Quím ica

CROMATOGRAFÍ A DE AFI NI DAD

La cromatografía de afinidad ocupa un lugar importante en la tecnología de separación, ya

que es una técnica capaz de purificar biomoléculas sobre la base de su función biológica o

est ructura quím ica individual. Esto hace que sea un método de mayor resolución

precisamente por la ext raordinaria select ividad en que se basa su principio de separación.

La primera aplicación de este t ipo cromatografía se llevó a cabo en 1910 en la purificación

de am ilasa sobre la base de un alm idón insoluble. Posteriorm ente en 1967, algunos autores

reportaron que las moléculas que contenían grupos am inos primarios, podían ser acopladas

a mat r ices de polisacáridos act ivadas con bromuro de cianógeno y ya en 1972, la Pharmacia

había desarrollado la Sepharose-4B act ivada con bromuro de cianógeno, un gel listo para la

inmovilización del ligando. En la actualidad existen una serie de productos (geles) listos

para la inmovilización del ligando a t ravés de diferentes grupos funcionales.

Ejemplos:

• Thiopropyl-Sepharose 6B (cont iene un grupo t iol act ivo, para inmovilizar ligandos

pequeños que contengan grupos t ioles, enlaces C= O, N= N o C= C ) .

• Epoxy-act ivated-Sepharose 6B (cont iene grupos oxiranos libres para interactuar con

ligandos que contengan hidroxilos, grupos am ino o grupos t ioles) .

• Act ivated CH-Sepharose 4B (cont iene un brazo espaciador de 6 átomos de carbono y un

grupo éster act ivo para interactuar con ligandos que contengan grupos am inos

primarios) .

Esta crom atografía es un t ipo de crom atografía de adsorción en la que la molécula a ser

purificada es adsorbida de forma reversible y específica, a una sustancia complementaria

( ligando) inmovilizada en un soporte insoluble (mat r iz) . Tiene un efecto concent rador, lo

que perm ite procesar grandes volúmenes de muest ra. La alta select ividad de las

separaciones depende de la especificidad natural de las moléculas interactuantes.

Este m étodo puede ser usado para:

• Purificar sustancias de m ezclas biológicas complejas.

• Separar la forma nat iva de la desnaturalizada de una m ism a sustancia.

• Elim inar pequeñas cant idades de material biológico de grandes cant idades de sustancias

contam inantes.

Este t ipo de cromatografía a la cual hacemos referencia se desarrolla en t res etapas

fundam entales (Figura 1) :

1. I nmovilización del ligando.

2. Adsorción de la sustancia a purificar.

3. Desorción de la sustancia fij ada.

Cromatografía de Afinidad

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Figura1. Etapas fundam entales de la cromatografía de afinidad.

Cromatografía de Afinidad

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Fig. 2 Procedim iento para la cromatografía de afinidad.

La interacción ent re las dos moléculas, producto (P) y ligando (L) , puede presentarse en el

siguiente equilibr io:

Cromatografía de Afinidad

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k1

P + L PL

k -1

donde:

P es la molécula que debe ser purificada

L es el ligando

k1 y k -1 , son las constantes de asociación y disociación de este equilibr io

respect ivamente.

La constante de disociación (kd) es igual a la relación k1/ k -1 y representa la afinidad ent re el

ligando y la proteína.

Los sistemas biológicos más usados, en la cromatografía de afinidad, son los pares

biológicos:

Enzim a - I nhibidor, cofactor, virus

Ant icuerpo - Ant ígeno, virus

Hormona - Receptor

Vitam ina - Proteína t ransportadora

Macrom oléculas que interactuan con metales - I ones metálicos

El procedim iento general de como llevar a cabo un proceso cromatográfico de afinidad se

representa en la Figura 2.

1- Selección del ligando.

En la cromatografía de afinidad el ligando es un com puesto que presenta una afinidad

reversible y más o menos específica, con el producto que se desea separar. En general el

ligando seleccionado para este t ipo de cromatografía debe tener las siguientes

característ icas:

1.1. Ser capaz de formar complejos reversibles con la molécula a separar, sino conllevaría a

ut ilizar métodos drást icos en la separación. La interacción reversible con la molécula a ser

separada debe ser en el orden de una kd = 10 -4-10 -8 mol/ L, lo cual aumenta la resolución.

