1
1
Penurunan produksi enzim eksoprotease aeromonas hydrophila oleh ekstrak
buah tomat
(lycopersicon esculentum mill.)
Skripsi
Untuk memenuhi sebagian persyaratan
guna mencapai derajat Sarjana Sains
Oleh :
Nur Aini
NIM. M.0402040
JURUSAN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
UNIVERSITAS SEBELAS MARET
SURAKARTA
2006
2
2
PENGESAHAN
SKRIPSI PENURUNAN PRODUKSI ENZIM EKSOPROTEASE
Aeromonas hydrophila OLEH EKSTRAK BUAH TOMAT (Lycopersicon esculentum Mill.)
Oleh :
Nur Aini NIM. M0402040
telah dipertahankan di depan Tim Penguji pada tanggal 24 Agustus 2006
dan dinyatakan telah memenuhi syarat
Surakarta,
Penguji III/Pembimbing I Penguji I Prof. Drs. Sutarno, M.Sc.Ph.D Dra. Ratna Setyaningsih, M. Si. NIP. 131 649 948 NIP. 132 240 377 Penguji IV/Pembimbing II Penguji II Ari Susilowati, M. Si. Solichatun, M. Si. NIP. 132 169 255 NIP. 132 162 554
Mengesahkan : Dekan F MIPA Ketua Jurusan Biologi Drs. Marsusi, M. S. Drs. Wiryanto, M. Si. NIP. 130 906 776 NIP. 131 124 613
3
3
PERNYATAAN
Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi ini adalah hasil penelitian saya sendiri
dan tidak terdapat karya yang pernah diajukan untuk memperoleh gelar
kesarjanaan di suatu perguruan tinggi, serta tidak terdapat karya atau pendapat
yang pernah ditulis atau diterbitkan oleh orang lain, kecuali yang secara tertulis
diacu dalam naskah ini dan disebutkan dalam daftar pustaka.
Apabila di kemudian hari dapat ditemukan adanya unsur penjiplakan maka gelar
kesarjanaan yang diperoleh dapat ditinjau dan atau dicabut.
Surakarta, Agustus 2006
Nur Aini NIM. M0402040
4
4
ABSTRAK
Nur Aini. 2006. PENURUNAN PRODUKSI ENZIM EKSOPROTEASE Aeromonas hydrophila OLEH EKSTRAK BUAH TOMAT (Lycopersicon esculentum Mill.). Jurusan Biologi. F.MIPA. UNS Aeromonas hydrophila bersifat patogen pada ikan. Salah satu faktor virulensinya adalah enzim eksoprotease. Produksi enzim eksoprotease diatur oleh sistem quorum sensing. Sistem quorum sensing ini merupakan sistem komunikasi interseluler bakteri dengan menggunakan molekul sinyal C4-HSL. Produksi enzim eksoprotease A. hydrophila dapat dihambat dengan menggunakan senyawa penghambat sistem quorum sensing. Penghambatan quorum sensing A. hydrophila dapat dilakukan oleh senyawa yang analog dengan molekul sinyal C4-HSL. Pada penelitian ini, senyawa yang diduga mampu menghambat quorum sensing sebagai analog molekul sinyal C4-HSL adalah senyawa furanon dari buah tomat. Penghambatan quorum sensing dapat diketahui dengan menurunnya produksi enzim eksoprotease A. hydrophila, sehingga penelitian ini bertujuan untuk mengetahui adanya penurunan produksi enzim eksoprotease A. hydrophila setelah perlakuan ekstrak n heksan, etil asetat, dan metanol buah tomat dengan variasi konsentrasi 0%, 2%, 4%, 6% dan 8%. Hasil pengujian produksi enzim eksoprotease secara kualitatif menunjukkan bahwa ektrak n-hexan buah tomat tidak menghambat pertumbuhan dan produksi enzim eksoprotease A. hydrophila. Ekstrak etil asetat buah tomat sebesar 4% menghambat produksi enzim eksoprotease tetapi mempengaruhi pertumbuhannya. Sedangkan ekstrak metanol buah tomat sebesar 4% menghambat produksi enzim eksoprotease tanpa mempengaruhi pertumbuhannya. Secara kuantitatif ekstrak metanol buah tomat sebesar 4% mampu menurunkan produksi enzim eksoprotease A. hydrophila sebesar 71,68% tanpa menghambat pertumbuhannya. Kata Kunci : penurunan, produksi enzim eksoprotease, Aeromonas hydrophila,
quorum sensing, buah tomat
5
5
ABSTRACT
Nur Aini. 2006. REDUCTION OF EXOPROTEASE PRODUCTION IN Aeromonas hydrophila by TOMATO FRUITS EXTRACT (Lycopersicon esculentum Mill.). Department of Biology. Faculty of Mathematic and Natural Science. Sebelas Maret University Aeromonas hydrophila is pathogenic bacteria in fish. One of it’s virulence factors is exoprotease. The production of exoprotease is controlled by quorum sensing system. Quorum sensing is an intercelluler communication of bacteria that use signal molecules C4-HSL. The A. hydrophila exoprotease production can be blocked using quorum sensing inhibitors. The inhibition of A. hydrophila quorum sensing can be done by C4-HSL analogs molecules. In this research, molecules that was predicted as quorum sensing inhibitors that act as C4-HSL analog molecules was furanon from tomato fruits. The inhibition of A. hydrophila quorum sensing could be shown by reduction of exoprotease production. The aim of this research was to know the reduction of A. hydrophila exoprotease production by extract n heksan, etil asetat, and metanol of tomato fruits with concentration 0%, 2%, 4%, 6%, and 8% respectively. The qualitative exoprotease assay result showed that the n-hexan extract of tomato had no effect on growth and exoprotease production of A. hydrophila. 4% ethyl acetate extract of tomato could inhibit exoprotease production, but affecting A. hydrophilla growth. While 4% methanol extract of tomato could inhibit exoprotease production, without affecting A. hydrophilla growth. Quantitative exoprotease assay showed that the 4% of methanol extract could inhibit exoprotease production 71,68% without affect growth of A. hydrophila. Keywords : reduction, exoprotease production, Aeromonas hydrophila,
quorum sensing, tomato fruits
6
6
MOTTO
“Jarak antara masalah dan solusi adalah sejauh jarak antara lutut dengan lantai untuk bersujud”
****
“Perhatikanlah orang yang mendapat nikmat lebih rendah daripada selalu memperhatikan orang
yang mendapat nikmat lebih tinggi dari kalian, maka demikian itu sungguh akan membuat kalian
tidak meremehkan karunia nikmat Alloh atas kalian” (Hadists)
****
PERSEMBAHAN
Karya ini kupersembahkan kepada :
7
7
v Kedua orang tuaku, hanyalah Alloh yang mampu membalas semua
pengorbananmu
v Adik beserta keluargaku
v Teman dan Saudara yang selalu menyertai langkah-langkahku
v Almamaterku
KATA PENGANTAR
8
8
Aeromonas hydrophila menyebabkan penyakit Motile Aeromonads
Septicemia (MAS) pada ikan. Pada umumnya penanggulangan penyakit MAS ini
masih bertumpu pada penggunaan antibiotik yang akan membunuh bakteri A.
hydrophila, namun ternyata timbul dampak negatif yaitu meluasnya resistensi
bakteri terhadap senyawa antibiotik, sehingga penggunaan antibiotik ini menjadi
kurang efektif.
Adanya penemuan bahwa faktor virulensi bakteri ternyata diatur oleh
sistem quorum sensing memberikan alternatif baru untuk mengatasi penyakit
infeksi bakteri yaitu dengan cara menghambat sistem quorum sensing bakteri ini.
Faktor virulensi A. hydrophila yang berupa produksi enzim eksoprotease juga
diatur oleh quorum sensing dengan molekul sinyal C4-HSL (N-Butanoyl-L-
Homoserine Lactones), sehingga penghambatan produksi enzim eksoprotease
dapat dilakukan dengan menghambat sistem quorum sensing_nya.
Penghambatan sistem quorum sensing dapat dilakukan oleh senyawa yang
analog dengan molekul sinyal C4-HSL. Salah satunya adalah senyawa furanon
dalam buah tomat. Penelitian ini berjudul Penurunan Produksi Enzim
Eksoprotease Aeromonas hydrophila Oleh Ekstrak Buah Tomat (L. esculentum
Mill.). Tujuan dari penelitian ini adalah untuk mengetahui adanya penurunan
produksi enzim eksoprotease A. hydrophila oleh ekstrak buah tomat.
DAFTAR ISI
Halaman HALAMAN JUDUL ...................................................................................... i
HALAMAN PERSETUJUAN ....................................................................... ii
9
9
HALAMAN PERNYATAAN ....................................................................... iii
ABSTRAK ..................................................................................................... iv
ABSTRACT ................................................................................................... v
MOTTO ......................................................................................................... vi
HALAMAN PERSEMBAHAN .................................................................... vii
KATA PENGANTAR ................................................................................... viii
DAFTAR ISI .................................................................................................. ix
DAFTAR TABEL .......................................................................................... xi
DAFTAR GAMBAR ..................................................................................... xii
DAFTAR LAMPIRAN .................................................................................. xiii
BAB I. PENDAHULUAN ............................................................................. 1
A. Latar Belakang Masalah ............................................................... 1
B. Perumusan Masalah ..................................................................... 3
C. Tujuan Penelitian .......................................................................... 3
D. Manfaat Penelitian ....................................................................... 4
BAB II. LANDASAN TEORI
A. Tinjauan Pustaka .......................................................................... 5
B. Kerangka Pemikiran .................................................................... 18
C. Hipotesis ....................................................................................... 20
BAB III. METODE PENELITIAN
A. Waktu dan Tempat Penelitian ................................................... 21
B. Alat dan Bahan .......................................................................... 21
C. Cara Kerja ................................................................................. 22
D. Analisis Data ............................................................................. 27
BAB IV. HASIL DAN PEMBAHASAN
A. Kepadatan A. hydrophila yang Memenuhi Quorum Sensing..... 28
B. Produksi Enzim Eksoprotease A. hydrophila Secara Kualitatif. 29
C. Pertumbuhan A. hydrophila Pada Perlakuan Ekstrak Buah Tomat
(L. esculentum Mill.) .................................................................. 43
D. Penurunan Produksi Enzim Eksoprotease A. hydrophila Secara
Kuantitatif .................................................................................. 45
10
10
BABV. KESIMPULAN DAN SARAN
A. Kesimpulan .................................................................................. 50
B. Saran ............................................................................................. 50
DAFTAR PUSTAKA .................................................................................... 51
LAMPIRAN ................................................................................................... 56
HALAMAN UCAPAN TERIMA KASIH .................................................... 57
RIWAYAT HIDUP PENULIS ...................................................................... 59
DAFTAR TABEL
Tabel 1. Nilai OD dan jumlah bakteri A. hydrophila pada hitungan
cawan………………………………………………………
28
11
11
Tabel 2. Diameter koloni dan luas zona bening pada perlakuan ekstrak
n-heksan buah tomat (L. esculentum Mill.) …………………
33
Tabel 3. Diameter koloni dan luas zona bening pada perlakuan ekstrak
etil asetat buah tomat (L. esculentum Mill.) ………………….
36
Tabel 4. Diameter koloni dan luas zona bening pada perlakuan ekstrak
metanol buah tomat (L. esculentum Mill.) …………………
41
DAFTAR GAMBAR
Halaman
Gambar 1. Sistem quorum sensing oligopeptida pada bakteri gram positif ………………………………………………………….
9
12
12
Gambar 2. Sistem quorum-sensing Lux IR pada bakteri gram negatif…………………………………………………………..
10
Gambar 3. Struktur furaneol………………………………………………. 16
Gambar 4. Struktur C4-HSL………………………………………………. 17
Gambar 5. Gambar 6. Gambar 7.
Struktur halogen furanon dari Delisea pulchra ……………… Kerangka pemikiran………………………………………….. Kurva standar A. hydrophila…………….………………….
17 19 29
Gambar 8.
Gambar 9.
Produksi enzim eksoprotease A. hydrophila pada perlakuan
ekstrak n heksan buah tomat (L. esculentum
Mill.)………………………………………………………….
Produksi enzim eksoprotease A. hydrophila pada perlakuan
ekstrak etil asetat buah tomat (L. esculentum
Mill.)………………………………………………………….
32
35
Gambar10. Produksi enzim eksoprotease A. hydrophila pada perlakuan
ekstrak metanol buah tomat (L. esculentum Mill.)
39
Gambar 11. Kurva pertumbuhan A. hydrophila…………………………… 44
Gambar 12. Kurva produksi enzim eksoprotease A. hydrophila ................. 47
Gambar 13.
Histogram produksi enzim eksoprotease A. hydrophila pada
jam ke-4……………………………………………………..
