8/16/2019 Contoh Dan Cara Pembuatan Kotoran Sapi
1/9
USE OF PCR FOR DIRECT DETECTION OF CAMPYLOBACTER SPECIES IN
BOVINE FECES
Contoh Penerapan Amplifia!i "en
Jurnal ini membahas mengenai penggunaan PCR untuk langsung mendeteksi danmembedakan spesies Campylobacter dalam kotoran sapi tanpa pengayaan uraniumnya. Inhibitor
yang ada dalam tinja adalah rintangan utama untuk menggunakan PCR dalam mendeteksi
mikroorganisme. Metode mini kit ternyata tidak manjur untuk ekstraksi, seperti yang ditetapkan
oleh amplifikasi positif dari internal kontrol D! ditambahkan ke kotoran sapi sebelum
ekstraksi. Campylobacter coli, C. janin, C. hyointestinalis, dan C. jejuni tersebut diletakkan atau
seminested multiple" PCR, yang dideteksi pada semua sampel kotoran, kemudian diinokulasi di
#$% C&' g(# dan )$ hingga *+ dari sampel diinokulasi di #$+ C&' g(# terbukti positif. Pada
#$- C&' g(# C. fetus, C. hyointestinalis, and C. jejuni #/ hingga )$ persen dari sampel 0 selain
C. coli terdeteksi oleh PCR. Dari kotoran sapi uninoculated, dipilih secara acak sebanyak #12
Campylobacter diisolasi ditemukan di empat yang umum digunakan di tiga media isolasi dalam
inkubasi.
3elompok yang paling sering ditemukan adalah C. jejuni #)-0 dan C. lanienae %-0,
tapi mengisolasi C. Janin. Janin, !rcobacter but4leri, dan. 5kirro6ii juga ditemukan. &rekuensi
isolasi Campylobacters cukup ber7ariasi terpantau di antara empat media dan tiga suhu inkubasi
yang diujikan. Dengan primer genus(specific, Campylobacter D! itu terdeteksi di /) persen
sampel kotoran, terjadi * persen peningkatan dibandingkan dengan yang diperoleh dari
sensiti7itas isolasi mikrobiologi di empat media dan tiga suhu inkubasi yang diujikan. Dengan
primer bersarang, C. jejuni dan C. lanienae tersebut yang masing(masing terdeteksi -) dan 2/
persen dari sampel. 8idak ada D! yang terlihat baik dari C. coli, C. janin, atau C.
hyointestinalis dideteksi pada kotoran sapi yang tidak diinokulasi. PCR lebih sensitif dari isolasi
mikrobiologi pada media untuk mendeteksi C. lanienae #/ 0 tetapi tidak C. jejuni.
Campylobacters yang beragam dan pengembangan langsung PCR tidak hanya akan
meningkatkan pemahaman tentang spesies Campylobacter yang beragam dan frekuensi
kemunculannya dalam kotoran, tetapi juga akan meningkatkan pengetahuan tentang peran
mereka dalam saluran pencernaan ternak dan dari sejumlah faktor yang mempengaruhi.
8/16/2019 Contoh Dan Cara Pembuatan Kotoran Sapi
2/9
Cara Pem#$atan
Perkembangan percobaan. Percobaan yang dilakukan untuk setiap tujuan disajikan pada
9ambar. #. 'ntuk tujuan pertama 9br. #!0, D! pengendalian internal dan primer untuk
mendeteksi spesies Campylobacter langsung dalam kotoran dikembangkan. 'ntuk tujuan kedua
9ambar. #:0, sensiti7itas PCR untuk memperkuat spesies ganjil(lobacter langsung dari kotoran
sapi diinokulasi dengan empat taksa itu com(dikupas dengan yang pengenceran plating. 3hasiat
dari D! ekstraksi kit komersial untuk menghapus inhibitor PCR juga dipastikan dengan
menggunakan D! pengendalian internal dirancang untuk digunakan dengan Campylobacter
genus spesifik primer. 'ntuk ketiga ob(jecti7e 9ambar. #C0, deteksi spesies Campylobacter
dalam kotoran sapi tanpa inokulasi dengan PCR dibandingkan dengan pengenceran plating.
