SUSANTI Validasi Metode Bioautografi untuk Determinasi Kloramfenikol Validation of Bioautographic...

SUSANTI, et al./ VALIDASI METODE BIOAUTOGRAFI UNTUK DETERMINASI KLORAMFENIKOL

15

PENDAHULUAN

Kloramfenikol adalah salah satu jenis antibiotika turunan

amfenikol yang secara alami diproduksi oleh Streptomy-

ces venezuelae (Reynolds, 1982). Melalui pengembangan

teknologi fermentasi, kloramfenikol dapat diisolasi,

disemisintesis menjadi antibitoka turunannya, antara

lain tiamfenikol dan turunan lain melalui berbagai reaksi

kimia dan enzimatis (http://www. springerlink. com/

content/p573u390x883183 k).

Senyawa dengan rumus molekul C11

H12

Cl2N

2

O5 dan nama kimia D(-) treo-2-dikloroasetamido-

1-p-notrofenilpropana-1,3-diol, memiliki struktur

molekul tersaji pada Gambar di bawah ini (USP

XXXI, 2008).

Validasi Metode Bioautografi untuk Determinasi Kloramfenikol

Validation of Bioautographic Method for the Determination of Chloramphenicol

Meliana Susanti, Isnaeni, Sri PoedjiartiFakultas Farmasi Universitas Airlangga Surabaya

ABSTRACT

Background: Contact bioautography method has been developed for determination of chlorampheni-col concentration. Validation of bioautography method has beed carried out by using parametersincluding linearity, accuracy, precision, and detection limit.

Methods: Thin Layer Chromatography of chloramphenicol has been performed by using Silica gel 60F

254 as a stationary phase, chloroform : methanol (80:20, v/v) and UV lamp as a solvent and for spot

visualization respectively. Before spotting, analyte of the chloramphenicol was dissolved in aceton assolvent. Bioautography has been performed by using Escherichia coli ATCC 25922 as a bacterial andNutrient Agar as medium test.

Results: It was found that one spot visualized on the chromatogram has Rf value 0.5. The resultshowed that respon of activity to be linear at the amount of chloramphenicol between 100 ppm-200ppm, with regression quotion: Y = 2.8X - 4.3, r value =0.9 and Vxo = 1.8%. Accuracy and precision of themethod are 2.8% + 2.3 and 96.2% + 4.7 respectively.

Conclusion: Detection Limit (DL) value is 0.06 µg could be expressed as Minimum Inhibition Concen-tration (MIC). Jurnal Kedokteran Indonesia: 1 (1): 15-24

Keywords: chloramphenicol, bioautography, Validation method

Struktur bangun pada Gambar 1 memberi infor-

masi bahwa kloramfenikol memiliki dua atom karbon

asimetrik, sehingga menghasilkan 4 stereoisomer.

Mekanisme kerja kloramfenikol sebagai anti

bakteri bersifat stereospesifik, karena hanya satu ste-

reoisomer yang memiliki aktivitas anti bakteri, yaitu

D(-) treo-isomer. Kloramfenikol bekerja pada

spektrum luas, efektif baik terhadap Gram positif

maupun Gram negatif. Mekanisme kerja kloram-

fenikol melalui penghambatan terhadap biosintesis

protein pada siklus pemanjangan rantai asam ami-

no, yaitu dengan menghambat pembentukan ikatan

peptida. Antibiotika ini mampu mengikat subunit

ribosom 50-S sel mikroba target secara terpulihkan,

akibatnya terjadi hambatan pembentukan ikatan

peptida dan biosintesis protein. Kloramfenikol

umumnya bersifat bakteriostatik, namun pada

konsentrasi tinggi dapat bersifat bakterisid terhadap

bakteri-bakteri tertentu (Ganiswarna, 1995).

Spektrum antibakteri kloramfenikol meliputi D.

pneumoniae, Str. pyogenes, Str. viridans, Neisseria,

Haemophilus, Bacillus spp, Listeria, Bartonella, Bru-Gambar 1. Struktur Bangun Kloramfenikol

JURNAL KEDOKTERAN INDONESIA, VOL. 1/NO. 1/JANUARI/2009

16

cella, P. multocida, C. diphtheriae, Chlamydia, Myco-

plasma, Rickettsia, Treponema dan kebanyakan mikro-

ba anaerob. Senyawa ini juga efektif terhadap keba-

nyakan galur E. coli, K. pneumoniae, dan Pr. mirabilis

(Ganiswara, 1995). Kloramfenikol efektif mengobati

riketsia dan konjungtivitas akut yang disebabkan oleh

mikroorganisme, termasuk Pseudomonas sp. Kecuali

Pseudomonas aeruginosa, senyawa ini juga efektif untuk

pengobatan infeksi berat yang disebabkan oleh

Bacteroides fragilis (infeksi kuman anaerob di bawah

diafragma), Haemophylus influenzae (meningitis

purulenta), Streptococcus pneumoniae (pneumoniae)

(Soekardjo et al., 2000). Akhir-akhir ini, makin sering

dilaporkan adanya resistensi S. typhi terhadap kloram-

fenikol, namun secara generik kloramfenikol masih

dianggap sebagai obat pilihan untuk mengobati

demam tifoid.

