8/7/2019 LAporan enumerisasi
1/14
BAB I
PENDAHULUAN
1.1 Latar Belakang
Beratus-ratus spesies dapat menghuni bermacam-macam bagian tubuh kita,
termasuk mulut, saluran pencernaan, dan kulit baik sebagai flora normal atau bahkan
patogenik. Oleh karena sebab itu, farmasi dituntut untukmengembangkan penelitian pada
obat-obatan yang dapat menekan laju pertumbuhan mikroba-mikroba tersebut.
Contohnya, antibakteri, baik bakteriostatik maupun bakterisid dan antimikotika
baik itu fungisid atau fungistatik. Obat-obatan ini tidak saja bermanfaat langsung pada
manusia namun juga pada produk makanan, minuman, dan kosmetika. Sifat0sifat obat ini
dapat dimanfaatkan untuk mengawetkan produk-produk tersebut.
Kemampuan atau efektivitas pengawet sangat mempengaruhi stabilitas produk
obat, makanan, minuman atau kosmetika. Oleh sebab itu dibutuhkan evaluasi efektifitas
pengawet. Parameter evaluasinya adalah jumlah sel mikroba yang tersisa atau masih tetap
ada setelah pengawet bekerja. Muncul pertanyaan, bagaimana cara menghitung jumlah sel
mikroba ini ?
Berangkat dari hal inilah, praktikum Enumerasi Sel sebaiknya dipahami dengan
benar agar pertanyaan diatas dapat dijawab oleh calon-calon farmasis. Pengetahuan
mengenai cara enumerasi sel merupakan salah satu modal penunjang keterampilan
seorang farmasis.
1.2 Tujuan
Mahasiswa mengetahui dan dapat melakukan cara penghitungan mikroorganisme.
8/7/2019 LAporan enumerisasi
2/14
BAB II
TINJAUAN PUSTAKA
2.1 Definisi Pertumbuhan Mikroorganisme
Pertumbuhan mikroorganisme adalah pertambahan jumlah sel yang juga berarti
pertambahan jumlah organisme yang membentuk populasi atau suatu biakan. Para
mikroorganisme penambahan kualitas isi dan kandungan di dalam sel dapat berubah
langsung menjadi pertumbuhan populasi, sehingga karena terlalu cepat perubahannya,
sulit untuk diamati dan dibedakan (Waluyo, 2007).
2.2 Pengukuran Pertumbuhan Mikroorganisme
Hakikatnya, terdapat 2 macam pengukuran dasar yaitu penentuan jumlah sel dan
penentuan massa sel. Pengukuran jumlah sel biasanya dilakukan bagi organismebersel
tunggal (misalnya bakteri), sedangkan penentuan massa sel dapat dilakukan tidak hanya
bagi organisme bakteri tunggal tetapi juga organisme berfilamen (misalnya kapang)
(Hadioetomo, 1990).
2.2.1 Penetapan Jumlah Bakteri
a) Hitungan mikroskopik secara langsung
Pada metode ini, dihitung semua sel yang nampak,sehingga dengan
demikian sel-sel mati dan cacat ikut dihitung. Cara yang paling banyak
digunakan untuk penetapan jumlah sel total ialah penghitungan dengan
mikroskop sel-sel yang disebarkan dalam lapis tipis dalam bilik hitung (contoh
menurut Neubauer, Thoma, atau Petroff-Hauser) (Schlegel, 1994).
Metode Petroff-Hauser
Hitungan mikroskopik dilakukan dalam pertolongan kotak-kotak skala,
dimana dalam setiap ukuran skala seluas 1mm2 terdapat 25buah kotak besar
dengan luas 0,04 mm2, dan setiap kotak besar terdiri dari 16 kotak-kotak kecil.