48
DAFTAR LAMPIRAN
Halaman
Lampiran 1. Komposisi Media………………………………………….. 56
13
13
BAB I
PENDAHULUAN
14
14
A. Latar Belakang Masalah
Aeromonas hydrophila yang ditemukan paling banyak di perairan air tawar
bersifat patogen terhadap ikan, dan hampir semua ikan air tawar rentan terhadap
serangan bakteri ini (Noga, 1995). Aeromonas hydrophila menyebabkan penyakit
Motile Aeromonad Septicemia (MAS) (Fryer and Bartholomew, 1996). Di Jawa
bakteri ini secara luas menyebabkan kematian ikan budidaya, yang dilaporkan
pertama kali tahun 1980 dan mengakibatkan kerugian sangat besar dalam
perikanan air tawar (Afrianto dan Liviawati, 1992). Oleh sebab itu, perlu adanya
tindakan penanganan yang efektif untuk mengatasi patogenisitas dari A.
hydrophila.
Aeromonas hydrophila mampu menghasilkan endotoksin dan produk
ekstraseluler seperti hemolisin, sitotoksin, enterotoksin, leukosidin, dan protease
(Allan dan Stevenson, 1981). Enzim eksoprotease merupakan faktor virulensi
utama yang bersifat proteolitik, dapat mendegradasi jaringan otot, sehingga
merusak jaringan tubuh inang dan akan menimbulkan infeksi pada jaringan inang
tersebut (Secades and Guijarro, 1999).
Produksi eksoprotease A. hydrophila diatur oleh suatu molekul sinyal N-
Butanoyl-L-Homoserine Lactone (C4-HSL). Molekul sinyal ini juga berfungsi
sebagai alat komunikasi antar sel pada suatu populasi bakteri sehingga disebut
sistem quorum sensing (Swift et al., 1997). Dengan adanya molekul sinyal,
bakteri mampu mengetahui kehadiran bakteri lain di lingkungannya. Konsentrasi
molekul sinyal sebanding dengan jumlah bakteri yang ada. Semakin banyak
populasi bakteri, semakin tinggi konsentrasi C4-HSL di lingkungan, dan apabila
15
15
telah mencapai kepadatan tertentu C4-HSL ini akan mengaktifkan gen penyandi
enzim eksoprotease (Taga and Bassler, 2003). Dengan demikian sistem quorum
sensing tersebut merupakan target utama dalam upaya pengendalian infeksi A.
hydrophila, yaitu dengan merusak sistem quorum sensingnya sehingga produksi
enzim eksoprotease menurun dan patogenisitas A. hydrophila menurun tanpa
harus membunuh bakteri tersebut.
Perusakan sistem quorum sensing dapat dilakukan oleh senyawa kemo
terapeutik yaitu dengan menghambat molekul sinyal C4-HSL (Hentzer and
Givskov, 2003). Dengan terhambatnya C4-HSL, maka produksi enzim
eksoprotease menurun sehingga patogenisitas A. hydrophila dapat diturunkan
(Lynch, 2002).
Berdasarkan penelitian Rasmussen et al. (2000), halogen furanon yang
merupakan metabolit sekunder dari makroalga laut Delisea pulchra mampu
menghambat molekul sinyal N-Butanoyl-L–Homoserine Lactone pada Serratia
liquefaciens sehingga menghambat motilitas Serratia liquefaciens. Furanon juga
dapat menghambat Acyl Homoserine Lactone yang mengontrol produksi faktor
virulensi dan patogenisitas Pseudomonas aeruginosa (Hentzer and Givskov,
2003). Selain sebagai metabolit sekunder pada D. pulchra, senyawa furanon ini
juga terdapat secara alami sebagai senyawa cita rasa (flavour compound) pada
tomat (Lycopersicon esculentum Mill.) (Martinelli et al., 2004; Buttery et al.,
2001). Hal ini menjadi dasar untuk melakukan penelitian tentang pengaruh ekstrak
buah tomat terhadap produksi C4-HSL A. hydrophila. Penghambatan C4-HSL
pada A. hydrophila dapat dibuktikan dengan penurunan produksi enzim
16
16
eksoprotease yang dihasilkan. Produksi enzim eksoprotease diketahui dengan cara
mengukur aktivitasnya. Oleh karena itu, perlu dilakukan penelitian untuk
mengukur aktivitas enzim eksoprotease dari A. hydrophila setelah pemberian
ekstrak buah tomat dengan pelarut n heksan, etil asetat, dan metanol.
B. Perumusan Masalah
Berdasarkan latar belakang di atas, maka dapat dirumuskan permasalahan sebagai
berikut :
1. Apakah terdapat penurunan produksi enzim eksoprotease A. hydrophila
setelah pemberian ekstrak n heksan, etil asetat, dan metanol buah tomat (L.
esculentum Mill.) dengan variasi konsentrasi 0%, 2%, 4%, 6%, dan 8% ?
2. Jenis ekstrak dan konsentrasi ekstrak buah tomat (L. esculentum Mill.) mana
yang tepat untuk menurunkan produksi enzim eksoprotease A. hydrophila ?
C. Tujuan Penelitian
1. Mengetahui adanya penurunan produksi enzim eksoprotease A. hydrophila
setelah pemberian ekstrak n heksan, etil asetat, dan metanol buah tomat (L.
esculentum Mill.) dengan variasi konsentrasi 0%, 2%, 4%, 6%, dan 8%
2. Mengetahui jenis dan konsentrasi ekstrak buah tomat (L. esculentum Mill.)
yang tepat untuk menurunkan produksi enzim eksoprotease A. hydrophila
D. Manfaat Penelitian
Penelitian ini dapat digunakan sebagai dasar penggunaan ekstrak buah tomat
(L. esculentum Mill.) sebagai pencegah infeksi pada ikan yang disebabkan bakteri
17
17
A. hydrophila dengan cara menurunkan produksi enzim eksoprotease A.
hydrophila.
BAB II
LANDASAN TEORI
18
18
A. Tinjauan Pustaka
1. Aeromonas hydrophila
Aeromonas hydrophila termasuk dalam familia Vibrionaceae. Aeromonas
hydrophila tersebar di lingkungan akuatik, bersifat positif oksidatif, fakultatif
anaerob, dapat memfermentasi glukosa, dan merupakan bakteri gram negatif
(Janda and Abbott, 1998). Aeromonas hydrophila berbentuk batang, bersifat
motil dengan diameter 0,3-1,0 µm dan panjang 1,0-3,5 µm, tidak berspora, tidak
berkapsula, tumbuh optimum pada suhu 28oC (Bottarelli and Ossiprandi, 1999).
Aeromonas hydrophila ditemukan di perairan air tawar terutama yang
mengandung bahan organik tinggi, dapat diisolasi dari air payau, perairan pantai
dan perairan terklorinasi (Alavandi et al., 1998). Aeromonas hydrophila juga
terdapat pada air minum mineral (Bottarelli and Ossiprandi, 1999). Selain itu,
Aeromonas hydrophila juga dapat diisolasi dari produk makanan dingin, produk
susu, produk ternak ruminansia, dan produk unggas (Ibrahim and Mac Rae, 1991).
Di daerah iklim sedang, bakteri ini dapat mencapai populasi tertinggi pada
akhir musim panas atau awal musim gugur saat temperatur 20-25°C dan jarang
ditemukan pada musim dingin (Gavriel et al., 1998). Pada media air laut steril
yang miskin nutrien, populasi A. hydrophila menurun 0,1 CFU/ml setelah 3-5
minggu (Maalej et al., 2004). Sedangkan pada media air destilasi steril yang
miskin nutrien, populasi A. hydrophila menurun 0,1 CFU/ml dalam jangka waktu
7 minggu pada suhu pertumbuhan 4°C (Mary et al., 2002). Berdasarkan penelitian
Sautor et al. (2003), pertumbuhan maksimum A. hydrophila terjadi pada suhu
19
19
30°C, pH 7, dan aw (water activity) 0,99, sedangkan pada suhu 10°C, pH 7, dan
aw 0,95 pertumbuhan A. hydrophila berjalan lambat.
2. Patogenisitas dan Penyakit yang Disebabkan oleh A. hydrophila
Aeromonas hydrophila yang tersebar luas di lingkungan akuatik mudah
melakukan kontak dengan hewan akuatik khususnya ikan dan amfibi. Kontak
antara bakteri dan hewan ini dapat menyebabkan infeksi bahkan dapat
mengancam kelangsungan hidup hewan akuatik (Hayes, 2000).
Aeromonas sering menyerang luka pada permukaan tubuh, umumnya
bersamaan dengan jamur air atau parasit. Penyakit ikan yang disebabkan A.
hydrophila disebut Motile Aeromonad Septicemia (MAS) atau Hemorrhagic
Septicemia yang ditandai dengan luka-luka pada permukaan tubuh, pengelupasan
sisik, pendarahan pada insang dan anus (Noga, 1995). Selain itu juga dikenal
dengan ulcer disease (borok bernanah) dan red sore disease (bercak merah).
Sedangkan Hayes (2000) menyebutkan bahwa A. hydrophila menimbulkan
penyakit infectious abdominal dropsy yang ditandai dengan adanya cairan dalam
rongga peritoneal, anemia, pembengkakan hati dan ginjal serta pendarahan pada
usus, otot, dan hati.
Ikan yang terinfeksi A. hydrophila biasanya memperlihatkan gejala-gejala
seperti warna tubuh ikan menjadi gelap, kemampuan berenang menurun, mata
rusak dan agak menonjol, sisik terkuak, seluruh siripnya rusak, insangnya rusak
dan berwarna merah keputihan, kulit menjadi kasat dan timbul pendarahan, luka
20
20
borok, perut kembung (dropsy), dan apabila dilakukan pembedahan maka akan
kelihatan pendarahan pada hati, ginjal dan limpa (Kordi, 2004).
Patogenisitas A. hydrophila ini disebabkan oleh adanya faktor virulensi
yang berupa:
a. Komponen permukaan sel berupa : pili, S-layer dan lipopolisakarida
(LPS).
b. Faktor ekstraseluler, berupa siderofor, enterotoksin, Glysero-
phospholipid Cholesterol Acetyltransferase (GCAT), hemolisin,
lipase, dan protease (Swift et al., 1999).
Berdasarkan penelitian Merino et al. (1992), A. hydrophila yang
ditumbuhkan pada suhu 20°C lebih virulen pada ikan dibandingkan suhu 37°C
karena pada suhu 20°C terjadi peningkatan aktivitas ekstraseluler. Aktivitas
hemolitik A. hydrophila maksimum pada suhu 35°C selama 30 jam, sedangkan
aktivitas proteolitiknya maksimal pada suhu 30°C dalam jangka waktu 36 jam
(Khalil, 1997).
3. Sistem Quorum Sensing
Sistem quorum sensing ditemukan pertama kali dalam mengontrol
ekspresi bioluminescen pada Vibrio fischeri (Parsek and Greenberg, 1997). Sistem
quorum sensing merupakan kemampuan bakteri untuk berkomunikasi dan
mengatur tingkah lakunya melalui molekul sinyal. Dengan sistem quorum
sensing, bakteri mampu memonitor kehadiran bakteri lain di sekitarnya dengan
memproduksi dan merespon molekul sinyal yang dikenal dengan autoinducer.
Konsentrasi autoinducer sebanding dengan jumlah bakteri yang ada. Jadi dengan
21
21
mendeteksi autoinducer, bakteri mampu mengetahui keberadaan bakteri di
sekitarnya. Autoinducer direspon melalui perubahan ekspresi gen sehingga
membentuk tingkah laku tertentu, misalnya : produksi enzim ekstraseluler pada
Pseudomonas aeruginosa dan Erwinia carotovora, bioluminescen pada Vibrio
fishceri dan Vibrio harveyi (Bassler et al., 1993), produksi antibiotik pada E.
carotovora dan pembentukan biofilm pada P. aeruginosa (Taga and Bassler,
2003). Menurut Eberl (1999) molekul sinyal Acyl Homoserine Lactone (AHL)
berfungsi ekologis yaitu untuk berinteraksi dengan populasi bakteri lain atau
dengan inang eukariotik.
Sistem quorum sensing pada bakteri dibedakan menjadi 2 macam yaitu:
gram positif oligopeptida dan gram negatif lux IR.
a. Gram positif oligopeptida
Bakteri gram positif menggunakan oligopeptida sebagai molekul
sinyalnya. Prekursor peptida disintesis, diproses dan dimodifikasi menjadi
molekul oligopeptida yang matang, kemudian dikeluarkan melalui kompleks
transport ATP binding cassette. Konsentrasi autoinducer meningkat sejalan
dengan pertambahan jumlah sel. Pada konsentrasi tinggi, autoinducer dapat
dideteksi oleh sensor kinase. Informasi ini dikirim ke dalam sel melalui
fosforilasi, dan berhenti pada perubahan yang sesuai untuk ekspresi gen (Gambar
1) ( Taga and Bassler, 2003).