Pada saat ini, kloramfenikol muncul dalam ko-

moditas perikanan udang dan produk frozen foods

yang lain (ikan, katak dsb.), yang digunakan bukan

hanya untuk komoditas dalam negeri, tetapi juga

kebutuhan ekspor. Sebagai contoh, kloramfenikol

digunakan oleh petani tambak dengan maksud men-

cegah penyakit udang yang disebabkan oleh bakteri

Salmonella (Efendi, 2007). Selain itu, dari hasil anali-

sis sampel udang yang harus memenuhi persyaratan

bebas atau dalam batas yang diijinkan sebelum di-

ekspor, ditemukan residu kloramfenikol yang melam-

paui batas yang dipersyaratkan (0.1-1 ppb). Residu

kloramfenikol juga dilaporkan terdeteksi pada hati

dan ginjal ayam petelur apkir (Anonim, 2004), serta

dalam produk yang dihasilkan oleh lebah (Dharma-

nanda, 2003). Fenomena ini menimbulkan

problematika spesifik terkait resistensi antibiotika,

yang harus ditangani secara intensif. Para pembeli

frozen foods ekspor menindak tegas pemasok yang me-

langgar batas residu dalam produknya, bahkan apa-

bila terdeteksi residu antibiotik dalam jumlah me-

lampaui batas yang telah ditetapkan, seluruh produk

dalam containers akan dibakar dan pemasok

dimasukkan ke dalam “black list”. Untuk itulah para

distributor atau produsen mengantisipasi produknya

sebelum laik ekspor harus melalui uji lolos residu

antibiotik.

Artikel ini disajikan untuk merespon kebutuh-

an para pengguna jasa analisis, khususnya kloram-

fenikol dalam matriks yang komplek. Berbagai meto-

de analisis yang dikembangkan, misalnya untuk

mendeteksi residu kloramfenikol dalam udang antara

lain KLT dan kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT).

Salah satu metode yang dikembangkan berbasis pada

gabungan sifat fika-kimia dan mikrobiologi adalah

bioautografi. Metode ini sangat membantu dalam

melakukan skrining atau penapisan awal kloramfenikol

dalam matrik yang komplek baik tunggal maupun

dalam bentuk campuran dengan antibiotika lain,

karena keberadaan kloramfenikol dalam sampel dapat

diidentifikasi tidak hanya berdasarkan sifat fisika-

kimianya, melainkan berdasarkan aktivitas

biologisnya sebagai anti mikroba.

Metode tersebut didasarkan pada aktivitas

biologi analit baik sebagai antibakteri, antifungi,

antitumor, maupun antiprotozoa (Choma, 2005).

Bioautografi sering digunakan untuk mendeteksi

antibiotik yang dapat dianalisis dengan KLT atau

kromatografi kertas. Pada umumnya, efek biologi

senyawa yang dapat dikatakan menghambat pertum-

buhan organisme dinyatakan sebagai zona hambat

(Touchstone dan Dobbins, 1983). Dari kromatogram

KLT dapat diketahui jumlah komponen dalam

sampel yang ditotolkan berdasarkan jumlah noda

(dengan penampak noda yang sesuai), sedang data

bioautogram memberikan informasi jumlah

komponen sampel yang memiliki aktivitas terhadap

mikroba uji baik secara kualitatif maupun kuantitatif

(Isnaeni, 2005).

Prinsip uji mikrobiologi pada bioautografi

menggunakan metode difusi. Metode tersebut sama

dengan metode pada uji sensitivitas kerja antibiotik.

Besar daya hambat pertumbuhan bakteri pada

metode difusi diperoleh dengan mengukur diameter

zona hambat (Choma, 2005).

Penelitian tentang penggunaan metode bioau-

tografi untuk penentuan kadar kloramfenikol telah

dikembangkan, namun data validasi metodenya

belum pernah dilaporkankan. Untuk mengetahui

bahwa metoda ini dapat memberikan hasil yang baik,

mendekati kebenaran dan dapat dipercaya, maka

diperlukan uji validasi dengan parameter yang

meliputi linieritas, akurasi, presisi, dan limit deteksi

(LOD) (Indrayanto, 1994).


