimasukkan
ke dalam bungkus alumi-
ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga
25
nium f o i l kemudian di s t e r i l i s a s i
di dalam oven 160°C selama empat jam (9)..
111.3,1,2 Air suling Sterilisasi dilakukan di dalam otoklaf 121°c
selama 15 menit.
III.3.2 Pembuatan media Pembuatan media dilakukan sesuai dengan
meto- de Kurashige , Masing-masing komponen media dibuat larutan
stok dan dengan mencampur la- rutan-larutan stok diperoleh larutan
MS. pH media diatur + 5>7 dengan penambahan la rutan NaOH 0,1 N
atau HCl 0,1 N. Setelah di- tambah 1 % agar, larutan dituqng ke
dalam botol bermulut lebar sebanyak 25 ml. Botol ditutup rapat
dengan aluminium foil dan di- sterilkan dalam otoklaf 121°C,
tekanan 20 psi selama 15 menit.
III.3-3 Penanaman eksplan Daun Dioscorea sp. dicuci bersih dengan
air suling. Direndam dalam alkohol 90 % selama 2 menit, kemudian
disterilkan dalam larutan Klorox 30 % (mengandung Natrium
hipoklorit 1*575 %) selama 10 menit. Setelah dibilas tiga kali
dengan air suling steril bebas mi neral, eksplan dipotong pada
bagian tangkai
ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga
26
dekat pangkal helai daun + 5 mm, kemudian ditanam pada media. Semua
pekerjaan dilakukan dalam laminar air flow cabinet.
III.3.4 Pemindahan kultur kalus Botol kultur yang berisi kalus
dibuka tutup- nya kemudian mulut botol dibakar. Dengan meng-
gunakan scalpel steril, kalus dipindahkan ke dalam media baru.
Mulut botol dan tutup alu minium masing-masing dibakar, kemudian
botol ditutup rapat.
III.3*5 Pengamatan hasil III.-3*-3*l Pemeriksaan makroskopis
kalus
Pemeriksaan makroskopis kalus me- liputi : - warna - tekstur -
organogenesis
111.3.5.2 Pengamatan pertumbuhan kalus Parameter pertumbuhan kalus
dihya^- takan dengan Indeks Pertumbuhan (IP). Indeks Pertumbuhan
didefini- sikan sebagai :
Bobot basah kalus akhir IP = ---------------------- x 100
Bobot basah kalus awal Bobot basah kalus akhir ditentukan tiap
minggu dengan cara kalus di-
ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga
27
keluarkan dari botol kultur kemudi- an ditimbang. Bobot awal kalus
di peroleh dengan cara: B ~ B — Bav/ ” media + kalus “ media
111.3.5*3 Pengolahan data Dari data yang diperoleh d 'buat gra fik
log IP rata-rata terhadap waktu. Dengan menghitung persamaan
regresi yang dilakukan pada minggu I sampai dengan minggu II, dapat
diketahui waktu duplikasi (t ) dari kalus ya-
. itu dengan menggunakan (28): Persamaan regresi y = bx + a dimana:
y = log IP rata-rata
x = waktu b = slope
28
Komponen Jumlah (mg/1)
CaCl2. 2 H20 440 Mgso^. 7 h2o" 370 KH2P0if 170
KI 0,83 H,BO, 3 3 6,20
MnSO^. 4 H20 22,30 ZnSO^* 7 H20 8,60 Na2MoO^# 2 H20 0,25 CuSO^. 5
h2o 0,025 CoC12. 6 H20 0,025 FeSO .. 7 H20 27 ,,80 Na2EDTA. 2 H20
37,30 Mio-inositol 100 Asam nikotinat 0,50 Piridoksin HC1 0,50
Glisin 2 Thiamin KC1 0,10 Agar 10000 Sukrosa 30000
ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga
Tab.el 2. Rancangan kombinasi zat pengatur tumbuh untuk pembentukan
kalus Dioscorea sp
Ket: ZPT= Zat pengatur tumbuh ; KM= Kode media * Konsentrasi dalam
ppm.
ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga
30
eksplan Dioscorea sp.
D. hispida Daun Klorox 40 % 4 menit -
D. esculenta Daun Klorox 40 % 4 menit -
D. pentaphylla Daun Klorox 40 % 4 menit - D. hispida Daun Klorox 10
% 10 menit
kemudian Klorox 1 %
10 menit D. esculenta Daun - idem - -
D. pentaphvlla Daun - idem - - D. esculenta Daun Klorox 20 % 10
menit -
D. esculenta Daun Klorox 20 % + Tween 2 10 menit
3
D. esculenta Daun Klorox 20 % 20 menit - D. hispida Daun - idem - -
D. esculenta Daun HgCl2 10 ppm 10 menit -
D. hispida Daun - idem - -
D. batatas Daun Klorox 40 % 10 menit +
D. pentapnvlla Daun Klorox 40 % 10 menit +
ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga
31
IV.2 Pembentukan kalus Tabel 4* Pembentukan kalus dari eksplan
Dioscorea sp.
pada media MS dengan penambahan zat penga tur tumbuh
* - = tidak tumbuh + = tumbuh
32
Tabel 5. Waktu tumbuh kalus dari eksplan Dioscorea nentanhylla
L.
Kode media Waktu tumbuh (hari) Rata-rata I II III -IV- V
KD1 7 7 10 - 8 + 1 kd2 7 10 10 - - 9 + 1 KD^ 7 13 10 - - 10 + 1,7
kd6 7 10 - 10 - 9 + 1 KDg 7 13 13 - 13 11,5+ 1,5
KI1 16 13 - - 10 13 + 1,7
Tabel Waktu tumbuh kalus dari eksplan Dioscorea batatas Decne
Kode media Waktu tumbuh (hari) Rata-rataI II III IV V
KD^ - 9 - 12 .12 1 1 + 1 kd2 - - 8 8 7 7,7+ 9*3 KD^ - 9 12 - -
10,5+ 1,.5 KD6 12 9 - 12 - 1 1 + 1 KDa 14 14 13 13 14 13,6+
0,3
KI1 13 13 14 14 14 13,6+ 0,3
ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga
33
Dioscorea pentaphvlla L.
KDr coklat muda kompak terbentuk dan daun
tunas
tunas
tunas
34
1] * " a
Gambar 2. Terjadinya organogenesis pada kalus Dioscorea pentaphvlla
L«. pada media (A) KDlf (B) KD3
Tabel 8. Pemeriksaan makroskopis kalus Dioscorea batatas
Decne
Kode media Warna Tekstur Organogenesis
KD1 putih — coklat rapuh - kd2 putih — coklat rapuh - KD^ putih —
coklat rapuh - kd6 putih — coklat rapuh -
kd8 putih — * coklat rapuh -
KIi putih — * coklat rapuh -
ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga
35
* k'
L .
M
Gambar:3«- Kalus Dioscorea batatas J)ecae yang dita- nam pada media
(A) KDcj (B) KD« pada minggu ke IV ^ '
\ N ' c ; ! s v - 7 Jfc - „ V' *' '
* _______S v ^ ' ^ - - - ’ ^ A ^ i‘ 'r ^ ;
^ £ ' 1 * - V v \ '
* . 'V " V ' ' V fv' ,^ i* , v' \ - s, - * A' 1~ - v - ^ > - r ,
' / p . f ;
: Ym s.
Gambar 4. Sel-sel kalus Dioscorea pentaphvlla L* (pembesaran 50
x)
ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga
36
IV*4 Hasil perhitungan Tabel 9* Indeks Pertumbuhan (IP) kalus
Dioscorea pentaphvlla L*.
log In de ks Pe rt um bu ha n
3?
Waktu (hari)
Gambar 5. Grafik log Indeks Pertumbuhan rata-rata terhadap waktu
(hari) dari kalus Dioscorea pentaphvlla L..
ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga
38
Tabel 10.. Contoh perhitungan persamaan jregresi dari data Indeks
Pertumbuhan rata-rata dan wak tu (kalus Dioscorea pentaphvlla L.
pada media KD^)
n iVaktu IP log IP x2 y2 xy ^hit.X y
1. 7 119,38 2,0769 49 4,3133 14,3383 2,0284 2. 14 121,14 2,0833 196
4,3401 29,1662 2,1796 3. 21 239,10 2,3786 441 3,6377 49,9506
2,3308
I 42 6,5368 686 14,3113 93,6551 x 14 y 2,1796
42 . 6,5388 93,6551 -
Persamaan regresi : y = 0,0216x + 1,8772
Mb = 2,303
ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga
39
ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga
40
41
IP Kod^^^ medians.
KD5 109,-58 101,72 106,32
lug In de ks Pe rt um bu ha n
42
Waktu (hari)
Gambar 7. Grafik log Indeks Pertumbuhan rata-rata terhadap waktu
(hari) dari kalus Dioscorea batatas Decne
ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga
43-
(A )
KD
(B )
KD
umrnqum^jad s^apuj 9o*[
ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga
45-
Kode media Slope (hari)
kd8 0,0181 16., 62 KD10 0,0205 16,62
14 , 68
Kode media Slope ** (hari)
kd^ 0,0159 18,93 kd7 0,0146 20,62 KDg 0,0142 21,19 KD1q 0,0175
17,20
ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga
46
PEMBAHASAN
Proses sterilisasi pada jenis tanaman Dioscorea di- pengaruhi
beberapa faktor antara lain lokasi pengambilan bahan dan morfologi
dari bagian yang digunakan. Bahan yang diperoleh dari lapang
ternyata mempunyai tingkat kontami- nasi yang cukup tinggi. Adanya
bulu-bulu halus pada daun menyulitkan penetrasi bahan pensteril
seperti yang terja- di pada Dioscorea hispida Dennst dan Dioscorea
esculenta (Lour) Burk. Pada daun Dioscorea batatas Dedne tidak
terda- pat bulu sedangkan Dioscorea pentaphylla L. berbulu kaku dan
jarang, sehingga proses sterilisasi lebih mudah. Meski- pun
demikian diperlukan konsentrasi yang cukup tinggi dari bahan
pensteril (Klorox) yaitu 40 % dimana mengandung 2,1 % Natrium
hipoklorit. Seperti yang dilakukan Tjondro- negoro dkk. ternyata
tingkat kontaminasi dari bahan yang diperoleh dari lapang mencapai
80 - 9 0 dari kultur umbi. Oleh kareaanya penyimpanan tanaman dalam
rumah kaca di- anjurkan. untuk memperkecil terjadinya kontaminasi
(?) atau penggunaan biji sebagai bahan untuk inisiasi pembentukan
kalus akan mempermudah proses sterilisasi (29)*
Selanjutnya untuk pembentukan kalus digunakan eksplan daun
Dioscorea batatas Decne dan Dioscorea pentaphvlla L. Pembentukan
kalus pada kedua jenis Dioscorea ini cukup su^v; lit. Dari 25 macam
kombinasi zat pengatur tumbuh pada media
BAB V
47.
MS hanya 6 macam kombinasi yang berhasil yaitu : - MS + 0,5 ppm
kinetin + 1 ppm 2,4 D - MS + 1 ppm kinetin + 0,5 ppm 2,4 D - MS + 1
ppm kinetin + 1 ppm 2,.4 D - MS + 1,5 ppm kinetin + 2 ppm 2,4 D -
MS + 2 ppm kinetin + 1 ppm 2,4 D - MS + 2 ppm kinetin + 1 ppm IAA
Keberhasilan pembentukan kalus disamping dipengaruhi
adanya zat pengatur tumbuh juga dipengaruhi oleh asal eksplan
(organ yang digunakan), umur organ dan ukuran eksplan. Pada
Dioscorea pentaphylla L. potongan helai da un lebih mudah
membentuk kalus daripada tangkai daun. Se- dang pada Dioscorea
batatas Decne terbentuknya kalus dari helai dan tangkai daun sama
lambatnya. Kalus mulai tumbuh 7 - 1 4 hari setelah penanaman,
tetapi proses pertumbuhan selanjutnya sangat lambat. Pembentukan
kalus pada eksplan Dioscorea pentaphylla L.. diawali dengan
terjadinya pem- besaran massa, daun menggelembung dan menggulung.