22
22
dimodifikasi
Prekursor peptida Gen target
(Schauder and Bassler, 2001)
Gambar 1. Sistem quorum sensing oligopeptida pada bakteri gram positif. Prekursor spesifik oligopeptida diproduksi, lalu dimodifikasi dan diproses. ATP binding cassete (ABC) mengeluarkan autoinducer oligopeptida yang matang keluar membran sel. Bila konsentrasi autoinducer tinggi, autoinducer dapat dideteksi oleh dua komponen sinyal transduksi. Secara spesifik sensor protein kinase mengenali autoinducer dan melakukan autofosforilasi pada histidin (H) residu, lalu bergabung dengan protein regulator dan mengadakan fosforilasi pada residu aspartat (D). Protein regulator yang terfosforilasi ini berikatan dengan gen target dan menyebabkan terekspresinya gen target.
b. Gram negatif Lux IR
LuxI merupakan protein yang mengkatalis pembentukan autoinducer AHL
(Acyl Homoserine Lactone) yang tersebar ke dalam dan keluar sel. LuxR adalah
tipe protein yang berikatan dengan autoinducer yang spesifik ketika konsentrasi
autoinducer mencapai tingkat tertentu. Ikatan antara LuxR dengan AHL akan
mengenali sekuen DNA tertentu sehingga mengaktifkan transkripsi dari sekuen
gen tersebut (Gambar 2) (Taga and Bassler, 2003). Masing-masing bakteri
23
23
mempunyai molekul sinyal dan protein regulator yang spesifik (Hentzer and
Givskov, 2003). Pada bakteri gram negatif, sistem quorum sensing berkaitan
dengan asosiasinya dengan inang, termasuk metabolit sekunder dan produksi
faktor virulen (Finch et al., 1998).
Gen target
(Schauder and Bassler, 2001).
Gambar 2. Sistem quorum sensing Lux IR pada bakteri gram negatif. Protein Lux I mengkatalis pembentukan molekul autoinducer (pentagon hijau). Autoinducer berdifusi secara bebas melewati membran sel dan berakumulasi. Pada konsentrasi autoinducer tinggi, protein Lux R akan berikatan dengan autoinducer. Ikatan antara autoinducer dengan Lux R ini akan mengaktifkan transkripsi gen target.
24
24
4. Enzim Eksoprotease
Aeromonas hydrophila menghasilkan enzim eksoprotease yang merupakan
penyebab virulensi. Protease yang bersifat proteolitik mampu mengambil
persediaan nutrien dan melawan pertahanan tubuh inang sehingga berfungsi untuk
berkembangnya penyakit pada inang. Enzim protease pada suatu bakteri berperan
memecah ikatan peptida protein sehingga dihasilkan komponen asam amino
dalam bentuk bebas yang merupakan sumber nutrien bagi bakteri. Protease
mampu menghidrolisis kasein dan elastin (Cascon et al., 2000). Enzim
eksoprotease ini juga dapat merusak atau mendegradasi jaringan konektif atau
jaringan otot seperti kolagen, gelatin, dan sebagainya sehingga dapat merusak
jaringan tubuh inang. Enzim eksoprotease merupakan faktor virulensi utama
bakteri patogen, berperan dalam perusakan jaringan inang yang akan
menimbulkan infeksi pada jaringan inang tersebut (Secades and Guijarro, 1999).
Enzim eksoprotease A. hydrophila tahan terhadap pemanasan 56°C dan
pada penyimpanan 4°C atau -20°C (Nieto and Ellis, 1986). Berdasarkan penelitian
McMahon (2004), ekspresi enzim eksoprotease A. hydrophila tergantung pada
suhu inkubasi dan kondisi udara. Pada kondisi udara yang berbeda-beda, A.
hydrophila mengeluarkan enzim protease yang sama, namun aktivitasnya
bervariasi sesuai kondisinya.
Enzim eksoprotease pada A. hydrophila ada 2 macam yaitu : serin protease
dan metaloprotease. Serin protease merupakan enzim protease yang mempunyai
residu serin dalam lokasi aktifnya, sedangkan metalloprotease adalah enzim
protease yang keaktifannya tergantung pada adanya metal. Pada A. hydrophila ini,
25
25
Serin protease, memiliki berat molekul 22 kD, stabil pada suhu 56°C selama 10
menit, memiliki aktivitas sitotoksik dan memiliki nilai LD50 sebesar 50 ng/g ikan.
Sedangkan metalloprotease, memiliki berat molekul 38 kD, stabil pada suhu 56°C
selama 10 menit, tidak memiliki aktivitas sitotoksik dan memiliki nilai LD50
sebesar 150 ng/g ikan ( Rodrigues et al., 1992).
Produksi enzim serin protease dan metalloprotease A. hydrophila diatur
oleh sistem quorum sensing yang homolog dengan tipe Lux IR dengan molekul
sinyal N-Butanoyl-L-Homoserine Lactone (C4-HSL) (Swift et al., 1997). Molekul
sinyal ini juga berfungsi sebagai perantara komunikasi antar sel dalam populasi
bakteri sehingga disebut sistem quorum sensing. Sintesis C4-HSL diatur oleh
protein regulator AhyI yang diekspresikan gen AhyI. Selanjutnya molekul sinyal
ini akan disekresikan ke lingkungan. Apabila konsentrasi C4-HSL dalam
lingkungan tinggi, senyawa ini akan masuk kembali ke dalam sel dan berinteraksi
dengan reseptor protein regulator AhyR yang diekspresikan gen AhyR, kemudian
AhyR akan mengikat rangkaian promoter pada gen penyandi eksoprotease dan
mengaktifkan faktor transkripsi RNA polymerase untuk mengadakan proses
transkripsi (Swift et al., 1999).
Berdasarkan penelitian Swift et al.(1997), produksi C4-HSL A. hydrophila
terdeteksi pada nilai OD600 sebesar 1. Hal ini sebanding dengan populasi bakteri
107-108 CFU/ml (Gram et al., 1999).
26
26
5. Jumlah dan Satuan Enzim
Keaktifan suatu enzim dapat ditentukan secara kualitatif dengan reaksi
kimia yaitu dengan substrat yang dapat dikatalisis oleh enzim tersebut, dan secara
kuantitatif ditentukan dengan mengukur laju reaksi tersebut. Jumlah enzim lebih
banyak dinyatakan dalam bentuk keaktifan enzim dan dinyatakan dalam satuan
atau unit enzim. Secara umum, satuan enzim berhubungan dengan laju reaksi yang
dikatalisis. Jumlah satuan enzim dapat ditentukan dengan menentukan jumlah
satuan enzim yang mampu mendegradasi substrat pada kondisi tertentu (Winarno,
1986). Satu unit aktivitas enzim didefinisikan sebagai jumlah enzim yang dapat
menghasilkan kenaikan pengukuran absorbansi sebesar 0,01 setiap jam pada
kondisi pengukuran (Hanlon and Hodges, 1981)
6. Mekanisme Penghambatan Quorum Sensing
Banyak bakteri yang menggunakan quorum sensing dalam mengontrol
virulensinya terhadap organisme lain, sehingga quorum sensing merupakan target
baru untuk agen kemoterapeutik (Rasch et al., 2004). Menurut Keivit and
Iglewski (2000), bakteri gram negatif yang virulen dapat dijadikan nonpatogen
dengan cara menghambat sistem quorum sensingnya. Hal ini dapat dijadikan
sebagai cara pencegahan infeksi kronis yang merusak tanpa menggunakan agen
yang menghambat pertumbuhan seperti antibiotik dan desinfektan yang dapat
menyebabkan resistensi organisme.
27
27
Pada bakteri gram negatif, sistem quorum sensingnya menggunakan
molekul sinyal AHL, maka beberapa cara yang dapat mengganggu sistem quorum
sensing adalah :
a. Penghambatan Pembentukan Sinyal AHL
Pembentukan AHL dikatalis oleh protein LuxI. Prosesnya meliputi
mekanisme reaksi yang berurutan yang menggunakan S-Adenosyl Methionine
(SAM) sebagai donor asam amino untuk pembentukan cincin homoserine lactone,
dan Acyl Carrier Protein (ACP) sebagai prekursor untuk rantai acyl dari molekul
sinyal AHL. Beberapa analog SAM seperti S-adenosylhomosistein, S-
adenosylcysteine, dan sinefungin dapat digunakan sebagai inhibitor pembentukan
AHL yang dikatalis oleh protein RhlI pada Pseudomonas aeruginosa (Hentzer
and Givskov, 2003). Antibiotik yang termasuk dalam macrolide antibiotic mampu
menekan sintesis AHL pada P. aeruginosa ketika diberikan pada konsentrasi
penghambatan di bawah minimal (Hentzer and Givskov, 2003).
b. Penghambatan Penyebaran Sinyal AHL
Komunikasi antar sel bakteri dapat dihambat oleh adanya penurunan
konsentrasi molekul sinyal yang aktif di lingkungan. Kerusakan AHL dapat
terjadi secara non enzimatik, misalnya molekul sinyal AHL dapat dihidrolisis
pada pH tinggi. Beberapa bakteri mampu mendegradasi molekul sinyal AHL
secara spesifik. Dong et al. (2002) menemukan bahwa AiiA, enzim yang
diproduksi oleh bakteri Bacillus sp dapat mempercepat reaksi hidrolisis molekul
AHL. Ekspresi dari gen AiiA pada Erwinia carotovora, bakteri patogen pada
tanaman menunjukkan penurunan pelepasan sinyal AHL, menurunkan aktivitas
28
28
enzim pektolitik ekstraseluler dan melemahkan gejala infeksinya pada tanaman
(Hentzer and Givskov, 2003).
c. Penghambatan Penerimaan Sinyal AHL
Penghambatan penghantaran molekul sinyal quorum sensing dapat
dilakukan oleh molekul antagonis yang mampu bersaing atau bercampur dengan
sinyal AHL asli untuk berikatan dengan reseptor LuxR. Inhibitor kompetitif
strukturnya mirip dengan molekul sinyal AHL sehingga berikatan dan mengambil
tempat berikatan AHL tetapi gagal untuk mengaktifkan LuxR. Inhibitor
nonkompetitif mempunyai struktur kurang mirip atau tidak mirip dengan molekul
sinyal AHL, molekul ini mengikat pada sisi yang berbeda pada protein reseptor
(Hentzer and Givskov, 2003).
6. Tomat (Lycopersicon esculentum Mill.)
Tomat (Lycopersicon esculentum Mill.) termasuk famili Solanaceae
(Tjitrosoepomo, 2002). Taanaman ini merupakan tanaman perdu, berakar
tunggang dengan akar samping yang banyak dan dangkal; batang bersegi dan
berbulu halus. Bunganya berbentuk terompet kecil dengan benang sari yang
bersatu membentuk tabung, warna bunga umumnya kuning. Buahnya berbentuk
bulat, pipih, berdaging dan banyak mengandung air, tersusun dalam tandan.
Daunnya bercelah dengan tulang daun menyirip dan tersusun dalam sebuah
tangkai bersama (Sunarjono, 2004; Steenis, 1997).
Buah tomat mengandung gula (glukosa, fruktosa, sukrosa), asam organik
(asam sitrat, asam malat), mineral, volatil, asam askorbat, vitamin, dan polifenil,
29
29
protein, selulosa, hemiselulosa, dan asam amino lain (Atherton and Rudich,
1996). Buah tomat mempunyai senyawa cita rasa (flavouring compound) yang
disebut furaneol (2,5 dimetil, 4-hidroksi-3(2H)-furanon). Furaneol ini dapat larut
dalam air (Buttery et al., 2001).
(Buttery et al., 2001)
Gambar 3. Struktur furaneol
7. Senyawa furanon
Furanon terdapat di alam sebagai pheromone, flavour compound , dan
metabolit sekunder (Martinelli et al., 2004). Butenolids (2(5H)-Furanon) telah
diisolasi dari Streptomyces sp. atau dari Hortonia sp. Furanon juga diproduksi
oleh alga hijau, alga merah, dan alga coklat, sponge, fungi,dan ascidian. Pada
kecoa jantan , furanon digunakan sebagai sex pheromone. Furanon ini terdapat
secara alami pada nanas atau strawberry dan membuat senyawa cita rasa pada
keju dan wine (Martinelli et al., 2004). Pada alga laut Delisea pulchra, furanon
dihasilkan sebagai metabolit sekunder dengan nama (Z)-5(bromomethylene)
furan-2(5H)-one (furanon) (Lonn, 2005). Halogen furanon ini dapat menghambat
sistem quorum sensing (Givskov et al., 1996; Manefield et al., 1999).
30
30
Beberapa furanon mempunyai struktur kimia mirip dengan N-Acyl
Homoserine Lactone (AHL) yang merupakan molekul sinyal dalam sistem
quorum sensing bakteri gram negatif, sehingga senyawa furanon ini bersaing
dengan AHL untuk berikatan dengan reseptor LuxR. Beberapa penelitian telah
menunjukkan bahwa furanon : (1). Menghambat AHL-faktor pengatur virulensi
dan patogenisitas pada Pseudomonas aeruginosa, (2). Menghambat quorum
sensing yang mengatur luminescen dan virulensi dari Vibrio harveyi yang patogen
pada udang, dan (3). Menghambat quorum sensing yang mengontrol virulensi dari
Erwinia carotovora (Hentzer and Gisvskov, 2003).