Tinggi sampel yang terletak di antara kaca benda dan kaca penutup adalah 0,02
mm. Jumlah sel dalam beberapa kotak besar dapat dihitung, kemudian dihitung
jumlah sel rata-rata dalam kotak besar. Jumlah sel per ml sampel dapat dihitung
sebagai berikut (Waluyo, 2007) :
8/7/2019 LAporan enumerisasi
3/14
Jumlah sel/ml sampel = Jumlah sel/kotak besar x 25 kotak x 1/0,02 x 103
Jumlah sel/mm2
Jumlah sel/mm3
Jumlah sel/cm(ml)3
Jumlah sel per ml sampel = Jumlah sel per kotak besar x 253 x 50 x 10
Jumlah sel per ml sampel = Jumlah sel per kotak besar x 1,25 x 106
b) Hitungan Cawan
Prinsip dari metode ini adalah bila sel mikroba yang masih hidup
ditumbuhkan pada medium, maka mikroba tersebut akan berkembang biak dan
membentuk koloni yang dapat dilihat langsung dan kemudian dihitung tanpa
menggunakan mikroskop (Waluyo, 2007).
Metode hitungan cawan dibedakan atas dua cara, yakni metode tuang
(pour plate) dan metode permukaan (surface / spread plate). Jumlah kolonidalam
sampel dapat dihitung sebagai berikut (Waluyo, 2007) :
c) Metode MPN (Most Probable Number)
Pada metode MPN digunakan medium cair di dalam tabung reaksi.
Perhitungan MPN berdasarkan pada jumlah tabung reaksi yang positif, yakni
yang ditumbuhi oleh mikroba setelah inkubasi pada suhu dan waktu tertentu
(Waluyo, 2007).
Metode MPN sering digunakan dalam pengamatan untuk menghitung
jumlah bakteri yang terdapat di dalam tanah seperti Nitrosomonas dan
Nitrobacter. Kedua jenis bakteri ini memegang peranan penting dalam
meningkatkan pertumbuhan dan produksi tanaman, sehubungan dengan
kemampuannya dalam mengikat N2 dari udara dan mengubah amonium menjadi
nitrat (Sutedjo, 1991).
Koloni per ml atau per gram = Jumlah koloni per cawan x 1
Faktor Pengenceran
8/7/2019 LAporan enumerisasi
4/14
2.2.2 Perhitungan Massa Sel Secara Tidak Langsung
Perhitungan ini terdiri dari analisa komponen sel dan produk katabolisme.
Perhitungan massa sel secara tidak langsung sering digunakan dalam mengamati
pertumbuhan sel selama proses fermentasi, dimana komponen substrat atau bahan
yang difermentasi dapat diamati dan diukur (Waluto, 2007).
Metode pengukuran ini dipakai jika metode lain tidak dapat digunakan,
misalnya pada kerapatan sel yang amat rendah (Schlegel, 1994).
2.2.3 Perhitungan Massa Sel Secara Langsung
Metode ini terdiri dari cara volumetrik, gravimetrik, dan turbidimetrik.
Metode volumetrik dan gravimetrik,pengukuran volume dan berat sel dilakukan
terlebih dahulu dengan menyaring mikroorganisme tersebut (Waluyo, 2007).
