BAB III
METODE KERJA
A. Alat dan Bahan
1. Alat Yang Digunakan
Aerator, batang pengaduk,, botol semprot, bunsen, corong buchner, corong
pisah, chamber, cawan porselen, eksikator, erlenmeyer, gelas ukur, gunting,
hairdryer, karet gelang, kardus, kotak makan plastik, lampu UV 256 nm dan 366 nm,
kipas angin, lampu belajar, lempeng kaca, lumpang dan alu, mangkuk kaca,
mikroskop, mikropipet, neraca analitik, objek glass, oven, ose bulat, parang, pensil,
pisau, pipet tetes, pipet skala, pinset, penutup chamber, pipa kapiler, pensil warna,
penggaris, pompa vakum, rak tabung, sendok tanduk, sendok besi, sikat tabung, statif
dan klem, spoit, sentrifuge, seperangkat alat rotavapor, tabung sentrifuge, tabung
effendorf, tali raffia, topleks kaca, vial, dan vortex.
2. Bahan yang digunakan
Air laut, air suling, aluminium foil, bulu babi, etanol, etil asetat, F eCl3,
formalin, n-heksan, H2SO4 10%, HCl, KCl 10%, kloroform, kapas, kertas saring,
larva Artemia salina, lempeng silica, metanol, metanol PA, n-butanol, NaCl, reagen
Dragendorff, reagen Lieberman-Burchard, reagen Mayer, reagen Wagner, dan sampel
daun coppeng.
B. Penyiapan Sampel
1. Pengambilan Sampel
Pengambilan sampel dilaksanakan pada hari minggu, tanggal 21 september
2014. bertempat di hutan Desa Compo Tompong, Kecamatan Mandalle, Kabupaten
Pangkep Sulawesi Selatan pada pukul 7:30 wita sampai selesai. Pengambilan sampel
ini dilakukan dengan cara mengambil daun dari tanaman coppeng.
2. Pengolahan Sampel
Sampel daun coppeng yang telah dikumpulkan dicuci hingga bersih dengan
air mengalir yang bertujuan untuk membersihkan sampel dari sisa-sisa tanak atau
kotoran yang melekat dan dikeringkan karena sampel yang basah sangat rentan
terhadap pertumbuhan mikroba juga untuk memperoleh simplisia yang dapat
disimpan lebih lama, tidak dibawah sinar matahari langsung atau bisa juga dioven,
kemudian dipotong kecil-kecil, selanjutnya diangin-anginkan dalam ruangan dan
hindarkan dari sinar matahari langsung. Setelah kering dihaluskan hingga derajat
halus yang diinginkan dengan menggunakan lumpang dan alu kemudian ditimbang
ekstrak yang didapat.
C. Ekstraksi Sampel
1. Maserasi
Sampel yang telah ditimbang dan dirajang masukkan dalam topleks kaca
kemudian dibasahi dengan menggunakan methanol. Setelah itu tambahkan methanol
untuk merendam simplisia dimana cairan penyari dicukupkan hingga merendam
semua simplisia sekitar 1 cm dari batas simplisia, lalu ditutup dengan aluminium foil
dan diamkan selama 2 x 24 jam. Kemudian sampel disaring dengan menggunkan
corong dan kertas saring, hasilnya disimpan dalam topleks lalu selanjutnya lakukan
proses rotavapor kurang lebih 6 jam, supaya proses rotavapor cepat dapat dilakukan
dengan menggunakan es batu untuk mempercepat proses penguapan yaitu dibawah
titik didih sampel. Hasil dari rotavapor disimpan dalam mangkuk dan disimpan diatas
penangas untuk mempercepat proses penguapan, lalu ditutup dengan aluminium foil.
2. Partisi
Ekstrak hasil rotavapor dimangkuk dikeruk lalu ditimbang dan letakkan dalam
lumpang sambil digerus dan tambahkan pelarut heksan, setelah itu dipipet cairan
ekstrak kedalam tabung sentrifuge dengan kecepatan 3000 rpm selama 10 menit.
Sampel yang telah disentrifuge disimpan dalam mangkuk kemudian diangin-
anginkan, lakukan perlakuan yang sama hingga ekstrak yang dihasilkan menjadi
jenuh.