(Hentzer and Givskov, 2003)
Gambar 4. Struktur C4-HSL
(Hentzer and Givskov, 2003)
Gambar 5. Struktur halogen furanon dari Delisea pulchra
31
31
B. Kerangka Pemikiran
Aeromonas hydrophila bersifat patogen pada ikan. Faktor patogenisitasnya
adalah enzim eksoproteasenya. Produksi enzim eksoprotease pada A. hydrophila
diatur oleh sistem quorum sensing dengan C4-HSL sebagai molekul sinyalnya. C4-
HSL ini akan disekresikan ke lingkungan, bila konsentrasi C4-HSL di lingkungan
tinggi, C4-HSL akan masuk kembali ke dalam sel dan mengaktifkan faktor
transkripsi gen penyandi enzim eksoprotease. Ekstrak buah Lycopersicon
esculentum Mill. yang mengandung furanon diharapkan akan menyebabkan
penghambatan sistem quorum sensing A. hydrophila sehingga ekspresi gen
penyandi enzim eksoprotease menurun. Penurunan ekspresi gen penyandi enzim
eksoprotease akan menyebabkan menurunnya produksi enzim eksoprotease.
Dengan menurunnya produksi enzim eksoprotease, maka patogenisitas A.
hydrophila juga menurun. Kerangka pemikiran secara skematis adalah sebagai
berikut (Gambar 6)
32
32
Gambar 6. Kerangka pemikiran
Menghambat sistem quorum sensing A. hydrophila
Produksi enzim eksoprotease A. hydrophila menurun
Patogenisitas A. hydrophila menurun
Aeromonas hydrophila
Enzim Eksoprotease Patogen pada ikan
Ekstrak buah L.
esculentum Mill.
Sistem quorum sensing
33
33
C. Hipotesis
1. Ada penurunan produksi enzim eksoprotease A. hydrophila setelah pemberian
ekstrak n heksan, etil asetat, dan metanol buah tomat (L. esculentum Mill.)
dengan variasi konsentrasi 0 %, 2 %, 4 %, 6 %, dan 8 %.
2. Ekstrak metanol buah tomat (L. esculentum Mill.) dengan konsentrasi 4 %
menunjukkan penurunan produksi enzim eksoprotease A. hydrophila yang
terbesar.
34
34
BAB III
METODE PENELITAN
A. Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian dilaksanakan pada bulan Februari sampai Juli 2006 di Sub
Laboratorium Biologi, Laboratorium Pusat MIPA Universitas Sebelas Maret,
Surakarta.
B. Alat dan Bahan
1. Alat
Alat yang digunakan dalam penelitian ini meliputi:
a. Alat untuk ekstraksi : timbangan elektrik, blender, pisau (cutter), erlenmeyer,
freezer, gelas beker, gelas ukur, alumunium foil, kertas saring, dan rotary
evaporator.
b. Alat untuk pemeliharaan kultur A. hydrophila : tabung reaksi, inkubator, hot
plate.
c. Alat untuk pengujian kualitatif aktivitas enzim eksoprotease A. hydrophila :
cawan petri, jarum ose, laminar air flow, bunshen buchner, tabung reaksi,
vortek, hot plate.
d. Alat untuk pengukuran pertumbuhan, dan pengukuran aktivitas enzim
eksoprotease A. hydrophila : spektrofotometer, kuvet, shaker, mikropipet dan
tip, laminar air flow, gelas ukur, erlenmeyer, hot plate, dan sentrifus.
e. Alat sterilisasi : autoklaf
35
35
2. Bahan
Bahan yang digunakan dalam penelitian ini meliputi:
a. Buah tomat (Lycopersicon esculentum Mill.) var commune
b. Kultur murni A. hydrophila yang diperoleh dari Laboratorium Penyakit Ikan
(Fish disease) Jurusan Teknologi Perikanan Universitas Gajah Mada,
Yogyakarta.
c. Medium Luria Bertani (LB) Agar (Lampiran 1), Luria Bertani (LB) Broth
(Lampiran 1), azocasein (Sigma), susu skim, trichloroacetic acid (TCA),
NaOH 0,5 M, dan buffer fosfat pH 8
d. Pelarut : n heksan , etil asetat, metanol
C. Cara Kerja
1. Pembuatan ekstrak n-heksan, ekstrak etil asetat, dan ekstrak metanol buah
Tomat (L. esculentum Mill.)
Buah tomat yang masak dicuci bersih, kemudian diiris tipis dan
dikeringkan dalam oven dengan suhu 80°C. Irisan yang sudah kering diblender
menjadi serbuk dan disimpan dalam wadah tertutup. Serbuk dilarutkan dalam n-
heksan (100 mg serbuk/100ml n-heksan), dikocok dan dibiarkan selama 24 jam.
Ekstrak disaring dan diambil filtratnya. Filtrat dipekatkan dalam rotary
evaporator hingga diperoleh ekstrak n heksan buah tomat. Selanjutnya ampas
yang diperoleh dari penyaringan dilarutkan dalam etil asetat, dikocok dan
dibiarkan selama 24 jam. Ekstrak disaring dan diambil filtratnya. Filtrat
dipekatkan dalam rotary evaporator hingga diperoleh ekstrak etil asetat buah
36
36
tomat, sedangkan ampasnya dilarutkan dalam metanol, dikocok dan dibiarkan
selama 24 jam. filtrat dipekatkan dalam rotary evaporator hingga diperoleh
ekstrak metanol buah tomat (Wardhani, 2005)
2. Pemeliharaan Kultur A. hydrophila
Kultur A. hydrophila ditumbuhkan pada agar miring NA pada suhu 30oC.
3. Penentuan Kurva Standar A. hydrophila
Penentuan kurva standar dilakukan untuk mengetahui waktu yang tepat A.
hydrophila mencapai kepadatan 107-108 CFU/ml. Penentuan kurva standar bakteri
dilakukan dengan cara memindahkan isolat bakteri berumur 24 jam ke dalam 200
ml medium LB broth, kemudian diinkubasi pada suhu 30°C, dan dikocok dengan
shaker. Pengukuran pertumbuhan bakteri dilakukan setiap 2 jam sekali mulai jam
ke-0 dan selanjutnya setiap 2 jam selama 24 jam, 10 ml suspensi bakteri diambil
dan diukur pertumbuhannya menggunakan spektrofotometer pada panjang
gelombang 600 nm sehingga diketahui nilai OD (Optical Density). Hubungan
antara nilai OD dengan jumlah bakteri per ml didapatkan melalui pembuatan
kurva standar dengan menentukan plot antara nilai OD dengan jumlah sel bakteri
per ml pada hitungan cawan. Dari kurva standar ini dapat diketahui nilai OD A.
hydrophila yang memenuhi kepadatan 107-108 CFU/ml.
37
37
4. Pengujian Kualitatif Aktivitas Enzim Eksoprotease
Uji ini dilakukan untuk mengetahui aktivitas enzim eksoprotease A.
hydrophila secara kualitatif setelah perlakuan ekstrak buah tomat. Medium yang
digunakan adalah Luria-Bertani (LB) agar yang ditambah dengan 2% susu skim.
Sterilisasi medium dengan autoklaf pada suhu 121°C selama 15 menit, sedangkan
sterilisasi susu skim pada suhu 110°C selama 30 menit. Cawan petri diisi dengan
12 ml medium dengan penambahan ekstrak n heksan, etil asetat, dan metanol
buah tomat dengan konsentrasi 0% (sebagai kontrol), 2%; 4%; 6% dan 8% . Isolat
A. hydrophila yang telah ditumbuhkan dalam media LB Broth diinokulasikan
pada cawan petri yang berisi medium LB agar padat dengan menggunakan metode
titik (spot plate) dan diinkubasi pada suhu 30°C selama 24 jam. Masing-masing
dilakukan dengan tiga kali ulangan Aktivitas enzim eksoprotease dapat dilihat
dengan adanya zona bening pada medium (Swift et al., 1999). Luas zona bening
pada masing-masing perlakuan dihitung, kemudian dibandingkan dengan luas
zona bening pada kontrol.
Luas zona bening : π R2- π r2
Keterangan :
R : jari-jari lingkaran total (koloni bakteri + zona bening) (dalam cm)
R : jari-jari lingkaran koloni bakteri (dalam cm)
π: 3,14
Luas zona bening dalam cm2
38
38
5. Pengukuran Pertumbuhan A. hydrophila
Uji ini dilakukan untuk mengetahui pertumbuhan A. hydrophila pada
perlakuan ekstrak buah tomat. Isolat A. hydrophila berumur 24 jam ditumbuhkan
pada 200 ml LB broth yang telah diberi ekstrak buah tomat, selanjutnya
diinkubasi pada suhu 30°C dan dikocok dengan shaker. Pengukuran pertumbuhan
bakteri dilakukan setiap 2 jam sekali mulai jam ke-0 dan selanjutnya setiap 2 jam
selama 24 jam, 10 ml suspensi bakteri diambil dan diukur pertumbuhannya
menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang 600 nm sehingga
diketahui nilai OD (Optical Density). Sebagai kontrol, dilakukan pengukuran
pertumbuhan A. hydrophila dalam medium LB Broth yang tidak diberi perlakuan
ekstrak buah tomat.
6. Pengujian Kuantitatif Aktivitas Enzim Eksoprotease A. hydrophila
Pengujian ini dilakukan untuk mengetahui aktivitas enzim eksoprotease A.
hydrophila secara kuantitatif pada perlakuan ekstrak buah tomat. Prinsip
pengujian aktivitas enzim eksoprotease berdasarkan metode Hanlon dan Hodges
(1981) yaitu kemampuan enzim protease untuk menghidrolisis azocasein. Residu
azocasein yang tidak dapat terhidrolisis oleh enzim eksoprotease akan diendapkan
oleh tricloro acetic acid (TCA). Endapan dipisahkan dengan filtrat. Filtrat akan
membentuk warna bila direaksikan dengan NaOH. Intensitas warna yang
terbentuk diukur dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 440 nm.
Pengujian secara kuantitatif hanya dilakukan pada ekstrak yang menunjukkan
pengurangan aktivitas proteolitik terbesar yang ditunjukkan dengan luas zona
39
39
bening paling kecil dibandingkan kontrol pada pengujian kualitatif aktivitas enzim
eksoprotease. Sepuluh ml suspensi bakteri yang telah diukur pertumbuhannya
disentrifugasi dengan kecepatan 10.000 g selama 10 menit. Filtratnya diambil
sebanyak 1 ml, lalu dimasukkan dalam tabung reaksi yang telah berisi 3 ml
larutan buffer fosfat (pH 8). Campuran ini kemudian diletakkan di atas penangas
air hingga suhunya mencapai 37°C. Setelah itu, ditambahkan 2 ml azocasein yang
sebelumnya telah dipanaskan pada penangas air hingga suhunya mencapai 37°C,
lalu diinkubasi selama 30 menit pada suhu 37°C. Selanjutnya ditambahkan 4 ml
trichloro acetic acid (TCA) 10% sehingga terbentuk endapan kuning yang
dipisahkan dengan disentrifugasi. Filtrat sebanyak 5 ml diambil, lalu ditambah
dengan 5 ml larutan NaOH 0,5 M kemudian diukur absorbansinya pada panjang
gelombang 440 nm. Pengukuran aktivitas enzim dilakukan setiap 2 jam sekali
selama 24 jam sebanyak 3 kali ulangan. Satu unit aktivitas enzim eksoprotease
didefinisikan sebagai jumlah enzim yang dapat menghasilkan kenaikan
pengukuran absorbansi sebesar 0.01 setiap jam pada kondisi pengukuran. Unit
aktivitas enzim eksoprotease yang digunakan dalam penelitian ini dinyatakan
dalam U/ml, dan ditetapkan dengan rumus :
Unit aktivitas/ml sampel (U/ml) = (absorbansi : 0,01) X 2
(Hanlon and Hodges, 1981)
40
40
D. Analisis Data
Penurunan produksi enzim eksoprotease A. hydrophila dapat dilihat dari
aktivitas enzim eksoprotease secara kualitatif dan kuantitatif. Hasil pengujian
kualitatif aktivitas enzim eksoprotease A. hydrophila yang dinyatakan dalam luas
zona bening (dalam cm2) pada masing-masing perlakuan dibandingkan dengan
luas zona bening pada kontrol. Perlakuan yang mempunyai luas zona bening
terkecil akan dilanjutkan pada pengujian kuantitatif aktivitas enzim eksoprotease.
Hasil pengukuran aktivitas enzim eksoprotease A. hydrophila berupa unit
aktivitas enzim/ml sampel (U/ml) pada perlakuan yang menunjukkan aktivitas
enzim eksoprotease terendah dibandingkan dengan aktivitas enzim eksoprotease
pada kontrol dan penurunannya dinyatakan dalam persentase.
