NGHIÊN CỨU ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA NANO ...

BỘ GIÁO DỤC VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC

VÀ ĐÀO TẠO VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ -----------------------------

QUÁCH THỊ QUỲNH

NGHIÊN CỨU ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA

NANO ASTAXANTHIN

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Hà Nội – Năm 2021

BỘ GIÁO DỤC VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ ĐÀO TẠO VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ -----------------------------

QUÁCH THỊ QUỲNH

NGHIÊN CỨU ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA

NANO ASTAXANTHIN

Chuyên ngành : Sinh học thực nghiệm

Mã số : 8420114

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC

Hướng dẫn 1 : TS. Hoàng Thị Minh Hiền

Hướng dẫn 2 : TS. Hoàng Mai Hà

Hà Nội – 2021

LỜI CAM DOAN

Tôi xin cam đoan đề tài nghiên cứu trong luận văn này là công trình nghiên

cứu của tôi và nhóm tác giả. Chính vì vậy, các kết quả nghiên cứu đảm bảo

trung thực và khách quan nhất. Đồng thời, kết quả này chưa từng xuất hiện

trong bất cứ một nghiên cứu nào. Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là

trung thực nếu sai tôi hoàn chịu trách nhiệm.

Hà Nội, ngày tháng 12 năm 2021

Học viên

Quách Thị Quỳnh

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Hoàng Thị Minh

Hiền, Trưởng Phòng Công nghệ Tảo, Viện Công nghệ sinh học và TS. Hoàng

Mai Hà, Trưởng Phòng Vật liệu tiên tiến, Phó viện trưởng Viện Hóa học, Viện

Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã định hướng và giúp đỡ tôi trong

suốt quá trình thực hiện luận văn.

Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới ThS. Hồ Thị Oanh - Phòng vật

liệu tiên tiến, Viện Hóa học đã chỉ bảo, hướng dẫn tận tình và giúp đỡ tôi

trong suốt thời gian làm nghiên cứu. Ngoài ra tôi xin cảm ơn tới các cán bộ ở

phòng Công nghệ Tảo – Viện Công nghệ Sinh học đã tạo mọi điều kiện cho tôi

hoàn thành tốt nhiệm vụ.

Tôi xin trân trọng cảm ơn các thầy, cô giáo của Phòng Đào tạo – Học

Viện Khoa học và Công nghệ đã tạo điều kiện thuận lợi giúp đỡ tôi hoàn thành

mọi thủ tục cần thiết trong quá trình thực hiện luận văn.

Luận văn được thực hiện trong khuôn khổ đề tài Quỹ Phát triển Khoa

học và Công nghệ Quốc gia - Nafosted, Bộ Khoa học và Công nghệ:“Nghiên

cứu chế tạo và đánh giá hoạt tính chống oxy hóa và giảm rối loạn chuyển hóa

lipit của tổ hợp nano astaxanthin/kaempferol trên mô hình in vitro và in vivo”

mã số 108.06-2019.314 do TS. Hoàng Thị Minh Hiền làm chủ nhiệm.

Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất tới gia đình, bạn bè –

những người luôn bên cạnh chia sẻ, động viện, ủng hộ, giúp đỡ và tạo mọi

điều kiện tốt nhất cho tôi trong suốt thời gian nghiên cứu và hoàn thành luận

văn của mình.

Hà Nội, ngày tháng 12 năm 2021

Tác giả luận văn

Quách Thị Quỳnh

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Từ viết tắt Tên đầy đủ Tên tiếng Việt

FDA Food and Drug Administration

Cơ quan Quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Hoa Kỳ

BKT β - carotene oxygenase Enzyme β - carotene oxygenase

CrtR-b β -carotene hydroxylase Enzyme β -carotene hydroxylase

H. pluvialis Haematoccocus pluvialis Vi tảo lục Haematoccocus pluvialis

NF-KB Nuclear factor kappa B Yếu tố nhân kappa B

RNA Ribonucleic acid Acid ribonucleic

DNA Deoxyribonucleic acid Acid deoxyribonucleic

HDL High Density Lipoprotein Lipoprotein tỉ trọng cao

CT Computer tomography Chụp cắt lớp vi tính

MRI Magnetic Resonance Imaging Chụp ảnh cộng hưởng từ hạt nhân

MLV Multilamellar Vesicle Liposome nhiều lớp

LUV Liposome Large Unilamellar Vesicle

Liposome loại to

COX-2 Cyclooxygenase-2 Enzyme cyclooxygenase-1

TNFα Tumor Necrosis Factor-α Yếu tố hoại tử khối u alpha

PS20 Polysorbate 20 Polysorbate 20

SC Sodium caseinate Natri Caseinate

GA Gum Arabic Gum Arabic

PDI Polydispersity index Chỉ số đa phân tán

PLGA Poly axit lac-tic-co-glycolic Poly axit lacticco glycolic

COS Chitosan oligosaccharides Chitosan oligosaccharides

ASX-NANE astaxanthin non-aqueous nanoemulsions

Nano astaxanthin không chứa nước

ASTA @ Lec NS

Astaxanthin lecithin nano-liposol

Astaxanthin lecithin nano-liposol

FTIR Fourier Transform Infared Spectrometer

Quang phổ chuyển đổi hồng ngoại Fourier

HPLC High Performance Liquid Chromatography

Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao

DMEM Dulbecco's Modified Eagle Medium

Môi trường nuôi cấy tế bào DMEM

FBS Fetal bovine serum Huyết thanh thai bò

ORO Oil Red O Dầu đỏ

TEM Transmission electron microscopy

Kính hiển vi điện tử truyền qua

DLS Dynamic Light Scattering phương pháp tán xạ ánh sáng động

HepG2 Các dòng tế bào gan người

HT29 Tế bào ung thư đại tràng

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Nguồn cung cấp astaxanthin trong tự nhiên ........................................... 10

Bảng 1.2 Ảnh hưởng của thức ăn bổ sung astaxanthin lên các đối tượng thủy

sản............................................................................................................................14

Bảng 2.1. Thành phần các mẫu nano astaxanthin .................................................. 28

Bảng 2.2. Địa điểm tiến hành nghiên cứu .............................................................. 34

Bảng 3.1 Kết quả đánh giá khả năng phân tán trong nước của astaxanthin tinh

khiết và mẫu nano astaxanthin............................................................................... 39

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ

Hình 1.1 Cấu trúc của astaxanthin ............................................................................ 5

Hình 1.2. Vị trí vượt trội của astaxanthin trên màng tế bào ..................................... 6

Hình 1.3. Con đường sinh tổng hợp astaxanthin ở H. pluvialis ............................... 8

Hình 1.4. Phản ứng tổng hợp astaxanthin ................................................................. 9

Hình 1.5 Cấu trúc của hệ vật liệu nano đa chức năng ........................................... 18

Hình 2.1. Sơ đồ chế tạo nano astaxanthin .............................................................. 29

Hình 3.1. Giản đồ phân bố kích thước hạt của nano astaxanthin theo các tỷ lệ khác

nhau giữa astaxanthin và chất hoạt động bề mặt cremorphor RH40 ................... 36

Hình 3.2. Giản đồ phân bố kích thước hạt của nano astaxanthin sử dụng chất hoạt

động bề mặt cremophor RH40 và tween 80 .......................................................... 37

Hình 3.3. Ảnh TEM của các mẫu A1, A2, A3 và A4 ........................................... 38

Hình 3.4. So sánh khả năng phân tán trong nước của astaxanthin tinh khiết và

nano astaxanthin ..................................................................................................... 39

Hình 3.5. Hoạt tính chống oxi hóa của astaxanthin và nano astaxanthin sử dụng

DPPH................. ...................................................................................................... 40

Hình 3.6. Ảnh hưởng của nano astaxanthin lên khả năng sống sót của tế bào

HT29........................................................................................................................ 41


HepG2 ..................................................................................................................... 42

Hình 3.8. Hiệu quả hấp thu astaxanthin của tế bào HT29 ..................................... 43

Hình 3.9. Sắc ký đồ HPLC của astaxanthin được hấp thu trong tế bào được ủ với

mẫu trắng (A), astaxanthin (B) và nano astaxanthin (C) ............................. ......... 44

Hình 3.10. Khả năng sống của tế bào HepG2 được cảm ứng với H2O2 trong các

nhóm xử lý khác nhau (n = 6) ................................................................................ 45

Hình 3.11. Tác dụng của nano astaxanthin lên hàm lượng cholesterol (A) và

triglycerid (B) trong tế bào HepG2...................................................................47

Hình 3.12. Khả năng tích lũy lipit nội bào được phân tích bằng phương pháp

nhuộm Oil Red O (A) và đo mật độ quang ở bước sóng 500 nm trên máy

quang phổ Hitachi U-1100 (B)....................................... ..................................48

MỤC LỤC

Trang

MỞ ĐẦU ................................................................................................................... 1

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .................................................................. 4

1.1 ASTAXANTHIN ................................................................................................ 4

1.1.1. Giới thiệu chung .............................................................................................. 4

1.1.2. Cấu trúc và tính chất của astaxanthin .............................................................. 4

1.1.2.1 Cấu trúc của astaxanthin ................................................................................ 4

1.1.2.2 Tính chất của astaxanthin .............................................................................. 6

1.1.3. Sinh tổng hợp astaxanthin ............................................................................... 7

1.1.4. Các nguồn astaxanthin ..................................................................................... 8

1.1.3.1 Nguồn tổng hợp hóa học ............................................................................... 8

1.1.3.2 Nguồn tự nhiên .............................................................................................. 9

1.1.4. Sinh khả dụng và động học dược lý của astaxanthin .................................. 11

1.1.4.1 Sinh khả dụng của Astaxanthin .................................................................. 11

1.1.4.2. Động học dược lý của astaxanthin ............................................................ 11

1.1.5. Hoạt tính chống oxy hóa của astaxanthin .................................................... 12

1.1.6. Ứng dụng của astaxanthin ............................................................................ 13

1.1.6.1 Astaxanthin trong nuôi trồng thủy sản ....................................................... 13

1.1.6.2 Astaxanthin đối với con người ................................................................... 15

1.2 CÔNG NGHỆ NANO VÀ NANO ASTAXANTHIN ................................... 17

1.2.1 Cấu trúc của hệ nano y sinh ......................................................................... 17

1.2.2. Các loại vật liệu nano ................................................................................... 18

1.2.3 Các chức năng y sinh của hệ ......................................................................... 19

1.2.3.1 Chức năng chuẩn đoán (phân tích đặc hiệu, ảnh MRI, ảnh quang) .......... 19

1.2.3.2 Chức năng điều trị ...................................................................................... 19

1.2.4. Các phương pháp chế tạo vật liệu nano ....................................................... 20

1.2.4.1 Phương pháp từ dưới lên ........................................................................... 20

1.2.4.2 Phương pháp từ trên xuống ........................................................................ 21

1.2.4.3 Phương pháp kết hợp .................................................................................. 22

1.2.5. Tình hình nghiên cứu về nano astaxanthin .................................................. 22

CHƯƠNG 2. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..... 26

2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU ..................................................................................... 26

2.1.1. Đối tượng nghiên cứu .................................................................................. 26

2.1.2. Các dòng tế bào ............................................................................................ 26

2.1.3 Hóa chất ......................................................................................................... 26

2.1.4. Thiết bị .......................................................................................................... 27

2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................................................................. 28

2.2.1. Nghiên cứu chế tạo nano astaxanthin .......................................................... 28

2.2.2. Phương pháp xác định tính chất của nano astaxanthin ................................ 29

2.2.2.1 Đánh giá hình thái và kích thước các mẫu vật liệu nano bằng kính hiển vi

điện tử truyền qua (Transmission electron microscopy - TEM) ........................... 29

2.2.2.2 Nghiên cứu sự phân bố kích thước hạt của nano astaxanthin bằng phương

pháp tán xạ ánh sáng động (Dynamic Light Scattering – DLS) ........................... 30

2.2.3. Phương pháp đánh giá một số hoạt tính sinh học của nano astaxanthin ở

mức độ in vitro. ....................................................................................................... 30

2.2.3.1. Phương pháp xác định hoạt tính chống oxi hóa bằng DPPH ................. 30

2.2.3.2. Phương pháp nuôi cấy tế bào ................................................................... 30

2.2.3.3. Phương pháp đánh giá độc tính của nano astaxanthin trên dòng tế bào

HT29 và HepG2 ...................................................................................................... 31

2.2.3.4. Phương pháp xác định sự hấp thu của tế bào đối với nano astaxanthin 31

2.2.3.5. Phương pháp đánh giá tác dụng bảo vệ tế bào của nano astaxanthin

chống lại stress oxy hóa do H2O2 gây ra trong tế bào HepG2 ............................ 32

2.2.3.6. Phương pháp đánh giá tác dụng giảm lipit của nano astaxanthin trên

dòng tế bào HepG2 ................................................................................................. 32

2.2.3.7. Phương pháp nhuộm lipit bằng Oil Red O (ORO) ................................... 33

2.2.3.8. Phương pháp phân tích hàm lượng lipit ................................................... 33

2.2.2.9. Phương pháp xử lý số liệu ......................................................................... 34

2.2.4. Địa điểm tiến hành các thí nghiệm trong nghiên cứu .................................. 34

CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ........................................................ 36

3.1. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO NANO ASTAXANTHIN .............. 36

3.1.1 Ảnh hưởng của chất hoạt động bề mặt tới quá trình chế tạo nano astaxanthin

............ .....................................................................................................................36

3.1.2. Hình thái của các mẫu nano astaxanthin ...................................................... 38

3.1.3. Đánh giá khả năng phân tán trong nước của mẫu bột nano astaxanthin .... 39