D. Identifikasi dengan KLT(Kromatografi Lapis Tipis)
1. Penjenuhan Chamber
Chamber yang telah diisi eluen dengan kepolaran dan perbandingan yang
berbeda, dikocok hinggan pelarut dalam chamber jenuh. Cairan pengelusi yang
digunakan dimasukkan ke dalam chamber setinggi lebih kurang 0,5 cm kemudian
diberi kertas. Kejenuhan chamber ditandai dengan naiknya cairan pengelusi pada
kertas saring hingga melewati kaca penutup.
2. Penotolan Sampel pada Lempeng
Ekstrak metanol dari masing-masing sampel ditotolkan pada lempeng pada
batas bawahnya, demikian pula untuk ekstrak n-heksan dan n-butanol (tidak larut n-
heksan). Lempeng dielusi dengan heksan : etil (2 : 1) dalam chamber, sampai cairan
pengelusi mengelusi lempeng sampai batas akhir. Lempeng dikeluarkan dan diangin-
anginkan, lempeng siap untuk diamati penampakan nodanya.
3. Penampakan Noda pada Lampu UV 254 nm dan UV 366 nm
Lempeng yang telah dielusi diamati dibawah sinar lampu UV 254 nm dan 366
nm, lalu diamati noda yang terbentuk pada lempeng.
4. Penampakan Noda dengan H2SO4 10%
Setelah diamati di bawah lampu UV, lempeng disemprot dengan larutan
H2SO4 10%, kemudian dipanaskan di dalam oven selama beberapa menit, hingga
terbentuk noda. Lalu diamati noda yang terbentuk pada lempeng.
E. Identifikasi Komponen Kimia
Ekstrak methanol dilarutkan dengan kloroform dan methanol, ekstrak n-
heksan dilarutkan dengan kloroform dan tidak larut heksan dengan methanol masing-
masing dalam vial, lalu divortex setelah itu ditotol pada lempeng KLT yang telah
diaktifkan dan jenuhkan pada chamber. Setelah itu lakukan uji :
1. Alkaloid
Diambil lempeng ekstrak methanol, ekstrak larut etil asetat dan ekstrak tidak
larut etil asetat yang telah dielusi. Disemprot dengan reagen dragendrof. Diamati
perubahan warna dan diambil gambarnya. Hasil (+) ditandai dengan perubahan warna
hingga latar kuning
2. Flavonoid
Diambil lempeng ekstrak methanol, ekstrak larut etil asetat dan ekstrak tidak
larut etil asetat yang telah dielusi. Disemprot dengan AlCl3 5%. Diamati pada lampu
UV 366 nm penampakan nodanya. Hasil (+) ditandai dengan adanya flouresensi
kuning.
3. Fenol
Diambil lempeng ekstrak methanol, ekstrak larut etil asetat dan ekstrak tidak
larut etil asetat yang telah dielusi. Disemprot dengan FeCl3 5%. Difoto penampakan
noda. Hasil (+) fenol ditandai dengan adanya perubahan warna hitam/biru.
4. Uji LB
Diambil lempeng ekstrak methanol, ekstrak larut etil asetat dan ekstrak tidak
larut etil asetat yang telah dielusi. Disemprot dengan reagen LB. Difoto penampakan
noda. Dipanaskan lempeng pada oven. Diamati pada lampu UV 366 nm penampakan
nodanya. Hasil (+) terpenoid yaitu perubahan merah/coklat, hasil (+) steroid yaitu
perubahan hijau biru.
5. Senyawa Organik
Diambil lempeng ekstrak methanol, ekstrak larut etil asetat dan ekstrak tidak
larut etil asetat yang telah dielusi. Disemprot dengan H2SO4. Difoto penampakan
noda. Dipanaskan lempeng pada oven Difoto penampakan noda. Hasil (+) ditujukan
dengan perubahan arna kuning, coklat/ kehitaman.
F. Uji Bioassay
1. Skrining Aktifitas Antimikroba
a. Pembuatan medium
Disiapkan alat dan bahan. Ditimbang medium dengan menggunakan
timbangan analitik. Dilarutkan dengan aquadest. Dipanaskan hingga larut di atas
penangas untuk menghilangkan sifat agar dari medium hingga berwujud cair.