41
41
BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN
A. Kepadatan A. hydrophila yang Memenuhi Quorum Sensing
Aeromonas hydrophila mempunyai faktor virulensi utama berupa produksi
enzim eksoprotease yang diatur oleh sistem quorum sensing. Dengan demikian
untuk mendeteksi adanya produksi enzim eksoprotease, sistem quorum sensing A.
hydrophila harus berjalan terlebih dahulu. Sistem quorum sensing dapat berjalan
apabila bakteri telah mencapai kepadatan tertentu. Pada A. hydrophila ini, mulai
kepadatan 107-108 CFU/ml sistem quorum sensing mulai berjalan (Gram et al.,
1999). Dengan bekerjanya sistem quorum sensing, maka A. hydrophila telah
mampu memproduksi enzim eksoprotease. Dalam penelitian ini, penentuan
kepadatan A. hydrophila yang mampu mencapai quorum dilakukan dengan cara
membuat kurva standar A. hydrophila. Suspensi A. hydrophila diukur
absorbansinya pada panjang gelombang 600 nm sehingga dihasilkan nilai OD
yang kemudian dikorelasikan dengan jumlah bakteri pada hitungan cawan. Nilai
OD dan jumlah bakteri dalam hitungan cawan dapat diikuti dalam Tabel 1.
Tabel 1. Nilai OD dan jumlah bakteri A. hydrophila pada hitungan cawan
Jam ke OD Jumlah bakteri/ml Log Jml Bakteri 4 0,0697 3,1 . 105 5,49136 6 0,5310 1,6. 108 8,21085 8 0,9040 2,3. 108 8,36173 10 1,1930 9,9. 108 8,99564
42
42
Dari nilai OD dan jumlah bakteri hasil hitungan cawan dibuat kurva
standar A. hydrophila sehingga didapatkan persamaan Y=2,947X + 5,7774 yang
diperoleh melalui analisis regresi linier sederhana (Gambar 7).
Gambar 7. Kurva standar A. hydrophila
Berdasarkan kurva standar tersebut, kepadatan A. hydrophila sebesar 107-
108 CFU/ml dicapai pada nilai OD lebih besar atau sama dengan 0,415. Dari hasil
tersebut, maka inokulum yang digunakan untuk perlakuan adalah inokulum yang
mempunyai nilai OD lebih besar atau sama dengan 0,415.
B. Produksi Enzim Eksoprotease A. hydrophila Secara Kualitatif
Enzim eksoprotease merupakan enzim protease yang disekresikan oleh A.
hydrophila ke dalam lingkungannya. Enzim eksoprotease ini merupakan faktor
virulensi utama pada bakteri patogen sehingga perlu diturunkan produksinya.
Produksi enzim eksoprotease A. hydrophila dikontrol oleh suatu sistem
komunikasi bakteri yang disebut sistem quorum sensing, dengan molekul sinyal
y = 2,947x + 5,7774
R2 = 0,8493
0123456789
10
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4
OD
log
Jum
lah
Bak
teri
/ml
43
43
adalah C4-HSL. Untuk menurunkan produksi enzim eksoprotease A. hydrophila
dapat dilakukan dengan cara menghambat sistem quorum sensingnya.
Dalam penelitian ini, senyawa yang diduga mampu menghambat sistem
quorum sensing A. hydrophila adalah senyawa furanon dalam buah tomat.
Senyawa furanon mempunyai struktur mirip dengan molekul sinyal C4-HSL
sehingga berperan sebagai C4-HSL analog dan mampu mengganggu quorum
sensing. Untuk mendapatkan senyawa yang terkandung dalam buah tomat, maka
dalam penelitian ini dilakukan ekstraksi bertingkat buah tomat menggunakan
pelarut non polar, semi polar, dan polar yaitu : n heksan, etil asetat, dan metanol.
Uji kualitatif produksi enzim A. hydrophila dilakukan dengan metode titik
(spot plate) pada media Luria Bertani (LB) Agar yang ditambah 2% susu skim
dan pada perlakuan ditambah dengan ekstrak buah tomat dengan berbagai variasi
konsentrasi. Inokulum yang digunakan adalah inokulum A. hydrophila yang telah
mencapai kepadatan 107 dari hasil pembuatan kurva standar A. hydrophila
(Gambar 7). Media Luria Bertani digunakan dalam uji kualitatif produksi enzim
eksoprotease karena Luria Bertani ini mengandung tripton (asam amino triptofan)
sehingga bisa memacu aktivitas enzim proteolitik. Penambahan susu skim
dimaksudkan untuk menunjukkan adanya produksi enzim eksoprotease melalui
terbentuknya zona bening di sekitar koloni bakteri A. hydrophila. Zona bening ini
menunjukkan adanya aktivitas enzim eksoprotease yang menghidrolisis ikatan
peptida protein susu skim menjadi asam amino (Poernomo dan Purwanto, 2005).
Penurunan produksi enzim eksoprotease A. hydrophila secara kualitatif dapat
44
44
diketahui dengan tidak adanya zona bening atau terjadinya pengurangan luas zona
bening di sekitar koloni A. hydrophila.
Apabila produksi enzim eksoprotease secara kualitatif terhambat oleh
salah satu jenis ekstrak tanpa menghambat pertumbuhan bakteri, maka akan
dilanjutkan dengan uji kuantitatif produksi enzim eksoprotease untuk mengetahui
persentase penurunan produksi enzim eksoprotease.
1). Produksi Enzim Eksoprotease A. hydrophila Pada Perlakuan Ekstrak
n heksan Buah Tomat (L. esculentum Mill.)
n heksan merupakan pelarut non polar yang akan melarutkan senyawa non
polar dalam buah tomat. Kandungan non polar dalam buah tomat antara lain
adalah likopen yang termasuk golongan karotenoid (Sauriasari, 2006). Ekstrak n
heksan buah tomat ditambahkan pada media Luria Bertani Agar dengan variasi
konsentrasi 0%; 2%; 4%; 6% dan 8%. Pada semua konsentrasi masih terdapat
produksi enzim eksoprotease A. hydrophila. Hal ini ditunjukkan dengan adanya
zona bening di sekitar koloni A. hydrophila yang menunjukkan adanya aktivitas
enzim eksoprotease menghidrolisis ikatan peptida susu skim. Berkurangnya zona
bening diikuti pula oleh pengurangan koloni bakteri yang tumbuh (Gambar
8a,b,c,d,e).
45
45
Gambar 8. Produksi enzim eksoprotease A. hydrophila pada perlakuan ekstrak n heksan buah tomat (L. esculentum Mill.)
Keterangan : 1. koloni bakteri. 2. zona bening. (Zona bening di sekitar koloni bakteri menunjukkan adanya produksi enzim eksoprotease A. hydrophila)
a. Kontrol (media LB Agar) b. LB Agar ditambah ekstrak n heksan buah tomat 2% c. LB Agar ditambah ekstrak n heksan buah tomat 4% d. LB Agar ditambah ekstrak n heksan buah tomat 6% e. LB Agar ditambah ekstrak n heksan buah tomat 8%
a
c d
e
b
2
1
1
2
1
2
2
1
2
1
46
46
Bakteri tetap tumbuh yang ditunjukkan dengan diameter koloni A. hydrophila
yang cukup besar dan mampu memproduksi enzim eksoprotease terbukti dengan
terukurnya luas zona bening di sekitar koloni A. hydrophila. Diameter koloni A.
hydrophila dan luas zona bening setelah perlakuan dengan ekstrak n heksan buah
tomat dapat diikuti pada Tabel 2.
Tabel 2. Diameter koloni A. hydrophila dan luas zona bening pada perlakuan dengan ekstrak n heksan tomat (L. esculentum Mill.)
Konsentrasi Rata-rata diameter
koloni (cm)
Rata-rata luas zona
bening (cm2)
Kontrol (0%) 0,467 0,429
2% 0,380 0,110
4% 0,425 0,149
6% 0,316 0,081
8% 0,250 0,077
Pertumbuhan dan produksi enzim eksoprotease A. hydrophila mengalami
penurunan, namun penurunan produksi enzim eksoprotease dan pertumbuhannya
relatif kecil. Hal ini diduga karena senyawa-senyawa aktif non polar yang
terkandung dalam ekstrak buah tomat tidak mampu menghambat sistem quorum
sensing A. hydrophila. Ekstrak yang bersifat non polar menyebabkan ekstrak
tersebut kurang larut dalam media LB agar yang mempunyai pelarut air yang
bersifat polar. Dalam ekstrak n heksan buah tomat ini diduga senyawa furanon
tidak terekstrak sehingga tidak mampu menghambat sistem quorum sensing A.
hydrophila sehingga perlakuan ekstrak n heksan buah tomat ini tidak dilanjutkan
47
47
pada pengukuran pertumbuhan bakteri dan pengujian kuantitatif aktivitas enzim
eksoprotease A. hydrophila.
2). Produksi Enzim Eksoprotease A. hydrophila Pada Perlakuan Ekstrak Etil
Asetat Buah Tomat (L. esculentum Mill.)
Etil asetat merupakan pelarut semi polar yang akan melarutkan senyawa
non polar dalam buah tomat. Ekstrak etil asetat buah tomat ditambahkan pada
media Luria Bertani Agar dengan variasi konsentrasi 0%; 2%; 4%; 6% dan 8%.
Produksi enzim eksoprotease setelah penambahan ekstrak etil asetat buah tomat
ini mengalami penghambatan sejalan dengan meningkatnya konsentrasi ekstrak
yang diberikan. Hal ini dapat terlihat dari terbentuknya zona bening yang ada di
sekitar koloni bakteri. Demikian pula dengan pertumbuhan bakterinya, semakin
tinggi konsentrasi ekstrak, pertumbuhan A. hydrophila semakin terhambat.
Adapun produksi enzim eksoprotease A. hydrophila setelah penambahan ekstrak
etil asetat buah tomat dapat dilihat pada Gambar 9.
48
48
Gambar 9. Produksi enzim eksoprotease A. hydrophila pada perlakuan ekstrak etil asetat buah tomat (L. esculentum Mill.)
Keterangan : 1. koloni bakteri. 2. zona bening (Zona bening di sekitar koloni bakteri menunjukkan adanya produksi enzim eksoprotease A. hydrophila) a. Kontrol (pada media LB Agar) b. LB Agar ditambah ekstrak etil asetat buah tomat 2% c. LB Agar ditambah ekstrak etil asetat buah tomat 4% d. LB Agar ditambah ekstrak etil asetat buah tomat 6% e. LB Agar ditambah ekstrak etil asetat buah tomat 8%
a
c d
e
b
1
2
1
2
1
1
1
49
49
Berdasarkan Gambar 9b, dilihat dari koloni bakteri yang tumbuh dan zona
bening yang ada dapat dikatakan bahwa pertumbuhan dan produksi enzim
eksoprotease pada konsentrasi 2% relatif sama dengan pertumbuhan dan produksi
enzim eksoprotease pada kontrol A. hydrophila. Hal ini menunjukkan bahwa
konsentrasi tersebut belum mampu menghambat sistem quorum sensing A.
hydrophila. Pada konsentrasi 4% (Gambar 9c) menunjukkan penghambatan
produksi enzim eksoprotease A. hydrophila yang ditunjukkan dengan tidak adanya
zona bening di sekitar koloni A. hydrophila, walaupun hanya terjadi sedikit
penurunan pertumbuhan bakteri A. hydrophila. Sedangkan pada konsentrasi 6%
(Gambar 9d) dan 8% (Gambar 9e) tidak memperlihatkan adanya zona bening di
sekitar koloni A. hydrophila yang menunjukkan tidak terdapatnya produksi enzim
eksoprotease.
Adanya penghambatan pertumbuhan dan produksi enzim eksoprotease
secara rinci dapat diketahui dari hasil pengukuran diameter koloni dan luas zona
bening yang dapat dilihat pada Tabel 3.
Tabel 3. Diameter koloni A. hydrophila dan luas zona bening pada perlakuan dengan ekstrak etil asetat buah Tomat (L. esculentum Mill.)
Konsentrasi Rata-rata diameter
koloni (cm)
Rata-rata luas zona
bening (cm2)
Kontrol (0%) 0,467 0,429
2% 0,483 0,322
4% 0,320 -
6% 0,233 -
8% 0,225 -
Keterangan : tanda (-) menunjukkan tidak adanya zona bening di sekitar koloni bakteri
50
50
Pada Tabel 3 terlihat bahwa pada kontrol dan perlakuan ekstrak etil asetat
buah tomat sebesar 2%, diameter koloni cukup besar yaitu 0,467 dan 0,483
dengan diameter zona bening yang cukup besar pula. Lain halnya pada
konsentrasi 4%, meskipun diameter koloninya relatif besar ternyata tidak terdapat
zona bening di sekitar koloni bakteri. Hal ini menunjukkan bahwa ekstrak etil
asetat buah tomat sebesar 4% mampu menghambat produksi enzim eksoprotease
A. hydrophila. Terhambatnya produksi enzim eksoprotease pada pemberian
ekstrak etil asetat buah tomat sebesar 4% ini diduga disebabkan oleh kandungan
semi polar buah tomat mampu menghambat quorum sensing A. hydrophila.