3arena fre(;uency tinggi isolasi C. lanienae, primer bersarang dikembangkan untuk takson ini
dan kemudian digunakan dalam PCR multiple" dengan primer untuk C. janin.
8ujuan #. i0 'ji taksa dan budaya kondisi. Primer untuk mendeteksi D! dari Campylobacter
genus, C. coli, C. janin, C. hyointestinalis, dan C. jejuni langsung dalam kotoran sapi yang
dikembangkan 8abel #0. 3ami memilih ini taksa menjadi penyebab hubungan mereka dengan
spesies sapi. 'ntuk meningkatkan sensiti7itas dan spec(ificity, primer untuk C. coli, C. janin, C.
hyointestinalis, dan C. jejuni yang bersarang atau seminested. 5elanjutnya, C. coli dan C. jejuni
diuji oleh multipleks PCR.
5train referensi berikut ini digunakan untuk menguji primer yang kita de7el(oped< !rcobacter
but4leri !8CC %12#2 =3oleksi :udaya 8ipe !merika>0, !. cryaerophilus !8CC %11%-0, C. coli
?C #### =3esehatan 3anada> dan !8CC %11%# 0, C. concisus !8CC ++-+/0, C. janin subsp.
janin !8CC -)1+20, C. janin subsp. 7enerealis !8CC #1%+*0, C. hyointestinalis subsp.
hyointestinalis !8CC +)-#/0, C. hyointestinalis subsp. la6sonii C8C #-1$# =ational
Collection of 8ype :udaya dan Pathogenic Jamur>0, C. jejuni ?C ##$-, ?C ##$%, ?C ###), ?C##$*, !8CC -1%-*, !8CC %11%+, dan !8CC ++-1#0, C. lanienae C8C #+$$%0 , C. lari !8CC
+)--#0, dan C. upsaliensis @CDC )%-% =@aboratorium Pusat Pengendalian Penyakit>0. 'ntuk
mendapatkan biomassa, semua isolat ditumbuhkan pada Campylobacter darah bebas agar base
selektif dimodifikasi agar Campylobacter arang diferensial =CCD!>0 A"oid, epean, Antario,
3anada0 tanpa suplemen antibiotik atau brucella agar Difco, Detroit, Mich.0 Di +/ B C dalam
8/16/2019 Contoh Dan Cara Pembuatan Kotoran Sapi
3/9
8/16/2019 Contoh Dan Cara Pembuatan Kotoran Sapi
4/9
GA@. 21, -$$+ PCR deteksi Campylobacter pada 8IJ! :AGIF +%+1
dan C#--*. Plasmid D! diekstraksi dengan kit I!prep 5pin Miniprep iagen0. Plasmid(IC
yang linierisasi oleh pencernaan dengan en4im coI Pro(mega0. en4im telah dihapus oleh dua
ekstraksi dengan resin 5trataclean 5tratagen0 menurut protokol pabrik. 3onsentrasi linierisasi
plasmid(IC telah disesuaikan untuk /$$ eksemplar l # di #$ mM 8ris(Cl p? *,)0 buffer, dan
plasmid(IC disimpan pada -$ B C sampai digunakan.
Ii0 Fkstraksi D! dari kotoran sapi. 5ebuah I!amp D! tinja minikit iagen0 digunakan
untuk mengekstrak D! dari -$$ ) mg kotoran sapi sesuai dengan protokol pabrik untuk isolasi
D! dari kotoran untuk deteksi patogen. 5ecara singkat, prosedur yang terlibat lisis sel bakteri
dalam feces di !5@ penyangga, adsorpsi kotoran ke InhibitF reagen, dan pemurnian D! pada
kolom berputar. 5ebelum ekstraksi, pengendalian internal ditambahkan ke setiap sampel pada
tingkat #$ l per -$$ mg kotoran. Diekstraksi D! disimpan pada -$ B C sampai diproses.