1.1.1. Si kd es menor de 10 -8 (o sea una kd baja) , ocurr ir ía una unión L-P ext rem adam ente

fuerte, por lo que la forma de desorción t raería consigo la desnaturalización de P o la

dest rucción del L.

1.1.2. Si kd es mayor que 10 -4 (o sea una kd alta) , ocurr ir ía una unión L-P débil debido a la

poca afinidad de P por el L y ésto pudiera dar lugar a que no se fije toda la proteína o nada,

prom oviendo la unión de ot ras moléculas o contam inantes.

1.2. Poseer al menos un grupo quím icamente react ivo que perm ita su inmovilización. Este

grupo no debe estar involucrado en el proceso de interacción con el producto.

1.3. Ser estable durante las reacciones de inmovilización.

Tipos de ligando:

Existen diferentes t ipos de ligandos:

Cromatografía de Afinidad

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• Monoespecíficos de bajo peso molecular (ej . vitam inas y horm onas) .

• Monoespecíficos de alto peso molecular (ej . complejos inm unoenzim át icos Ag-Ac) .

• Grupos específicos de bajo peso molecular (ej . cofactores enzim át icos y NADH) .

• Grupos específicos de alto peso molecular (ej . lecit inas) .

2. Selección de la mat r iz.

Los factores que caracterizan un soporte apropiado para cromatografía de afinidad son los

siguientes:

2.1. Que sea lo más inerte posible pero con grupos que interactúen con el ligando.

2.2. I nsoluble en agua.

2.3. Hidrofílico.

2.4. Que posea una porosidad que perm ita la difusión de la part ícula al ligando y está

relacionada con la capacidad de adsorción del soporte, ya que a mayor tamaño, mayor

superficie y mayor capacidad.

2.5. Rigidez, tam año y form a de la part ícula.

2.6. Estabilidad quím ica, mecánica y biológica.

2.7. Poseer grupos quím icos disponibles para la act ivación.

2.8. Resistencia al ataque m icrobiano.

2.9. Facilidad de regeneración.

2.10. Bajo costo.

La capacidad de adsorción de un soporte generalmente depende de la cant idad de ligando

inmovilizado y su accesibilidad. Una inmovilización máxima de ligando se produce o bien

cuando la reacción t iene lugar tanto sobre la superficie como en el interior de la part ícula de

gel act ivada o cuando los grupos funcionales de la m at r iz están altam ente concent rados. Sin

embargo, debe señalarse que el alto grado de sust itución, part icularm ente en el caso de las

m acrom oléculas, da lugar a un gran núm ero de sit ios de adsorción no específicos y que una

alta concent ración de polímero en el soporte produce insuficiente porosidad. Por lo tanto, la

selección de la mat r iz es un comprom iso ent re un alto grado de sust itución y una pobre

porosidad en la mat r iz.

En general los soportes cromatográficos ut ilizados en cromatografía de afinidad, pueden ser

de origen natural o sintét ico. Dent ro de los soportes de origen natural, los más usados son

los polisacáridos, como la agarosa, la celulosa y la dext rana. Son ut ilizados también

frecuentemente algunas mat r ices sintét icas como geles de poliacrilam ida.

Cromatografía de Afinidad

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También en este t ipo de cromatografía, a veces es necesario ut ilizar un Brazo Espaciador,

que se usa cuando el ligando t iene un peso molecular relat ivamente pequeño (menor o igual

a 5000) , cuando t iene una baja afinidad hacia el P a separar y cuando hay problem as de

accesibilidad. Generalmente el brazo espaciador está const ituido por una cadena

hidrocarbonada pequeña y lineal. En un ext remo se localiza el grupo quím ico que se une a

la mat r iz (ej . am ina primaria) y el ot ro ext remo cont iene el grupo seleccionado, sobre la

base del ligando que va a ser fij ado. Este grupo, se conoce com o "Term inal" y usualm ente

es una am ina primaria o un grupo carboxilo.

Fórm ula general de un brazo espaciador (B.E.)

NH2- (CH2) n-X

donde:

X = -COOH ó -NH2

La longitud del B.E. es crít ica. La cadena debe tener de 2 a 12 átom os de carbono.

- Si es muy larga, favorece las adsorciones no específicas, part icularmente cuando la

cadena hidrocarbonada t iene un carácter hidrofóbico.