3.2. KẾT QUẢ ĐÁNH GIÁ MỘT SỐ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA NANO

ASTAXANTHIN ................................................................................................... 40

3.2.1. Hoạt tính tiêu diệt gốc tự do DPPH của astaxanthin và nano astaxanthin . 40

3.2.2. Độc tính tế bào của nano astaxanthin .......................................................... 41

3.2.3. Khả năng hấp thu của tế bào HT29 đối với nano astaxanthin .................... 42

3.2.4. Tác dụng bảo vệ tế bào HepG2 của nano astaxanthin chống lại tổn thương

bởi stress oxy hóa do H2O2 gây ra ........................................................................ 44

3.2.5. Tác dụng của nano-astaxanthin lên sự thay đổi hàm lượng lipit nội bào

trong tế bào gan HepG2 .......................................................................................... 46

CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ........................................................ 50

4.1. KẾT LUẬN ..................................................................................................... 50

4.2. KIẾN NGHỊ ..................................................................................................... 50

TÀI LIỆU THAM KHẢO ...................................................................................... 51

PHỤ LỤC ................................................................................................................ 62

1

MỞ ĐẦU

Bệnh rối loạn mỡ máu gây nên xơ vữa động mạch, dẫn đến nhiều biến

chứng nguy hiểm lên hệ tim mạch. Theo dự báo của Tổ chức Y tế Thế giới,

đây sẽ là nguyên nhân gây tử vong hàng đầu trong những năm tới. Tại Việt

Nam những năm gần đây, tỷ lệ người mắc các biến chứng tim mạch từ xơ vữa

động mạch ngày càng tăng cao và có xu hướng trẻ hóa. Việc phòng ngừa các

yếu tố nguy cơ gây ra xơ vữa động mạch rất quan trọng để ngăn ngừa các biến

chứng có thể xảy ra. Chính vì vậy, việc phát triển các hệ phân phối thuốc

nhằm tăng khả năng hòa tan thuốc, dẫn thuốc tới đích chính xác hơn, tập

trung thuốc tại đích có tác dụng trong thời gian dài, đồng thời an toàn khi sử

dụng là các hướng đang được tập trung nghiên cứu.

Astaxanthin - một caroteinoit có nhiều ứng dụng trong lĩnh vực thực

phẩm chức năng và y sinh học. Các nghiên cứu lâm sàng và trên động vật

thực nghiệm đã chứng minh rằng astaxanthin có nhiều hoạt tính sinh học như

tiêu diệt hiệu quả các gốc tự do, kháng viêm, chống lão hóa, giảm sự hình

thành khối u, phòng ngừa bệnh tim mạch và tai biến mạch máu não, bảo vệ

gan, chống tiểu đường, bảo vệ cơ thể khỏi bức xạ tia cực tím v.v...

Astaxanthin là loại carotenoit duy nhất có thể xuyên qua hàng rào máu của

võng mạc và não, có tác động tích cực đến hệ thần kinh trung ương và chức

năng não.

Mặc dù có nhiều hoạt tính sinh học quý nhưng astaxanthin lại được xếp

vào nhóm hoạt chất có độ tan trong nước rất thấp, do vậy sinh khả dụng bị

hạn chế. Hiện nay, công nghệ nano là một giải pháp hữu hiệu trong việc nâng

cao khả năng phân tán, cải thiện sự hấp thu, tăng cường dược tính và nâng cao

độ bền của hoạt chất. Để khắc phục những nhược điểm về độ hòa tan và độ

bền thấp, nano astaxanthin đang được nghiên cứu chế tạo. Việc nghiên cứu

đánh giá, so sánh hoạt tính của nano astaxanthin với astaxanthin nguyên chất

là một hướng nghiên cứu mới và cần thiết. Do vậy, luận văn tiến

hành: ‘‘Nghiên cứu đánh giá hoạt tính sinh học của nano astaxanthin’’.

* Mục tiêu của luận văn :

- Xác định được hình thái và sự phân bố kích thước hạt của nano

astaxanthin.

- Đánh giá được khả năng hấp thu, hoạt tính chống oxi hóa và khả năng

2

giảm lipit của nano astaxanthin theo hướng sử dụng trong y sinh học và thực

phẩm chức năng.

* Nội dung nghiên cứu

- Nội dung 1: Nghiên cứu hình thái và sự phân bố kích thước hạt của

nano astaxanthin:

+ Nghiên cứu hình thái hạt của nano astaxanthin;

+ Nghiên cứu sự phân bố kích thước hạt (DLS) của nano astaxanthin.

- Nội dung 2: Nghiên cứu đánh giá một số hoạt tính sinh học của nano

astaxanthin ở mức độ in vitro.

+ Xác định hoạt tính tiêu diệt gốc tự do DPPH của astaxanthin và nano

astaxanthin;

+ Đánh giá độc tính tế bào của nano astaxanthin;

+ Xác định khả năng hấp thu của tế bào ung thư đại tràng HT29 đối với

nano astaxanthin;

+ Đánh giá tác dụng bảo vệ tế bào HepG2 của nano astaxanthin chống

lại tổn thương bởi stress oxy hóa do H2O2 gây ra;

+ Nghiên cứu khả năng giảm lipit của nano astaxanthin.

* Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của luận văn:

Việc tạo ra những hệ dẫn truyền thuốc hướng đích, điều trị tập trung hiệu quả,

giảm lượng thuốc cần sử dụng là mục tiêu nghiên cứu của rất nhiều nhà khoa

học trong và ngoài nước. Luận văn thực hiện với mục đích đánh giá hoạt tính

sinh học của nano astaxanthin. Kết quả nghiên cứu có ý nghĩa khoa học và

thực tiễn cao. Kết quả thu được cho thấy những ưu điểm vượt trội như tăng

cường hiệu xuất hấp thu tế bào, tăng khả năng chống oxy hóa và giảm lipit

của sản phẩm nano. Như vậy, sản phẩm nano astaxanthin là nguồn dược liệu

đầy tiềm năng ứng dụng trong các ngành dược phẩm, mỹ phẩm và công nghệ

thực phẩm.

* Những đóng góp mới của luận văn:

1. Bột nano astaxanthin được chế tạo có khả năng phân tán tốt trong

nước, các hạt phân bố đồng đều và kích thước hạt nhỏ dưới 100 nm. Sản

3

phẩm này có tiềm năng ứng dụng làm nguồn nguyên liệu cho các công ty

dược phẩm trong nước.

2. Việc đánh giá được sự cải thiện về mức độ sinh khả dụng, khả năng

tăng cường hoạt tính chống oxy hóa và lipit của nano astaxanthin so với

astaxanthin dạng tự do góp phần nâng cao giá trị của sản phẩm nano

astaxanthin.

4

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 ASTAXANTHIN

1.1.1. Giới thiệu chung

Astaxanthin (3,3′-dihydroxy-β,β-carotene-4,4′-dione) là một

xanthophyll carotenoit màu đỏ cam có trong rất nhiều loại thủy sản (cá hồi, cá

vền, tôm, cua); động vật có vú không có khả năng tổng hợp astaxanthin và

phải được cung cấp từ khẩu phần ăn [1]. So với các carotenoit khác,

astaxanthin có hoạt tính sinh học mạnh mặc dù nó không có hoạt tính tiền

Vitamin A. Cơ quan Quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Hoa Kỳ (FDA) đã

chấp thuận việc sử dụng astaxanthin làm chất tạo màu thực phẩm trong thức

ăn gia súc và cá. Ủy ban Châu Âu coi astaxanthin tự nhiên như một loại thuốc

nhuộm thực phẩm [2]. Haematococcus pluvialis là một loại vi tảo lục có khả

năng sản xuất một lượng lớn astaxanthin trong điều kiện căng thẳng như độ

mặn cao, thiếu nitơ, nhiệt độ cao và ánh sáng [3]. Astaxanthin được sản xuất

từ loại vi tảo này là nguồn chính cung cấp cho con người [4]. Việc tiêu thụ

astaxanthin có thể ngăn ngừa hoặc giảm nguy cơ mắc các chứng rối loạn khác

nhau ở người và động vật. Được biết đến là chất chống oxy hóa mạnh,

astaxanthin mang lại nhiều lợi ích cho sức khỏe như chống lão hóa, hỗ trợ sức

khỏe tim mạch, giảm viêm, đau khớp, cholesterol cao và thậm chí có tiềm

năng lớn trong ngăn ngừa và hỗ trợ điều trị ung thư [1,2]. Chính vì vậy, việc

sử dụng astaxanthin như một chất bổ sung dinh dưỡng đã và đang được phát

triển nhanh chóng trong thực phẩm, mỹ phẩm và dược phẩm.

1.1.2. Cấu trúc và tính chất của astaxanthin

1.1.2.1 Cấu trúc của astaxanthin

Astaxanthin có công thức phân tử C40H52O4 và khối lượng 596,84g/mol

là một chất có nhiều nhóm hydroxyl hơn các xanthophylls khác, giúp tăng

cường hoạt động chống oxy hóa và tăng lợi ích sức khỏe ở người và động vật.

Astaxanthin gồm hai vòng β-ionone 6 cạnh được nối với nhau bởi một chuỗi

polyene có chứa liên kết đôi liên hợp. Phân tử này có hai nguyên tử cacbon

không đối xứng nằm ở vị trí 3 và 3’ của vòng β-ionone [1,2].

Astaxanthin có ba dạng cấu hình là astaxanthin tự do, dạng monoester

và dạng diester tùy thuộc vào sự kết hợp của 1 hoặc 2 gốc hydroxyl với các

5

axít béo [5]. Nhóm ester tạo ra mối liên kết giữa astaxanthin và protein. Vì

vậy, astaxanthin không thể gắn kết với protein nếu liên kết ester không tồn tại.

Do cấu trúc của astaxanthin có 2 vị trí 3 và 3’ ở dạng chiral nên chúng có 3

dạng đồng phân hình học: 3R-3’R; 3R-3’S và 3S-3’S (Hình 1.1). Trong đó,

3S-3’S là dạng astaxanthin có hoạt tính chống oxy hóa mạnh nhất, hai dạng

đồng phân còn lại có hoạt tính sinh học yếu [6].

Hình 1.1. Cấu trúc của astaxanthin

(Nguồn: Miao và cs, 2006 [5])

Astaxanthin chứa các liên kết đôi liên hợp, nhóm hydroxyl và nhóm

keto, có tính chất ưa béo tốt và ưa nước kém. Màu đỏ được tạo ra bởi các liên

kết đôi liên hợp tại trung tâm của hợp chất. Những liên kết đôi này giúp

astaxanthin hoạt động như một chất chống oxy hóa mạnh bằng cách cho

electron và phản ứng với các gốc tự do để biến chúng thành chất ổn định hơn

và chấm dứt phản ứng chuỗi gốc tự do trong nhiều sinh vật sống. Hoạt tính

chống oxy hóa của astaxanthin còn nhờ vào khả năng bắt gốc tự do của

nguyên tử hydro ở C3 methine của vòng β-ionone. Do sự tương đương về số

lượng các liên kết hydro nội phân tử kỵ nước và liên kết hydro của nhóm

phân cực trong các phân tử phospholipit, 2 vòng β-ionone của astaxanthin có

thể quét các gốc tự do cả ở mặt trong và mặt ngoài của màng tế bào. Vì vậy,

hoạt động sinh học của astaxanthin tốt hơn so với các chất chống oxy hóa

khác do nó có thể liên kết với màng tế bào từ trong ra ngoài (Hình 1.2) [7].

6

Hình 1.2. Vị trí vượt trội của astaxanthin trên màng tế bào

(Nguồn: Eiji Yamashita, 2015 [7])

1.1.2.2 Tính chất của astaxanthin

- Tính chất vật lý [8]

Tính tan: Astaxanthin là hợp chất không phân cực nên rất ít tan trong

nước (7.9 x 10-10 mg/L ở 25°C), trong một số dung môi hữu cơ độ tan của

astaxanthin như sau: 30 g/L trong DCM; 10 g/L trong CHCl3; 0.5 g/L trong

DMSO; 0.2 g/L trong aceton.

Điểm nóng chảy: 216 0C và điểm sôi: 774 0C.

Sự hấp thụ ánh sáng và màu sắc: Astaxanthin hấp thụ rất mạnh bức xạ

trong vùng 470÷510 nm nên có màu đỏ cam.

Tính hấp thu ánh sáng của astaxanthin có thể bị thay đổi khi

astaxanthin liên kết với các chất khác. Trong tôm, cua astaxanthin thường liên

kết với phân tử protein (crutacyanin) có λmax = 628 nm tạo nên màu xanh đặc

trưng của các loài thủy sản sống. Dưới tác dụng của nhiệt, liên kết bị phá hủy

và astaxanthin được giải phóng dưới dạng tự do có màu đỏ cam.

- Tính chất hóa học [8]

Trong phân tử astaxanthin có chuỗi polyen liên kết với các nhóm keto,

hydroxyl gắn với các vòng ở đầu mạch nên astaxanthin rất nhạy với ánh sáng,

7

nhiệt độ cao và các tác nhân oxy hóa, axít, bazơ… Sự oxy hóa astaxanthin

diễn ra nhanh khi có sự hiện diện của sunfit, ion kim loại, độ ẩm, oxy không khí.