17

SUBJEK DAN METODE

BAHAN

Kloramfenikol p.a. (Phyto Technology Laboratories),

aseton p.a., Escherichia coli ATCC 25922, serat agar

(Food grade), serbuk instant Nutrient Broth (Difco),

larutan salin, metanol p.a., kloroform p.a., dan asam

asetat glasial p.a.ALAT

Neraca analitik (Sartorius), bejana kromatografi,

cawan petri diameter 15 cm, hair dryer, vortex, kawat

Öse, pipet ukur, lempeng KLT Silika gel 60 F254

,

inkubator (Memmert), mycrolyter syringe, pipet mikro,

jangka sorong (Tricle brand), otoklaf (Huxley HV-

340 Speedy), spektrofotometer (Shimadzu), micro

balance (Shimadzu). Lampu UV (254 nm).

METODE

1. Preparasi Media

Media Nutrient Agar 100 mL dibuat dengan cara

mencampurkan 3 gram serat agar dan serbuk Nutri-

ent Broth 0.8 gram, ditambah air suling 100 mL,

dipanaskan sambil diaduk hingga campuran larut dan

homogen. Selanjutnya media yang masih cair terse-

but segera diambil dengan pipet ukur dan dimasuk-

kan ke dalam tabung reaksi, masing-masing sebanyak

10 mL dan 15 mL. Tabung yang berisi media tersebut

ditutup dengan kapas bebas lemak, kemudian

disterilkan menggunakan otoklaf pada suhu 121°C

selama 15 menit. Segera setelah dikeluarkan dari

otoklaf, media 10 mL yang masih cair dimiringkan

hingga padat. Media tersebut digunakan sebagai

media peremajaan mikroba uji. Sedangkan media 15

mL tanpa dimiringkan digunakan sebagai media

pertumbuhan mikroba uji. Media uji bioautografi

dibuat dua lapis, masing-masing sebanyak lebih

kurang 20 mL untuk lapisan dasar (base layer) dan

15 mL untuk lapisan atas sebagai media perbenihan

yang diinokulasi dengan mikroba uji (Isnaeni, 2005).

2. Penyiapan Bakteri Uji

Koloni bakteri E. coli dari kultur persediaan diambil

dengan sengkelit sebanyak satu Öse, kemudian

digesekkan pada permukaan agar miring dan

diinkubasi pada suhu 37°C selama 24 jam. Suspensi

bakteri disiapkan dengan cara menambahkan larutan

salin steril pada biakan agar miring, kemudian

suspensi dikocok menggunakan vortex sampai seluruh

koloni pada permukaan agar terlepas ke dalam larutan

salin. Kerapatan optik inokulum bakteri diatur dan

diukur menggunakan spektrofotometer pada panjang

gelombang 580 nm sampai diperoleh transmitan

25%, bila perlu dilakukan pengenceran atau

pemekatan (Isnaeni, 2005).

3. Pembuatan Larutan Baku Kloramfenikol

Larutan baku induk kloramfenikol disiapkan dengan

cara ditimbang seksama kloramfenikol p.a sebanyak

25 mg dan dilarutkan dalam aseton sampai 25.0 mL

(1000 ppm). Larutan baku kerja disiapkan dengan

mengencerkan larutan baku induk 1000 ppm hingga

diperoleh konsentrasi sesuai kebutuhan, misalnya 75

ppm, 100 ppm, 150 ppm dan 200 ppm.

4. KROMATOGRAFI LAPIS TIPIS

Pada tahap awal KLT, dilakukan pemilihan fasa gerak

yang sesuai. Analisis KLT kloramfenikol dilakukan

dengan cara menotolkan larutan baku kloramfenikol

sebanyak 6 L dengan pipet mikro pada tiga lempeng

KLT ukuran 1.5cm x 10cm, kemudian dielusi dengan

tiga macam fasa gerak: air-metanol-kloroform

(1:10:90, v/v) (Choma, 2003), kloroform-methanol-

asam asetat glasial (79:14:7, v/v) (Arlikaningrum,

2006) dan kloroform-metanol (85:15, v/v) (Sohaskey

dan Barbour, 1999). Orientasi fasa gerak juga

dilakukan dengan mengatur perbandingan

komponen ketiga fasa gerak tersebut. Lempeng hasil

elusi setelah dikeringkan di udara dan diamati dengan

lampu UV pada panjang gelombang 254 nm dihitung

masing-masing harga Rf setiap noda, kemudian

dibandingkan satu sama lain untuk memilih harga

Rf yang memasuki rentang 0.3 - 0.7 (Dirjen POM,

1995).

