Contoh Dan Cara Pembuatan Kotoran Sapi

8/16/2019 Contoh Dan Cara Pembuatan Kotoran Sapi

1/9

USE OF PCR FOR DIRECT DETECTION OF CAMPYLOBACTER SPECIES IN

BOVINE FECES

Contoh Penerapan Amplifia!i "en

Jurnal ini membahas mengenai penggunaan PCR untuk langsung mendeteksi danmembedakan spesies Campylobacter dalam kotoran sapi tanpa pengayaan uraniumnya. Inhibitor

yang ada dalam tinja adalah rintangan utama untuk menggunakan PCR dalam mendeteksi

mikroorganisme. Metode mini kit ternyata tidak manjur untuk ekstraksi, seperti yang ditetapkan

oleh amplifikasi positif dari internal kontrol D! ditambahkan ke kotoran sapi sebelum

ekstraksi. Campylobacter coli, C. janin, C. hyointestinalis, dan C. jejuni tersebut diletakkan atau

seminested multiple" PCR, yang dideteksi pada semua sampel kotoran, kemudian diinokulasi di

#$% C&' g(# dan )$ hingga *+ dari sampel diinokulasi di #$+ C&' g(# terbukti positif. Pada

#$- C&' g(# C. fetus, C. hyointestinalis, and C. jejuni #/ hingga )$ persen dari sampel 0 selain

C. coli terdeteksi oleh PCR. Dari kotoran sapi uninoculated, dipilih secara acak sebanyak #12

Campylobacter diisolasi ditemukan di empat yang umum digunakan di tiga media isolasi dalam

inkubasi.

3elompok yang paling sering ditemukan adalah C. jejuni #)-0 dan C. lanienae %-0,

tapi mengisolasi C. Janin. Janin, !rcobacter but4leri, dan. 5kirro6ii juga ditemukan. &rekuensi

isolasi Campylobacters cukup ber7ariasi terpantau di antara empat media dan tiga suhu inkubasi

yang diujikan. Dengan primer genus(specific, Campylobacter D! itu terdeteksi di /) persen

sampel kotoran, terjadi * persen peningkatan dibandingkan dengan yang diperoleh dari

sensiti7itas isolasi mikrobiologi di empat media dan tiga suhu inkubasi yang diujikan. Dengan

primer bersarang, C. jejuni dan C. lanienae tersebut yang masing(masing terdeteksi -) dan 2/

persen dari sampel. 8idak ada D! yang terlihat baik dari C. coli, C. janin, atau C.

hyointestinalis dideteksi pada kotoran sapi yang tidak diinokulasi. PCR lebih sensitif dari isolasi

mikrobiologi pada media untuk mendeteksi C. lanienae #/ 0 tetapi tidak C. jejuni.

Campylobacters yang beragam dan pengembangan langsung PCR tidak hanya akan

meningkatkan pemahaman tentang spesies Campylobacter yang beragam dan frekuensi

kemunculannya dalam kotoran, tetapi juga akan meningkatkan pengetahuan tentang peran

mereka dalam saluran pencernaan ternak dan dari sejumlah faktor yang mempengaruhi.


2/9

Cara Pem#$atan

Perkembangan percobaan. Percobaan yang dilakukan untuk setiap tujuan disajikan pada

9ambar. #. 'ntuk tujuan pertama 9br. #!0, D! pengendalian internal dan primer untuk

mendeteksi spesies Campylobacter langsung dalam kotoran dikembangkan. 'ntuk tujuan kedua

9ambar. #:0, sensiti7itas PCR untuk memperkuat spesies ganjil(lobacter langsung dari kotoran

sapi diinokulasi dengan empat taksa itu com(dikupas dengan yang pengenceran plating. 3hasiat

dari D! ekstraksi kit komersial untuk menghapus inhibitor PCR juga dipastikan dengan

menggunakan D! pengendalian internal dirancang untuk digunakan dengan Campylobacter

genus spesifik primer. 'ntuk ketiga ob(jecti7e 9ambar. #C0, deteksi spesies Campylobacter

dalam kotoran sapi tanpa inokulasi dengan PCR dibandingkan dengan pengenceran plating.