Sự oxy hóa: Astaxanthin ở dạng tự do rất dễ bị oxy hóa bởi tác nhân

electrophil như oxy phân tử. Nhưng khi astaxanthin tạo phức với protein hay

ở dạng este hóa thì chúng trở nên bền hơn. Hoạt tính chống oxy hóa của

astaxanthin trong cơ thể được giải thích bởi khả năng bắt giữ gốc tự do tạo

thành gốc cacbon trung tâm bền vững nhờ hiệu ứng cộng hưởng:

RCOO* + AX RCOO - AX

Phản ứng với axít: Astaxanthin phản ứng với axít yếu làm dịch chuyển

cực đại hấp thụ của phân tử về phía bước sóng dài. Khi trung hòa bằng bazơ

yếu, cấu trúc phân tử astaxanthin lại được phục hồi, tuy nhiên khi phản ứng

với axít mạnh như: HCl, H2SO4… thì có thể xảy ra sự phân hủy chuỗi polyen

của astaxanthin làm nhạt màu đỏ cam.

1.1.3. Sinh tổng hợp astaxanthin

Có hai con đường sinh tổng hợp astaxanthin ở tảo H. pluvialis: con

đường thứ nhất bắt đầu với quá trình oxy hoá β- carotene tạo thành các chất

trung gian là echinenone, canthaxanthin và adonirubin; con đường thứ hai bắt

đầu bằng quá trình hydroxyl hoá β-carotene tạo thành các chất trung gian là

β-cryptoxanthin, zeaxanthin và adonixanthin (Hình 1.3) [9].

Mặc dù các bước đặc thù của quá trình sinh tổng hợp astaxanthin diễn

ra ở tế bào chất nhưng các enzyme chính của con đường tổng hợp carotenoit

chung lại được phân bố ở lục lạp [10]. Sinh tổng hợp astaxanthin của H.

pluvialis cũng theo con đường tổng hợp carotenoit chung đến β - carotene. Từ

β - carotene, astaxanthin được hình thành bởi hoạt động của 2 enzyme β -

carotene oxygenase (BKT) và β -carotene hydroxylase (CrtR-b). Các nghiên

cứu sử dụng chất ức chế quá trình carotenoit hóa đã chứng minh rằng

astaxanthin được tạo ra từ tiền chất canthaxanthin và zeaxanthin. BKT chuyển

hóa β - carotene thành canthaxanthin thông qua dạng trung gian là

echinenone, tiếp đó dưới tác dụng của enzyme CrtR-b sẽ chuyển

canthaxanthin thành astaxanthin. Ở con đường thứ 2, CrtR-b chuyển hóa β-

carotene thành zeaxanthin thông qua dạng trung gian là β-Cryptoxanthin, sau

đó dưới tác dụng của enzyme BKT sẽ chuyển zeaxanthin thành astaxanthin.

8

Như vậy, BKT và CrtR-b là 2 emzyme chìa khóa quan trọng trong quá trình

sinh tổng hợp astaxanthin ở tảo H. pluvialis.

Hình 1.3. Con đường sinh tổng hợp astaxanthin ở H. pluvialis

(Nguồn: Gimpel, 2015 [9])

1.1.4. Các nguồn astaxanthin

Có hai nguồn astaxanthin chính là nguồn astaxanthin tổng hợp hóa học

và tự nhiên.

1.1.3.1 Nguồn tổng hợp hóa học

Hiện nay, astaxanthin tổng hợp là nguồn cung cấp chủ yếu cho nuôi

trồng thuỷ sản. Hơn 95% astaxanthin tổng hợp trên thị trường được sử dụng

làm thức ăn bổ sung nhằm tạo ra các màu sắc của đối tượng nuôi khác nhau.

9

Quá trình tổng hợp hóa học astaxanthin được sử dụng lâu đời và rộng

rãi nhất liên quan đến phản ứng Wittig của muối photphat ở vị trí C15 với

dialdehyde ở vị trí carbon C10 (Hình 1.4A) [12]. Các phương pháp khác bao

gồm hydroxyl hóa canthaxanthin (Hình 1.4B) [13], một quá trình trùng hợp 3

mạch carbon có chiều dài 10, 20, 30 nguyên tử carbon thông qua ngưng tụ

dienolether [14] và các đồng phân của lutein được chiết xuất từ hoa cúc vạn

thọ để tạo thành zeaxanthin và sau đó chất này bị oxy hóa để hình thành

astaxanthin (Hình 1.4C) [15].

Hình 1.4. Phản ứng tổng hợp astaxanthin

(Phản ứng Wittig (A); Hydroxyl hóa canthaxanthin (B); Oxy hóa zeaxanthin (C))

(Nguồn: Nguyen Khoa Dang, 2013 [13])

1.1.3.2 Nguồn tự nhiên

Trong tự nhiên, astaxanthin được tìm thấy chủ yếu trong tảo, nấm men,

các loài cá hồi, tôm, cua và một số loài vi sinh vật khác (Bảng 1.1). Ngoài

nguồn tổng hợp hóa học, astaxanthin sản xuất cho thương mại hiện nay chủ

yếu thu nhận từ nấm men đỏ Phaffia rhodozyma, vi tảo lục H. pluvialis, trong

đó vi tảo lục H. pluvialis là một trong những nguồn thu nhận astaxanthin tốt

nhất trong tự nhiên [16]. Tôm, cua và cá hồi là nguồn cung cấp astaxanthin tự

nhiên tốt nhất cho con người thông qua chế độ ăn hợp lý. Trung bình một

người có thể ăn 165 gam cá hồi mỗi ngày để có được 3,6 mg astaxanthin, đây

10

cũng là lượng astaxanthin cần thiết tạo ra nhiều lợi ích cho con người theo

báo cáo của Iwamoto và cộng sự [17].

Bảng 1.1. Nguồn cung cấp astaxanthin trong tự nhiên

(Nguồn: Ambati và cs, 2014 [2])

Nguồn cung cấp Hàm lượng astaxanthin

(% sinh khối khô)

Chlorophyceae

Haematococcus pluvialis

Haematococcus pluvialis (K-0084)

Haematococcus pluvialis (Local isolation)

Haematococcus pluvialis (AQSE002)

Chlorococcum

Chlorella zofingiensis

Neochloris wimmeri

3,8

3,8

3,6

3,4

0,2

0,001

0,6

Ulvophyceae

Enteromorpha intestinalis

Ulva lactuca 0.01

0,02

0,01

Florideophyceae

Catenella repens

0,02

Alphaproteobacteria

Agrobacterium aurantiacum

Paracoccus carotinifaciens (NITE SD 00017)

0,01

2,2

Tremellomycetes

Xanthophyllomyces dendrorhous (JH)

Xanthophyllomyces dendrorhous (VKPM Y2476)

0,5

0,5

Labyrinthulomycetes

Thraustochytrium sp. CHN-3 (FERM P-18556)

0,2

Malacostraca

Pandalus borealis

Pandalus clarkia

0,12

0,015

11

1.1.4. Sinh khả dụng và động học dược lý của astaxanthin

1.1.4.1 Sinh khả dụng của Astaxanthin

Dầu ăn có thể tăng cường sự hấp thu của astaxanthin. Astaxanthin kết

hợp với dầu cá có tác dụng hạ lipit/giảm cholesterol máu và tăng hoạt tính

thực bào của các bạch cầu trung tính hoạt hóa khi so sánh với astaxanthin và

dầu cá riêng lẻ [18]. Astaxanthin đặc biệt vượt trội so với dầu cá về khả năng

cải thiện phản ứng miễn dịch, giảm nguy cơ mắc các bệnh truyền nhiễm và

bảo vệ thành mạch. Hoạt động tăng sinh của các tế bào lympho T và B giảm,

theo sau đó là giảm mức độ tạo thành O2, H2O2 và NO, đồng thời tăng các

enzym chống oxy hóa superoxide dismutase, catalase và glutathione

peroxidase và giải phóng canxi trong dịch bào sau khi dùng astaxanthin với

dầu cá. Sinh khả dụng và hoạt tính chống oxy hóa của astaxanthin được tăng

cường trong huyết tương chuột và mô gan sau khi sử dụng sinh khối

Haematococcus trong dầu ô liu [19].

Astaxanthin là một hợp chất hòa tan trong chất béo, do đó khả năng hấp

thu chất này sẽ được tăng lên khi kết hợp với các loại dầu. Astaxanthin đã

được chứng minh là có ảnh hưởng đáng kể đến chức năng miễn dịch trong

một số thử nghiệm in vitro và in vivo [19]. Các hợp chất ưa mỡ như

astaxanthin thường được biến đổi chuyển hóa trước khi chúng được bài tiết ra

ngoài và các chất chuyển hóa của astaxanthin đã được phát hiện trong các mô

khác nhau của chuột [20]. Sinh khả dụng của astaxanthin trong huyết tương

người đã được xác nhận với liều duy nhất 100 mg [21]. Tuy nhiên chỉ có 6%

astaxanthin xuất hiện ở trong máu người tình nguyện. Bên cạnh đó, các nghiên

cứu trên tế bào ruột Caco-2 cho thấy chỉ có 14-27% astaxanthin được hấp thu

vào trong ruột [22].

1.1.4.2 Động học dược lý của astaxanthin

Carotenoit được hấp thụ vào cơ thể giống như lipit và được vận chuyển

qua hệ thống bạch huyết vào gan. Sự hấp thụ của carotenoit phụ thuộc vào các

thành phần chế độ ăn uống kèm theo. Chế độ ăn nhiều cholesterol có thể làm

tăng hấp thu carotenoit trong khi chế độ ăn ít chất béo làm giảm hấp thu.

Astaxanthin trộn với axit mật sau khi uống vào và tạo thành các mixen trong

ruột. Các mixen cùng astaxanthin được hấp thụ một phần bởi các tế bào niêm

mạc. Tế bào niêm mạc ruột kết hợp astaxanthin vào chylomicra và được tiêu

12

hóa bởi lipoprotein lipase sau khi giải phóng vào bạch huyết trong vòng tuần

hoàn hệ thống và chylomicron dư thừa nhanh chóng được gan và các mô khác

loại bỏ. Astaxanthin được đồng hóa với lipoprotein và được vận chuyển vào

các mô [23]. Trong số các carotenoit có nguồn gốc tự nhiên, astaxanthin được

coi là một trong những loại carotenoit tốt nhất có thể bảo vệ tế bào, lipit và

màng lipoprotein chống lại tác hại oxy hóa.

1.1.5. Hoạt tính chống oxy hóa của astaxanthin

Astaxanthin là một chất chống oxy hóa và hoạt tính chống oxy hóa của

nó đã được chứng minh cao gấp 1000 lần so với vitamin E, 200 lần so với

polyphenol từ trà, 60 lần so với coenzyme Q10, 20 lần so với lycopene, 17 lần

so với hạt nho, 10 lần so với các carotenoit khác như zeaxanthin, lutein,

canthaxanthin, β-carotene và cao hơn 100 lần so với α-tocopherol [24]. Vì

vậy, astaxanthin thường được gọi là một “siêu vitamin E”. Nhiều công trình

công bố đã cho thấy astaxanthin có thể giúp ngăn ngừa một số bệnh ung thư

như ung thư bàng quang, gan, vòm họng và kết tràng. Astaxanthin có tác dụng

trong việc bảo vệ võng mạc khỏi bị oxy hóa, cải thiện những tổn thương võng

mạc, bảo vệ các tế bào tiếp nhận ánh sáng khỏi bị thoái hóa. Hơn nữa, chúng

có vai trò rất hữu hiệu trong việc giúp phòng ngừa và chữa trị những tổn

thương tế bào thần kinh như bệnh Alzheimer, Parkinson và những tổn thương

tủy sống [25]. Astaxanthin có khả năng ngăn ngừa sự oxy hóa lipoprotein có

tỷ trọng thấp, cung cấp 1,8; 3,6; 14,4 và 21,6 mg astaxanthin/ngày trong 2

tuần liên tiếp, ngăn ngừa bệnh xơ cứng động mạch, chứng tắc nghẽn động

mạch vành trên người tình nguyện [17]. Theo Hussein và cộng sự (2007),

chuột được uống astaxanthin với liều 50mg/kg/ngày có tác dụng tăng

cholesterol tốt (HDL-C, high density lipoprotein - cholesterol), giảm

triglyceride và các axit béo có hại [26]. Nghiên cứu khác trên chuột bị bệnh

tim mạch cũng cho thấy, chuột được điều trị bằng dịch chiết tảo lục giàu

astaxanthin có tác dụng giảm hàm lượng triglyceride huyết thanh [27].

Nghiên cứu tương tự trên chuột béo phì của Jia và cộng sự (2016) chỉ ra rằng

bổ sung astaxanthin có tác dụng giảm nồng độ cholesterol máu và triglyceride

trong cả gan và máu [28]. Hơn nữa, một đặc điểm đặc biệt quan trọng là

astaxanthin không có hoạt tính của một tiền vitamin A với người và động vật

có vú; vì vậy, sự tích lũy quá nhiều astaxanthin không gây ra nguy cơ ngộ độc

[29]. Kết quả thực nghiệm trên cả chuột đực và cái đã cho thấy không có một

13

tác dụng nguy hại nào khi sử dụng liều astaxanthin 12 mg/kg trọng lượng cơ

thể/ngày trong vòng 14 ngày. Đối với người, liều dùng an toàn có thể đạt đến

14,4 mg astaxanthin/kg/ngày trong vòng 2 tuần.

1.1.6. Ứng dụng của astaxanthin

Hiện nay, sản xuất astaxanthin từ các nguồn tự nhiên đã trở thành một

trong những hoạt động thành công nhất trong lĩnh vực công nghệ sinh học.

Nhu cầu sử dụng astaxanthin trong các lĩnh vực thực phẩm, thức ăn chăn

nuôi, dinh dưỡng và dược phẩm là rất lớn. Điều này đã thúc đẩy những nỗ lực

lớn để cải thiện sản xuất astaxanthin từ các nguồn sinh học thay vì tổng hợp.