Iii0 Inokulasi. 8inja dikumpulkan dari sapi di @ethbridge, !lberta, 3anada. sampel kotoran yang
ditentukan untuk menjadi negatif untuk Campylobacter D! atau yang menghasilkan amplikon
lemah dengan Campylobacter #25 genus spesifik rR! primer gen yang dipilih. sampel tinja
yang bebas dari D! ganjil(lobacter yang jarang diperoleh, dan situasi ini mengharuskan
penggunaan kotoran yang terkontaminasi, meskipun tinja mengandung sejumlah kecil
campylobacters. 5ubsamples sampel tinja disimpan pada -$ B C sampai diperlukan. sampel tinja
yang dicairkan sekali.
Isolat yang digunakan untuk menyuntik kotoran termasuk C. coli !8CC %11%#, C. janin !8CC
-)1+2, C. hyointestinalis !8CC +)-#/, dan C. jejuni !8CC %1.1%+ yaitu, pengobatan takson0.
5emua bakteri ditumbuhkan selama -% jam pada +/ B C. Dalam replikasi #, C. coli, C. janin, dan
C. jejuni ditumbuhkan pada brucella agar, sedangkan C. hyointestinalis ditumbuhkan pada
CCD!. Dalam ulangan - dan +, baik C. janin dan C. hyointestinalis ditumbuhkan pada CCD!,
dan spesies lainnya ditanam di brucella agar. Dalam semua kasus, media produksi biomassa tidak
diubah dengan antibiotik. 'ntuk
memperoleh biomassa, sel tergores dari media dan ditangguhkan di steril brucella kaldu Difco0.
8/16/2019 Contoh Dan Cara Pembuatan Kotoran Sapi
5/9
3ekeruhan !2$$0 dari suspensi diatur ke $,) ini me6akili kepadatan sel sekitar - #$1 C&' ml
#0, dan enam #$(kali lipat pengenceran serial disusun brucella kaldu yaitu, inokulum0,
me6akili(ing rentang dari kepadatan sel sekitar #$+(#$1 C&' ml # yaitu, pengobatan
kepadatan0. 'ntuk menghitung kepadatan sel di suspensi, pengenceran penyebaran jumlah piring
dibuat di kedua brucella agar C. coli dan C. jejuni0 atau CCD! C. fetus dan C. hyointestinalis0.
8inja diinokulasi dengan masing(masing perlakuan takson pada tingkat - ml per #* g berat
basah0 dari tinja untuk setiap kepadatan steril brucella kaldu digunakan untuk kontrol. 5egera
setelah penambahan inokulum, tinja yang dicampurkan dengan spatula logam. Penelitian
dilakukan pada tiga kesempatan terpisah yaitu, ulangan0. 'ntuk setiap ulangan, dua sampel
disiapkan misalnya, subsamples0.
I70 Deteksi spesies Campylobacter oleh dilusi plating. 'ntuk menghitung campylobacters dalam
tinja diinokulasi plating mikrobiologi kon7ensional,
-,) g tinja ditempatkan di --,) ml phosphate(buffered saline #+$ mM natrium klorida, #$ mM
bufer natrium fosfat =p? /,->0 dalam tabung &alcon )$(ml Diamed, Missassauga, Antario,
3anada0, dan suspensi itu 7orte"ed pada pengaturan maksimum selama # menit. 5uspensi
diencerkan dalam pengenceran seri #$ kali lipat, dan #$$ l tersebar di CCD! mengandung
selektif suplemen 5R##)F A"oid0. 3ultur diinkubasi microaerophilically pada +/ B C seperti
dijelaskan di atas. 3oloni dicacah di pengenceran menghasilkan -$(-$$ C&' setelah %* jam, dan
C&'s per gram tinja segar dan bobot kering0 dihitung. 'ntuk menentukan bobot kering tinja,
dua ali;uot tinja sekitar -$ g masing(masing0 dikeringkan pada )$ B C selama /- jam. 3ami
mengamati tidak ada perbedaan kadar air kadar bahan kering berkisar #1,#(#1,*0 di antara
sampel tinja, sehingga C&'s disajikan per gram berat basah. ilai rata(rata C&' per gram0
untuk dua subsamples untuk setiap perlakuan pengobatan takson dan kepadatan digunakan untuk
menghitung rata(rata secara keseluruhan dan 5FM untuk tiga ulangan.