3arena fre(;uency tinggi isolasi C. lanienae, primer bersarang dikembangkan untuk takson ini

dan kemudian digunakan dalam PCR multiple" dengan primer untuk C. janin.

8ujuan #. i0 'ji taksa dan budaya kondisi. Primer untuk mendeteksi D! dari Campylobacter

genus, C. coli, C. janin, C. hyointestinalis, dan C. jejuni langsung dalam kotoran sapi yang

dikembangkan 8abel #0. 3ami memilih ini taksa menjadi penyebab hubungan mereka dengan

spesies sapi. 'ntuk meningkatkan sensiti7itas dan spec(ificity, primer untuk C. coli, C. janin, C.

hyointestinalis, dan C. jejuni yang bersarang atau seminested. 5elanjutnya, C. coli dan C. jejuni

diuji oleh multipleks PCR.

5train referensi berikut ini digunakan untuk menguji primer yang kita de7el(oped< !rcobacter

but4leri !8CC %12#2 =3oleksi :udaya 8ipe !merika>0, !. cryaerophilus !8CC %11%-0, C. coli

?C #### =3esehatan 3anada> dan !8CC %11%# 0, C. concisus !8CC ++-+/0, C. janin subsp.

janin !8CC -)1+20, C. janin subsp. 7enerealis !8CC #1%+*0, C. hyointestinalis subsp.

hyointestinalis !8CC +)-#/0, C. hyointestinalis subsp. la6sonii C8C #-1$# =ational

Collection of 8ype :udaya dan Pathogenic Jamur>0, C. jejuni ?C ##$-, ?C ##$%, ?C ###), ?C##$*, !8CC -1%-*, !8CC %11%+, dan !8CC ++-1#0, C. lanienae C8C #+$$%0 , C. lari !8CC

+)--#0, dan C. upsaliensis @CDC )%-% =@aboratorium Pusat Pengendalian Penyakit>0. 'ntuk

mendapatkan biomassa, semua isolat ditumbuhkan pada Campylobacter darah bebas agar base

selektif dimodifikasi agar Campylobacter arang diferensial =CCD!>0 A"oid, epean, Antario,

3anada0 tanpa suplemen antibiotik atau brucella agar Difco, Detroit, Mich.0 Di +/ B C dalam


3/9


4/9

GA@. 21, -$$+ PCR deteksi Campylobacter pada 8IJ! :AGIF +%+1

dan C#--*. Plasmid D! diekstraksi dengan kit I!prep 5pin Miniprep iagen0. Plasmid(IC

yang linierisasi oleh pencernaan dengan en4im coI Pro(mega0. en4im telah dihapus oleh dua

ekstraksi dengan resin 5trataclean 5tratagen0 menurut protokol pabrik. 3onsentrasi linierisasi

plasmid(IC telah disesuaikan untuk /$$ eksemplar l # di #$ mM 8ris(Cl p? *,)0 buffer, dan

plasmid(IC disimpan pada -$ B C sampai digunakan.

Ii0 Fkstraksi D! dari kotoran sapi. 5ebuah I!amp D! tinja minikit iagen0 digunakan

untuk mengekstrak D! dari -$$ ) mg kotoran sapi sesuai dengan protokol pabrik untuk isolasi

D! dari kotoran untuk deteksi patogen. 5ecara singkat, prosedur yang terlibat lisis sel bakteri

dalam feces di !5@ penyangga, adsorpsi kotoran ke InhibitF reagen, dan pemurnian D! pada

kolom berputar. 5ebelum ekstraksi, pengendalian internal ditambahkan ke setiap sampel pada

tingkat #$ l per -$$ mg kotoran. Diekstraksi D! disimpan pada -$ B C sampai diproses.

Iii0 Inokulasi. 8inja dikumpulkan dari sapi di @ethbridge, !lberta, 3anada. sampel kotoran yang

ditentukan untuk menjadi negatif untuk Campylobacter D! atau yang menghasilkan amplikon

lemah dengan Campylobacter #25 genus spesifik rR! primer gen yang dipilih. sampel tinja

yang bebas dari D! ganjil(lobacter yang jarang diperoleh, dan situasi ini mengharuskan

penggunaan kotoran yang terkontaminasi, meskipun tinja mengandung sejumlah kecil

campylobacters. 5ubsamples sampel tinja disimpan pada -$ B C sampai diperlukan. sampel tinja

yang dicairkan sekali.