5. PELAKSANAAN UJI BIOAUTOGRAFI

Larutan baku kerja kloramfenikol ditotolkan pada

lempeng KLT, dielusi dengan larutan pengembang

terpilih. Bioautogram dibuat dengan cara meletakkan

hasil KLT (yang telah dikeringkan dengan aliran

udara panas dalam cawan petri steril untuk

menghilangkan sisa fasa gerak) di atas permukaan

media perbenihan Nutrient Agar yang mengandung

bakteri uji Escherichia coli (1.4 L/15 mL media),

kemudian disimpan di dalam lemari es selama dua


18

jam agar proses difusi kloramfenikol dalam noda pada

lempeng KLT ke dalam media uji menjadi sempurna.

Cawan petri dikeluarkan dari lemari es, lempeng KLT

diangkat dari permukaan agar, biakan diinkubasi pada

suhu 37°C selama 24 jam. Zona yang terbentuk pada

posisi noda diamati dan diukur diameternya (Isnaeni,

1998).

6. PENENTUAN KONSENTRASI ANALIT

Pada penentuan konsentrasi analit, dilakukan peno-

tolan larutan baku kerja dengan lima macam kon-

sentrasi pada rentang 75 ppm - 200 ppm pada

lempeng KLT ukuran 1.5 cm x 10 cm sebanyak 6

L dengan pipet mikro tanpa dielusi, kemudian

dikeringkan. Noda diamati di bawah lampu UV pada

panjang gelombang 254 nm. Apabila noda telah

tampak, dilakukan bioautografi dengan tahapan

seperti butir 5. Berdasarkan hasil orientasi konsentrasi

tersebut dilakukan uji bioautografi. Konsentrasi dan

jumlah penotolan tersebut juga digunakan sebagai

referensi penentuan parameter validasi.

7. PENENTUAN LINEARITAS

Penentuan linearitas dilakukan dengan konsentrasi

larutan kloramfenikol 100 ppm, 125 ppm, 150 ppm,

175 ppm dan 200 ppm pada lempeng KLT ukuran

9.5 cm x 10 cm. Setelah didapatkan zona hambat

hasil uji bioautografi, ditentukan koefisien korelasi

(r) dan koevisien korelasi fungsi (Vx0) antara diam-

eter zona hambat dengan logaritma konsentrasi.

8. PENENTUAN AKURASI

Dilakukan penimbangan kloramfenikol, kemudian

diencerkan dengan aseton hingga didapatkan

konsentrasi 125 ppm; 150 ppm; dan 175 ppm (kadar

sebenarnya). Masing-masing konsentrasi direplikasi

tiga kali mulai dari penimbangan, kemudian ditotol-

kan pada lempeng KLT ukuran 10 cm x 1,5 cm

sebanyak 6 L dan dielusi dengan fasa gerak terpilih

secara bersamaan dalam satu bejana. Hasil elusi

kemudian diuji bioautografi kontak hingga diperoleh

zona hambat. Diameter zona hambat diukur dan

diplotkan pada kurva linearitas, sehingga didapatkan

sebuah konsentrasi (kadar yang diperoleh), kemudian

dihitung harga persen perolehan kembali (recovery).

9. PENENTUAN PRESISI

Dilakukan penimbangan kloramfenikol, kemudian

diencerkan hingga didapatkan konsentrasi 125 ppm;

150 ppm; dan 175 ppm. Masing-masing konsentrasi

direplikasi tiga kali, kemudian ditotolkan pada

lempeng KLT ukuran 10 cm x 1,5 cm sebanyak 6

L dan dielusi bersamaan dengan fasa gerak terpilih.

Hasil elusi kemudian diuji dengan bioautografi

kontak hingga diperoleh zona hambat, diameter zona

hambat diukur dan dihitung harga SD untuk

perhitungan harga KV.

10. PENENTUAN LIMIT DETEKSI

Penentuan limit deteksi dilakukan dengan larutan

kloramfenikol konsentrasi 100 ppm – 200 ppm dan

penotolan sebanyak 6 L, kemudian dilakukan

pengenceran bertingkat dan ditotolkan pada

lempeng KLT ukuran 9.5 cm x 10 cm sebanyak 6

L. Lempeng dielusi, selanjutnya dilakukan uji

bioautografi, zona hambat yang didapat diukur

diameternya.

HASIL-HASIL

1. KETENTUAN PARAMETER VALIDASI

Linearitas metode bioautografi dikatakan valid apabila

harga koefesien korelasi (r) lebih besar dari r Tabel

atau harga koefisien variasi fungsi (Vx0) tidak lebih

dari 5%. Akurasi dinyatakan memenuhi harga persya-

ratan validasi, jika persen perolehan kembali 80%-

120%. Harga parameter presisi dapat diterima

sebagai metode yang valid apabila harga KV tidak

lebih dari 5%. Limit deteksi ditentukan melalui har-

ga Kadar Hambat Minimum (KHM) kloramfenikol,

konsentrasi kloramfenikol terkecil yang masih men-

unjukkan aktivitas menghambat pertumbuhan E. coli.