Disterilakn agar tidak terkontaminasi oleh mikroba.
b. Sterilisasi Alat
Disiapkan alat dan bahan yang akan disterilkan. Dibungkus semua alat
menggunakan kertas. Alat berupa kaca disterilkan dngan menggunakan oven pada
suhu 1800C sedangkan alat bahan dasar plastic disterilkan dalam autoklaf pada suhu
1210C. Ditunggu ± 1-2 jam
c. Skrinning antimikroba
Disiapkan alat dan bahan yang akan digunakan. Ditimbang sampel ekstrak
methanol, ekstrak larut etil asetat dan ekstrak tidak larut etil asetat sebanyak 10 mg
masing-mmasing 3 kali. Dimasukkan ke dalam botol coklat yang telah disterilkan
sebelumnya. Ditambahkan DMSO 200 mikroliter kemudian di vortex hingga larut.
Ditambahkan medium NA 10 ml ke dalam botool coklat yang berisi sampel dan
DMSO kemudian dihomogenkan. Dipindahkan ke dalam cawan petri yang telah
disterilkan. Didiamkan hingga medium padat. Diberi tanda pada bagian bawah cawan
petri (dibagi dalam beberapa bagian). Digoreskan bakteri pada masing-masing
bagiannya. Diinkubasi 1x24 jam dalam incubator. Diambil gambar yang diperoleh
dengan menggunakan kamera. Dikerjakan pengerjaan di atas dengan cara aseptis.
2. Uji Brain Shrimp Lethality Test (BST)
a. Penyiapan air bebas protozoa
Disiapkan alat dan bahan. Ditimbang garam tak beryodium sebanyak 37 gr.
Diukur aqquadest sebanyak 1 liter. Dimasukkan aquadest ke dalam toples kemudian
ditambahkan garam yang telah ditimbang. Diaduk hingga garam terlarut dengan
sempurna. Disaring air garam menggunakan kertas saring
b. Penyiapan konsentrasi ekstrak (stok)
Disiapkan alat dan bahan. Ditarer vial sebanyak 5 ml dan diberi tanda.
Ditimbang ekstrak sebanyak 30 mg (ekstrak methanol, ekstrak n-heksan dan ekstrak
n-butanol). Dimasukkan ke dalam vial dan ditambahkan pelarut yang sesuai. Divortex
hingga larut. Larutan stok siap digunakan
c. Penyiapan konsentrasi ekstrak
Disiapkan alat dan bahan. Ditarer vial 5 ml sebanyak 60 vial. Untuk ekstrak
methanol diambil 5 vial untuk konsentrasi [1000] ppm, 5 vial untuk konsentrasi [100]
ppm, 5 vial untuk konsentrasi [10] ppm.Untuk ekstrak larut n-heksan diambil 5 vial
untuk konsentrasi [1000] ppm, 5 vial untuk konsentrasi [100] ppm, 5 vial untuk
konsentrasi [10] ppm.Untuk ekstrak tidak n-heksan diambil 5 vial untuk konsentrasi
[1000] ppm, 5 vial untuk konsentrasi [100] ppm, 5 vial untuk konsentrasi [10]
ppm.Untuk kontrol (methanol, larut n-heksan dan tidak larut n-heksan) diambil 5 vial
untuk konsentrasi [1000] ppm, 5 vial untuk konsentrasi [100] ppm, 5 vial untuk
konsentrasi [10] ppm.Untuk memindahkan digunakan mikropipet 10 mikroliter, 50
mikroliter dan 100 mikroliter yang sesuai dengan konsentrasi yang digunakan
d. Penyiapan larva udang
Disiapkan alat dan bahan. Direndam larva udang dalam air. Diambil bagian
tenggelam. Disiapkan toples yang telah berisi plastic gula dan air laut bebas protozoa.
Dimasukkan larva udang yang telah direndam dalam air. Dimasukkan aerator di
dalam air laut bebas protozoa yang berisi larva udang. Disinari di bawah lmpu
belajar. Ditunggu hingga menetas. Disiapkan wadah makanan yang bersekat dan
telah diberi lobang-lobang kecil. Dimasukkan air laut bebas protozoa. Dimasukkan
larva udang yang telah menetas ke dalam salah satu bagian wadah kemudian tutup
menggunakan lakban hitam. Disinari di bawah lampu belajar. Diambil larva udang
yang tidak ditutupi lakban
e. Pemindahan larva udang
Disiapkan alat dan bahan. Ditambahkan air laut bebas protozoa 1 ml pada
masing-msing vial. Ditambahkan larva udang sebanyak 10 ekor pada masing-masing
vial. Ditambahkan air laut bebas protozoa hingga 5 ml pada masing-masing vial.