Isolat yang digunakan untuk menyuntik kotoran termasuk C. coli !8CC %11%#, C. janin !8CC

-)1+2, C. hyointestinalis !8CC +)-#/, dan C. jejuni !8CC %1.1%+ yaitu, pengobatan takson0.

5emua bakteri ditumbuhkan selama -% jam pada +/ B C. Dalam replikasi #, C. coli, C. janin, dan

C. jejuni ditumbuhkan pada brucella agar, sedangkan C. hyointestinalis ditumbuhkan pada

CCD!. Dalam ulangan - dan +, baik C. janin dan C. hyointestinalis ditumbuhkan pada CCD!,

dan spesies lainnya ditanam di brucella agar. Dalam semua kasus, media produksi biomassa tidak

diubah dengan antibiotik. 'ntuk

memperoleh biomassa, sel tergores dari media dan ditangguhkan di steril brucella kaldu Difco0.


5/9

3ekeruhan !2$$0 dari suspensi diatur ke $,) ini me6akili kepadatan sel sekitar - #$1 C&' ml

#0, dan enam #$(kali lipat pengenceran serial disusun brucella kaldu yaitu, inokulum0,

me6akili(ing rentang dari kepadatan sel sekitar #$+(#$1 C&' ml # yaitu, pengobatan

kepadatan0. 'ntuk menghitung kepadatan sel di suspensi, pengenceran penyebaran jumlah piring

dibuat di kedua brucella agar C. coli dan C. jejuni0 atau CCD! C. fetus dan C. hyointestinalis0.

8inja diinokulasi dengan masing(masing perlakuan takson pada tingkat - ml per #* g berat

basah0 dari tinja untuk setiap kepadatan steril brucella kaldu digunakan untuk kontrol. 5egera

setelah penambahan inokulum, tinja yang dicampurkan dengan spatula logam. Penelitian

dilakukan pada tiga kesempatan terpisah yaitu, ulangan0. 'ntuk setiap ulangan, dua sampel

disiapkan misalnya, subsamples0.

I70 Deteksi spesies Campylobacter oleh dilusi plating. 'ntuk menghitung campylobacters dalam

tinja diinokulasi plating mikrobiologi kon7ensional,

-,) g tinja ditempatkan di --,) ml phosphate(buffered saline #+$ mM natrium klorida, #$ mM

bufer natrium fosfat =p? /,->0 dalam tabung &alcon )$(ml Diamed, Missassauga, Antario,

3anada0, dan suspensi itu 7orte"ed pada pengaturan maksimum selama # menit. 5uspensi

diencerkan dalam pengenceran seri #$ kali lipat, dan #$$ l tersebar di CCD! mengandung

selektif suplemen 5R##)F A"oid0. 3ultur diinkubasi microaerophilically pada +/ B C seperti

dijelaskan di atas. 3oloni dicacah di pengenceran menghasilkan -$(-$$ C&' setelah %* jam, dan

C&'s per gram tinja segar dan bobot kering0 dihitung. 'ntuk menentukan bobot kering tinja,

dua ali;uot tinja sekitar -$ g masing(masing0 dikeringkan pada )$ B C selama /- jam. 3ami

mengamati tidak ada perbedaan kadar air kadar bahan kering berkisar #1,#(#1,*0 di antara

sampel tinja, sehingga C&'s disajikan per gram berat basah. ilai rata(rata C&' per gram0

untuk dua subsamples untuk setiap perlakuan pengobatan takson dan kepadatan digunakan untuk

menghitung rata(rata secara keseluruhan dan 5FM untuk tiga ulangan.