Semakin besar konsentrasi ekstrak, semakin kecil diameter bakteri yang terbentuk.
Hal ini terlihat pada konsentrasi ekstrak 6% dan 8% yang mempunyai diameter
relatif kecil. Diameter koloni yang kecil ini menunjukkan adanya penghambatan
pertumbuhan A. hydrophila. Dengan demikian terjadinya penurunan produksi
enzim eksoprotease disebabkan oleh adanya penghambatan pertumbuhan A.
hydrophila. Senyawa semi polar buah tomat diduga bersifat sebagai antibakteri
yang mampu menghambat pertumbuhan A. hydrophila sehingga menghambat
produksi enzim eksoprotease A. hydrophila. Pada perlakuan ekstrak etil asetat
buah tomat ini, yang dilanjutkan pada uji pertumbuhan bakteri A. hydrophila
adalah ekstrak etil asetat buah tomat dengan konsentrasi 4%.
51
51
3). Produksi Enzim Eksoprotease A. hydrophila Pada Perlakuan Ekstrak Metanol
Buah Tomat (L. esculentum Mill.)
Metanol merupakan pelarut polar, sehingga mampu melarutkan senyawa
furanon dalam tomat. Ekstrak metanol buah tomat diduga mengandung senyawa
furanon yang mempunyai aktivitas sebagai penghambat sistem quorum sensing
(quorum sensing inhibitor) sehingga mampu menghambat produksi enzim
eksoprotease yang merupakan faktor virulensi A. hydrophila.
Ekstrak metanol buah tomat ditambahkan pada media Luria Bertani Agar
dengan variasi konsentrasi 0%; 2%; 4%; 6% dan 8%. Produksi enzim
eksoprotease A. hydrophila pada perlakuan ekstrak metanol buah tomat ini juga
menunjukkan adanya penurunan. Semakin besar konsentrasi ekstrak yang
ditambahkan, semakin kecil produksi enzim eksoproteasenya. Adapun produksi
enzim eksoprotease A. hydrophila setelah penambahan ekstrak metanol buah
tomat dapat dilihat pada Gambar 10.
52
52
Gambar 10. Produksi enzim eksoprotease A. hydrophila pada perlakuan ekstrak metanol buah tomat (L. esculentum Mill.)
Keterangan : 1. koloni bakteri. 2. zona bening (Zona bening di sekitar koloni bakteri menunjukkan adanya produksi enzim eksoprotease A. hydrophila)
a. Kontrol (media LB Agar) b. LB Agar ditambah ekstrak metanol buah tomat 2% c. LB Agar ditambah ekstrak metanol buah tomat 4% d. LB Agar ditambah ekstrak metanol buah tomat 6% e. LB Agar ditambah ekstrak metanol buah tomat 8%
a
c d
e
b
1
1 1
1
1
2
2
2
53
53
Pada Gambar 10a tampak bahwa pada kontrol terjadi produksi enzim
eksoprotease yang cukup besar yang terlihat dari zona bening yang ada di sekitar
koloni A. hydrophila. Pada konsentrasi 2% (Gambar 10b) masih menunjukkan
adanya produksi enzim eksoprotease terlihat dengan adanya zona bening di sekitar
koloni A. hydrophila. Hal ini menunjukkan bahwa konsentrasi tersebut belum
mampu menghambat sistem quorum sensing A. hydrophila. Pada konsentrasi
ekstrak 4% (Gambar 10c) memang masih menunjukkan produksi enzim
eksoprotease A. hydrophila, namun hanya kecil sekali apabila dibandingkan
dengan kontrol. Pada konsentrasi ini tidak tampak adanya penghambatan
pertumbuhan bakteri. Sedangkan pada konsentrasi 6% (Gambar 10d) dan 8%
(Gambar 10e) tidak terlihat adanya zona bening di sekitar koloni bakteri yang
menunjukkan tidak terjadi produksi enzim eksoprotease. Koloni bakteri yang
tumbuh relatif kecil yang menunjukkan terjadinya penghambatan pertumbuhan A.
hydrophila.
Berdasarkan hasil pengukuran diameter koloni bakteri dan luas zona
bening yang tersaji pada Tabel 4, dapat dilihat bahwa pada konsentrasi 4%,
produksi enzim eksoproteasenya memang relatif kecil yaitu sebesar 0,048 cm2
apabila dibandingkan dengan kontrol yang mempunyai luas zona bening 0,429
cm2. Adanya penurunan produksi enzim eksoprotease ini tidak disertai
penghambatan pertumbuhan, terlihat dari dimeter zona bening yang relatif besar.
Hal ini menunjukkan bahwa konsentrasi ini mampu menghambat sistem quorum
sensing A. hydrophila.
54
54
Tabel 4. Diameter koloni A. hydrophila dan luas zona bening pada perlakuan dengan ekstrak metanol buah tomat (L. esculentum Mill.)
Konsentrasi Rata-rata diameter
koloni (cm)
Rata-rata luas zona
bening (cm2)
Kontrol (0%) 0,467 0,429
2% 0,367 0,264
4% 0,308 0,048
6% 0,236 -
8% 0,216 -
Keterangan : tanda (-) menunjukkan tidak adanya zona bening di sekitar koloni bakteri
Pada Tabel 4 juga menunjukkan bahwa pada konsentrasi 6% dan 8% tidak
menunjukan adanya produksi enzim eksoprotease A. hydrophila, namun disertai
penghambatan pertumbuhan A. hydrophila terlihat dari diameter koloni A.
hydrophila yang kecil, sehingga terjadinya penghambatan produksi enzim diduga
disebakan oleh terhambatnya pertumbuhan bakteri A. hydrophila.
Penurunan produksi enzim eksoprotease A. hydrophila ini disebabkan oleh
adanya penghambatan sistem quorum sensing A. hydrophila. Berdasarkan
penelitian Swift et al. (1999) penghambatan quorum sensing dapat dilakukan
dengan menambahkan senyawa analog C4-HSL pada kultur A. hydrophila.
Penghambatan quorum sensing dapat dilakukan oleh senyawa yang mirip dengan
molekul sinyal sebagai quorum sensing inhibitors (QSI). Pada perlakuan ekstrak
metanol buah tomat ini, senyawa yang diduga mampu menghambat sistem
quorum sensing A. hydrophila sehingga mampu menghambat produksi enzim
eksoprotease A. hydrophila adalah senyawa furanon dalam ekstrak buah tomat.
55
55
Dalam buah tomat ini, furanon terdapat dalam bentuk furaneol (2,5 dimetil, 4-
hidroksi-3(2H)-furanon) (Buttery et al., 2001). Berdasarkan penelitian Rasmussen
et al. (2000), halogen furanon yang merupakan metabolit sekunder dari makroalga
laut Delisea pulchra mampu menghambat molekul sinyal N-Butanoyl-L–
Homoserine Lactone pada Serratia liquefaciens sehingga menghambat motilitas
Serratia liquefaciens.
Senyawa yang bertindak sebagai QSI mampu menghambat quorum sensing
dalam konsentrasi yang relatif kecil (Hentzer and Givskov, 1999). Apabila
diberikan dalam konsentrasi yang lebih besar, senyawa QSI akan bersifat sebagai
antibakteri yang menghambat pertumbuhan bakteri (Rasch et al., 2004). Dalam
penelitian ini terbukti bahwa pada konsentrasi 4%, senyawa dalam ekstrak
metanol buah tomat mampu menurunkan produksi enzim eksoprotease tanpa
menghambat pertumbuhan A. hydrophila. Pada saat ekstrak metanol buah tomat
diberikan pada konsentrasi lebih besar yaitu 6% dan 8% terjadi penghambatan
produksi enzim eksoprotease, namun disertai penghambatan pertumbuhan A.
hydrophila, sehingga berdasarkan prinsip quorum sensing inhibitors (QSI) yang
mampu menghambat faktor virulensi bakteri (dalam penelitian ini adalah produksi
enzim eksoprotease A. hydrophila) tanpa menghambat pertumbuhan bakteri itu
sendiri maka yang dilanjutkan ke tahap pengujian produksi enzim eksoprotease A.
hydrophila secara kuantitatif adalah ekstrak metanol buah tomat dengan
konsentrasi 4%. Penelitian ini terfokus pada senyawa QSI bukan pada antibakteri
karena pada umumnya senyawa antibakteri mempunyai dampak negatif yaitu
56
56
munculnya resistensi bakteri dan timbulnya strain bakteri yang baru sehingga
penggunaan senyawa antibakteri menjadi kurang efektif.
C. Pertumbuhan A. hydrophila Pada Perlakuan Ekstrak Buah Tomat
(L. esculentum Mill.)
Pertumbuhan bakteri A. hydrophila setelah pemberian ekstrak buah tomat
diketahui dengan membuat kurva pertumbuhan. Pengukuran pertumbuhan
digunakan untuk mengetahui bahwa penghambatan produksi enzim eksoprotease
A. hydrophila tidak disebabkan oleh terhambatnya pertumbuhan A. hydrophila,
namun disebabkan oleh terhambatnya sistem quorum sensing yang mengontrol
sintesis enzim eksoprotease tersebut. Pengukuran pertumbuhan A. hydrophila
hanya dilakukan pada perlakuan yang menunjukkan penurunan produksi enzim
eksoprotease secara kualitatif tanpa terhambat pertumbuhannya yaitu pada
perlakuan ekstrak metanol buah tomat sebesar 4% dan ekstrak etil asetat tomat
sebesar 4%.
Gambar 11 menunjukkan pertumbuhan A. hydrophila setelah perlakuan
ekstrak metanol buah tomat sebesar 4% dan ekstrak etil asetat buah tomat sebesar
4%. Selain itu, dilakukan pula pengukuran pertumbuhan A. hydrophila dengan
penambahan pelarut etil asetat dan metanol dalam media LB cair untuk
mengetahui pengaruh pelarut yang digunakan untuk mengekstrak buah tomat
terhadap pertumbuhan A. hydrophila. Secara umum kurva pertumbuhan
menunjukkan pertumbuhan bakteri yang terdiri dari fase lag, fase eksponensial,
dan fase stasioner.
57
57
Gambar 11. Kurva pertumbuhan A. hydrophila
Keterangan : A : Kontrol negatif (media LB broth) B : Kontrol positif (media LB broth + pelarut etil asetat 4%) C : Kontrol positif (media LB broth + pelarut metanol 4%) D : Media LB broth + ekstrak etil asetat buah tomat 4% E : Media LB broth + ekstrak metanol buah tomat 4%
Berdasarkan Gambar 11, fase lag tidak begitu kelihatan. Hal ini diduga
disebabkan bakteri sudah mampu beradaptasi dengan media cair yang digunakan.
Pada fase lag, sel bakteri mengalami perubahan dalam komposisi kimiawi dan
bertambah ukurannya, namun belum ada penambahan populasi bakteri (Pelzar and
Chan, 1992). Pada fase eksponensial terjadi penambahan massa sel dengan cepat
(Pelzar and Chan, 1992). Fase eksponensial A. hydrophila pada penelitian ini
berlangsung pada jam ke-0 sampai jam ke-10. Pada fase stasioner, terjadi
penumpukan produk beracun dan terjadi kekurangan nutrien sehingga beberapa
sel mati sedangkan yang lain tetap tumbuh sehingga jumlah sel hidup menjadi
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24
Waktu pengukuran (jam)
nila
i OD
A B C D E
58
58
tetap (Pelzar and Chan, 1992). Pada penelitian ini fase stasioner berlangsung pada
jam ke-12 sampai jam ke-24.
Pada perlakuan ekstrak metanol buah tomat sebesar 4% dan kontrol positif
yang ditambah pelarut metanol, pertumbuhan A. hydrophila berlangsung dengan
normal, tidak terjadi penghambatan pertumbuhan A. hydrophila, terlihat dengan
nilai Optical density (OD) yang relatif sama dengan kontrol. Sedangkan pada
kontrol yang ditambah pelarut etil asetat, menunjukkan penghambatan
pertumbuhan A. hydrophila. Etil asetat mengandung asam asetat. Asam mampu
menyebabkan denaturasi protein sel bakteri, sehingga terjadi koagulasi protein sel
bakteri dan akhirnya bakteri mati kemudian sel bakteri menjadi menggumpal dan
cenderung turun ke bawah dasar erlenmeyer saat pengukuran pertumbuhan A.
hydrophila. Pada perlakuan ekstrak etil asetat buah tomat sebesar 4% terjadi
penghambatan pertumbuhan bakteri A. hydrophila. Hal ini dimungkinkan akibat
adanya kandungan senyawa semi polar dalam tomat yang mampu menghambat
pertumbuhan bakteri A. hydrophila. Sehubungan dengan terhambatnya
pertumbuhan A. hydrophila setelah penambahan ekstrak etil asetat buah tomat
sebesar 4%, maka perlakuan ini tidak dilanjutkan pada tahap uji kuantitatif
aktivitas enzim eksoprotease A. hydrophila.