1.1.6.1 Astaxanthin trong nuôi trồng thủy sản

Astaxanthin giúp tạo màu cho vỏ, các cơ quan bên trong của các loài

giáp xác. Màu sắc của lòng đỏ trứng, thịt cá hoặc tôm phụ thuộc vào sự bổ

sung astaxanthin trong khẩu phần ăn, giúp tạo ra sản phẩm cuối cùng có màu

sắc hấp dẫn. Đối với các loài tôm như tôm thẻ, tôm sú thì màu sắc cơ thể sẽ

quyết định giá trị của chúng nhưng động vật giáp xác lại không thể tự tổng

hợp được astaxanthin; do đó, trong quá trình nuôi cần phải bổ sung một lượng

astaxanthin hợp lý vào thức ăn nhằm tạo màu sắc ưa thích cho người tiêu

dùng.

Ứng dụng quan trọng nhất của việc sử dụng astaxanthin trong công

thức thức ăn cho động vật thủy sản là tăng sắc tố cho thịt cá, màu của cá và

giáp xác, tăng sản lượng và chất lượng chăn nuôi [32]. Ngoài ra, astaxanthin

hoạt động như một hormone sinh sản, qua đó kích thích hoạt động của tinh

trùng, giúp tăng khả năng thụ tinh, kích thích sự phát triển của cơ quan sinh

dục và thành thục của động vật thủy sản. Nhiều nghiên cứu chỉ ra rằng

astaxanthin được sử dụng như một thực phẩm bổ sung trong công thức thức

ăn của động vật thủy sản và đóng vai trò quan trọng trong chuyển hóa tế bào

tăng cường quá trình trao đổi chất qua đó giúp vật nuôi hấp thu chất dinh

dưỡng tốt hơn, thúc đẩy tăng sản lượng, kích thích tăng trưởng đồng thời tăng

cường hệ miễn dịch, tăng khả năng chống chịu stress và kháng bệnh qua đó

tăng tỷ lệ sống, tăng năng suất trong nuôi trồng thủy sản [33, 34, 35, 36]. Lợi

ích của việc bổ sung nguồn astaxanthin vào thức ăn đối với màu sắc, sự tăng

trưởng, tỷ lệ sống, hệ miễn dịch và sinh sản của một số loài thủy sản được thể

hiện ở bảng 1.2.

14

Bảng 1.2. Ảnh hưởng của thức ăn bổ sung astaxanthin lên các đối tượng thủy sản

(Nguồn: Hồ Sơn Lâm, 2017 [37])

Đối tượng Hàm lượng

astaxanthin (mg/kg) Hiệu quả

Tôm thương phẩm 100 Tăng tỷ lệ sống

Cá vàng 36-37 Cải thiện màu sắc da, tăng

tỷ lệ sống

Tôm sú 50 Cải thiện màu sắc vỏ

Cá hồi Đại Tây Dương Trên 80 Tăng tỷ lệ tăng trưởng, tỷ

lệ sống

Cá hồi Đại Tây Dương

chưa trưởng thành 190

Tăng khả năng tích trữ

vitamin A

Tôm sú 80 Tăng tỷ lệ tăng trưởng, tỷ

lệ sống

Cá hồi Đại Tây Dương 100 Cải thiện màu sắc cơ thịt

Tôm thẻ chân trắng 125-150 Tăng khả năng

chống oxy hóa

Cá khoang cổ đỏ 200 Cải thiện màu sắc da

Tôm thẻ chân trắng 200 Tăng tỷ lệ tăng trưởng, tỷ

lệ sống

Cá dĩa 300 Cải thiện màu sắc da

Cá hồi vân 8 Tăng khả năng sinh sản, tỷ

lệ sinh nở

Cá Astronotus ocellatus 200 Tăng khả năng miễn dịch

Tôm Macrobrachium

nipponense 150 Tăng sức đề kháng

Cá đù vàng 35-75 Cải thiện màu sắc da

15

1.1.6.2 Astaxanthin đối với con người

Astaxanthin có vai trò sinh học đặc biệt quan trọng đối với sức khỏe

con người.

- Khả năng chống oxy hóa

Astaxanthin là một nguồn tuyệt vời hơn bất kỳ chất chống oxy hóa nào

để chống lại các gốc tự do. Nó được liên kết với một số hợp chất khác để cải

thiện lưu lượng máu và giảm stress oxy hóa ở những người hút thuốc và thừa

cân.

Theo các nghiên cứu trước đây, astaxanthin được chứng minh có khả

năng bảo vệ các mô cơ thể khỏi quá trình oxy hóa và tổn thương do tia cực

tím thông qua sự ức chế kích hoạt NF-KB [38,39]. Astaxanthin cũng ngăn

ngừa ung thư hình thành bằng cách bảo vệ DNA cơ thể khỏi tổn thương oxy hóa

cực tím.

- Ngăn ngừa và hỗ trợ điều trị ung thư

Do đặc tính chống oxy hóa mạnh mẽ, đã có rất nhiều nghiên cứu về

astaxanthin trong điều trị các bệnh ung thư khác nhau. Astaxanthin ngăn chặn

khối u lây lan bằng cách giảm sản xuất khối u và ngăn chặn sự nhân lên của tế

bào nhanh chóng bằng cách ngăn chặn ung thư chu kỳ sinh sản tế bào và tăng

cường apoptosis [38,40,41]. Tuy nhiên, vì astaxanthin tinh khiết có chi phí

cao nên còn hạn chế sử dụng trong các nghiên cứu và điều trị ung thư.

- Astaxanthin cải thiện sức khỏe làn da

Astaxanthin có thể bảo vệ da khỏi tác hại của tia cực tím bằng cách vô

hiệu hóa hoặc phá hủy các gốc tự do được hình thành do tia cực tím và ngăn

chặn những tác hại như cháy nắng hoặc viêm da. Chúng còn có chức năng

bảo vệ chống tác hại của tia tử ngoại [42]. Chính vì vậy, astaxanthin hoạt

động như một loại kem chống nắng bên trong vì nó làm giảm viêm, và giảm

tổn thương tia cực tím cho các tế bào da.

Một nghiên cứu của Kumi Tominaga và cộng sự (2012) được thực hiện

ở 38 phụ nữ khỏe mạnh đã uống bổ sung 6mg astaxanthin/ngày và 2ml

astaxanthin/ngày dùng tại chỗ. Kết quả cho thấy, astaxanthin có nguồn gốc từ

H. pluvialis đã cải thiện tình trạng da ở tất cả các lớp biểu bì, lớp trung bì và

lớp hạ bì [43].

16

- Hỗ trợ hoạt động thể chất

Có rất nhiều nghiên cứu về hoạt động của astaxanthin liên quan đến sức

chịu đựng, mức độ mệt mỏi sau khi tập thể dục. Astaxanthin được biết đến

với tác dụng thúc đẩy sức bền cơ bắp và bảo vệ chống lại tổn thương cơ [44].

Trong một nghiên cứu ở chuột, astaxanthin giúp làm giảm tổn thương cơ

xương. Các tính chất tương tự mà astaxanthin mang lại giúp cho cá hồi có khả

năng bơi ngược dòng. Do đó, astaxanthin được đánh giá có tiềm năng hỗ trợ

các vận động viên tăng cường hiệu suất, tăng cường sức chịu đựng [44,45].

- Tác dụng của Astaxanthin đối với sức khỏe mắt

Nhờ đặc tính chống oxy hóa và có khả năng vượt qua hàng rào máu

võng mạc, astaxanthin có tác dụng trong việc bảo vệ võng mạc khỏi bị oxy

hóa, bảo vệ các tế bào tiếp nhận ánh sáng khỏi thoái hóa và chống lại sự thoái

hóa điểm vàng do tuổi tác - nguyên nhân gây mù loà [46].

- Astaxanthin bảo vệ sức khỏe tim mạch

Bằng cách giảm stress oxy hóa trong máu, astaxanthin giúp bảo vệ nội

mạc, từ đó ngăn ngừa tổn thương tim ở người và động vật khi được điều trị

trước bằng astaxanthin [47].

- Tác dụng bảo vệ thần kinh, giảm nguy cơ tăng huyết áp, đột quỵ

Astaxanthin giúp bảo vệ nơron thần kinh và có thể làm chậm lại tác

động của tuổi tác (giảm các triệu chứng như giảm trí nhớ, suy giảm chức năng

thần kinh). Khi sử dụng astaxanthin thường xuyên sẽ giảm đáng kể sự tích tụ

hydroperoxide phospholipit, một hợp chất có nhiều ở những người bị bệnh

mất trí nhớ, hay quên ở người lớn tuổi, do đó nó có thể chống lại bệnh

Alzheimer. Ngoài ra, astaxanthin giúp cải thiện tuần hoàn máu và giảm huyết

áp. Nó rất có lợi cho màng tim, có tác động tốt lên máu, tăng lượng HDL và

giảm triglycerides [17].

Hiện nay, có rất nhiều sản phẩm astaxanthin đang được thương mại hóa

trên thị trường như ở dạng viên nang, gel mềm, viên nén, bột, sinh khối, kem,

nước tăng lực, dầu và dạng chiết xuất như Astaxanthin & Biberry extract -

Wellness Oriflame, Thụy Điển; Astaxanthin 10 mg – Fettle Biotanical, Anh;

BioAstin Hawaiian Astaxanthin, Mỹ; MacuGuard Ocular Support with

Astaxanthin - Life Extension, Mỹ; Astaxanthin DHC, Nhật Bản. Bên cạnh đó,

17

cũng có rất nhiều sản phẩm kết hợp astaxanthin với các hợp chất flavonoid để

tăng cường hoạt tính chống oxi hóa, bảo vệ gan, chống béo phì, đái đường và

các bệnh liên quan đến tim mạch như Organic Spirulina & Astaxanthin -

Swanson, Ấn Độ; Resveratrol with 4 mg Astaxanthin - Vita-Age, Canada;

Life Extension Supplement – Levean, Mỹ; Daily Antioxidant Enzyme -

Allegany Nutrition, Mỹ với sự kết hợp của astaxanthin và các flavonoid như

kaempferol và quercetin trong dịch chiết thực vật. Hầu hết các sản phẩm

astaxanthin đang được thương mại hóa trên thị trường có nguồn gốc từ vi sinh

vật hoặc động vật với các lợi ích như là ngăn ngừa nhiễm trùng do vi khuẩn,

viêm, suy mạch, ung thư, các bệnh tim mạch, ức chế quá trình peroxy hóa

lipit, giảm tổn thương tế bào và mỡ cơ thể, cải thiện chức năng não và độ dày

của da.

1.2 CÔNG NGHỆ NANO VÀ NANO ASTAXANTHIN

Ra đời chỉ khoảng vài chục năm trở lại đây, công nghệ nano đã và đang

tác động rất lớn tới tất cả các lĩnh vực khoa học, sản xuất và đời sống. Việc

nghiên cứu phát triển và ứng dụng công nghệ nano sẽ tạo ra cơ hội cho các

ngành khoa học - kỹ thuật có bước nhảy vượt bậc trong tiến trình phát triển,

có thể sản xuất ra các giá trị cao hơn và ngang tầm với trình độ khoa học công

nghệ tiên tiến, hiện đại. Các vật thể có kích thước nano có một loạt các hiện

tượng và đặc tính hấp dẫn về vật lý, hóa học, sinh học, cơ học và điện được

ứng dụng hữu ích cho đời sống con người, đặc biệt là trong lĩnh vực Y sinh.

1.2.1 Cấu trúc của hệ nano y sinh

Vật liệu nano là thuật ngữ dùng để chỉ các vật liệu trong đó chứa các

thành phần có kích thước nanomet (từ 1-100 nm). Trong lĩnh vực y sinh, vật

liệu nano có thể được định nghĩa với kích thước lớn hơn (đến vài trăm

nanomet), do sự tương đồng về kích thước với các cấu trúc nano tự nhiên như

vi rút [48,49].

Vật liệu cấu trúc nano có nhiều đặc tính nổi trội và khác biệt với vật

liệu dạng khối cũng như dạng phân tử như: Kích thước đặc biệt (<1000 nm),

tỷ lệ bề mặt/thể tích rất lớn, tiềm năng phản ứng cao, tạo ra hiệu ứng cộng

hưởng bề mặt Plasmon… Những tính chất đặc biệt so với vật liệu kích thước

lớn là do kích cỡ nano đạt tới kích thước tới hạn của nhiều tính chất hóa lý

18

khác nhau. Nhờ những tính chất này, vật liệu nano được ứng dụng trong nhiều

lĩnh vực, đặc biệt là trong y sinh [50].

Kết cấu chung:

Nhiều vật liệu hữu cơ và vô cơ đã được sử dụng để tạo ra các hệ vật

liệu nano y sinh đa chức năng có cấu tạo đặc biệt với các chức năng đi kèm.

Cấu trúc của hệ thường là kiểu cấu trúc lõi vỏ [51]. Hình 1.5 mô tả cấu trúc

chung với nhiều chức năng của hệ vật liệu nano đa chức năng.