G0 deteksi langsung dari spesies Campylobacter dengan PCR. D! diekstraksi dari dua
subsamples untuk setiap perlakuan takson dan pengobatan kepadatan dengan minikit D! tinja
seperti dijelaskan di atas. !mplifikasi C. coli, C. janin, C. hyointestinalis, dan C. jejuni D!
dicapai dengan primer PCR primer dan bersarang atau seminested tercantum dalam 8abel #.
Dalam semua kasus, reaksi dan amplifikasi kondisi yang sama seperti yang dijelaskan di atas
8/16/2019 Contoh Dan Cara Pembuatan Kotoran Sapi
6/9
adalah digunakan, dengan pengecualian bah6a - l dari D! tinja digunakan sebagai template.
Proporsi rata(rata sampel positif untuk dua subsamples untuk setiap perlakuan pengobatan takson
dan kepadatan digunakan untuk menghitung rata(rata secara keseluruhan dan 5FM n +0.
8ujuan +. i0 3oleksi feses. 8inja yang aseptik dikumpulkan dari delapan sapi perah ?olstein
pada tiga kesempatan terpisah yaitu, ulangan0 di ca. inter7al - minggu. 5emua ternak yang
digunakan adalah sapi a6al(laktasi yang diberi ransum campuran keseluruhan yang terdiri dari
barley, alfalfa, dan silase jagung. sampel tinja diperoleh fol(melenguh memberi makan pagi.
!R!. -. Perbandingan #25 -10 dan -+5 rD! primer de7el(oped dalam penelitian ini untuk
mendeteksi C. hyointestinalis. @ane #, #$$(bp penanda berat molekul band gelap berada di )$$
bp0 jalur -, #25 primer dengan C. hyointestinalis subsp. hyointestinalis ?:& jalur +, #25 primer
dengan C. hyointestinalis subsp. hyointestinalis ?:F lane %, #25 primer dengan C.
hyointestinalis subsp. hyointestinalis !8CC +)-#/ lane ), #25 primer dengan C. hyointestinalis
subsp. la6sonii C8C #-1$# jalur 2, -+5 primer dengan C. hyointestinalis subsp.
hyointestinalis ?:& lane /, -+5 primer dengan C. hyointestinalis subsp. hyointestinalis ?:F
jalur *, -+5 primer dengan C. hyointestinalis subsp. hyointestinalis !8CC +)-#/ jalur 1, -+5
primer dengan C. hyointestinalis subsp. la6sonii C8C #-1$#. 5ebuah amplikon tidak diamati
dalam salah satu reaksi kontrol negatif, dan pera6atan ini telah dihapus.
Ii0 Deteksi spesies Campylobacter oleh plating. Pada setiap tanggal koleksi,
-,) g kotoran dari setiap sapi dihentikan di --,) ml phosphate(buffered saline oleh 7orte"ing
seperti dijelaskan di atas, dan #$$ l masing(masing suspensi tersebar di masing(masing empat
media yang tes. Media terdiri dari i0 ganjil(@ine agar Dalynn :iologicals0 -*0 Ii0 3armali
agar A"oid0 --0 dengan suplemen selektif CM1+) A"oid0 Iii0 CCD! dengan selektif
suplemen 5R##)F dan i70 Preston agar, terdiri dari CM2*1 campylobacter dasar A"oid0, )$ ml
segaris darah kuda 5R%* A"oid0 liter #, dan selektif suplemen 5R##/F A"oid0. Cul(
membangun struktur ditumbuhkan microaerophilically pada +$, +), dan %$ B C seperti dijelaskan
di atas. Pada %*(dan /-(h inter7al, C&'s spesies Campylobacter dicacah berdasarkan morfologi
8/16/2019 Contoh Dan Cara Pembuatan Kotoran Sapi
7/9
koloni dan penampilan mikroskopis. koloni se6enang(6enang dipilih dianggap campylobacters
dipindahkan ke media yang sama dari mana mereka telah diisolasi dan melesat untuk kemurnian.
3oloni dipilih berdasarkan penampilan koloni dan frekuensi kejadian. 5emua strain disimpan di
brucella kaldu diubah dengan +$ gliserol pada -$ dan *$ B C sampai diidentifikasi. Dalam
kebanyakan kasus, pengelompokan berdasarkan penampilan koloni dan morfologi bertekad
untuk menjadi monota"ic berdasarkan identifikasi strain per6akilan0, dan rata(rata C&' per
gram dan 5FM n +0 dihitung untuk setiap takson.