Setelah itu vial tersebut disinari pada sianr lampu belajar 1x24 jam. Diamati jumlah
kematian larva udang pada masing-masing vial.
3. Uji Antimitosis
a. Pembuatan konsentrasi ekstrak
Timbang 10 mg ekstrak methanol, masukkan dalam vial dan tambahkan 1 ml
DMSO setelah itu homogenkan dengan cara di vortex, maka diperoleh larutan stok
10.000 ppm. Dibuat pengenceran 1000 ppm dalam 1000 µl dengan cara diambil 100
µl larutan stok lalu tambahkan 800 µl air laut bebas protozoa dan homogenkan, untuk
pengenceran 100 ppm dalam 100 µl dengan cara diambil 100 µl larutan stok lalu
tambahkan 890 µl air laut bebas protozoa dan homogenkan, dan pada pengenceran
10 ppm dalam 1 µl dilakukan perlakuan yang sama yaitu dengan mengambil 100 µl
larutan stok lalu tambahkan 899 µl air laut bebas protozoa dan homogenkan.
b. Pembuatan zigot
Diambil bulu babi jantan lalu di induksi dengan KCl 10 % , di ambil sperma
sebanyak 1 ml dan untuk bulu babi betina juga di induksi dengan KCl 10 %,
kemudian di ambil ovum sebanyak 5 ml, lalu keduanya digabungkan dalam
Erlenmeyer dan simpan di dinginkan di kulkas selama 10-15 menit, setelah itu di
amati di mikroskop, dan jika telah terbuahi menjadi zigot maka siap untuk dilakukan
pengamatan selanjutnya.
c. Uji Antimitosis
Diambil ekstrak methanol, ekstrak heksan dan ekstrak tidak larut heksan, lalu
dibuat stok 1000 ppm, 100 ppm, 10 ppm masing-masing tiga replikasi, setelah itu
simpan di tabung effendorf, tambahkan Masukkan 100 µl zigot, kemudian diamkan
1-2 jam dalam suhu ruang atau es batu dan di amati di mikroskop.
G. Isolasi Sampel
1. Penyiapan Sampel dan Adsorben
a. Kromatografi Cair Vakum (KCV)
Disiapkan alat dan bahan. Ditimbang ekstrak methanol sebanyak 3 gr dan
silika gell sebanyak 25 g. Dicampur silika gel ke dalam ekstrak methanol secara
sedikit demi sdikit sambil digerus hingga kering dengan menggunakan tabung reaksi.
Dimasukkan sisa silika ke dalam centre glass sambil dimapatkan. Dimasukkan
camppuran silica dan ekstrak methanol ke dalam centre glass yang berisi silika gel
kemudian diberi kertas saring.
b. Kromatografi Lapis Tipis Preparatif (KLTP)
Disiapkan alat dan bahan. Lempeng kaca dibebaslemakkan dengan
menggunakan methanol kemudian dikeringkan. Dibuat bubur silika dengan
mencampurkan silika gel dan aquadest (30 gr silika : 90 ml aquadest) dalam
Erlenmeyer dan dihomogenkan. Dituang bubur silika di atas lempeng kaca yang telah
dibebaslemakkan dan diratakan .Diamkan 1x24 jam.
2. Isolasi Komponen Kimia
a. KCV (Kromatografi Cair Vakum)
Disiapkan alat dan bahan. Dibuat 18 eluen yaitu; Heksan 50 ml, Heksan : etil
(10 : 1), Heksan : etil (8 : 1), Heksan : etil (6 : 1), Heksan : etil (4 : 1), Heksan : etil
(2 : 1), Heksan : etil (1 : 1), Heksan : etil (1 : 2) , Heksan : etil (1 : 4), Heksan : etil
(1 : 6), Heksan : etil (1 : 8), Heksan : etil (1 : 10), Etil 50 ml, Etil : methanol (4 : 1),
Etil : methanol (2 : 1), Etil : methanol (1 : 1), Etil : methanol (1 : 2), Etil : methanol
(1 : 4), dan methanol 50 ml. Dimasukkan ke dalam corong sesuai dengan
perbandingan sedikit demi sedikit. Ditunggu hingga selesai kemudian dimasukkan
perbandingan berikutnya hingga seluruh perbandingan selesai. Hasilnya ditampung di
mangkuk untuk setiap perbandingan yang berbeda.