Hình 1.5. Cấu trúc của hệ vật liệu nano đa chức năng

(Nguồn: Bao G, 2013 [51])

1.2.2. Các loại vật liệu nano

Các loại vật liệu nano được phân loại rộng rãi thành hai loại, hữu cơ và

vô cơ dựa trên thành phần của chúng [52]. Có ba loại hạt nano hữu cơ gồm

hạt nano dựa trên carbohydrate, protein và lipit (tinh thể chất béo, mixen, giọt

dầu và túi) được sử dụng nhiều trong các sản phẩm thực phẩm thương mại

[53]. Các hạt nano vô cơ chủ yếu bao gồm kim loại và các oxit kim loại như

bạc, titan dioxit, kẽm dioxit, silic dioxit và sắt oxit [54]. Các hạt nano hữu cơ

được cho là ít độc hơn các hạt vô cơ do chúng dễ tiêu hóa trong đường tiêu

hóa [55]. Cấu trúc vật liệu nano được phân loại thành không chiều (hạt nano,

đám nano, chấm lượng tử và fullerene), một chiều (thanh nano và ống nano),

hai chiều (màng mỏng) và ba chiều (dendrimers và nanocomposite) dựa trên

các yếu tố cấu trúc [56]. Các loại vật liệu nano khác nhau được sử dụng trong

19

bảo quản thực phẩm là liposome, micelle, dendrimers, nanosphere,

nanocapsule, nanofilm và nanoconjugate [57].

1.2.3 Các chức năng y sinh của hệ

1.2.3.1 Chức năng chuẩn đoán (phân tích đặc hiệu, ảnh MRI, ảnh quang)

Nhiều nghiên cứu đã được công bố về việc chế tạo các loại chất tương

phản dựa trên hạt nano để chụp ảnh y sinh học. Chẳng hạn, chấm lượng tử

được sử dụng để chụp ảnh huỳnh quang. Các hạt nano vàng với hóa học bề

mặt phong phú và khả năng hấp thu tốt được sử dụng trong chụp cắt lớp vi

tính tia X (Computer tomography – CT). Các hạt nano oxit sắt với kích thước,

thành phần chính xác và các hợp chất nano mới của gadolinium đang được

nghiên cứu làm tác nhân tương phản cho chụp ảnh cộng hưởng từ hạt nhân

(Magnetic Resonance Imaging - MRI) [49].

Đối với chức năng chụp ảnh huỳnh quang, để quan sát được độ thâm

nhập vào bên trong tế bào, các phân tử phát huỳnh quang có thể được đính kết

vào hệ dẫn thuốc. Việc nối kết các phân tử có khả năng phát huỳnh quang

(fluorophore) như fluorescein (phát màu xanh lục) hay rhodamine (phát màu

đỏ) vào các tế bào để định vị và quan sát sự phân bố trong những thí nghiệm

sinh học đã được thực hiện từ nhiều năm nay [58]. Tuy nhiên, các phân tử

huỳnh quang này có cường độ phát quang yếu và bị lu mờ sau vài phút hoạt

động. Hơn nữa, việc sử dụng một số chất màu như rhodamine thường có độc

tính cao [59]. Do vậy, sử dụng hạt nano với một số chất phát quang thích hợp

khác (như curcumin, doxorubicin) sẽ giải quyết được những vấn đề tồn tại

nêu trên. Kết hợp chấm lượng tử trên hạt nano từ cũng cho phép thực hiện

chức năng quang học tương tự. Trong cùng một điều kiện kích hoạt, hạt nano

có thể tỏa sáng gấp 20 lần phân tử huỳnh quang và giữ độ sáng liên tục không

bị lu mờ theo thời gian. Việc phát quang tạo ảnh giúp người quan sát nhìn

thấy tế bào ở vùng sâu bên trong cơ thể và ước lượng được mật độ kết tập và

phân bố của hệ mang thuốc tại một "địa chỉ" nào đó [60].

1.2.3.2 Chức năng điều trị

Chức năng điều trị của vật liệu nano được thực hiện với nhiều đặc

trưng [49]:

- Cải thiện khả năng điều trị của thuốc bằng cách tăng hiệu quả và/hoặc

giảm độc tính đối với tế bào thường.

20

- Đưa dược chất đến mục tiêu là các mô, tế bào hoặc cơ quan cụ thể.

- Tăng cường các tính chất của dược chất (ví dụ: sự ổn định, độ tan,

thời gian lưu thông trong máu và khả năng tích tụ tại khối u).

- Kích hoạt sự phóng thích thuốc kéo dài hoặc phóng thích thuốc dưới

tác động của môi trường sinh lý khối u.

- Tạo thuận lợi cho việc mang các dạng thuốc sinh học phân tử (ví dụ

DNA, RNA (siRNA) nhỏ, mRNA và protein) đến các điểm hoạt động nội

bào.

- Đồng phối hợp nhiều thuốc để cải thiện hiệu quả điều trị và chống

kháng thuốc.

- Vận chuyển thuốc qua các hàng rào sinh học (ví dụ, đường tiêu hóa và

hàng rào máu - não).

- Hiển thị các điểm phân phối thuốc bằng cách kết hợp các tác nhân trị

liệu với chẩn đoán hình ảnh và/hoặc các phản hồi thời gian thực về tính hiệu

quả của dược chất.

- Cung cấp các phương pháp tiếp cận mới cho việc phát triển vắc xin

tổng hợp.

- Kết hợp tính chất điều trị vốn có của một số vật liệu nano (ví dụ: nano

vàng hoặc nano sắt oxit khi được kích thích phù hợp).

1.2.4. Các phương pháp chế tạo vật liệu nano

Để tổng hợp hạt nano nói chung và hạt nano trong y dược nói riêng

gồm có hai phương pháp: bottom-up (từ dưới lên) và top-down (từ trên

xuống) [61,62].

1.2.4.1 Phương pháp từ dưới lên

Phương pháp bottom-up là phương pháp hình thành hạt nano từ các

phần tử kích thước nhỏ (ion, nguyên tử, phân tử hoặc tiểu phân nhỏ), liên kết

chúng thành các tiểu phân kích thước lớn hơn trong môi trường phân tán nhờ

các liên kết hóa lý. Để thu được hạt ở kích thước nano với hình dạng cấu trúc

mong muốn, chúng ta có thể điều chỉnh các điều kiện lý hoá và xúc tác trong

quá trình phát triển cấu trúc và tránh tạo ra các phân tử có kích thước lớn cỡ

µm. Phương phương bottom – up bao gồm các phương pháp sau:

21

- Phương pháp hóa ướt (wet chemical methods)

Phương pháp hóa ướt gồm có phương pháp thủy nhiệt, sol-gel, và đồng

kết tủa [63]. Theo phương pháp này, các dung dịch chứa ion khác nhau được

trộn với nhau theo một tỷ phần thích hợp, dưới tác động của nhiệt độ, áp suất,

điều kiện pH… mà các vật liệu nano được kết tủa từ dung dịch. Sau các quá

trình lọc, sấy khô, ta thu được các vật liệu có kích thước nano.

Ưu điểm của phương pháp hóa ướt là các vật liệu có thể chế tạo được

rất đa dạng, chúng có thể là vật liệu vô cơ, hữu cơ, kim loại. Đặc điểm của

phương pháp này là rẻ tiền và có thể chế tạo được một khối lượng lớn vật liệu

nhưng nó cũng có nhược điểm là các hợp chất có liên kết với phân tử nước có

thể là một khó khăn, phương pháp sol-gel không có hiệu suất cao, sản phẩm

không đồng nhất.

- Phương pháp bốc bay nhiệt (thermal evaporation method)

Gồm các phương pháp quang khắc (lithography), bốc bay trong chân

không (vacuum deposition) vật lí, hóa học. Các phương pháp này áp dụng

hiệu quả trong chế tạo màng mỏng hoặc lớp bao phủ bề mặt, người ta cũng có

thể dùng nó để chế tạo hạt nano bằng cách cạo vật liệu nano từ tấm chắn [64].

Tuy nhiên, phương pháp này không hiệu quả để có thể chế tạo vật liệu ở quy

mô thương mại.

- Phương pháp hình thành từ pha khí (gas-phase method)

Gồm các phương pháp nhiệt phân (flame pyrolysis), nổ điện (electro-

explosion), đốt laser (laser ablation method), bốc bay nhiệt độ cao, plasma

[64]. Nguyên tắc của các phương pháp này là hình thành vật liệu nano từ pha

khí. Nhiệt phân là phương pháp có từ rất lâu, được dùng để tạo các vật liệu

đơn giản như carbon, silicon. Phương pháp đốt laser có thể tạo được nhiều

loại vật liệu nhưng lại chỉ giới hạn trong phòng thí nghiệm vì hiệu suất của

chúng thấp. Phương pháp plasma một chiều và xoay chiều có thể dùng để tạo

rất nhiều vật liệu khác nhau nhưng lại không thích hợp để tạo vật liệu hữu cơ

vì nhiệt độ của nó có thể đến 90000C.

1.2.4.2 Phương pháp từ trên xuống

Công nghệ top-down thường bắt đầu từ các tinh thể hoặc phần tử có

kích thước cỡ µm trở lên và làm giảm kích thước đến cỡ nano. Bao gồm các

22

phương pháp tán, nghiền, hợp kim cơ học [61]. Theo phương pháp này, vật

liệu ở dạng bột được nghiền đến kích thước nhỏ hơn. Ngày nay, các máy

nghiền thường dùng là máy nghiền kiểu hành tinh hay máy nghiền quay.

Phương pháp cơ học có ưu điểm là đơn giản, dụng cụ chế tạo không đắt tiền

và có thể chế tạo với một lượng lớn vật liệu. Tuy nhiên, nó lại có nhược điểm

là các hạt bị kết tụ với nhau, phân bố kích thước hạt không đồng nhất, dễ bị

nhiễm bẩn từ các dụng cụ chế tạo và thường khó có thể đạt được hạt có kích

thước nhỏ. Phương pháp này thường được dùng để tạo vật liệu không phải là

hữu cơ như kim loại.

1.2.4.3 Phương pháp kết hợp

Trong thực tế, điều chế hệ tiểu phân nano thường kết hợp giữa hai

phương pháp trên. Phương pháp từ dưới lên tạo hệ tiểu phân thô, sau đó phân

tán giảm kích thước để thu được hệ tiểu phân nano [61]. Chẳng hạn, điều chế

hệ tiểu phân liposome bằng kỹ thuật tạo lớp màng phim lipit kép rồi hydrat

hóa tạo hệ liposome MLV hoặc LUV kích thước ở hàng micromet. Để giảm

kích thước xuống hàng nanomet, sử dụng các kỹ thuật phân tán như siêu âm,

đùn ép, đồng nhất hóa.

Trong các phương pháp nano để bào chế thuốc và thực phẩm chức

năng, phương pháp đơn giản nhất là tạo hỗn hợp dầu, dung môi và chất hoạt

động bề mặt. Các phương pháp tương tự cũng có thể tạo hệ nano như nano

nhũ tương, huyền phù, dung môi và nhũ tương cô quay. Đồng hoá nóng hoặc

đồng hoá áp suất cao, vi nang, siêu âm, sấy phun, .… tạo các hệ nano bằng

các kỹ thuật thường được sử dụng để sản xuất quy mô lớn. Ngoài ra, một số

kỹ thuật phức tạp hơn có thể được ứng dụng để tạo hệ nano như lắng đọng,

nghiền quay, quay điện, tạo sợi nano, v.v… [65].

1.2.5. Tình hình nghiên cứu về nano astaxanthin

Để tăng tối đa khả năng hấp thụ cũng như là bảo vệ hoạt tính đầy tiềm

năng của astaxanthin, rất nhiều phương pháp đã được áp dụng như công nghệ

nano, biến đổi cấu trúc, tạo phức chất vùi... Trong đó, công nghệ nano mang

lại hiệu quả vượt trội hơn cả trong việc nâng cao độ phân tán, cải thiện sự hấp

thu vào trong tế bào, giảm chuyển hóa tại gan, giữ ổn định nồng độ trong

máu, giúp tăng cường dược tính của hoạt chất [66]. Tiểu phân nano được thiết

kế phù hợp với đường đi của thuốc bên trong cơ thể, có khả năng giúp vận

23

chuyển thuốc đến đúng vị trí cần giải phóng hoạt chất hoặc đích sinh học (mô

bệnh, tế bào bệnh hoặc bào quan bên trong tế bào bệnh). Trên đường vận

chuyển đến đích, các hoạt chất kém bền như astaxanthin được bao bọc bên

trong tiểu phân nano sẽ tránh được các tác nhân phân hủy như: nhiệt độ, độ

ẩm, oxy, không khí và ánh sáng, pH, dịch sinh lý, enzyme. Đồng thời, tiểu

phân nano sẽ tránh được sự phân bố thuốc đến các mô lành và tế bào lành.

Năm 2011, Meor Mohd Affandi và nhóm nghiên cứu đã chế tạo thành

công nano nhũ tương bằng phương pháp ly tâm tốc độ cao 9000 vòng/phút ở

áp suất 800 bars. Nhũ tương nano astaxanthin bao gồm các thành phần: 4%

w/w chất hoạt động bề mặt, 2% w/w astaxanthin, 14% w/w dầu và 80% w/w

nước. Sản phẩm nano thu được có kích thước là 150-160 nm, dễ hòa tan trong

nước và có khả năng tăng hoạt tính sinh học mà không thay đổi cấu trúc hóa

học của astaxanthin [67].

Trong thí nghiệm nghiên cứu tác dụng bảo vệ da do tia cực tím của

nano astaxanthin, astaxanthin tan trong dầu và lutein của Harada và cộng sự

năm 2017 đã cho thấy, chuột được uống nano astaxanthin có tác dụng giảm

viêm, giảm số lượng tế bào niêm mạc bị chết cùng với giảm mức độ biểu hiện

của các gen COX-2, p-IκB-α, TNFα và CD45 cao nhất khi so sánh với các

nhóm chuột được uống astaxanthin pha trong dầu và lutein [68]. Nghiên cứu

chứng minh rằng nano astaxanthin có hiệu quả trong việc bảo vệ bề mặt mắt

chống lại các tác động có hại của việc tiếp xúc với tia UVB cấp tính, mà

không có tác dụng phụ bất lợi rõ ràng nào được quan sát thấy. Nano

astaxanthin tạo ra một chất hòa tan trong nước có nguồn gốc tự nhiên đầy hứa

hẹn để bảo vệ chống lại tổn thương bề mặt mắt trong điều kiện căng thẳng

oxy hóa cao khi sử dụng theo đường uống.