Kalus berwarna coklat - coklat keputihan dan kompak. Pada Dioscorea
batatas Decne kalus tumbuh pada bagian yang ter- potong dari
eksplan, berwarna putih yang kemudian menjadi coklat dan friable.
Untuk mengatasi pertumbuhan kalus yang lambat, perlu dilakukan
optimasi media pertumbuhan untuk mendapatkan pertumbuhan kalus yang
optimal.
Browning terjadi pada kultur kalus Dioscorea pentaphylla L. satu
bulaa. setelah penanaman.
ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga
Skripsi PERCOBAAN INISIASI KALUS... Retno Sari
Media yang ditanami berwarna coklat, kadang ungu kebiru- an.
Browning terjadi karena oksidasi senyawa-senyawa fe- nolik akibat
adanya pelukaan karena pemotongan. Terben- tuknya senyawa ini
kemudian menyebar dan menurapuk dida- lam media sehingga warna
media menjadi coklat. Pada ke- adaan ini sukar•terbentuk kalus
karena senyawa fenolik yang menyebabkan browning menghambat
pertumbuhan, mau- pun proses pemhelahan dan perpanjangan sel. Untuk
menga- tasi gejala browning jnaka disarankan penaigbahan anti
ok-si-
dan antara-lain as'an* askorbat, sistein. Adanya variasi
konsentrasi zat pengatur tumbuh dan
asal eksplan mempengaruhi pertumbuhan kalus dan terjadi- nya
organogenesis. Pada media dengan konsentrasi zat pe ngatur tumbuh
(1) 0,5 ppm kinetin + 1 ppm 2,4 D, (2) 1 ppm kinetin + 1 ppm 2,4 D,
(3) 1 ppm kinetin + 0,5 ppm. 2,4 D terbentuk tunas dan daun dari
kalus 'Dioscorea pentaphvlla.- L. setelah + 3 bulan (84 hari).
Jumlah tunas mencapai 7 - 11 buah.
Kalus yang terbentuk setelah cukup besar baru disub- kulturkan.
Pengamatan terhadap pertumbuhan kalus dilaku kan dengan
penimbangan bobot basah kalus. Dari hasil per- hitungan Indeks
Pertumbuhan dibuat grafik log Indeks Per tumbuhan terhadap waktu.
Grafik log Indeks Pertumbuhan terhadap waktu menunjukkan bentuk
sigmoid. Fase eksponen- sial dimulai pada minggu kedua sampai
ketiga, kecuali pa da media KDg pertumbuhan kalus Dioscorea
pentaph.ylla L.
ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga
:49
sampai minggu keempat belum mencapai fase stationer, de- mikian
juga Dioscorea batatas Decne pada media KDr,.. De - ngan deraikian
subkultur sebaiknya dilakukan antara ming gu kedua dan ketiga
karena pada masa tersebut kecepatan pembentukan kalus
meningkat.
Dari perhitungan waktu duplikasi diketahui waktu du- plikasi kalus
dalam penelitian ini untuk Dioscorea pentaphvlla L. paling cepat
13s94 hari pada me dia KD^ (MS + 1 ppm kinetin + 2 ppm. 2,4 D).
Pada Dioscorea batatas Decne waktu duplikasi paling cepat pada
media KD^q (MS + 2 ppm kinetin + 2 ppm. 2*4 D) yaitu 17,20 hari.