Hasil dari KCV sebanyak 18 mangkuk setelah kering dilarutkan dengan etil
asetat lalu ditotolkan pada lempeng KLT yang telah diaktifkan. Kemudian
dimasukkan dalam oven lalu diamati penampakan nodanya pada UV 254 nm dan UV
366 nm serta disemprot dengan larutan H2SO4 10%, panaskan dioven da amati
penampakan nodanya.
b. KLTP (Kromatografi Lapis Tipis Preparatif)
Diambil ekstrak dari 7 hasil KCV sebelumnya. Dimasukkan ke dalam vial lalu
dilarutkan menggunakan etil asetat hingga larut. Disiapkan alat dan bahan, lalu
lempeng kaca yang telah diaktifkan selama dua jam diambil, kemudian ditotol
meggunakan pipa kapiler dengan berdekatan secara perlahan. Sementara itu
dijenuhkan chamber dengan menggunakan perbandingan eluen heksan : etil (2 : 1)
dalam 40 ml. Dimasukkan lempeng kaca dengan hati-hati ke dalam chamber.
Ditunggu hingga noda mencapai batas. Diangkat lempeng kaca. Diamati lempeng
pada UV 366 nm dan 254 nm, serta disemprot dengan larutan H2SO4 10%, panaskan
dioven da amati penampakan nodanya.
Hasil KLTP dari ketiga lempeng kaca yang telah ditotol dan dipanaskan
dalam oven kemudian dikruk dan disimpan dalam mangkuk lalu ditambahkan
methanol PA secukupnya. kemudian masukkan dalam pipet tetes yang dijepit dengan
klem. Dimasukkan sedikit kapas pada pipet tetes. Dimasukkan sedikit demi sedikit ke
dalam pipet tetes. Diteteskan menggunakan buret pipet atau karet pipet tetes
ditampung dalam vial yang telah ditarer sebelumnya .Dibiarkan pelarutnya menguap
kemudian ditimbang berat vial + isolate.
H. Uji Kemurnian Isolat
1. Kromatografi Lapis Tipis Dua Dimensi
Disiapkan alat dan bahan yang akan digunakan. Disediakan lempeng
aluminiumukuran 10 x 10 cm.Diberi batas masing-masing ujung baah jarak 1 cm dan
ujung atas 0,5 cm menggunakan pensil. Lalu ditotolkan isolate yang dipilih dan
dipakai pada pengujian multi eluen dengan menggunkan pipa kapiler secra berulang-
ulang agar pekat. Dielusi lempeng dalam chamber yang berisi eluen dengan
perbandingan pelarut heksan : etil (1 : 2). Dielusi hingga batas atas. Setelah dielusi,
diperiksa penampakan noda pada sinar UV 366 nm. Setelah penampakan noda (+)
dan noda berada berada di bagian atas lempeng maka diputar/balik dimana bagian
awwal yang dielusi adalah bagian yang paling dekat bagian bawahnya penampakan
nodanya dengan pelarut/eluen untuk mengelusi kembali noda dengan pelarut/eluen
yang sama dengan elusi pertama. Dimasukkan kembali lemepng ke chamber untuk
dielusi. Setelah mencapai batas atas yang ditentukan lalu dilihat penampakan nod
pada sinar UV 366 nm. Diambil gambarnya. Disemprot dengan H2SO4. Dipanaskan
lempeng pada oven. Diperiksa kembali penampakan noda secara kasat mata. (+)
penampakan noda 2 tunggal pada 2 kali elusi menandakan kekurangan senyawa.