2. PENENTUAN FASA GERAK

Hasil KLT koramfenikol untuk penentuan fasa gerak

tersaji pada Gambar 1 dan Tabel 1. Dari kelima harga

Rf fasa gerak yang dianalisis, fasa gerak yang

memenuhi nilai Rf 0.3-0.7 adalah kloroform : meta-

nol: asam asetat glasial (83:10:7, v/v) dan kloroform

: metanol (80:20, v/v). Selanjutnya dipilih fasa gerak

kloroform : metanol (80 : 20) dengan harga Rf 0,57

untuk uji bioautografi.


19

3. PENENTUAN KONSENTRASIKLORAMFENIKOL

Penentuan konsentrasi tanpa dilakukan elusi pada

rentang konsentrasi 75 ppm – 200 ppm sebanyak 6

L tersaji pada Gambar 2. Data dalam Gambar 2

menunjukkan bahwa pada konsentrasi 75 ppm tidak

dihasilkan zona hambat.

dilakukan pada konsentrasi 75 ppm – 200 ppm. Pada

konsentrasi tersebut diperoleh zona hambat seperti

pada Gambar 3. Hasil penentuan konsentrasi secara

sistematis tersaji pada Tabel 2. Pada konsentrasi 75

ppm – 200 ppm bioautogram dengan fasa gerak kloro-

form: metanol (80:20, v/v) dan jumlah penotolan 6

L menunjukkan zona hambat yang nyata.

Tabel 1. Harga Rf

Gambar 3. Penentuan konsentrasi kloramfenikol denganelusi menggunakan fasa gerak kloroform : metanol (80 : 20,

v/v) pada konsentrasi 75 ppm – 200 ppm.Penentuan konsentrasi dengan elusi menggu-

nakan fasa gerak kloroform : metanol (80:20, v/v)

Gambar 1. Hasil elusi kloramfenikol dengan fasa gerak air : metanol : kloroform (1 : 10 : 90, v/v)(a), kloroform : metanol : asam asetat glasial (79 : 14 : 7, v/v) (b), kloroform : metanol : asam asetat glasial(83 : 10 : 7, v/v) (c), kloroform : metanol (85 : 15,v/v) (d), dan kloroform : metanol (80 : 20,v/v) (e).

(a) (b) (c) (d) (e)

Gambar 2. Penentuan konsentrasi kloramfenikol tanpa elusimenggunakan fasa gerak kloroform : metanol (80:20,v/v)

pada konsentrasi 75 ppm – 200 ppm.


20

Dari data di atas dibuat kurva linearitas yang

tersaji pada Gambar 5, dengan persamaan garis

regresi Y = 2.8X - 4.3 dan koefisien korelasi (r) =

0.9. Harga koefisien variasi fungsi (Vx0) = 1.8%.

Data di atas kemudian digunakan sebagai acuan

untuk penentuan parameter linearitas, akurasi, dan

presisi, serta penentuan harga KHM kloramfenikol

sebagai parameter limit deteksi.

4. PENENTUAN PARAMETER VALIDASI4.1. Penentuan Linearitas

Penentuan parameter validasi linearitas dilakukan

seperti prosedur 7. Hasil uji bioautografi parameter

linearitas dapat dilihat pada Gambar 4 dan Tabel 3.

Hasil penentuan linearitas menunjukkan bahwa di-

ameter zona hambat meningkat proporsional dengan

peningkatan konsentrasi kloramfenikol.

Gambar 5. Kurva hubungan antara logaritmik konsentrasikloramfenikol dan diameter zona hambatan

Tabel 2. Tabel Penentuan Konsentrasi kloramfenikol setelahbioautografi

Tabel 3. Hasil uji bioautografi parameter linearitas

4.2. Akurasi

Penentuan akurasi dilakukan pada konsentrasi 125

ppm, 150 ppm, dan 175 ppm. Hasil bioautografi

parameter akurasi dapat dilihat pada Gambar 6. Hasil

analisis persen recoveri terdapat pada Tabel 4.

Akurasi dinyatakan dengan persen perolehan

kembali, diperoleh dengan memplotkan diameter zo-

na (mm) hambat uji bioautografi pada kurva linea-

ritas y = 2.8x - 4.3. Dari hasil analisis akurasi diperoleh

harga persen perolehan kembali 98.8% ± 0.5.Gambar 4. Hasil uji bioautografi parameter linearitas

(a) (b) (c)

Gambar 6. Hasil uji bioautografi parameter akurasi pada konsentrasi 125 ppm (a), 150 ppm (b), dan 175 ppm (c)


21

4.3. Presisi

Hasil uji bioautografi kloramfenikol parameter presisi

pada konsentrasi 125 ppm, 150 ppm, dan 175 ppm

tersaji pada Gambar 7 dan Tabel 5.