- Si es muy corta, no perm ite la elim inación de los efectos estéricos, o sea no resuelve el

problema de accesibilidad P-L.

A pesar de que existe la posibilidad de seleccionar brazos espaciadores de longitudes

diferentes, el más ut ilizado cont iene 6 átomos de carbono (ácido am inohexanoico o

hexam et ilendiam ino) .

Cromatografía de Afinidad

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Fig. 3. Principales métodos de inmovilización.

3. Acoplam iento del ligando.

Cromatografía de Afinidad

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En principio, la mat r iz en su forma nat iva no está preparada para inmovilizar el ligando, por

lo tanto se requiere de un proceso de act ivación- inmovilización (o sea, primero act ivar la

mat r iz y después inmovilizar el ligando. Sólo en el caso que se ut ilicen mat r ices comerciales

preact ivadas, la act ivación no t iene lugar.

3.1. Principales métodos de inmovilización (Figura 3)

3.1.1. I nmovilización directa: unión del ligando a un soporte act ivado.

3.1.2. I nmovilización indirecta: unión del ligando a un brazo espaciador previamente fijado

a un soporte act ivado.

Existen diferentes técnicas de act ivación de la mat r iz, que difieren de acuerdo a los grupos

disponibles de la m isma. Por ejemplo, el bromuro de cianógeno, bisepoxiranos,

divinilsulfona, epiclorhidr ina, benzoquinona, carbonildiim idazol, peryodato y cloruro de tosilo

reaccionan con los grupos hidroxilos de la mat r iz. En la Tabla 1 se muest ran las

característ icas fundamentales de los diferentes métodos de act ivación e inmovilización.

Los ácidos nucleicos y azúcares pueden ser inmovilizados en mat r ices act ivadas con

bisepoxiranos.

La unión de m acrom oléculas que cont ienen t irosina (ej . proteínas) , puede ser realizada por

act ivación de los grupos diazonios. Para ello se requiere unir a la mat r iz un derivado

aromát ico (ej . cloruro de p-nit ro bencilo) , seguido de una reducción del grupo -NO2 y

diazotación en medio ácido. El más usado es el bromuro de cianógeno (Figura 4) . el cual

reacciona con los grupos hidroxilos de polisacáridos y da lugar fundamentalmente a dos

productos react ivos (éster de cianato, que es m uy react ivo y predom ina cuando la m at r iz es

agarosa, y el im idocarbonato cíclico que predom ina cuando la mat r iz es celulosa) , a los

cuales pueden acoplarse proteínas, ácidos nucleicos y ot ros biopolímeros, grupos am idas,

tales como poliacrilam ida y para la inmovilización de L que contengan am ino. Estos métodos

no funcionan sobre m at r ices de polisacáridos. Es rápido, un t iem po de act ivación de 0.2-0.4

horas, inestable a pH menor que 5 y mayor o igual que 10 y es tóxico.

La simplicidad del método, el hecho que t rabaja también en combinación con la agarosa,

una mat r iz con excelentes propiedades cromatográficas y que es lo suficientemente suave

para enlazar ligandos sensibles tales como proteínas (ant icuerpos y enzim as) ha hecho que

sea la técnica más usada para la preparación de adsorbentes de afinidad.

Por ot ra parte la act ivación con glutaraldehido e hidracina (Figura 5) , son usadas con

mat r ices que t ienen grupos am idas o am ino primario.

Cromatografía de Afinidad

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Fig. 4 Act ivación de la m at r iz con CNBr

Cromatografía de Afinidad

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Fig. 5 Act ivación de la mat r iz con Hidracina.

3.2 Detalles práct icos en el acoplam iento del ligando.

3.2.1. Como en el L se usan más los grupos am inos, no se debe inmovilizar con buffer Tris-

HCl porque t ienen grupos NH2 también y podría bloquear la unión del ligando a la mat r iz.

3.2.2. Los buffers m ás usados son los de carbonato-bicarbonato, normalmente a μ no

elevadas y pH = 9.

3.2.3. El t iempo y la temperatura de reacción ideal es durante toda la noche a 4º C ó a 20º C

y siempre en agitación para evitar las lim itaciones difusionales.

3.2.4. Cuando se det iene la inmovilización se debe filt rar al vacío (nunca a sequedad) y