Dari tabel 12 dan tabel 13 diketahui pertum buhan kalus Dioscorea
pentaphvlla L* lebih cepat daripa- da Dioscorea batatas
Decne*
ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga
50
Dari penelitian ini dapat disimpulkan: 1* Eksplan Dioscorea
esculenta (Lour) Burk, dan
Dioscorea hispida Dennst,. pada penelitian ini tidak ^
berhasil disterilkan, sedang eksplan Dioscorea batatas Decne dan
Dioscorea pentaphylla L. dengan penggunaan Klorox 40 % (mengandung
2,1 V> Natrium hipoklorit) diperoleh eksplan steril.
2. Media yang rc&npu menumbuhkan kalus dari eksplan Dioscorea
batatas Decne dan Dioscorea pentaphylla L. adalah: - MS + 0,5 ppni
kinetin + 1 ppm 2,4 D - MS + 1 ppm kinetin + 0,5 ppm 2,4 D - MS + 1
ppm kinetin + 1 ppm 2,4 D - MS + 2 ppm kinetin + 1 ppm 2,4 D - MS +
1,5 ppm kinetin + 2 ppm 2,4 D - KS + 2 ppm kinetin + 1 ppm
IAA
3. Adanya variasi konsentrasi zat pengatur tuvabuh, asal eksplan
dan ukuran eksplan mempengaruhi terjadinya or ganogenesis dan
pertumbuhan kalus. Dioscorea pentaphylla L. memperlihat^an
pembentukan tu nas dan daun pada media (1) MS + 1 ppm kinetin + 1
ppm 2,4 D (2) MS + 0,5 ppm kinetin + 1 ppm 2,4 D (3) + 1 ppm
kinetin + 0,5 ppm 2,4 D. Jumlah tunas antara 7 - 1 1 buah.
ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga
51
4.- Waktu duplikasi (t<j) paling cepat pada penelitian ini: -
Kalus Dioscorea pentaphvlla L. pada media KS + 1 ppm kinetin + 2
ppm 2,4 D yaitu 13,94 hari,
- Kalus Dioscorea batatas Decne pada media MS + 2 ppm kinetin + 2
ppm 2,4 D yaitu 17,20 hari.
ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga
52
Dengan mengetahui kemampuan pembentukan dan pertum buhan kalus
dari Dioscorea pentaphvlla L. dan Dioscorea batatas Decne pada
penelitian yang telah dilakukan perlu diadakan penelitian optimasi
media untuk mendapatkan pertumbuhan kalus yang optimal dan
dilakukan identifikasi kandungannya.
ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga
53
RINGKASAN
Dilakukan percobaan inisiasi kalus terhadap 4 jenis Dioscorea. Pada
proses sterilisasi daun Dioscorea hispida Dennst dan Dioscorea
esculenta (Lour) Burk dipengaruhi adanya bulu-bulu halus sehingga
menyuiitkan penetrasi dari bahan pensteril, disamping dipengaruhi
juga oleh faktor lokasi pengambilan tanaman. Untuk percobaan
selanjutnya di gunakan 2 jenis Dioscorea yang berhasil disterilkan
yaitu Dioscorea pentaphylla L. dan Dioscorea batatas Decne.
Pembentukan kalus dari kedua jenis Dioscorea yang digunakan terjadi
rata-rata 7 - 1 4 hari setelah penanaman eksplan pada media
Murashige - Skoog dengan penambahan zat pengatur tumbuh kinetin,
2,4 D dan IAA. Pertumbuhannya lambat dan pada Dioscorea pentaphylla
L. terjadi browning pada media. Organogenesis terjadi pada kalus
Dioscorea pentaphylla L. + 3 bulan setelah penanaman dengan
terbentuknya tunas dan daun.
Kurva pertumbuhan kalus dari k3dua jenis Dioscorea tersebut
berbentuk sigmoid dengan waktu duplikasi kalus antara 13 - 21
hari.
ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga
54
1. Laporan Analisa Data. Program Keluarga Berencana Nasi onal
Triwulan I Tahun 1985/1986* Badan Koordinasi Ke luarga Berencana
Nasional. p. 20.
2. Panjaitan, Sahala. dan Gandung Sujiantov 1986. Dampak Praktek
Peraakaian Kontrasepsi pada Tingkat Kelahiran.; Badan Koordinasi
Keluarga Berencana Nasional, Biro Ana lisa Pelaksanaan Program:
Jakarta, pp. 1,2.