Chengzhen Liu và cộng sự (2019) đã nghiên cứu chế tạo astaxanthin

bao bọc trong các hạt nano poly (axit lactic-co-glycolic) (PLGA) và chitosan

oligosaccharides (COS). Sự bao bọc tốt của các hạt nano PLGA và COS đã

cho kết quả sản phẩm nano chứa astaxanthin có dạng hình cầu, kích thước hạt

trung bình khoảng 150 nm. Hiệu suất bao bọc (> 85%) và khả năng tải (>

15%) của astaxanthin trong các hạt nano là tương đối cao. Phân tích tia X cho

thấy rằng astaxanthin được bao bọc ở dạng vô định hình. Các hạt nano có khả

năng phân tán tốt và ổn định trong dung dịch nước và có khả năng tương thích

tế bào cao [69].

24

Cũng trong năm 2019, Guan và cộng sự (2019) cũng đã chế tạo thành

công sản phẩm nano chứa astaxanthin bằng phương pháp đông khô. Bột nano

cho khả năng phân tán rất tốt trong nước. Tuy nhiên hàm lượng astaxanthin có

trong sản phẩm tương đối thấp chỉ 2,9%. Kết quả thử nghiệm trên chuột cho

thấy với liều uống là 2,4 mg/kg, sau 28 ngày sử dụng liên tiếp không có độc

tính [70].

Trong nghiên cứu của Sun và cộng sự (2019), nhũ tương nano

astaxanthin không chứa nước (ASX-NANE) được chế tạo bằng phương pháp

đồng nhất áp suất cao. Sản phẩm kết hợp các ưu điểm của chất mang nano và

nhũ tương không chứa nước. ASX-NANE thu được có dạng hình cầu với sự

phân bố kích thước đồng đều và hiệu suất bám cao (98,4 ± 0,3%). Phân tích

FTIR chỉ ra rằng astaxanthin đã được bao bọc thành công vào lõi lipit của

ASX-NANE. Hệ nano nhũ tương này có tính ổn định trong khoảng thời gian

4 tuần ở 25°C và có thể bảo vệ astaxanthin chống lại sự oxy hóa. Nghiên cứu

tế bào in vitro cho thấy ASX-NANE có độc tính thấp và có thể bảo vệ tế bào

chống lại stress oxy hóa. Nghiên cứu thẩm thấu trong ống nghiệm và các phần

mô học da cho thấy sự thẩm thấu tăng cường của astaxanthin và sự biến đổi

của lớp sừng với sự hấp thụ toàn thân thấp và biểu bì không thay đổi. Do đó,

nhũ tương nano không chứa nước có thể là một chiến lược thích hợp để sản

xuất chế phẩm astaxanthin bôi tại chỗ [71].

Bằng phương pháp nhũ hóa - bay hơi, Hyeryeon Oh và cộng sự (2020)

đã chế tạo astaxanthin lecithin nano-liposol (ASTA @ Lec NS) có kích thước

169-187 nm và chỉ số đa phân tán <0.3. ASTA @ Lec NS ổn định trong một

thời gian đủ dài và dễ dàng đông khô thành bột khi thêm một lượng sucrose

thích hợp. Ngoài ra, khả năng hòa tan trong nước tốt của ASTA @ Lec NS đã

cải thiện đáng kể sinh khả dụng của astaxanthin. Sản phẩm ASTA @ Lec NS

có thể loại bỏ các gốc tự do (ROS) và thúc đẩy quá trình chữa lành vết thương

của các tế bào NIH 3T3 (nguyên bào sợi) hiệu quả hơn mà không gây ra bất

kỳ độc tính tế bào nào. Kết quả nghiên cứu đã khẳng định khả năng chống

oxy hóa tại chỗ và in vitro của ASTA@Lec NS đều cao hơn so với

astaxanthin tinh khiết và lecithin [72].

Ở nước ta, các nghiên cứu về bào chế dạng nano của các hoạt chất có

hoạt tính sinh học đang được quan tâm và phát triển trong những năm gần

đây. Tuy nhiên, việc nghiên cứu chế tạo dạng nano astaxanthin nói riêng cho

25

tới thời điểm hiện tại là rất ít. Liên quan tới hoạt chất này, tại Việt Nam mới

chỉ triển khai nghiên cứu chiết tách astaxanthin từ các nguồn nguyên liệu khác

nhau, trong đó các nghiên cứu đều đưa ra kết luận: Vi tảo Haematococcus

pluvialis là nguồn nguyên liệu cho hàm lượng tích lũy astaxanthin cao nhất và

sản phẩm astaxanthin thu được có khả năng ứng dụng sử dụng được cho con

người. Thị trường trong nước hiện nay hầu hết các sản phẩm chứa nano

astaxanthin đều là nhập ngoại với giá thành cao, riêng chỉ có công ty Nano

Việt Nam Technology cho ra sản phẩm dung dịch nano astaxanthin. Tuy

nhiên, sản phẩm này chưa đáp ứng các tiêu chuẩn cơ sở của dược liệu do đó

khả năng ứng dụng mới chỉ áp dụng trong nuôi trồng thủy sản. Cụ thể là tăng

sức đề kháng cho tôm mẹ.

26

CHƯƠNG 2. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU

2.1.1. Đối tượng nghiên cứu

- Astaxanthin (90%) được tách chiết từ vi tảo lục Haematococcus

pluvialis do phòng Công nghệ tảo, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm

Khoa học và Công nghệ Việt Nam cung cấp.

2.1.2. Các dòng tế bào

- Tế bào ung thư đại tràng HT29 có nguồn gốc từ Bộ môn Sinh học tế

bào, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội.

- Dòng tế bào gan ung thư HepG2 nguồn gốc từ phòng Thử nghiệm

sinh học, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ

Việt Nam.

2.1.3 Hóa chất

- Các hóa chất sử dụng chế tạo nano astaxanthin: Dung môi

Dichloromethane; Tween 80 (Polysorbate 80; Sigma-Aldrich), cremophor

RH40 (Sigma-Aldrich), copolyme polylactid-polyetylen glycol (PLA-PEG)

đã được tổng hợp từ nghiên cứu trước đây [73] có khối lượng phân tử Mw là

8400, với chỉ số PDI là 1,2.

- Các hóa chất dùng để nuôi cấy tế bào: môi trường nuôi cấy

Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), DMEM/high glucose, Fetal

bovine serum (FBS), bovine serum albumin, penicillin, và streptomycin

(Invitrogen, Mỹ), Fenofibrate (C20H21ClO4, Sigma F6020), Oil Red O

(C26H24N4O, Sigma O0625), acid oleic (OA), isopropanol (Trung Quốc);

- Hóa chất dùng để xác định hoạt tính chống oxy hóa: DPPH (1,1-

diphenyl-2-picrylhydrazyl), ethanol, methanol (Trung Quốc);

- Hóa chất dùng để tách chiết lipit: Phosphate buffered saline (PBS), n-

hexane, isopropanol (Trung Quốc);

- Hóa chất dùng cho nhuộm lipit: Oil Red O (ORO - 1-([4-

(Xylylazo)xyly]azo)phenylazo]-2-naphthol) (Sigma), formanlin (Trung

Quốc).

27

2.1.4. Thiết bị

Thiết bị dùng cho nghiên cứu gồm:

- Kính hiển vi quang học Olympus CH02 và CX21 (Nhật Bản);

- Kính hiển vi điện tử truyền qua JEM 1400 (Nhật Bản);

- Máy Litesizer™ 500 (Mỹ);

- Máy ảnh kỹ thuật số Canon IXY Digital 70 (Japan);

- Cân kỹ thuật Precisa XB 1200C (max 1200 g; e= 0,1 g; min 0,5 g; d=

0,01 g) (Switzerland);

- Cân phân tích Shimadzu AY 120 (max 120 g; d= 0,1 mg) (Nhật Bản);

- Máy ly tâm Sorvall® LEGEND RT (Đức);

- Máy đo quang phổ UV1601 UV-Visble Spectrophotometer

SHIMADZU (Nhật Bản);

- Máy khuấy từ Kika Labortechnik (Đức),

- Tủ sấy Cornthem (New Zealand);

- Máy ly tâm Sorvall Legen RT 1900W (Kendro, Germany);

- Buồng đếm Burker-Turk (Đức);

- Nồi khử trùng (ALP, Nhật Bản);

- Tủ lạnh thường;

- Máy sắc kí khí HP-6890, ghép nối với Mass Selective Detector

Agilent 5973;

- Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC (Agilent 1260 – Mỹ) với bơm

tứ cực G1311C, bộ bơm mẫu tự động G2260A, bộ điều nhiệt cột G1316A,

đầu dò DAD G1315D. Cột XDB-C18 (150 mm × 4.6 mm, 5 µm)

- Cột HP-5MS;

- Khí mang He;

- Pipetteman các loại (Gilson, France);

- Pipette Pasteur (USA);

- Pipette tự động và các dụng cụ thông thường của phòng thí nghiệm.

28

2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2.1. Nghiên cứu chế tạo nano astaxanthin

Astaxanthin cùng chất hoạt động bề mặt là Tween 80 hoặc Cremophor

RH40 (Bảng 2.1) được hòa tan hoàn toàn trong dung môi Dichloromethane bằng

máy khuấy từ trong 30 phút. Dung dịch sau đó được nhỏ từ từ từng giọt vào

nước cất có chứa PLA-PEG; dưới điều kiện khuấy ở tốc độ 9000 vòng/phút

trong thời gian 30 phút. Tiếp theo, hỗn hợp đồng nhất đưa vào hệ thống cất quay

chân không để loại dung môi hữu cơ. Dung dịch nano trong nước sau đó được

làm lạnh ở -54 oC. Sau thời gian 24 giờ, dung dịch nano đóng băng được chuyển

vào hệ thống thiết bị đông khô. Cuối cùng, thu được bột nano astaxanthin mịn,

tơi và có màu đỏ tươi.

Bảng 2.1. Thành phần các mẫu nano astaxanthin

Mẫu Astaxanthin

(mg)

Tween 80

(mg)

Cremophor

RH40

(mg)

Copolyme

PLA-PEG

(mg)

Hàm lượng

astaxanthin

(%)

A1 50 - 50 900 5

A2 50 - 100 850 5

A3 50 - 150 800 5

A4 50 100 - 850 5

Ghi chú (-): không có

Sơ đồ quy trình chế tạo của bột nano astaxanthin được mô tả trong

Hình 2.1.

29

Astaxanthin+ ChấtHĐBM+ Dung

môi hữu cơ

Chất bao bọc vi nang+ Nước cất

Dung dịch hỗn hợpđồng nhất

Dung dịch nano trongnước

Bột nanoastaxanthin

Khuấy với tốc độ 9000 vòng/phút trong 30 phút

Cất quay chân khôngloại dung môi

Đông khô

Siêu âm 10 phút

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

--

-

-

-

-

-

-

-

- -

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

- -

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

--

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

- -

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

--

-

-

-

-

-

-

Hình 2.1. Sơ đồ chế tạo nano astaxanthin

2.2.2. Phương pháp xác định tính chất của nano astaxanthin

2.2.2.1 Đánh giá hình thái và kích thước các mẫu vật liệu nano bằng

kính hiển vi điện tử truyền qua (Transmission electron microscopy - TEM)

Mẫu đo TEM được chuẩn bị bằng cách nhỏ dung dịch nano (hạt nano

phân tán trong toluene) với nồng độ rất thấp lên một lưới đồng phủ carbon và

sau đó để dung môi bay hơi tự nhiên. Hình thái của các hạt nano astaxanthin

được xác định bằng kính hiển vi điện tử truyền qua JEM 1400 tại phòng thí

nghiệm trọng điểm Quốc gia vật liệu polyme và compozit –Trường Đại học

Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh.

30

2.2.2.2 Nghiên cứu sự phân bố kích thước hạt của nano astaxanthin

bằng phương pháp tán xạ ánh sáng động (Dynamic Light Scattering – DLS)

Mẫu nano astaxanthin được phân tán trong nước ở nồng độ thích hợp.

Sự phân bố kích thước hạt của các mẫu nano được xách định bằng thiết bị tán

xạ ánh sáng động DLS Litesizer™ 500 tại Viện Hoá học, Viện Hàn lâm Khoa

học và Công nghệ Việt Nam.

2.2.3. Phương pháp đánh giá một số hoạt tính sinh học của nano

astaxanthin ở mức độ in vitro.

2.2.3.1. Phương pháp xác định hoạt tính chống oxi hóa bằng DPPH

Hoạt tính chống oxi hóa của astaxanthin và nano astaxanthin được tiến

hành theo phương pháp của Abramovič và cộng sự [76] có cải tiến cho phù

hợp với điều kiện phòng thí nghiệm. Cụ thể: dung dịch gốc astaxanthin được

hòa tan trong dung môi methanol và nano astaxanthin được hòa tan trong

nước cất khử ion, sau đó các dung dịch gốc này được pha thành các dải nồng

độ thử nghiệm với nước cất khử ion. DPPH được pha trong methanol (100%)

đến nồng độ 0,25 µM. Hút mẫu nghiên cứu đã pha ở các nồng độ vào đĩa 96.