Tabel 4. Hasil uji bioautografi parameter akurasi

(a) (b) (c)

Gambar 7. Hasil uji bioautografi parameter presisi pada konsentrasi 125 ppm (a), 150 ppm (b), dan 175 ppm (c)

Tabel 5. Hasil uji bioautografi parameter presisi

Dari Tabel 5 dapat diamati terjadi variasi

replikasi diameter zona hambat, terutama pada

konsentrasi 125 ppm dan 175 ppm. Hasil

pengolahan data diameter zona hambat diperoleh

harga KV sebesar 2.8% ± 2.3.

4.4. Limit Deteksi

Hasil pengamatan untuk parameter limit deteksi

dapat diamati pada Gambar 8 dan Tabel 6.

Gambar 8 menunjukkan bahwa hasil uji

bioautografi untuk menentukan harga KHM

kloramfenikol, yang sekaligus digunakan sebagai

harga parameter limit deteksi. Gambar 8 (a) uji

bioautografi dilakukan pada konsentrasi 30 ppm -


22

80 ppm, dihasilkan zona hambat pada semua

konsentrasi. Gambar 8 (b) dilakukan pada konsen-

trasi 10 ppm – 40 ppm, juga diperoleh zona hambat

pada semua konsentrasi. Gambar 8 (c) dilakukan pada

konsentrasi 0.5 ppm – 10 ppm, hasilnya tidak

dihasilkan zona hambat pada semua konsentrasi. Dari

hasil uji bioautografi tersebut ditetapkan konsentrasi

10 ppm sebagai KHM kloramfenikol.

Dari data di atas dapat ditentukan limit deteksi

uji bioautografi kloramfenikol pada konsentrasi 10

ppm dengan jumlah penotolan 6 L, atau setara

dengan 0.006 g kloramfenikol.

PEMBAHASAN

Validasi metode bioautografi untuk penetapan kadar

kloramfenikol diharapkan dapat menjamin metode

tersebut ketika diaplikasikan untuk analisis analit

dalam matrik yang komplek. Aplikasi metode

bioautografi untuk determinasi kloramfenikol dapat

dilakukan pada sampel produk pertaniaan,

peternakan, dan makanan. Dengan alasan tersebut,

maka kajian ini diharapkan dapat membantu industri

produk pertanian dan peternakan menjamin mutu

produk melalui metode yang sederhana dan murah.

Pemilihan metode bioautografi kontak

dikembangkan, karena relatif lebih sederhana

dibanding metode bioautografi yang lain. Selama

proses difusi, noda kloramfenikol pada lempeng KLT

ke dalam media yang mengandung mikroba uji, petri

disimpan di dalam lemari es selama dua jam untuk

mencegah mikroba uji berkembang sebelum proses

difusi sempurna.

Penentuan fasa gerak yang tersaji pada Gambar

1 menggunakan lima sistem fasa gerak menunjukkan

bahwa fasa gerak air : metanol : kloroform (1:10:90,

v/v) menghasilkan kromatogram dengan jarak

tempuh noda dan harga Rf yang paling kecil, yaitu

sebesar 0.1. Sistem tersebut mengandung kloroform

dengan proporsi yang lebih besar, sehingga sistem

relatif lebih semi menuju ke polar. Sebaliknya, sistem

fasa gerak yang memiliki jarak tempuh noda dan

harga Rf paling besar adalah kloroform : metanol :

asam asetat glasial (79:14:7, v/v). Harga Rf yang

dihasilkan 0.7. Sistem ini relatif bersifat kurang po-

lar dibandingkan sistem pertama.

Gambar 2 juga menampilkan replikasi jarak

tempuh noda pada kromatogram yang bervariasi

dalam satu sistem fasa gerak. Fenomena ini terjadi

karena adanya perbedaan kejenuhan dalam bejana

kromatografi. Kondisi dalam bejana kromatografi

selama elusi sangat komplek, karena melibatkan tiga

faktor yaitu lempeng KLT sebagai fasa diam, sistem

fasa gerak, dan uap (Sherma, 2003).