3*- Hakim, A. dan S. Tatang, 1975* Prospek Alkaloid Solanum sebagai
Sumber Bahan Baku Kormon Steroid di Indonesia.; Simposium Tanaman
Obat ke 1. Bogor. pp. 105, 106.
4. Isnaeni. 1986. Optimasi Pembentukan Kalus dan Identi- fikasi
Steroid dari Solanum mammosum L. Tesis. Univer sitas Airlangga.
Surabaya, pp. 33-37*
5* Indrayanto, Gunawan. 1986. Prospek Kultur Jaringan Ta naman
pada Bidang Farraasi. Buletin ISFI Jatinu 1 7 , 12-13...
6. Rokem, J.S., B. Tal dan I. Goldberg. 1985* Methods for
Increasing Diosgenin Production by Dioscorea Cells in Suspension
Culture. Journal of Natural Products. 48. 210- 212, 220. . .
7* Tjondronegoro, P.D. et. al. 1986. Usaha Peningkatan Kadar
Diosgenin pada Dioscorea spp. dengan Cara Kultur In Vitro. Institut
Pertanian Bogor. pp. 42-47.
8. Heinstein, P. 1985* Journal of Natural Products. 48 1- 10.
9* Dodds, J*H. and L.7/. Roberts. 1982. Experiments in Plant Tissue
Culture..; Cambridge University Press: Cambridge, pp- 1-56
10. Thorpe, T.A. 1961. Plant Tissue Culture, Kethods ang
Application in Agriculture.; Academic Press; New York, pp.. 21-23,
36b.
DAFTAR PUSTAKA
55
11.. Narayanaswamy, S. 1977. Regeneration of Plants from Tissue
Culture.. In: Plant Cell,- Tissue, and Organ Culture, Chapter I..;
Springer - Verlag: Berlin, pp. 180-186.
12. Thomas, E. and M.R. Davey.. 1975- From Single Celle to Plants.;
Wykeham Publication Ltd: London, pp. 19-21, 56.
13* Puhan, Z. anc[ Martin S.M. 1975. The Industrial Poten- sial of
Plant Cell Culture.. Nat.. Res. Counc. of Canada 11595. pp. 15-19,
23,24-
14. Abidin, Zainal. 1985. Tentang Zat Pengatur Tumbuh.; Penerbit
Angkasa: Bandung, pp.. 14, 57-59*
15. Audus, L.J. 1953. Plant Growth Subtances.; Neill and Co. Ltd:
Edinburgh, p. 325.
16. Bhojwani, S.S. and M.K. Razdan. 1980. Plant Tissue Culture
Theory and Practise.; Elsevier, pp. 25-53.
17. Stohs, S.J. 1977. Metsbolisra of Steroid in Plant Tissue
Culture. In: Plant Tissue Culture and Its Biotechnological
Application..; Springer - Verlag: Berlin, pp. 7—11-
18. Khanha, Puspha. 1977. Tissue Culture and Useful Drug, A Review
on Twenty Plant Species Grown In Vitro. In: Cultivation and
Utilisation of Medicinal and Aromatic Plants.; Regional Research
Laboratory; Jammu-Tawi. pp. 495-499.
19. Stohs, S.J. and H. Rosenberg. 1975. Steroid and Steroid
Metabolism in Plant Tissue Culture. Lloydia. .3fi, 181-188.
20. Bohra, H. The Formation of Secondary Metabolite in Plant Tissue
and Cell Culture. International Review of Cytology. 3uppl. 11 B.
pp. 183-203.
ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga
56
21. Indrayanto, Gunawan. 1987. Produksi Metabolit Sekun der dengan
Teknik Kultur Jaringan Tanaman. Seminar Nasional Metabolit
Sekunder. PAU Teknologi - Univer- sitas Gajah Mada.- pp. 4-6.