Thêm dung dịch DPPH đã chuẩn bị ở trên vào các giếng đã có sẵn mẫu

nghiên cứu (tỉ lệ 1:1). Đối chứng là mẫu thử chỉ có 100 µl nước cất khử ion

và 100 µl DPPH. Ủ ở nhiệt độ phòng trong 30 phút. Xác định độ hấp thụ của

dung dịch sau phản ứng tại bước sóng 517 nm.

Phần trăm ức chế các gốc tự do của mẫu thử được tính theo công thức:

% Ức chế = [(ODđối chứng – ODmẫu thử) /ODđối chứng] *100

Trong đó: ODđối chứng: Độ hấp thụ tại giếng không chứa chất thử

ODmẫu thử: Độ hấp thụ tại giếng chứa chất thử

2.2.3.2. Phương pháp nuôi cấy tế bào

Tế bào HepG2 được nuôi cấy trên môi trường DMEM/high glucose có

chứa 10% FBS, 100 U/mL penicillin, và 0,1 mg/mL streptomycin trong tủ

nuôi cấy vô trùng ở 37°C, 5% CO2. Tế bào HT29 được nuôi cấy trên môi

trường DMEM/low glucose có chứa 10% FBS, 100 U/mL penicillin, và 0,1

mg/mL streptomycin trong tủ nuôi cấy vô trùng ở 37°C, 5% CO2.

31

2.2.3.3. Phương pháp đánh giá độc tính của nano astaxanthin trên dòng tế bào HT29 và HepG2

Độc tính của nano astaxanthin ở các nồng độ khác nhau (0, 10, 20, 50,

100 và 500 µg/mL) trên các dòng tế bào HT29 và HepG2 được phân tích theo

phương pháp Trypan Blue [79]. Thu nhận dịch huyền phù tế bào trong 1ml

môi trường. Nhuộm 10μL dịch tế bào với 10μL Trypan Blue 0,2% (Sigma-

Aldrich, Singapo), theo tỷ lệ 1:1. Đưa 10μL dung dịch vào buồng đếm hồng

cầu. Đếm số tế bào sống và chết trung bình ở 4 góc, mỗi góc gồm 16 ô vuông

nhỏ. Sử dụng công thức tính số tế bào:

Số tế bào/ml = Trung bình số tế bào đếm được ở 4 góc x 10.000 x N

Trong đó N = 2 là tỷ lệ pha loãng 2 lần với Trypan Blue.

Tỷ lệ tế bào sống có trong mẫu được xác định như sau:

Tỷ lệ tế bào sống (%) = (Số tế bào sống/Tổng số tế bào) x 100%.

2.2.3.4. Phương pháp xác định sự hấp thu của tế bào đối với nano

astaxanthin

Tế bào HT29 được nuôi trong đĩa 6 giếng bằng môi trường DMEM với

mật độ 1×106 tế bào mỗi giếng. Sau 24 h nuôi cấy, tế bào HT29 không được ủ

hoặc được ủ với astaxanthin tự do (5 µg/mL), nano-astaxanthin (100 µg/mL

với hàm lượng astaxanthin chiếm 5µg/mL) hoặc mẫu trắng (là mẫu nano

không có chứa astaxanthin; 100 µg/mL) trong thời gian 24h. Sau thời gian đó,

rửa lớp tế bào ba lần với nước muối đệm phosphat (PBS, pH 7,4) lạnh. Các tế

bào được thu bằng cách ly tâm ở tốc độ 2000 vòng/phút trong 3 phút và giữ ở

-20 ºC cho đến khi sử dụng.

Để tách chiết astaxanthin từ tế bào, 5 mL dimethyl sulfoxide (DMSO)

được trộn với 20 mg tế bào và nghiền với cát thủy tinh để phá vỡ tế bào [78].

Hỗn hợp được đun nóng ở 50 °C trong 20 phút trong nồi cách thủy và sau đó

ly tâm ở 4000 vòng/phút trong 5 phút. Hút các dịch phía trên và chuyển sang

ống eppendorf mới. Bước này được lặp đi lại cho đến khi màu của tế bào trở

nên nhạt. Tất cả dịch phía trên được trộn vào với nhau và cô đặc đến 100 µL

và astaxanthin được phân tích trên hệ sắc ký lỏng cao áp sử dụng của hãng

Agilent HPLC 1260 series với bơm tứ cực G1311C, bộ bơm mẫu tự động

G2260A, bộ điều nhiệt cột G1316A, đầu dò DAD G1315D. Cột XDB-C18

(150 mm × 4.6 mm, 5 µm; Agilent Co.) với đầu bảo vệ cột guard column (3.9

32

mm × 20 mm, C18, 5 µm). Hệ dung môi rửa giải bao gồm hai hệ chính là A

(dung môi methanol) và B (nước + 0.1% formic acid). Hệ phân tích rửa giải

với tốc độ dòng từ: 0.5 mL/phút. Giải sóng UV quét từ 200 đến 400 nm, giải

sóng UV-VIS quét từ 400 đến 800 nm. Quy trình sắc ký phổ và xử lý kết quả

phổ được thực hiện trên phần mềm chuyên dụng của hãng Agilent. Độ hấp

thụ của các pic rửa giải được ghi lại ở bước sóng 265 nm. Astaxanthin chuẩn

được cung cấp bởi hãng Energy Chemicals. Độ tinh khiết của mẫu chuẩn đạt

trên 98% được xác định dựa trên phương pháp phân tích sắc ký lỏng cao áp

(HPLC). Phương pháp xác định hàm lượng astaxanthin được tiến hành tại

phòng Hóa học phân tích, Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên, Viện Hàn

lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

Hiệu suất hấp thụ của tế bào được tính toán theo công thức sau:

H (%) = WS/WT x 100%

Trong đó WS là lượng nano astaxanthin trong tế bào và WT là tổng

astaxanthin trong môi trường nuôi cấy tế bào.

2.2.3.5. Phương pháp đánh giá tác dụng bảo vệ tế bào của nano astaxanthin chống lại stress oxy hóa do H2O2 gây ra trong tế bào HepG2

Đánh giá khả năng bảo vệ tế bào HepG2 chống lại stress oxy hóa do

H2O2 gây ra của nano astaxanthin được thực hiện theo phương pháp của

Wang và cộng sự [80]. Đầu tiên các tế bào HepG2 được nuôi cấy 24 h trong

môi trường DMEM/high glucose trong đĩa nuôi cấy loại 6 giếng với mật độ 1

x 106 tế bào/giếng. Sau 24 h nuôi cấy, tế bào được ủ với nano astaxanthin

hoặc mẫu trắng với nồng độ từ 100 µg/mL trong 24 h tiếp theo. Sau thời gian

ủ với nano astaxanthin hoặc mẫu trắng, tế bào tiếp tục được ủ dung dịch H2O2

(5 mM) trong 1 giờ. Tác dụng bảo vệ của các nano astaxanthin chống lại sự

phá hủy của stress oxy hóa đối với tế bào HepG2 được biểu thị bằng tỷ lệ

sống sót của tế bào. Khả năng sống sót của tế bào được xác đinh theo phương

pháp Trypan Blue của Crowley và cộng sự [79].

2.2.3.6. Phương pháp đánh giá tác dụng giảm lipit của nano

astaxanthin trên dòng tế bào HepG2

Các tế bào HepG2 được nuôi cấy 24 h trên môi trường DMEM/ high

glucose trong đĩa nuôi cấy loại 24 giếng với mật độ 1 x 105 tế bào/giếng. Sau

24 h nuôi cấy, tế bào HepG2 được cảm ứng gây rối loạn chuyển hóa lipit bằng

33

cách ủ với môi trường DMEM có chứa axit oleic 800 M pha trong 0,5%

fatty acid-free BSA trong thời gian 6 h.

Tế bào được cảm ứng gây tích tụ lipit sau đó được ủ với thuốc điều trị

giảm mỡ máu (fenofibrate; 50 M), nano astaxanthin hoặc mẫu trắng (10, 50

và 100 µg/mL) trong thời gian 24 h. Nước cất vô trùng được sử dụng như là

đối chứng. Mỗi công thức thí nghiệm lặp lại 3 lần. Sau thời gian ủ với

fenofibrate, nano astaxanthin hoặc mẫu trắng, thu tế bào và xác định hàm

lượng lipit.

2.2.3.7. Phương pháp nhuộm lipit bằng Oil Red O (ORO)

Phương pháp nhuộm lipit bằng ORO được thực hiện theo như mô tả

của Hoang và cộng sự [81]. Cụ thể: Tế bào HepG2 sau khi được ủ với nano

astaxanthin hoặc mẫu trắng được rửa 2 lần với PBS và cố định với 10% (v/v)

formalin ở nhiệt độ phòng trong thời gian 10 phút. Sau đó, loại bỏ phần dịch

trên và bổ sung formalin 37% (v/v) trong 1 h ở nhiệt độ phòng. Tiếp theo,

mẫu được rửa lại 2 lần với nước cất và bổ sung isopropanol 60% trong 5 phút

ở nhiệt độ phòng. Cuối cùng, loại bỏ phần dịch trên, làm khô mẫu bằng máy

sấy. Các tế bào sau đó được nhuộm với dung dịch Oil Red O trong 60 phút.

Rửa các dung dịch nhuộm thừa bằng nước cất. Chụp ảnh tế bào sau khi

nhuộm lipit bằng máy ảnh Canon IXY digital 70 (Canon, Tokyo, Nhật Bản).

Định lượng lipit nội bào bằng cách hòa tan các tế bào được nhuộm Oil Red O

trong isopropanol 100% và đo mật độ quang ở bước sóng 500 nm trên máy

quang phổ Hitachi U-1100 (Hitachi Ltd., Tokyo, Nhật Bản).

2.2.3.8. Phương pháp phân tích hàm lượng lipit

Tế bào HepG2 sau khi được ủ với nano astaxanthin hoặc mẫu trắng sẽ

được rửa 2 lần với PBS. Sau đó, chiết lipit nội bào bằng hỗn hợp dung môi n-

hexane: isopropanol (2:1, v:v) trong thời gian 30 phút theo như mô tả của

Hoang và cộng sự [81]. Dung dịch chứa lipit được làm bay hơi bằng máy

speed-vac và hòa tan trở lại trong 100 μL ethanol.

Hàm lượng cholesterol và triglyceride nội bào sẽ được xác định bằng

phương pháp enzym trên máy phân tích tự động Olympus AU400 (Olympus

Analyzers, Tokyo, Nhật Bản). Protein tổng số được xác định với kít Bradford

protein assay (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) và bovine serum albumin được

sử dụng làm chất chuẩn để chuẩn hóa hàm lượng protein. Hàm lượng

34

cholesterol và triglyceride trong tế bào sau đó sẽ được chuẩn hóa với nồng độ

của protein tổng số theo công thức sau:

Hàm lượng lipit tổng số

Hàm lượng lipit trong tế bào =

(mmol/L/mg protein) Hàm lượng protein tổng số

2.2.2.9. Phương pháp xử lý số liệu

Số liệu được xử lý thống kê theo phương pháp Student’s t-test bằng

phần mềm E-xcel.

2.2.4 Địa điểm tiến hành các thí nghiệm trong nghiên cứu

Địa điểm tiến hành các thí nghiệm và phân tích các kết quả trong

nghiên cứu được trình bày trong Bảng 2.2.

Bảng 2.2. Địa điểm tiến hành nghiên cứu

TT Nội dung thực hiện Địa điểm thực hiện

1. Nghiên cứu hình thái và sự phân bố kích thước hạt của nano astaxanthin

Xác định hình thái của nano

astaxanthin

Phòng thí nghiệm trọng điểm Quốc

gia vật liệu polyme và compozit,

Trường Đại học Quốc gia Thành phố

Hồ Chí Minh

Nghiên cứu sự phân bố kích

thước hạt (DLS) của nano

astaxanthin.

Phòng Vật liệu tiên tiến, Viện Hóa

học, Viện Hàn lâm Khoa học và

Công nghệ Việt Nam

2. Đánh giá hoạt tính sinh học của nano astaxanthin

Hoạt tính khử gốc DPPH của

astaxanthin và nano astaxanthin

Phòng Công nghệ tảo, Viện Công

nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa

học và Công nghệ Việt Nam

Độc tính tế bào của nano

astaxanthin




Khả năng hấp thu nội bào của

nano astaxanthin




35

Tác dụng bảo vệ tế bào HepG2

của nano astaxanthin chống lại

tổn thương bởi stress oxy hóa do

H2O2 gây ra




Tác dụng giảm lipit của nano

astaxanthin




36

CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO NANO ASTAXANTHIN

3.1.1 Ảnh hưởng của chất hoạt động bề mặt tới quá trình chế tạo

nano astaxanthin

Ảnh hưởng của tỷ lệ chất hoạt động bề mặt cremophor RH40/hoạt chất

astaxanthin tới sự hình thành hạt nano astaxanthin đã được khảo sát. Hình 3.1

là kết quả đo phân bố kích thước hạt của các mẫu nano astaxanthin chế tạo

được.