Diambil gambar
2. Kromatografi Lapis Tipis Multi Eluen
Disiapkan alat dan bahan. Disediakan beberapa lempeng pada masing-masing
lempeng untuk menandakan batas penotolan dan batas akhir eluen yaitu pada ujung
bawah (batas penotolan jarak 1 cm sedangkan ujung atas (batas akhir lempeng)
jaraknya 0,5 cm dengan pensil). Diaktifkan lempeng di dalam oven selama 5 menit.
Dipilih ekstrak hasil KLT Preparatif sebelumnya yang diyakini nodanya paling
bagus/tunggal. Dilarutkan ekstrak dengan pelarut yang sesuai. Divortex hingga larut.
Dikeluarkan lempeng yang telah diaktifkan sebelumnya. Ditotolkan ekstrak yang
telah dilarutkan dengan menggunakan pipa kapiker beberapa kali pada lmpeng.
Dielusi lempeng yang telah ditotolkan pada chamber dengan menggunakan beberapa
eluen yang berbeda yaitu eluen heksan : etil : methanol (1 : 3 : 1), etil : metano (3 : 1),
dan heksa : etil (1 : 5) . Dielusi setetlah beberapa saat kemudian hingga pelarut
sampai batas yang telah ditentukan. Setelah mencapai batas diperiksa lempeng hasil
elusi pada sinar UV 366 nm. Diambil gambarnya. Disemprot dengan menggunkan
H2SO4. Dipanaskan dalam oven. Diperiksa kembali penampakan noda secara kasat
mata. Diambil gambarnya
3. Rekristalisasi
a. Metode pemanasan
Disiapkan alat dan bahan. Diambil isolate dan ditambahkan methanol PA
secukupnya. Dipanaskan pada hot plate hingga pelarutnya menguap. Diamati kristal
yang terbentuk di dasar vial. Ditimbang berat kristal yang diperoleh
b. Metode pendinginan
Disiapkan alat dan bahan. Diambil isolate dan ditambahkan methanol PA
secukupnya. Diambil mangkuk kaca yang telah diisi dengan es batu. Dimasukkan vial
yang berisi isolate dan methanol PA ke dalam mangkuk yang telah diisi es batu.
Diaduk dinding vial dengan sendok besi. Dibentuk kristal yang terbentuk. Ditimbang
bobot kristal yang diperoleh
4. Identifikasi Golongan Kimia
Hasil isolat yang didapat setelah didiamkan dan ditambahkan dengan
methanol PA, lalu ditotolkan pada lempeng KLT yang telah diaktifkan lalu dilakukan
uji :
a. Alkaloid
Diambil lempeng ekstrak methanol, ekstrak n-heksan dan ekstrak tidak larut
n-heksan yang telah dielusi. Disemprot dengan reagen dragendrof. Diamati perubahan
warna dan diambil gambarnya. Hasil (+) ditandai dengan perubahan warna hingga
latar kuning
b. Flavonoid
Diambil lempeng ekstrak methanol, ekstrak larut n-heksan dan ekstrak tidak
larut n-heksan yang telah dielusi. Disemprot dengan AlCl3 5%. Diamati pada lampu
UV 366 nm penampakan nodanya. Hasil (+) ditandai dengan adanya flouresensi
kuning.
c. Fenol
Diambil lempeng ekstrak methanol, ekstrak larut n-heksan dan ekstrak tidak
larut n-heksan yang telah dielusi. Disemprot dengan FeCl3 5%. Difoto penampakan
noda. Hasil (+) fenol ditandai dengan adanya perubahan warna hitam/biru.
d. Uji LB
Diambil lempeng ekstrak methanol, ekstrak larut n-heksan dan ekstrak tidak
larut n-heksan yang telah dielusi. Disemprot dengan reagen LB. Difoto penampakan
noda. Dipanaskan lempeng pada oven. Diamati pada lampu UV 366 nm penampakan
nodanya. Hasil (+) terpenoid yaitu perubahan merah/coklat, hasil (+) steroid yaitu
perubahan hijau biru.
e. Senyawa Organik
Diambil lempeng ekstrak methanol, ekstrak larut n-heksan dan ekstrak tidak
larut n-heksan yang telah dielusi. Disemprot dengan H2SO4. Difoto penampakan noda.
Dipanaskan lempeng pada oven Difoto penampakan noda. Hasil (+) ditujukan dengan
perubahan warna kuning, coklat/ kehitaman.
Top Related