8/7/2019 LAporan enumerisasi
5/14
BAB III
METODE PERCOBAAN
3.1 Alat dan Bahan
3.1.1 Alat
Alat-alat yang digunakan dalam percobaan ini adalah :
a. Cawan petri f. Pembakar bunsen
b. Counter g. Petroff-Hauser Counting Chamber
c. Cover glass h. Pipet ukur
d. Jarum inokulum i. Tabung reaksi
e. Mikroskop
3.1.2 Bahan
Bahan-bahan yang digunakan dalam percobaan ini adalah :
a. Alkohol
b. Aquadest steril
c. Bakteri / jamur
d. Tissue
3.2 Prosedur Kerja
3.2.1 Perhitungan langsung (dengan kotak sedang)
Petroff-Hauser Counting Chamber
-dibersihkan dengan alkohol 70%
-dikeringkan dengan tissue
-diletakkan cover glass di atasnya
-ditambahkan 50L suspensi sel mikroba
pada parit kaca counting chamber
-dibiarkan sejenak hingga sel diam
Counting Chamber + Sel Mikoba
-diletakkan di meja benda mikroskop
-dicari fokusnya pada perbasaran 40x10
-dilakukan perhitungan kasar (koloni harus :30-300) untuk menentukan perlu atau
8/7/2019 LAporan enumerisasi
6/14
tidaknya pengenceran
-dihitung sampel paling tidak sebanyak 5 kotak
sedang
Hasil (Jumlah sel/ml samapel)
3.2.2 Perhitungan tidak langsung
Suspensi bakteri
-diencerkan tiga tingkat 10-6 ,10-9 ,10-8 dengan
aquadest steril
-ditanam dengan metode tuang masing-masing
pengenceran dalam 3 cawan petri
3 cawan petri/ media tanaman-diinkubasi pada suhu 30c selama 24-48 jam
-diamati dan dihitung jumlah koloni yang
tumbuh dari setiap pengenceran
-dipilih cawan petri yang sesui untuk total plate
count (koloni : 30-300)
-ditentukan jumlah mikroorganisme/ml sampel
Hasil = Jumlah mikroorganisme/ml sampel
BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN
8/7/2019 LAporan enumerisasi
7/14
4.1 Hasil
4.1.1 Total Plate Count
Tingkat pengenceran = 10-3 atau 1000 kali
4.1.2 Mikroskop Langsung
Isolat = Bakteri air, NA P2
Banyakna sel terhitung = 503
4.2 Pembahasan
4.2.1 Total Plate Count
Jumlah koloni yang muncul pada cawan petridish merupakan suatu moleks
bagi jumlah organisme yang dapat hidup yang terkandung dalam sampel. Inti dalam
perhitungan jumlah koloni dengan metode ini adalah pengenceran dan pencawanan
sampel dengan teliti. Pengenceran dilakukan agar jumlah koloni dalam bakteri
sesuai (tidak terlalu padat ataupun jarang), yakni memenuhi syarat 30-300 koloni per
cawan.
Metode hitungan cawan yang praktikan gunakan adalah metode tuang (pour
plate), dalam metode ini ditamakan 1 ml sampel dengan faktor pengenceran 10
-3
dalam 15 ml media NA. Cawan lebih baik dihitung jumlah koloninya dengan
bantuan colony counter daripada cara manual , agar hasil perhitungan lebih akurat.
Koloni dihitung dengan ketentuan : beberapa koloni yang bergabung menjadi
kumpulan koloni besar dihitung sebagai satu koloni dan satu deretan rantai koloni
yang terlihat sebagai suatu garis tebal dihitung sebagai satu koloni
Bantuan dari colony counter ini dapat diperoleh jumlah koloni sampel air
yang memenuhi syarat 30-300 jumlah koloni, sementara sampel tanah lebih dari 300
koloni. Hal ini dapat disebabkan variasi atau tingkat pengenceran yang hanya 1 jenis
yakni 10-3. Padahal seharusnya dibuat tingkat pengenceran lainnya agar dapat dipilih
Media Jumlah Koloni
Sampel air NA P1
Sampel air NA P2
Sampel tanah NA P1
Sampel tanah NA P2
81
158
337
467
8/7/2019 LAporan enumerisasi
8/14
cawan dengan jumlah koloni paling ideal. Meskipun hal ini telah berusaha
diantisipasi dengan duplo cawan, tetap saja kesalahan ini terjadi.
Jumlah koloni yang lebih dari 300 menandakan pengenceran 10 -3 atau 100
kali terlalu rendah untuk sampel tanah. Seandainya sampel ditanamkan dengan
beberapa tingkat pengenceran, akan dapat diperoleh jumlah koloni yang ideal dalam
tingkat pengenceran yang baik.