G0 deteksi langsung dari spesies Campylobacter dengan PCR. D! diekstraksi dari dua

subsamples untuk setiap perlakuan takson dan pengobatan kepadatan dengan minikit D! tinja

seperti dijelaskan di atas. !mplifikasi C. coli, C. janin, C. hyointestinalis, dan C. jejuni D!

dicapai dengan primer PCR primer dan bersarang atau seminested tercantum dalam 8abel #.

Dalam semua kasus, reaksi dan amplifikasi kondisi yang sama seperti yang dijelaskan di atas


6/9

adalah digunakan, dengan pengecualian bah6a - l dari D! tinja digunakan sebagai template.

Proporsi rata(rata sampel positif untuk dua subsamples untuk setiap perlakuan pengobatan takson

dan kepadatan digunakan untuk menghitung rata(rata secara keseluruhan dan 5FM n +0.

8ujuan +. i0 3oleksi feses. 8inja yang aseptik dikumpulkan dari delapan sapi perah ?olstein

pada tiga kesempatan terpisah yaitu, ulangan0 di ca. inter7al - minggu. 5emua ternak yang

digunakan adalah sapi a6al(laktasi yang diberi ransum campuran keseluruhan yang terdiri dari

barley, alfalfa, dan silase jagung. sampel tinja diperoleh fol(melenguh memberi makan pagi.

!R!. -. Perbandingan #25 -10 dan -+5 rD! primer de7el(oped dalam penelitian ini untuk

mendeteksi C. hyointestinalis. @ane #, #$$(bp penanda berat molekul band gelap berada di )$$

bp0 jalur -, #25 primer dengan C. hyointestinalis subsp. hyointestinalis ?:& jalur +, #25 primer

dengan C. hyointestinalis subsp. hyointestinalis ?:F lane %, #25 primer dengan C.

hyointestinalis subsp. hyointestinalis !8CC +)-#/ lane ), #25 primer dengan C. hyointestinalis

subsp. la6sonii C8C #-1$# jalur 2, -+5 primer dengan C. hyointestinalis subsp.

hyointestinalis ?:& lane /, -+5 primer dengan C. hyointestinalis subsp. hyointestinalis ?:F

jalur *, -+5 primer dengan C. hyointestinalis subsp. hyointestinalis !8CC +)-#/ jalur 1, -+5

primer dengan C. hyointestinalis subsp. la6sonii C8C #-1$#. 5ebuah amplikon tidak diamati

dalam salah satu reaksi kontrol negatif, dan pera6atan ini telah dihapus.

Ii0 Deteksi spesies Campylobacter oleh plating. Pada setiap tanggal koleksi,

-,) g kotoran dari setiap sapi dihentikan di --,) ml phosphate(buffered saline oleh 7orte"ing

seperti dijelaskan di atas, dan #$$ l masing(masing suspensi tersebar di masing(masing empat

media yang tes. Media terdiri dari i0 ganjil(@ine agar Dalynn :iologicals0 -*0 Ii0 3armali

agar A"oid0 --0 dengan suplemen selektif CM1+) A"oid0 Iii0 CCD! dengan selektif

suplemen 5R##)F dan i70 Preston agar, terdiri dari CM2*1 campylobacter dasar A"oid0, )$ ml

segaris darah kuda 5R%* A"oid0 liter #, dan selektif suplemen 5R##/F A"oid0. Cul(

membangun struktur ditumbuhkan microaerophilically pada +$, +), dan %$ B C seperti dijelaskan

di atas. Pada %*(dan /-(h inter7al, C&'s spesies Campylobacter dicacah berdasarkan morfologi


7/9

koloni dan penampilan mikroskopis. koloni se6enang(6enang dipilih dianggap campylobacters

dipindahkan ke media yang sama dari mana mereka telah diisolasi dan melesat untuk kemurnian.

3oloni dipilih berdasarkan penampilan koloni dan frekuensi kejadian. 5emua strain disimpan di

brucella kaldu diubah dengan +$ gliserol pada -$ dan *$ B C sampai diidentifikasi. Dalam

kebanyakan kasus, pengelompokan berdasarkan penampilan koloni dan morfologi bertekad

untuk menjadi monota"ic berdasarkan identifikasi strain per6akilan0, dan rata(rata C&' per

gram dan 5FM n +0 dihitung untuk setiap takson.