Iii0 Identifikasi spesies Campylobacter. identifikasi presumtif dari iso(lates pulih dari kotoran
sapi dicapai dengan baik karakter fisiologis dan molekuler. 5emua isolat mengalami koloni PCR
dengan Campy(lobacter genus spesifik, C. coli(C. jejuni, C. fetus(C. lanienae, dan C.
hyointestinalis set primer utama 8abel #0. Jika diperlukan, Campylobacter isolat juga diuji
dengan primer untuk C. hel7eticus, C. lari, C. mucosalis, C. sputorum, dan C. upsaliensis 8abel
-0. 3ami juga menguji set primer C. hyointestinalis dari @inton et al. -10 8abel -0 tapi
ditinggalkan primer ini ditetapkan untuk satu set dijelaskan pada 8abel #. sama reaksi dan
amplifikasi kondisi seperti yang dijelaskan di atas digunakan, dengan pengecualian bah6a
template D! terdiri dari # l dari suspensi yang mengandung -%( sel %*(h(lama isolat yang akan
diidentifikasi. 'ntuk setiap mengisolasi, sel(sel dari koloni tunggal yang seragam ditangguhkan
di #$$ l steril brucella kaldu di 12(baik piring mikro dengan tusuk gigi steril atau kiat pipet.
kontrol positif terdiri dari sel(sel dari strain referensi, dan kontrol negatif terdiri dari brucella
kaldu sendiri.
3emampuan strain untuk menghasilkan katalase dan ?-5, untuk mengurangi nitrat dan nitrit,
dan untuk menghidrolisis hippurate dan indo"yl asetat dan kepekaan mereka terhadap asam
nalidiksat +$ g ::@0 dan sefalotin +$ g ::@0 ditentukan seperti yang dijelaskan oleh @ogan
et !l. +#0. 5elain itu, C. strain janin diuji untuk kemampuan mereka untuk tumbuh pada brucella
agar yang mengandung # glisin. 'ntuk strain !rcobacter, kemampuan untuk tumbuh di
oksigen atmosfer, pada brucella agar yang mengandung # glisin,
+%%$ Inglis D! 3!@I5C?'3 !PP@. MF9FP'9. Microbiol.
8/16/2019 Contoh Dan Cara Pembuatan Kotoran Sapi
8/9
!R!. +. Dampak konsentrasi D! genom C. jejuni @#$- terhadap ekspresi amplikon
pengendalian internal. @ane #, #$$(bp mo(lecular penanda berat band gelap berada di )$$ bp0
jalur -, #$ # pengenceran jalur +, #$ - pengenceran lane %, #$ + pengenceran lane ), #$ %
pengenceran jalur 2, #$ ) pengenceran jalur /, ada template jalur *, tidak ada kontrol internal.
dan agar MacConkey ditentukan. 'ntuk C. jejuni dan C. lanienae, enam dan tujuh strain
se6enang(6enang dipilih menjadi sasaran tes fisiologis, respec(masing.
'ntuk isolat dugaan diidentifikasi sebagai C. janin, C. lanienae, !. but4leri, atau !. skirro6ii,
gen #25 rR! lengkap atau sebagian dibariskan. 9en #25 rR! diamplifikasi dengan PCR
dengan primer eubacterial 'I-/& dan 'I#%1-R 8abel -0. 'ntuk semua amplifikasi,
campuran PCR yang sama dan kondisi amplifikasi seperti yang dijelaskan di atas untuk koloni
PCR digunakan. 'ntuk mendapatkan urutan parsial untuk gen #25 rR!, primer 'I++*& dan
'I##$$R digunakan 8abel -0 dengan siklus se;uencing kit reaksi siap !:I PRI5M :ig Dye
8erminator !pplied :iosystems, &oster City, California.0. 5ebelum se;uencing, kelebihan 4at
6arna telah dihapus dengan iagen DyeF" berputar kit. 'rutan diperoleh dengan !:I PRI5M
+// se;uencer D! otomatis. Contigs dibangun dengan menggunakan 5taden Medical
Research Council, @aboratorium :iologi Molekuler, Cambridge, Inggris0, dan semua urutan
dibandingkan langsung dengan a(nasional Pusat Informasi :ioteknologi C:I0 9en:ank
basis data nukleotida nonredundan dengan menggunakan :@!58.