D. Penurunan Produksi Enzim Eksoprotease A. hydrophila Secara
Kuantitatif
Di dalam sel, jumlah enzim yang ada hanya kecil sehingga pengukuran
kadar enzim dalam ekstrak jaringan akan menjadi sangat sulit. Oleh karena itu,
59
59
pengukuran produksi enzim dalam sebuah ekstrak jaringan atau cairan biologik
lain dilakukan dengan mengukur aktivitas katalisis enzim. Jumlah molekul atau
massa enzim yang ada sukar ditentukan sehingga hasil pengukurannya
dinyatakan dalam bentuk unit aktivitas enzim (Murray et al., 1996).
Pengukuran produksi enzim eksoprotease A. hydrophila secara kuantitatif
hanya dilakukan pada perlakuan yang menunjukkan penurunan aktivitas
proteolitik pada uji kualitatif dan yang tidak menghambat pertumbuhan A.
hydrophila. Hal ini sesuai dengan prinsip quorum sensing inhibitors yang mampu
menghambat ekspresi gen penyandi faktor virulen, tanpa menghambat
pertumbuhan dari bakteri itu sendiri. Pada penelitian ini, hanya ekstrak metanol
buah tomat sebesar 4 % yang diuji kuantitatif aktivitas enzim eksoprotease.
Uji aktivitas enzim eksoprotease A. hydrophila secara kuantitatif dilakukan
dengan menggunakan azocasein sebagai substratnya. Azocasein akan dihidrolisis
oleh enzim eksoprotease menjadi peptida dan asam amino yang akan membentuk
warna apabila ditambah dengan NaOH. Intensitas warna yang terbentuk dapat
diukur nilai absorbansinya dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 440
nm.
Produksi enzim eksoprotease setelah pemberian ekstrak metanol buah
tomat sebesar 4% dibandingkan dengan kontrol untuk mengetahui persentase
penurunan produksi enzim eksoprotease. Untuk memastikan bahwa penurunan
produksi enzim eksoprotease itu disebabkan oleh senyawa dalam tomat dan bukan
pelarut metanolnya, maka dilakukan pula uji aktivitas enzim eksoprotease
kuantitatif pada media LB broth dengan penambahan pelarut metanol sebesar 4%.
60
60
Adapun produksi enzim eksoprotease A. hydrophila selama 24 jam dapat dilihat
pada Gambar 12.
Gambar 12 . Kurva produksi enzim eksoprotease A. hydrophila
Keterangan : A : Kontrol ditambah pelarut metanol sebesar 4% B : Perlakuan dengan penambahan ekstrak metanol buah tomat sebesar 4% C : Kontrol
Berdasarkan Gambar 12. produksi enzim eksoprotease sudah terdeteksi
sejak jam ke-0. Hal ini terjadi karena kepadatan bakteri pada jam ini telah
memenuhi quorum untuk berjalannya quorum sensing A. hydrophila (Gambar 11)
Produksi enzim eksoprotease cenderung stabil setelah jam ke-12 (pada fase
stasioner). Pada kontrol yang ditambah pelarut metanol tidak menunjukkan
adanya penghambatan produksi enzim eksoprotease. Pelarut metanol tidak
menghambat produksi enzim eksoprotease A. hydrophila karena metanol tidak
0
2
4
6
8
10
12
14
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24
WAKTU (JAM)
unit
aktiv
itas
enzi
m/m
l
A B C
61
61
mampu menghambat sistem quorum sensing A. hydrophila. Pada penelitian
Rasmussen et al. (2005) pelarut metanol memang tidak menunjukkan aktivitas
sebagai quorum sensing inhibitors.
Pada pemberian ekstrak metanol buah tomat menunjukkan adanya
penurunan produksi enzim eksoprotease A. hydrophila (Gambar 12). Produksi
enzim eksoprotease pada perlakuan ekstrak metanol buah tomat ini dibandingkan
dengan kontrol untuk memperoleh persentase penurunan produksi enzim
eksoprotease A. hydrophila. Pada kontrol, produksi enzim eksoprotease terbesar
terjadi pada jam ke-4 dan ini dianggap 100%, sehingga penurunan produksi enzim
eksoprotease A. hydrophila dihitung dengan membandingkan produksi enzim
eksoprotease setelah pemberian ekstrak metanol buah tomat dengan kontrol pada
jam ke-4. Histogram persentase produksi enzim eksoprotease A. hydrophila dapat
dilihat pada Gambar 13.
Gambar 13. Histogram produksi enzim eksoprotease A. hydrophila pada jam Ke-4
Keterangan :
A : Perlakuan ekstrak metanol buah tomat sebesar 4% B : Kontrol
020406080
100
% p
rodu
ksi e
nzim
ek
sopr
otea
se
A B
perlakuan
62
62
Penurunan produksi enzim eksoprotease A. hydrophila pada pemberian
ekstrak metanol buah tomat 4% adalah sebesar 71,68%. Adanya penurunan
produksi enzim eksoprotease ini diduga disebabkan oleh adanya aktivitas senyawa
furanon dalam ekstrak metanol buah tomat yang bertindak sebagai C4-HSL
analog. Senyawa furanon mempunyai struktur mirip dengan C4-HSL sehingga
berkompetisi dengan C4-HSL untuk berikatan dengan protein Lux R dan akhirnya
menghambat terjadinya induksi gen penyandi enzim eksoprotease (Manifield et
al., 1999). Gao et al. (2003) dan Bauer and Robinson (2002) menyebutkan bahwa
tanaman tomat mengeluarkan senyawa yang mampu menirukan aktivitas molekul
sinyal AHL pada sistem quorum sensing bakteri, dan mempunyai efek yang
spesifik terhadap quorum sensing bakteri.
63
63
BAB V
KESIMPULAN DAN SARAN
A. Kesimpulan
1. Terjadi penurunan produksi enzim eksoprotease setelah pemberian ekstrak
metanol buah tomat (L. esulentum Mill.) sebesar 4%
2. Ekstrak metanol buah tomat (L. esulentum Mill.) mampu menurunkan
produksi enzim eksoprotease A. hydrophila sebesar 71,68%, tanpa
menghambat pertumbuhan A. hydrophila.
B. Saran
Perlu penelitian lebih lanjut untuk mengetahui produksi enzim
eksoprotease A. hydrophila menggunakan senyawa furanon murni yang diisolasi
dari buah tomat (L. esculentum Mill.) beserta analisis ekspresi gen untuk
mengetahui pengaruh senyawa furanon tersebut terhadap gen penyandi enzim
eksoprotease A. hydrophila.
64
64
DAFTAR PUSTAKA
Afrianto, E.A dan Liviawaty, E. 1992. Pengendalian Hama dan Penyakit Ikan Yogyakarta : Kanisius.
Alavandi, A., S. A. Anathan., and G. Kang. 1998. Prevelance in Vitro Secretory Activity and Cytotoxicity of Aeromonas species Associated With Chilhood Gastroenterisis in Chennai (Madras) India. Jpn.J.Med.Sci.Biol (51):1-12
Allan, B.J. and R.M. Stevenson. 1981. Extracelluler Virulence Factors of A. hydrophila in Fish infection. Can J. Microbiol, 27: 1114-1122.
Atherton, J.G. and J. Rudich. 1996. The Tomato Crop. London : Chapman and Hall.
Bassler, B.L., M. Wright., R.C. Showalter., and M.R. Silverman. 1993. Intercelluler Signalling In Vibrio harveyi : Sequence and Function Of Gene Regulating Expression Of Luminescence. Mol microbiol, 2 : 773-786.
Bauer, W.D. and J.B. Robinson. 2002. Disruption of Bacterial Quorum Sensing by Other Organism. Current Opinion Biotechnology. 13 : 234-237
Bottarelli, E., and M.C. Ossiprandi. 1999. Aeromonas Infections : An Update. http://www.unipr.it/arpa/facvet/annali/1999/bottarelli2/bottarelli.htm.
Buttery, R.G., G.R. Takeda., M. Naim., H. Rabinowitch., and Y. Nam. 2001. Analysis of Furaneol in Tomato Using Dynamic headspace sampling with Sodium Sulfate. J. agric food chem, 49 : 4349-4351.
Cascon, A., J. Yugueros., A. Temprano., M. Sanchez., C. Hernanz., J.M. Luengo., and G. Maharro. 2000. A Major Secreted Elastase Is Essential for Pathogenicity Of Aeromonas hydrophila. Infect and Immun, 86(6) : 3233-3241.
Dong, Y.H., A.R. Gusti., Q. Zhang., J.L. Xu., and L.H. Zhang. 2002. Identification of Quorum Quenching N-Acyl Homoserine Lactonases from Bacillus Species. Appl and Environ Microbiol. 64 (4) : 1754-1759
Eberl, L. 1999. N-Acyl Homoserine lactone. Mediated Genes Regulation in Gram Negative Bacteria. Syst.Appl. Microbiol, 22(4) : 493-506.
Finch, R.G., D.I. Pritchard., B.W.P. Williams., and G.S.A.B. Stewart. 1998. Quorum Sensing : A Novel Target For Anti Infective Therapy. Jurnal of Antimicrob. Chemotherapy, 42 : 569-571.
65
65
Fardiaz, S. 1993. Analisis Mikrobiologi Pangan. Jakarta : PT Grafinddo Persada
Fryer, J.L and J.L. Bartholomew. 1996. Established and Emerging Infectious Disease of Fish. ASM News, 62 : 592-594.
Gavriel, A.A., J.P. Landre., and A.J. Lamb. 1998. Incidence of Mesophilic Aeromonas Within A public Drinking Water Supply in North East Schotland. J. Appl. Microbiol (84) : 383-392.
Gao, M., M. Teplitski., J.B. Robinson., and W.D. Bauer. 2003. Production of Substances by Medicago truncatula That Affect Bacterial Quorum Sensing. MPMI. 16 (9) : 827-834
Givskov, M., R. de Nys., .M. Manefield, L. Gram., R. Maximilein., L. Eberl., S. Molin., P.D. Steinberg., and S. Kjelleberg. 1996. Eukaryotic Interference with Homoserine Lactone Mediated Prokariotic Signalling. J. Bacteriol . 179 : 6618-6622.
Gram, L., A.B. Christensen., L. Ravn., S . Molin., and M. Givskov. 1999. Production of Acylated Homoserine Lactones by Psichrotrophic Members of The Enterobacteriaceae Isolated From Food. Appl. And Environ. Microbiol. 65(8) : 3458-3463
Hanlon, G. and N.A. Hodges. 1981. Bacitracin and Protease Production In Relation to Sporulation During Exponensial Growth Of Bacillus licheniformis On Poorly Utilized Carbon and Nitrogen Sources. J. Bacteriol, 162(2) : 427-431.
Hayes, J. 2000. Aeromonas hydrophila. Oregon State University : Disease of Fish spring Term Project 2000 (on line). http://www.. Hmsc.orst.edu/classes/hydrophila hayes.
Hentzer, M. and M. Givskov. 2003. Pharmacological Inhibition of Quorum Sensing for The treatment of Chronic Bacterial Infection. J. Clint. Invest (112): 1300-1307.
Ibrahim, A. and I.C. Mac Rae. 1991. Incidence of Aeromonas and Listeria sp. In Red Meat and Milk Sample in Brisbane, Australia. Int.J. Food microbiol (12): 263.
Janda, J.M and S.L. Abbot. 1998. Evolving Concepts Regarding The Genus Aeromonas : An Expanding Panorama of Species, Disease Presentation and Unanswered Question. Clin.infect.Dis, 27 : 332-344.
Khalil. 1997. Toxicity of Crude Extracelluler Products of Aeromonas hydrophila in Tilapia, Tilapia nilotica. Lett. Appl.Microbiol. 25(4): 269-273
66
66
Kievit, T.R and B.H. Igleweski. 2000. Bacterial Quorum Sensing in Phatogenic Relationship. Infect and Immun. September 2000. p.4839-4849
Kordi, M.G.H. 2004. Penanggulangan Hama dan Penyakit Ikan . Jakarta : Rineka Cipta dan Bina Aksara.
Lonn, J. 2005. May We Fight Bacteria by Inhibitting Cell-Cell Signaling UsingFuranon?. Institute of Oral Biology. Dental Faculty, Universitas Of Oslo Norway. www.odont.uio.no/forsking/uldanning
Lynch, M.J. 2002. The Regulation of Biofilm Development by Quorum Sensing in Aeromonas hydrophila. Environ Microbiol, 4: 18-28.
Maalej, S., M. Denis., and S. Dukan. 2004. Temperature and Growth Phase Effect on Aeromonas hydrophila Survival in Natural Sea Water Microcosm : Role of Protein Synthesis and Nucleic Acid Content on Viable But Temporarily non Culturable response. Microbiol, 150 : 181-187.