Iii0 Identifikasi spesies Campylobacter. identifikasi presumtif dari iso(lates pulih dari kotoran

sapi dicapai dengan baik karakter fisiologis dan molekuler. 5emua isolat mengalami koloni PCR

dengan Campy(lobacter genus spesifik, C. coli(C. jejuni, C. fetus(C. lanienae, dan C.

hyointestinalis set primer utama 8abel #0. Jika diperlukan, Campylobacter isolat juga diuji

dengan primer untuk C. hel7eticus, C. lari, C. mucosalis, C. sputorum, dan C. upsaliensis 8abel

-0. 3ami juga menguji set primer C. hyointestinalis dari @inton et al. -10 8abel -0 tapi

ditinggalkan primer ini ditetapkan untuk satu set dijelaskan pada 8abel #. sama reaksi dan

amplifikasi kondisi seperti yang dijelaskan di atas digunakan, dengan pengecualian bah6a

template D! terdiri dari # l dari suspensi yang mengandung -%( sel %*(h(lama isolat yang akan

diidentifikasi. 'ntuk setiap mengisolasi, sel(sel dari koloni tunggal yang seragam ditangguhkan

di #$$ l steril brucella kaldu di 12(baik piring mikro dengan tusuk gigi steril atau kiat pipet.

kontrol positif terdiri dari sel(sel dari strain referensi, dan kontrol negatif terdiri dari brucella

kaldu sendiri.

3emampuan strain untuk menghasilkan katalase dan ?-5, untuk mengurangi nitrat dan nitrit,

dan untuk menghidrolisis hippurate dan indo"yl asetat dan kepekaan mereka terhadap asam

nalidiksat +$ g ::@0 dan sefalotin +$ g ::@0 ditentukan seperti yang dijelaskan oleh @ogan

et !l. +#0. 5elain itu, C. strain janin diuji untuk kemampuan mereka untuk tumbuh pada brucella

agar yang mengandung # glisin. 'ntuk strain !rcobacter, kemampuan untuk tumbuh di

oksigen atmosfer, pada brucella agar yang mengandung # glisin,

+%%$ Inglis D! 3!@I5C?'3 !PP@. MF9FP'9. Microbiol.


8/9

!R!. +. Dampak konsentrasi D! genom C. jejuni @#$- terhadap ekspresi amplikon

pengendalian internal. @ane #, #$$(bp mo(lecular penanda berat band gelap berada di )$$ bp0

jalur -, #$ # pengenceran jalur +, #$ - pengenceran lane %, #$ + pengenceran lane ), #$ %

pengenceran jalur 2, #$ ) pengenceran jalur /, ada template jalur *, tidak ada kontrol internal.

dan agar MacConkey ditentukan. 'ntuk C. jejuni dan C. lanienae, enam dan tujuh strain

se6enang(6enang dipilih menjadi sasaran tes fisiologis, respec(masing.

'ntuk isolat dugaan diidentifikasi sebagai C. janin, C. lanienae, !. but4leri, atau !. skirro6ii,

gen #25 rR! lengkap atau sebagian dibariskan. 9en #25 rR! diamplifikasi dengan PCR

dengan primer eubacterial 'I-/& dan 'I#%1-R 8abel -0. 'ntuk semua amplifikasi,

campuran PCR yang sama dan kondisi amplifikasi seperti yang dijelaskan di atas untuk koloni

PCR digunakan. 'ntuk mendapatkan urutan parsial untuk gen #25 rR!, primer 'I++*& dan

'I##$$R digunakan 8abel -0 dengan siklus se;uencing kit reaksi siap !:I PRI5M :ig Dye

8erminator !pplied :iosystems, &oster City, California.0. 5ebelum se;uencing, kelebihan 4at

6arna telah dihapus dengan iagen DyeF" berputar kit. 'rutan diperoleh dengan !:I PRI5M

+// se;uencer D! otomatis. Contigs dibangun dengan menggunakan 5taden Medical

Research Council, @aboratorium :iologi Molekuler, Cambridge, Inggris0, dan semua urutan

dibandingkan langsung dengan a(nasional Pusat Informasi :ioteknologi C:I0 9en:ank

basis data nukleotida nonredundan dengan menggunakan :@!58.