22. Staba, E.J. 1977* Tissue Culture and Pharmacy. In: Plant Cell,
Tissue, and Organ Culture, Chapter VI.; Springer - Verlag: Berlin,
pp. 700-701.
23. Tal, B. and I. Goldberg. 1982. Growth and Diosgenin* Production
by Dioscorea deltoidea Cells in Batch and Continuous Cultures.
Planta Medica. 107--H0.*.'
24.- Heyne, K. 1950. De Nuttige Planten van Indonesia I, 3e Druk.;
N.V. Vitgeverij van Hoeve’s Gravenhage: Bandung, pp. if5
-Zf61.
25. Backer, WSc5. C.A. and R.C. Bhakhuizen van den Brink Jr. 1968.
Flora of Java, Vol. III.; Wolter Noordhoff N.V.: Groningen, pp.
154-155.
26. Claus, E.P. 1961. Pharmacognosy, 4th Edition.; Lea &
Febiger: Philadelphia, pp. 129-131> 134*
27. Van Steenis, C.G.G.J. et. al. 1975* Flora untuk Seko- lah di
Indonesia.; Penerbit Pradnya Paramita: Jakarta, pp. 160.161.
28. Mantell, S.H., J.A. Matthews and R. A. McKee. 1985. Principles
of Plant Biotechnology.; Blackwell Scientific. Publications:
Oxford, pp. 102-104.
29. Reinert, J. and M.M. Yeoman. 1982. Plant Cell & Tissue
Culture.; Springer - Verlag: Berlin., pp. 52-54.
ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga
57
LAMPIRAN DISKRIPSI TAKSONOMI
1* Dioscorea hispida Dennst* (Gambar lampiran 1) Tanaman ini di
Jawa dikenal dengan nama Gadung.
Merupakan tanaman yang banyak dikenal, tumbuh dengan baik secara
liar maupun sengaja ditanam. Biasanya terdi- ri dari 20 - 30 tuber
yang besar dengan disekitarnya ter- dapat tuber yang kecil,
sehingga tanah akan membengkak. Sebagai makanan, sukar
pengolahannya. Harus direndam dan dicuci berulang-ulang.
: perdu memanjat, tinggi mencapai 3 - 1 0 meter,
: berbentuk bulat, berbulu dan berduri, berwarna hijau kekuningan
dengan diame ter 9 mm. atau lebih.
: majemuk terdiri dari 3 anak daun, berbu lu.
: berbentuk bulat, kadang memanjang. Berat mencapai 35 kg. kadang
lebih. Kulitnya berwarna kekuning-kuningan sampai kelabu terang.
Dagingnya berwarna putih sampai kuning jeruk.
2. Dioscorea esculenta (Lour) Burk. (Gambar lampiran 2) Tanaman ini
dikenal dengan narna Gembili (Melayu,
Jawa), !luv:i butul (Sunda). Terraasuk jenis yang banyak
Habitus
Batang
Daun
Tubera
58
latang
Daun
Tubera
perdu meman.jat yang dapat mencapai tinggi 3 - 5 m. berbentuk
bulat, berbulu halus dan ber* duri tersebar diseluruh batang,
tunggal, berbentuk jantung, berbulu dan kadang terdapat duri pada
bulu-bu- lunya. berbentuk bulat sampai bulat panjang, berjumlah
banyak. Kulitnya berwarna coklat muda atau coklat kelabu dan ti
pis sehingga mudah terobek. Dagingnya berwarna putih, berasa
sedikit pahit pada bagian luar tetapi keseluruhannya mempunyai rasa
manis. Tuber dilindungi batang kecil berduri.
3. Dioscorea pentaphylla L. (Gambar lampiran 3) Tanaman ini
dimasukkan golongan setengah liar, ka
rena banyak ditemukan di hutan. Tubera dimakan dengan cara direbus
atau dibakar. r. abitus Batang
Daun
Tubera
: perdu memanjat mencapai 5 - 10 m. : bulat dan berbulu, diameter +
7 mm. Terdapat banyak bulbil.
: majemuk palmatus dengan anak daun 3, 5 atau 7, berbulu.