'rutan nukleotida untuk isolat dugaan diidentifikasi C. lanienae @)-0 yang selaras dengan data
diambil dari 9en:ank dengan menggunakan multialign(ment Program Clustal E %$0, dan
keberpihakan yang disempurnakan secara 7isual dengan menggunakan 9eneDoc 666.psc.edu
:iomed genedoc0. 'rutan 9en:ank nomor aksesi0 untuk C. concisus @$%+--0, C. cur7us
@$%+#+0, C. janin subsp. janin M2)$#-0, C. janin subsp. 7enerealis M2)$##0, C. gracilis
@$%+-$0, C. hyointes(tinalis subsp. hyointestinalis !&$1/2*#, !&$1/2*1 =type>, dan
!&$1/21#0, C. hyointestinalis !&-#1-+) dan M2)$#$0, C. hyointestinalis subsp. la6so(nii
!&$1/2*+ dan !&$1/2*) =type>0, C. lanienae !:$/22/), !:$/22//, !&$%+%-+, dan
8/16/2019 Contoh Dan Cara Pembuatan Kotoran Sapi
9/9
!&$%+%-) =type>0, C. mucosalis @$21/*0, C. rektus @$%+#/0, C. sputorum @$%+#10, dan C.
jejuni subsp. jejuni @$%+#)0 dimasukkan dalam analisis.
'rutan Data dianalisis dengan menggunakan program yang ada di program P?H@IP #+0.
Perkiraan filogenetik didasarkan pada metode untuk menentukan jarak tetangga(bergabung,
kekikiran maksimum, dan kemungkinan maksimum. Di(Gergence atau jarak0 untuk setiap
pasangan urutan dihitung dengan menggunakan D!(DI58 dengan 3imura model dua
parameter. Program 8F8!99! digunakan untuk memperkirakan filogeni dari matriks jarak.
D!P!R5 dieksekusi untuk melakukan analisis maksimum(kekikiran, dan D!M@ digunakan
untuk analisis kemungkinan maksimum. Dukungan untuk cabang internal dalam pohon re(timbul
semata(mata diperoleh dengan analisis bootstrap. 5ebanyak #.$$$ bootstrap ulangan untuk #25
D! ribosom rD!0 Data yang dihasilkan dengan menggunakan 5F:AA8, mayoritas(aturan
pohon konsensus dibangun dengan menggunakan program CA5F5F, dan pohon(pohon
di7isualisasikan dengan menggunakan 8reeGie6 http< ta"onomy.4oology .gla.ac.uk batang
rod.html0.
I70 deteksi langsung dari spesies Campylobacter dengan PCR. 'ntuk setiap sapi pada setiap
kesempatan, sebuah ali;uot tinja diinokulasi dengan pengendalian internal, D! diekstraksi
dengan tinja minikit D!, campuran PCR dan kondisi amplifikasi didirikan, dan produk PCR
di7isualisasikan seperti dijelaskan di atas. 3arena isolasi sering C. lanienae pada 3armali agar,
primer berdasarkan gen #25 rR! dikembangkan untuk takson ini 8abel #0 dan digunakan
!R!. %. Multiple" PCR untuk mendeteksi spesies Campylobacter dalam kotoran sapi. @ane #,
#$$(bp penanda berat molekul band gelap berada di )$$ bp0 jalur -, D! dari kotoran tanpa
inokulasi diperkuat dengan Campylobacter genus spesifik primer set jalur +, D! dari unin(
oculated kotoran diperkuat dengan Campylobacter genus spesifik primer set perhatikan
amplikon genus lemah dan amplikon pengendalian internal pada %2) bp0 lane %, D! dari
kotoran tanpa inokulasi diperkuat dengan C. jejuni(C. coli multipleks bersarang set primer
perhatikan amplikon C. jejuni pada %#+ bp0 lane ), D! dari kotoran tanpa inokulasi diperkuat
dengan C. janin(C.
Top Related