'rutan nukleotida untuk isolat dugaan diidentifikasi C. lanienae @)-0 yang selaras dengan data

diambil dari 9en:ank dengan menggunakan multialign(ment Program Clustal E %$0, dan

keberpihakan yang disempurnakan secara 7isual dengan menggunakan 9eneDoc 666.psc.edu

:iomed genedoc0. 'rutan 9en:ank nomor aksesi0 untuk C. concisus @$%+--0, C. cur7us

@$%+#+0, C. janin subsp. janin M2)$#-0, C. janin subsp. 7enerealis M2)$##0, C. gracilis

@$%+-$0, C. hyointes(tinalis subsp. hyointestinalis !&$1/2*#, !&$1/2*1 =type>, dan

!&$1/21#0, C. hyointestinalis !&-#1-+) dan M2)$#$0, C. hyointestinalis subsp. la6so(nii

!&$1/2*+ dan !&$1/2*) =type>0, C. lanienae !:$/22/), !:$/22//, !&$%+%-+, dan


9/9

!&$%+%-) =type>0, C. mucosalis @$21/*0, C. rektus @$%+#/0, C. sputorum @$%+#10, dan C.

jejuni subsp. jejuni @$%+#)0 dimasukkan dalam analisis.

'rutan Data dianalisis dengan menggunakan program yang ada di program P?H@IP #+0.

Perkiraan filogenetik didasarkan pada metode untuk menentukan jarak tetangga(bergabung,

kekikiran maksimum, dan kemungkinan maksimum. Di(Gergence atau jarak0 untuk setiap

pasangan urutan dihitung dengan menggunakan D!(DI58 dengan 3imura model dua

parameter. Program 8F8!99! digunakan untuk memperkirakan filogeni dari matriks jarak.

D!P!R5 dieksekusi untuk melakukan analisis maksimum(kekikiran, dan D!M@ digunakan

untuk analisis kemungkinan maksimum. Dukungan untuk cabang internal dalam pohon re(timbul

semata(mata diperoleh dengan analisis bootstrap. 5ebanyak #.$$$ bootstrap ulangan untuk #25

D! ribosom rD!0 Data yang dihasilkan dengan menggunakan 5F:AA8, mayoritas(aturan

pohon konsensus dibangun dengan menggunakan program CA5F5F, dan pohon(pohon

di7isualisasikan dengan menggunakan 8reeGie6 http< ta"onomy.4oology .gla.ac.uk batang

rod.html0.

I70 deteksi langsung dari spesies Campylobacter dengan PCR. 'ntuk setiap sapi pada setiap

kesempatan, sebuah ali;uot tinja diinokulasi dengan pengendalian internal, D! diekstraksi

dengan tinja minikit D!, campuran PCR dan kondisi amplifikasi didirikan, dan produk PCR

di7isualisasikan seperti dijelaskan di atas. 3arena isolasi sering C. lanienae pada 3armali agar,

primer berdasarkan gen #25 rR! dikembangkan untuk takson ini 8abel #0 dan digunakan

!R!. %. Multiple" PCR untuk mendeteksi spesies Campylobacter dalam kotoran sapi. @ane #,

#$$(bp penanda berat molekul band gelap berada di )$$ bp0 jalur -, D! dari kotoran tanpa

inokulasi diperkuat dengan Campylobacter genus spesifik primer set jalur +, D! dari unin(

oculated kotoran diperkuat dengan Campylobacter genus spesifik primer set perhatikan

amplikon genus lemah dan amplikon pengendalian internal pada %2) bp0 lane %, D! dari

kotoran tanpa inokulasi diperkuat dengan C. jejuni(C. coli multipleks bersarang set primer

perhatikan amplikon C. jejuni pada %#+ bp0 lane ), D! dari kotoran tanpa inokulasi diperkuat

dengan C. janin(C.

Contoh Dan Cara Pembuatan Kotoran Sapi

Documents

Transcript of Contoh Dan Cara Pembuatan Kotoran Sapi