Ditetapkan fasa gerak terpilih adalah kloroform:

metanol (80:20, v/v) dengan alasan komponennya

lebih sederhana, hanya tersusun dari dua komponen

pelarut. Selain itu, komposisi perbandingan kloroform

lebih sedikit, sehingga lebih ekonomis jika diaplikasi-

kan dalam industri. Faktor lain yang sangat berpenga-

ruh, fasa gerak kloroform : metanol : asam asetat

(a) (b) (c)

Gambar 8. Penentuan limit deteksi menggunakan konsentrasi 0.5 ppm hingga 80 ppm

Tabel 6. Hasil uji bioautografi parameter limit deteksi


23

glasial (83:10:7, v/v) menyebabkan zona hambat

kloramfenikol tidak dapat diamati. Fenomena ini

dapat dijelaskan bahwa asam asetat glasial dapat

menghambat pertumbuhan mikroba uji. Hasil kajian

ini menunjukkan bahwa dengan metode bioautografi

dapat diamati pengaruh aktivitas pelarut terhadap

mikroba uji, dan fenomena ini tidak dapat diamati

dengan metode fisika-kimia.

Hasil penentuan konsentrasi digunakan sebagai

acuan untuk menentukan konsentrasi linearitas dan

parameter yang lain. Penentuan konsentrasi tanpa

elusi ditunjukkan pada Gambar 2 (a). Konsentrasi

75 ppm tidak menunjukkan zona hambat karena

permukaan media agar yang tidak rata, sehingga noda

kloramfenikol pada lempeng KLT tidak dapat

menempel dan berdifusi pada media.

Hasil pengamatan linearitas menunjukkan

bahwa semakin besar konsentrasi kloramfenikol, di-

ameter zona hambat yang dihasilkan semakin besar.

Namun hal tersebut tidak berarti bahwa diameter

zona hambat dapat menggambarkan konsentrasi

kloramfenikol secara linear. Untuk penentuan

linearitas, digunakan hubungan antara logaritma

konsentrasi kloramfenikol dengan diameter zona

hambat kloramfenikol. Persamaan garis regresi yang

dihasilkan adalah Y = 2.8X – 4.3 dan koefisien

korelasi (r) = 0.9. Koefisien korelasi (r) disyaratkan

harus lebih besar dari r Tabel. Harga r Tabel untuk

derajat bebas 4 pada 0.05 adalah 0.8, maka harga

r hitung memenuhi persyaratan. Harga koefi sien

variasi fungsi (Vx0) = 1.8%. Harga tersebut

memenuhi syarat, yaitu lebih kecil dari 5%

(Indrayanto, 1994). Kurva linearitas yang terbentuk

dari logaritma konsentrasi dan diameter zona hambat

(Gambar 4) menunjukkan garis linear. Dengan

demikian, dapat disimpulkan adanya korelasi linear

antara logaritma konsentrasi dengan zona hambat

kloramfenikol pada konsentrasi 100 ppm, 125 ppm,

150 ppm, 175 ppm, dan 200 ppm.

Persen perolehan kembali yang didapat sebagai

harga parameter akurasi sebesar 98.8% ± 0.5. Harga

tersebut memenuhi rentang yang dipersyaratkan un-

tuk bioanalisis, yaitu 80% - 120% (Hartman et al.,

1994). Dari data tersebut dapat disimpulkan bahwa

metode bioautografi akurat dan dapat menggambar-

kan kadar sebenarnya.

Penentuan parameter presisi menunjukkan

variasi replikasi diameter zona hambat. Variasi ini

dapat disebabkan aseton yang digunakan sebagai

pelarut kloramfenikol mudah menguap, sehingga

terjadi variasi konsentrasi ketika ditotolkan. Harga

koefisien variasi (KV) konsentrasi 125 ppm, 150

ppm, dan 175 ppm berturut-turut adalah 3.7%,

0.2%, dan 4.7%, sedang harga KV rata-rata 2.8% ±

2.3. Baik harga KV masing-masing konsentrasi

maupun KV rata-rata memenuhi persyaratan, yaitu

tidak melebihi 5% (Skoog, 1980).

Pada penentuan limit deteksi, konsentrasi 10

ppm pada Gambar 8 (b) masih menghasilkan zona

hambat, tetapi pada Gambar 8 (c) konsentrasi 10

ppm tidak menunjukkan zona hambat. Maka,

konsentrasi 10 ppm ditentukan sebagai harga KHM

kloramfenikol. Nilai KHM merupakan konsentrasi

terkecil kloramfenikol dapat menghambat

pertumbuhan mikroba uji. Fenomena ini memberi-

kan acuan dalam menentukan batas konsentrasi

kloramfenikol yang masih dapat diamati

menggunakan metode KLT. Harga KHM tersebut

juga digunakan sebagai harga limit deteksi uji

bioautografi kloramfenikol, yaitu konsentrasi 10 ppm

dengan jumlah penotolan 6 L, atau setara dengan

0.006 g kloramfenikol. Dosis tengah untuk uji

aktivitas kloramfenikol dengan bakteri E. coli sesuai

Farmakope Indonesia Edisi IV adalah 2.5 g.