Manefield, M., R. de Nys., N. Kumar, R. Read., M. Givskov., P. Steinberg., and S. Kjelleberg,. 1999. Evidence That Halogenated Furanones From Delisea Pulchra Inhibit Acylated Homoserine Lactone (AHL) Mediated Gene Expression By Displacing the AHL Signal From Its Receptor Protein. Microibol. 145 : 283-291.
Martinelli, D., G.U. Sequin., H. Brandl., R. Bachosen. 2004. Effect of Natural and Chemichally Synthesised Furanones on Quorum sensing in Chromobacterium violaceum. BMC Microbiol. 4:25.
Mary, P., N.E. Chihib., O. Charafeddine., C. Defives., and J.P. Hornez. 2002. Starvation Survival and Viables But Nonculturable States in Aeromonas hydrophila. Microb. Ecology, 43(2) : 250-258.
McMahon, M.A.S. 2004. The Effect of Modified Atmosphere on Growth and Extracelluler Protein Production in Aeromonas hydrophila. www.science.ulst.ac.uk/food/Aeromonas.htm
Merino, S., S. Camprubi., and J.M. Thomas. 1992. The Effect of Growth Temperature on Outer Membrane Components and Virulence of Aeromonas hydrophila Strain of Serotype 0 : 34. Infect Immun, 60 (10) : 4343-4349.
Murray, R.K., D.k. Granner., P.A. Mayes., and V.W. Rodwell. 1996. Biokimia Harper.edisi 24. Jakarta : EGC : 68
Nieto, T.P. and A.E. Ellis. 1986. Characterisation Of Extracelluler Metallo and Serine Proteases Of Aeromonas hydrophila Strain B51. J.Gen Microbiol. 132(70 ; 1975-1979.
67
67
Noga, E.J. 1995. Fish Desease : Diagnosis and Treatment. The C.V Mosbi Company Missoury.
Parsek, M.R., and E.P. Greenberg. 1997. Acyl Homoserine Lactone Quorum Sensing In Gram Negative Bacteria : A Signalling Mechanism Involved Association With Higher Organism: http://www.pnas.org/cgi/content/full/96/16/8789=fn152.
Pelzar, J.M. and E.C.S. Chan. 1992. Dasar-dasar Mikrobiologi. Jakarta : UI Press
Purnomo, A.T. dan Purwanto, D.A. 2001. Karakterisasi Enzim Proteolitik Bacillus Subtilis FNCC 0059. Surabaya : Fakultas Farmasi Universitas Airlangga
Rasch, M., C. Buch., B. Austin., W.J. Slierendrecht., K.S. Ekmann., J.L.Larsen., C. Johansen., K. Riedel., L. Eberl., M. Givskov., and L. Gram. 2004. An Inhibitor Of Bacterial Quorum Sensing Reduces Mortality Caused By Vibriosis in Rainbow Trout ( Oncorhynchus mykiss, wal baum). Systematic and Appl microb, 24(3) : 350-359.
Rasmussen, T.B., M. Manefield., J.B. Anderson., L. Eberl., U. Anthoni., C. Christophersen., P. Steinberg., S. Kjelleberg., and M. Givskov. 2000. How Delisea pulchra Furanones Affect Quorum Sensing and Swarming Motility in Serratia liquefaciens MGJ. Microbiol (146) : 3237-3244.
Rasmussen, T.B; T. Bjarnsholt; M.E. Skindersoe; M. Hentzer; P. Kristoffersen.; M. Kote; J. Nielson; L. Eberl; and M. Givskov. 2005. Screening for Quorum Sensing Inhibitors by Use of A Novel Genetic System The Quorum Sensing Selector. J. Bacteriol. 185(5): 1755-1814
Rodrigues, L.A., A.E. Ellis and T.P. Nieto. 1992. Purification and Characterization of an Extracellular Metalloprotease, Serine Protease, and Hemolisin of Aeromonas hydrophila I strain B32: All are lethal for Fish. Microbpathogen (13) : 17-24.
Sautor, M., P. Mary., N.E. Chihib., and J.P. Hornez. 2003. The Effect Of Temperature, Water Activity and pH on The Growth of Aeromonas hydrophila and on its Subsequent Survival in Microscosm Water. Appl.microbiol. 95(4) : 807-813.
Sauriasari, R. 2006. Mengenaal dan Menangkal Radikal Bebas. Berita iptek. 22 Januari 2006.www.beritaiptek.com.
Schauder, S.,and B.L.Bassler. 2001. The Language Of Bacteria. J. Microbiol. 15(12) : 1468-1480.
68
68
Secades, D. and J.A. Guijarro. 1999. Purification and Characterization of an Extracelluler Proteases from Fish Pathogen Yersinia ruckeri and Effect of Cultures Condition and Production. Applied and Environmental Microbiol. 65 (9), : 3969-3975.
Steenis, C.G.G.J.V. 1997. Flora Untuk Sekolah di Indonesia. Jakarta : PT. Pradnya Paramita.
Sunarjono, H. 2004. Bertanam 30 Jenis Sayur. Jakarta : Penerbit Swadaya.
Swift, S., A.V. Karlyshev., L. Fish., El Durant., M.K Winson., S.R. Chhabra., P. Williams., S. Macintyre., and G.S. Stewart. 1997. Quorum Sensing In Aeromonas hydrophila and Aeromonas salmonicida Identification Of The LuxRI Homologs and Asa RI and Their Cognate N-acylhomoserine Lactone Signal Molecules. J.Bacteriol. 179(17) : 5271-5281.
Swift, S., M.J. Lynch., L. Fish., D.F. Leink., J.M. Thomas., C.J. A.B. Stewart., P. Williams. 1999. Quorum Sensing –Dependent Regulation and Blokade of Eksoprotease Production in Aeromonas hydrophila . Infection and imunity. 4 : 18-28.
Taga, M.E. and B.L. Bassler. 2003. Chemical Communication among Bacteria. Pnas Vol. 100 (2) : 14549-14554
Tjitrosoepomo, G. 2002. Taksonomi Tumbuhan (Spermatophyta). Yogyakarta : Gadjah Mada University Press.
Wardhani, S.Z. 2005. Pemantauan Aktivitas Penangkapan Radikal Bebas Secara Kromatografi Lapis Tipis Pada Lalapan. [Tesis]. Departemen farmasi JBPTPTBFA.
Winarno, F.G. 1986. Enzim Pangan. Jakarta : PT Gramedia : 11
69
69
Lampiran 1. Komposisi Medium
1. Nutrient Agar dalam 1 liter aquades (Fardiaz, 1993)
Agar…………………………………………………………………. 15,0 g
Pepton……………………………………………………………… 5,0 g
NaCl………………………………………………………………. 5,0 g
Yeast Extract……………………………………………………… 2,0 g
Beef Extract……………………………………………………… 1,0 g
2. Luria Bertani (LB) Agar dalam 1 liter aquades
Tryptone…………………………………………………………… 10,0 g
Yeast Extract………………………………………………………. 5,0 g
NaCl……………………………………………………………….. 10,0 g
Agar……………………………………………………………….. 15,0 g
3. Luria Bertani (LB) Broth dalam 1 liter aquades
Tryptone…………………………………………………………… 10,0 g
Yeast Extract………………………………………………………. 5,0 g
NaCl……………………………………………………………….. 10,0 g
Glukosa…………………………………………………………… 5,0 g
70
70
UCAPAN TERIMA KASIH Segala puji bagi Allah SWT yang telah memberikan rahmat-Nya sehingga
penulis dapat menyelesaikan naskah skripsi yang berjudul “PENURUNAN
PRODUKSI ENZIM EKSOPROTEASE Aeromonas hydrophila OLEH
EKSTRAK BUAH TOMAT (Lycopersicon esculentum Mill. )”. Penyusunan
naskah skripsi ini tidak terlepas dari bantuan berbagai pihak, oleh karena itu
penulis mengucapkan terima kasih kepada :
1. Bapak dan Ibu serta keluarga di rumah yang telah memberikan seluruh
kasih sayang kepada penulis.
2. Bapak Drs. Marsusi, M. S selaku Dekan Fakultas Matematika dan Ilmu
Pengetahuan Alam Universitas Sebelas Maret Surakarta.
3. Bapak Drs. Wiryanto, M. Si selaku Ketua Jurusan Biologi Fakultas
Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Sebelas Maret
Surakarta.
4. Bapak Prof. Drs. Sutarno, M.Sc., Ph.D selaku pembimbing I yang telah
membimbing dan mengarahkan dalam pelaksanaan penelitian dan
penyusunan skripsi.
5. Ibu Ari Susilowati, M. Si selaku pembimbing II yang telah membimbing
dan mengarahkan dalam pelaksanaan penelitian dan penyusunan skripsi.
6. Ibu Dra. Ratna Setyaningsih M. Si, selaku penguji I yang telah
memberikan masukan pada skripsi ini
7. Ibu Solichatun, M. Si selaku penguji II yang telah memberikan masukan
pada skripsi ini.
71
71
8. Ibu Artini Pangastuti, M. Si atas segala masukan dan bantuan pada skripsi
ini
9. Bapak Tjahjadi Purwoko, M.Si selaku pembimbing akademik yang telah
mengarahkan selama menempuh studi.
10. Kepala Sub Laboratorium Biologi, Laboratorium Pusat MIPA Universitas
Sebelas Maret Surakarta yang telah memberikan izin penelitian, beserta
seluruh staff yang telah membantu penulis dalam pelaksanaan penelitian di
laboratorium.
11. Umi Lestari, S.Si atas semua ilmu yang ditularkan padaku, atas semua
bantuan dan dorongannya mulai dari awal pembuatan proposal sampai
tersusunnya naskah skripsi ini .
12. Dian Ratnasih, Irmawati, Wiwin Undari, Slamet Mardiyanto, Feri Lina,
Isnaini N.H, Sevi Sawestri, Ana Fitri, Ana N.C dan teman-teman biologi
angkatan 2002 atas bantuan dan dorongan semangat selama penelitian
13. Teman-teman Kost Bu Husein atas persaudaraan dan persahabatan yang
kita jalin dan support yang diberikan.
14. Teman-teman seperjuangan di sub Lab. Biologi terima kasih atas segala
kerjasamanya
15. Rekan-rekan Biologi angkatan 2001, 2003, dan 2004.
16. Teman-teman remaja masjid Sabilarrosyad Sekarpace
17. Semua pihak yang tidak dapat disebutkan satu-persatu.
72
72
RIWAYAT HIDUP PENULIS
Penulis dilahirkan di Klaten pada tanggal 22 Mei 1984. Tahun 1996
penulis menyelesaikan pendidikan dasar di SD Gondangsari II. Selanjutnya,
penulis menyelesaikan pendidikan menengah di SLTPN I Juwiring pada tahun
1999 dan SMUN 1 Wonosari Klaten pada tahun 2002. Penulis diterima sebagai
mahasiswa di Jurusan Biologi FMIPA UNS melalui jalur UMPTN pada tahun
2002.
Selama menempuh pendidikan di Jurusan Biologi FMIPA UNS, penulis
pernah Magang di Pusat Penelitian dan Pengembangan Bioteknologi dan
Biodiversitas Lembaga Penelitian dan Pengabdian Masyarakat (LPPM) UNS,
pernah menjadi asisten praktikum mata kuliah Mikrobiologi, Genetika, Biologi
Molekuler, Limnologi, Struktur Perkembangan Tumbuhan I, II, dan III,
Taksonomi Tumbuhan I, dan Biologi umum. Tahun 2006 Penulis menjadi juara
pertama pada Lomba Karya Tulis mahasiswa tingkat Universitas Sebelas Maret,
dan termasuk sepuluh besar dalam Lomba Karya Tulis Mahasiswa tingkat
Wilayah B dengan judul karya tulis “ Penghambatan Faktor Virulensi Aeromonas
hydrophila Oleh Bawang Putih (Allium sativum Linn.) Sebagai Upaya
Pencegahan Penyakit Motile Aeromonads Septicemia Pada Ikan”. Pada tahun
yang sama Penulis juga terpilih sebagai Mahasiswa Berprestasi Tingkat Jurusan
Biologi Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, serta juara kedua
lomba Mahasiswa Berprestasi Tingkat Fakultas Matematika dan Ilmu
Pengetahuan Alam. Penulis pernah menjabat sebagai staff Bidang Kaderisasi dan
73
73
Pengembangan Organisasi HIMABIO pada periode 2003/2004, staff Bidang
Kaderisasi dan Pengembangan Organisasi HIMABIO pada periode 2004/2005,
staf Departemen Kemuslimahan SKI FMIPA pada periode 2003/2004,
Koordinator Keilmiahan Kelompok Studi Jamur dan Tanaman Obat (MUTANT),
serta Dewan Perwakilan Angkatan HIMABIO pada periode 2005/2006.
Top Related