: tunggal berbentuk bulat panjang atau
ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga
59
menjari, diliputi akar yang berbulu. Dagingnya berwarna putih atau
kuning jeruk kadang terdapat bintik-bintik ungu.
k* Dioscorea batatas Decne (Gambar lampiran 4). Disebut juga
Chinese yam, Chinese po.tato, Cinnamon
vine. Habitus : tanaman memanjat, tinggi mencapai 3 - 8 m, Batang :
bulat, tidak berbulu. Daun : tunggal, dengan 7 - 9 tulang daun,
berben
tuk jantung membulat dan bercangap, li- cin*
Tubera : - Identitas tanaman ini tidak banyak diketahui. Bia-
sanya tumbuh di daerah tropis, umbinya dapat dimakan. Tanaman ini
sangat tahan terhadap cuaca.
Burkill, I.H. 1951. Dioscoreaceae. In: Flora Malesiana. Series I.
Volume 4- Noordhoff - Kolff N.V. Djakarta* PP. 293 - 335. Bailey,
L.H* The Standard Cyclopedia of Horticulture,. Volume I.; The
Macmillan Company: New York.p*. 1013
ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga
60 ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga
Skripsi PERCOBAAN INISIASI KALUS... Retno Sari
61
ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga
ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga
63
ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga
H as
il pe
ni m
ba ng
k :
H as
il pe
ni m
ba ng
«b ps ** rH o rH
-Vk -s? rs rH — < oCf\ r*'.#»o O o
-4- rN rH rH O IT\ r 'l if\
•ko O O
no •4- O'c\ rH vO »T\ •0 «n CV rH <v
c. t«o o o
CO 'v t O'st> U t •o n » CV rH i ' i
•i't © o
fd •> *H f°i
rH C\’ CV rH cv #» •k <Ao o O O o
*»t i UN CM v<\ U \ I c*~ vO O rH ^ [ rHH tv CM CV l-i
c> «v r. k e. O O O | O O
v£» u \ r~i | 00 mo» CO C - CO o U*\ CO ) o CM rH rH of * rH
rH
O * cT d‘ 1 •»O •ko
O rH
r. o
•sT IT\ •sf m, *>o O o o
«r\ «o tv o'
01 » O O O
O r-3 rH vJDo cv -4 - o-~w *•O rH o
— i o rHri Oi o CO "<
vf UPv «s *
3 O o
rHOvf C'J
Oi o lT\ vO •<- rHvO CO o o iA ONc- C4 ur\ rH C \ C'J cv CV CVC«
u •« «ko o o o o o *<i- vrv ON o rH CVCO f- - <n> vrv C***
rHCV CV C-- O \ 0rH 4.W H rH rHg» •t •ko o O O O o
CV rHvD
A •k •s O o o
ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga
gdlhub-gdl-s1-2013-sariretno-23565-1.halam-
gdlhub-gdl-s1-2013-sariretno-23565-2.kata-
gdlhub-gdl-s1-2013-sariretno-23565-3.dafta-
gdlhub-gdl-s1-2013-sariretno-23565-4.dafta-
gdlhub-gdl-s1-2013-sariretno-23565-5.dafta-
gdlhub-gdl-s1-2013-sariretno-23565-6.dafta-
gdlhub-gdl-s1-2013-sariretno-23565-7.babi-
gdlhub-gdl-s1-2013-sariretno-23565-8.babi-
gdlhub-gdl-s1-2013-sariretno-23565-9.babi-
gdlhub-gdl-s1-2013-sariretno-23565-10.bab-
gdlhub-gdl-s1-2013-sariretno-23565-11.bab-
gdlhub-gdl-s1-2013-sariretno-23565-12.bab-
gdlhub-gdl-s1-2013-sariretno-23565-13.bab-
gdlhub-gdl-s1-2013-sariretno-23565-14.ring-
gdlhub-gdl-s1-2013-sariretno-23565-15.daft-
gdlhub-gdl-s1-2013-sariretno-23565-16.lamp-