Dibandingkan harga dosis tengah tersebut, harga

KHM atau limit deteksi yang diperoleh lebih kecil

dan merupakan batas pengamatan, sekaligus

menujukkan kloramfenikol masih peka terhadap

mikroba uji.

Untuk memudahkan pengukuran diameter zona

hambat pada uji bioautografi, diperlukan jumlah ino-

kulum mikroba uji yang proporsionl dengan volume

media dan potensi antibiotika, sehingga zona hambat

dapat diamati dengan jelas.

DAFTAR PUSTAKA

Anonim (2009). http://www. springer link.com/con-

tent/p573u390x 883183k/, Accessed tanggal

22/05/2009.

Anonim (2004). Residu Antibiotik pada Hati dan

Ginjal Ayam Petelur Apkir. http://www.


24

republika.co.id /suplemen/cetak_detail.asp? mid

=1&id=180684&katid=105&kat_id1=151

&kat_id2= 192. Accessed tanggal 24/10/2007.

Arlikaningrun, R.D. (2006). Perbandingan Stabilitas

Larutan Kloramfenikol dalam Dapar Borat dan

Sitrat. Disertasi, Universitas Airlangga, Surabaya.

Choma, I. (2005). The Use of Thin-Layer Chroma-

tography with Direct Bioautography for Antimi-

crobial Analysis. http://www. lcgceurope.adv

100.com/lcgceu rope/article/aarticleDetail. jsp?

id=177453. Accessed tanggal 24/10/2007.

Dharmananda S. (2003). Traces of Chlorampheni-

col in Chinese Bee Products:

Origin, Development, And Resolution. (2008).

http://www.itmonline.org/arts/bees.htm. Ac-

cessed tanggal 13/2/2008.

Direktorat Jendral Pengawasan Obat dan Makanan

Departemen Kesehatan Republik Indonesia

(1995). Farmakope Indonesia. Edisi ke-4,

Jakarta: Departemen Kesehatan, hal. 891-1017.

Efendi, E. (2007). Budidaya Perairan. http://www.

unila.ac.id/~fp-ikan/index.php?option =com_

content7 task=view&id=73&Itemid= 115. Ac-

cessed tanggal 24/10/2007.

Harmita (2004). Petunjuk pelaksanaan validasi

metode dan cara perhitungannya. Majalah Ilmu

Kefarmasian, No. 3, Vol. 1, p. 117-135.

Indrayanto, G. (1994). Metode validasi pada analisis

dengan kromatografi. Medika-Jurnal kedokter-

an dan Farmasi, hal. 49-51.

Hartman, C., Massart, D.L., McDowell, R.D.

(1994). An analysis of the Washington Confer-

ence report on bioanalytical method validation.

Journal of Pharmaceutical and Biomedical

Analysis, Vol. 12, p. 1337-1343.

Isnaeni (1998). Mutasintesis Antibiotika Mutan

Streptomyces griseus ATCC 10137. Disertasi,

ITB, Bandung.

Isnaeni (2005). Bioautogarafi antibiotika hasil fermen-

tasi mutan Streptomyces griseus ATCC 10137.

Majalah Farmasi Airlangga, No. 16, Vol. 5.

Ganiswarna, V.H.S. (1995). Farmakologi dan Terapi.

Edisi ke-4, Jakarta: Bagian Farmakologi Fakul-

tas Kedokteran Universitas Indonesia, hal. 571,

657-660.

Sherma, J. and Fried, B. (2003). Handbook of Thin-

Layer Chromatography, Ed. 3rd, New York:

Marcel Dekker, Inc., pp. 1-6, 437-438.

Skoog, D.A. (1980). Principles of Instrumental

Analisis. Ed. 3th, New York: Socunders College

Publishing, pp. 560.

Sohaskey, C.D and Barbour, A.G. (1999). Esterases

in serum-containing growth media counteract

ChloramphenicolAcetyltrans ferase activity in

vitro. Antimicrobial Agent and Chemotherapy,

No. 3, Vol. 43, p. 655-660.

Touchstone, J.C and Dobbins, M.F. (1983). Practice

of Thin Layer Chromatography. Ed. 2nd, New

York: John Wiley & Sons, Inc, p. 1-15, 361-365.

The United States Pharmacopeial Convention

(1999). The United States Pharmacopeia. Ed.

31th, Vol. 2rd, Philadelphia: The United States

Pharmacopeial Convention, Inc., pp. 1704.

SUSANTI Validasi Metode Bioautografi untuk Determinasi Kloramfenikol Validation of Bioautographic...

Documents

Transcript of SUSANTI Validasi Metode Bioautografi untuk Determinasi Kloramfenikol Validation of Bioautographic...