Sampel pada percobaan ini dilakukan duplo. Artinya untuk melaporkan CFU
atau jumlah satuan pembentuk koloni, data harus diambil dari kedua cawan. Jumlah
koloni dalam sampel dilaporkan dengan menentukan nilai perbandingan CFU/ml
sampel yang tertinggi terhadap yang terendah. Apabila hasil perbandingan kurang
dari sama dengan 2, untuk CFU/ml diambil dari rata-rata kedua cawan, sementara
bila hasil perbandingan lebih dari 2, dilaporkan hanya yang terkecil.
Cawan 1 maupun cawan 2 pada sampel tanah memiliki jumlah koloni lebih
dari 300, sehingga CFU/ml dihitung dan dilaporkan sebagai 300.000 (faktor
pengenceran 1000 kali) CFU/ml dengan tetap menyertakan jumlah yang sebenarnya
dalam tanda kurung.
Akan tetapi, perbedaan jumlah koloni yang terhitung dalam cawan duplo
harus diperhitungkan atau dipertimbangkan dengan cermat. Hal ini disebabkan
jumlah sel yang berdekatan dan teramati seolah-olah sebagai satu koloni seringkali
mengurangi jumlah organisme yang sebenarnya. Selain itu, pada cawan 1 dan 2
(duplo) seringkali menjadi kurang terkait / berhubungan karena begitu sampel
ditanamkan pada medium dan kondisi inkubasi yang berbeda, jumlah sel yang
dihasilkan pun berbeda. Meskipun demikian, metode ini masih disukai sebab
kesalahan penghitungan jumlah sel karena keterlibatan sel mati dapat diabaikan.
Koloni yang terlihat oleh mata telanjang hanyalah sel hidup.
4.2.2 Mikroskop Langsung
Penghitungan jumlah sel dengan metode mikroskopis dilakukan dengan
bantuan bilik hitung Petroff-Hauser (Hemositometer). Hemositometer terdiri dari 9
kotak besar yang masing-masing luasnya 1 mm2.
8/7/2019 LAporan enumerisasi
9/14
Daerah bidang hitung di bawah mikroskop
Perhitungan dilakukan pada 5 daerah hitung diatas. Dibawah mikroskop
terlihat titik-titik kecil pada daerah hitung tersebut. Titik kecil ini bisa jadi adalah sel
hidup saja atau bahkan sel hidup dan sel mati. Jadi memang pada metode ini terdapat
kelemahan dimana sel hidup dan sel mati sulit dibedakan. Pengamatan oleh
praktikan menunjukkan sel-sel yang terpisah dengan baik. Apabilasel bergerombol,
cara mengatasinya adalah dengan menambahkan Na.EDTA dan Tween 80 0,1%
untuk meneceraiberaikan sel-sel tersebut.
Oleh karena perhitungan dilakukan pada 5 kotak sedang, maka setiap kotak
sedang terdiri dari 16 kotak kecil, maka jumlah sel terhitung dibagi 80(16x5), utnutk
mendapatkan rata-rata jumlah sel per kotak kecil. Karena jumlah sel yang ingindiketahui adalah jumlah sel per mm3, maka rata-rata jumlah tersebut dibagi volume 1
kotak kecil yakni luas x tinggi kotak kecil ( 1/400 mm2 x 1/10mm ). Dan karena sampel
yang dihitung sebenarnya merupakan pengenceran 1000 kali, maka untuk mencari
jumlah sel yang sebenarnya harus dikali 1000. Berdasarkan penjelasan di atas
diperoleh persamaan :
1mm
Daerah
hitung
= Rata-rata sel x pengenceran
Volume kotak kecil
8/7/2019 LAporan enumerisasi
10/14
= ( Jumlah sel terhitung/80 ) x 1000
Luas x tinggi
= ( Jumlah sel terhitung/80 ) x 1000
1/400 mm2 x 1/10mm
= Jumlah sel terhitung x 400 x 10 x 1000
80 x mm3
8/7/2019 LAporan enumerisasi
11/14
BAB V
PENUTUP
5.1 Kesimpulan
Cara perhitungan jumlah sel dapat dilakukan dengan hitungan mikroskopik (secara
langsung) dan hitungan cawan (Total Plate Count). Berdasarkan metode TPC diperoleh
1,25x105 CFU/ml untuk sampel bakteri air dan 3,0x105 CFU/ml untuk sampel bakteri
tanah. Sedangkan untuk metode mikroskopis diperoleh 32,5x107 sel/ml untuk bakteri air
pada media NA. Pengenceran yang dilakukan pada praktikum ini adalah 10-3 dan masih
terlalu rendah untuk sampel bakteri tanah.
5.2 Saran
Penanaman sampel mikrobasebaiknya dilakukan dalam paling sedikit tiga tingkat
pengenceran dan penggunaan colony counter ataupuncounter elektronis sangat dianjurkan
untuk menghindari kesalahan matematis dalam penghitungan jumlah sel.
8/7/2019 LAporan enumerisasi
12/14
DAFTAR PUSTAKA
Hadioetomo, Ratna Sri. 1990. Mikrobiologi Dasar dalam Praktek. Jakarta : PT Gramedia
Pustaka Utama.
Schlegel, Hans G. 1994. Mikrobiologi Umum. Edisi Keenam. Yogyakarta : UGM Press.
Sutedjo. 1991. Mikrobiologi Tanah. Jakarta : Rineka Cipta.
Waluyo, Lus. 2007. Mikrobiologi Umum. Malang : UMM Press.
8/7/2019 LAporan enumerisasi
13/14
LAMPIRAN
Metode Perhitungan :
a) Total Plate Count
Jumlah mikroorganisme = Jumlah koloni terhitung x 1 CFU/ml
Pengenceran
b) Mikroskopis Langsung
Jumlah sel = Banyaknya sel terhitung x 4000 x pengenceran sel/ml
80
Analisa Data :
a) Total Plate Count
a.1 Sampel air NA P1
Koloni / ml = 81 x 1/10-3 CFU/ml = 81.000 CFU/ml
a.2 Sampel air NA P2
Koloni / ml = 158 x 1/10-3
CFU/ml = 158.000 CFU/ml
Perbandingan :
Koloni / ml NA P2 158.000 CFU/ml
Koloni / ml NA P1 81.000 CFU/ml
Nilai perbandingan hasil tertinggi dan terendah dari cawan duplo < 2, maka jumlah
koloni air pada media NA adalah rata-rata P1 dan P2 :
NA P1 + NA P2 81.000 + 158.000 CFU/ml = 1,2 x 105 CFU/ml
2 2
a.3 Sampel tanah NA P1
Koloni / ml = 337 x 1/10-3 CFU/ml = 337.000 CFU/ml
dilaporkan : 3,0 x 10
5
CFU/ml ( 3,4 x 10
5
CFU/ml )
a.4 Sampel tanah NA P2
= = 1,95
= = 119.500
8/7/2019 LAporan enumerisasi
14/14
Koloni / ml = 467 x 1/10-3 CFU/ml = 467.000 CFU/ml
dilaporkan : 3,0 x 105 CFU/ml ( 4,7 x 105 CFU/ml )
Perbandingan :
Koloni / ml NA P2 3,0 x 105 CFU/ml
Koloni / ml NA P1 3,0 x 105 CFU/ml
Hasil perbandingan < 2, sehingga jumlah koloni bakteri tanah pada media NA
adalah rata-rata P1 dan P2 :
NA P1 + NA P2 300.000 + 300.000
2 2
b) Mikroskop Langsung
Jumlah sel bakteri air pada NA P2 = 503 / 80 x 4000 x 10-3
= 2,515 x 107 sel/ml
= 2,5 x 107 sel/ml
= = 1
= = 300.000 = 3,0 x 105 CFU/ml
Top Related