0 50 100 150 200 250 300 350 4000

2

4

6

8

10

12

Dis

trib

uti

on

(%

)

Particle diameter (nm)

A1 A2 A3

Hình 3.1. Giản đồ phân bố kích thước hạt của nano astaxanthin theo các tỷ lệ

khác nhau giữa astaxanthin và chất hoạt động bề mặt cremorphor RH40

Các mẫu A1, A2, A3 với tỷ lệ hàm lượng astaxanthin/cremophor RH40

là 1/1 (A1), 1/2 (A2), và 1/3 (A3) cho kết quả đường kính hạt trung bình lần

lượt là 115 nm, 90 nm và 85 nm. Nhận thấy, khi giảm tỷ lệ hàm lượng

astaxanthin/RH40 thì đường kính hạt trung bình của các mẫu giảm, đặc biệt

khi giảm tỷ lệ 1/1 xuống 1/2 tức hàm lượng chất hoạt động bề mặt tăng gấp

37

đôi so với hoạt chất thì kích thước hạt giảm xuống đáng kể, từ 115 nm xuống

90 nm. Tiếp tục giảm tỷ lệ hàm lượng astaxanthin/cremophor RH40 từ 1/2

xuống 1/3 thì xu hướng kích thước hạt nano giảm không đáng kể. Theo một

số nghiên cứu, hàm lượng chất hoạt động bề mặt khi đưa vào công thức chế

tạo hạt nano cần phù hợp để tránh những tác dụng phụ của sản phẩm cuối

cùng như tăng mỡ máu hay rối loạn chuyển hóa lipit. Ngoài ra, giản đồ phân

bố kích thước hạt cho thấy mẫu A2 có sự phân bố hẹp và kích thước hạt trung

bình dưới 100 nm. Như vậy, kết quả cho thấy vai trò trong việc tạo hạt nano

astaxanthin của chất hoạt động bề mặt cremophor RH40 và tỷ lệ

astaxanthin/chất hoạt động bề mặt là 1/2 được lựa chọn cho công thức nano

astaxanthin.

Để đánh giá hiệu quả của các chất hoạt động bề mặt khác nhau tới quá

trình chế tạo hạt nano astaxanthin, chúng tôi thay thế RH40 bằng tween 80

với tỷ lệ astaxanthin/tween 80 là 1/2 (A4) là tỷ lệ đã đạt được kích thước hạt

nano tốt dưới 100 nm.

0 50 100 150 200 250 300 3500

2

4

6

8

10

12

Dis

trib

uti

on

(%

)

Particle diameter (nm)

A2 A4

Hình 3.2. Giản đồ phân bố kích thước hạt của nano astaxanthin sử dụng chất

hoạt động bề mặt cremophor RH40 và tween 80

38

A1

100nm 100nm

100nm 100nm

A2

A3 A4

Hình 3.2 là kết quả giản đồ phân bố kích thước hạt của nano

astaxanthin khi sử dụng chất hoạt động bề mặt cremophor RH40 và tween 80.

Các tiểu phân trong mẫu A2, A4 có đường kính trung bình lần lượt là 90 nm

và 96 nm. Không có sự khác biệt đáng kể giữa 2 mẫu này. Tuy nhiên, mẫu A4

có nhiều hạt tiểu phân lớn hơn, một số hạt có đường kính lên tới gần 200 nm.

Mặt khác, cremophor RH40 có độc tính thấp hơn tween 80. Do đó, cremophor

RH40 được lựa chọn sử dụng làm chất hoạt động bề mặt cho quá trình chế tạo

nano astaxanthin.

3.1.2. Hình thái của các mẫu nano astaxanthin

Hình thái của các mẫu bột nano astaxanthin được đánh giá qua ảnh

TEM. Kết quả ảnh TEM của các mẫu A1, A2, A3 và A4 được thể hiện lần

lượt trong Hình 3.3.

Hình 3.3. Ảnh TEM của các mẫu A1, A2, A3 và A4

39

Ảnh TEM cho thấy, các hạt nano astaxanthin trong các mẫu A1, A2,

A3 và A4 đều có dạng hình cầu và đặc biệt không có hiện tượng kết đám với

nhau. Ảnh TEM của mẫu A2 cho các hạt có kích thước nhỏ (khoảng 90 nm)

và có sự phân bố đồng đều nhất. Kết quả này hoàn toàn tương đồng với kết

quả đo phân bố kích thước hạt trong mục 3.1.1. Mẫu A2 tiếp tục được lựa

chọn để nghiên cứu và đánh giá các hoạt tính sinh học của nano astaxanthin.

3.1.3. Đánh giá khả năng phân tán trong nước của mẫu bột nano

astaxanthin

Mẫu bột nano astaxanthin (mẫu A2) trước khi nghiên cứu đánh giá một

số hoạt tính sinh học thì sản phẩm được khảo sát sơ bộ khả năng phân tán

trong nước. Các mẫu bột astaxanthin và nano astaxanthin sau khi phân tán

trong nước được lưu trữ ở nhiệt độ phòng. Sau đó quan sát hiện tượng dung

dịch sau 01 ngày. Bảng 3.1 là kết quả tổng hợp quá trình khảo sát sự phân tán

trong nước của astaxanthin tinh khiết và mẫu nano astaxanthin (mẫu A2).

Bảng 3.1. Kết quả đánh giá khả năng phân tán trong nước của astaxanthin

tinh khiết và mẫu nano astaxanthin

Mẫu Khả năng phân tán

trong nước Quan sát đáy lọ thủy tinh

sau 01 ngày

Bột astaxanthin tinh khiết

Rất kém (gần như không tan trong nước)

Lắng

Nano astaxanthin (5% astaxanthin)

Rất tốt Rất trong, không có hiện

tượng lắng

Astaxanthin NanoAstaxanthin

Hình 3.4. So sánh khả năng phân tán trong nước của astaxanthin tinh khiết

và nano astaxanthin

40

Nhận thấy, astaxanthin tinh khiết hầu như không phân tán trong nước,

ngay lập tức lắng xuống đáy lọ thủy tinh (Hình 3.4). Điều này lý giải vì sao

astaxanthin được hấp thu rất kém khi đưa vào cơ thể. Từ đó, sinh khả dụng

của hoạt chất bị hạn chế. Trong khi đó, mẫu bột nano astaxanthin (mẫu A2)

cho thấy khả năng phân tán rất tốt trong nước. Đặc biệt, mẫu bột nano phân

tán trong nước được lữu trữ ở nhiệt độ phòng sau 01 ngày, không thấy có hiện

tượng lắng và dung dịch thu được vẫn rất trong. Sự phân tán tốt này của nano

astaxanthin thể hiện hoạt chất đã tương hợp rất tốt với chất hoạt động bề mặt

là cremophor RH40 và chất bao bọc vi nang copolymer PLA-PEG. Như vậy,

việc chuyển hóa astaxanthin tinh thể về dạng nano không những giúp

astaxanthin phân tán tốt trong nước mà còn nâng cao tiềm năng ứng dụng của

hoạt chất trong thực tiễn.

3.2. KẾT QUẢ ĐÁNH GIÁ MỘT SỐ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA NANO

ASTAXANTHIN

3.2.1. Hoạt tính tiêu diệt gốc tự do DPPH của astaxanthin và nano astaxanthin

Một trong những hoạt tính nổi bật của asaxanthin là hoạt tính chống

oxy hóa [6, 25, 40, 42, 68]. Do đó đầu tiên, nghiên cứu tiến hành xác định và

so sánh khả năng bắt gốc tự do DPPH giữa astaxanthin tự nhiên và

astaxanthin đã được nano hóa (mẫu A2).

Hình 3.5. Hoạt tính chống oxi hóa của astaxanthin và nano astaxanthin

sử dụng DPPH

41

Kết quả trong Hình 3.5 cho thấy, theo sự tăng dần nồng độ từ 1-250

µg/mL hoạt tính bắt gốc tự do DPPH của cả astaxanthin và nano astaxanthin

tăng dần. Tương tự như các nghiên cứu đã được công bố trước đây [68,70,

80], kết quả nghiên cứu cũng cho thấy astaxanthin ở dạng nano hóa có hoạt

tính bắt gốc tự do DPPH cao hơn astaxanthin ở dạng tự nhiên (Hình 3.5). Với

nồng độ 4, 20, 100 và 250 µg/mL, tỉ lệ % hoạt tính bắt gốc DPPH của nano

astaxanthin là 13,2; 18,3; 43,3 và 92,1 % tương ứng cao hơn so với astxanthin

tự nhiên là 2,9; 7,9; 25,8 và 49,5. Điều này có thể là do ở dạng tự nhiên

astaxanthin không tan hoàn toàn trong dung môi methanol và nước; trong khi

đó ở dạng nano, astaxanthin tan hoàn toàn trong nước và do vậy cải thiện

đáng kể được khả năng bắt gốc tự do DPPH của astaxanthin.

3.2.2. Độc tính tế bào của nano astaxanthin

Trước khi đánh giá sự hấp thu tế bào cũng như hoạt tính chống oxy hóa

và giảm lipit của nano astaxanthin, tính độc của nano astaxanthin và mẫu

trắng (mẫu nano không bổ sung astaxanthin) trên các dòng tế bào HT29 và

HepG2 đã được kiểm tra (Hình 3.6 và Hình 3.7).


HT29

42


HepG2

Kết quả trong Hình 3.6 và Hình 3.7 cho thấy, các tế bào HT29 và

HepG2 vẫn giữ được khả năng sống sót trên 98% khi được ủ với nano

astaxanthin hoặc mẫu trắng trong vòng 24h với nồng độ tối đa là 500 µg/mL.

Do đó, nano astaxanthin an toàn và được sử dụng cho các nghiên cứu về hoạt

tính sinh học tiếp theo.

3.2.3. Khả năng hấp thu của tế bào HT29 đối với nano astaxanthin

Sự hấp thu carotenoid nói chung và astaxanthin nói riêng trong tế bào

bị ảnh hưởng bởi tính kỵ nước, sự phân bố kích thước hạt và khả năng tiếp

cận sinh học của chúng. Giảm kích thước hạt của thành phần ưa béo giúp cải

thiện sinh khả dụng của hoạt chất [82]. Một số nghiên cứu đã chứng minh

rằng các hệ thống phân phối nhũ hóa, chất keo cải thiện khả năng hòa tan hiệu

quả của một thành phần hoạt tính sinh học ưa béo, do đó cải thiện khả năng

tiếp cận sinh học và khả dụng sinh học của nó [72, 83, 84].

Nghiên cứu của Montero và cộng sự [85] cho thấy rằng việc bổ sung

chất nhũ hóa làm giảm kích thước hạt của astaxanthin và cải thiện khả dụng

sinh học của nó. Ở đây, chúng tôi cũng quan sát thấy rằng việc nano hóa đã

43

tăng cường khả năng hòa tan hiệu quả của astaxanthin và tăng khả năng tiếp

cận sinh học của nó (Hình 3.8).

Hình 3.8. Hiệu quả hấp thu astaxanthin của tế bào HT29

Từ hình 3.11 ta thấy rằng, hiệu suất tế bào hấp thu astaxanthin tự nhiên

tăng từ 2,5% lên 12,6% khi được nano hóa.

Sắc ký đồ HPLC (Hình 3.9) cho thấy, nano hóa astaxanthin đã giúp làm

tăng khả năng hấp thu vào tế bào HT29 lên hơn 5 lần so với astaxanthin dạng

tự nhiên. Kết quả của chúng tôi cũng hoàn toàn trùng khớp với kết quả nghiên

cứu của Edelman và cộng sự [86].

44

Hình 3.9. Sắc ký đồ HPLC của astaxanthin được hấp thu trong tế bào được ủ

với mẫu trắng (A), astaxanthin (B) và nano astaxanthin (C).

3.2.4. Tác dụng bảo vệ tế bào HepG2 của nano astaxanthin chống lại tổn

thương bởi stress oxy hóa do H2O2 gây ra

Stress oxy hóa được coi là yếu tố gây bệnh quan trọng góp phần vào

căn nguyên của nhiều loại bệnh như bệnh tim mạch, bệnh phổi tắc nghẽn mãn

tính, bệnh thoái hóa thần kinh [87]. Bên cạnh đó, các nghiên cứu cũng chỉ ra

rằng thêm trực tiếp H2O2 vào trong môi trường nuôi cấy tế bào sẽ dẫn đến

stress oxy hóa và gây chết tế bào [88]. Chính vì vậy, trong nghiên cứu này,

45

chúng tôi tiến hành đánh giá tác dụng bảo vệ tế bào của nano astaxanthin

chống lại tổn thương do stress oxy hóa gây ra bởi H2O2 (Hình 3.10).

Hình 3.10. Khả năng sống sót của tế bào HepG2 được cảm ứng với H2O2

trong các nhóm xử lý khác nhau (n = 6). *, ** cho thấy sự khác biệt có ý

nghĩa thống kê (*P < 0,05; ** P < 0,01) giữa các nhóm với nhóm được cảm ứng

chỉ với H2O2.

Kết quả trong Hình 3.10 cho thấy tỷ lệ tế bào HepG2 còn sống sót sau

1h nuôi cấy trong môi trường DMEM có bổ sung 5mM H2O2 là 50,9%, ngược

lại tỷ lệ này đạt 100% ở tế bào được nuôi trong môi trường DMEM đối

chứng. Ủ trước tế bào với nano astaxanthin đã có tác dụng ngăn chặn đáng kể

tác động có hại của H2O2 đối với sự tồn tại của tế bào; tỷ lệ tế bào sống sót có

ý nghĩa tăng từ 50,9% trong môi trường chỉ có H2O2 lên 66,7% trong tế bào

được ủ đồng thời cả nano astaxanthin và H2O2. So với nhóm được ủ trước

bằng nano astaxanthin, nhóm axit ascorbic cũng có tỷ lệ tế bào sống sót đạt

61,2%. Bên cạnh đó, chúng tôi cũng nhận thấy rằng khả năng sống sót của tế

bào được ủ trước với mẫu trắng (51,55%) tương tự như với nhóm chỉ được ủ

với H2O2. Điều này cho thấy khả năng bảo vệ tế bào ở đây chủ yếu là do tác

dụng của astaxanthin.

Liu và cộng sự [89] đã cho thấy khả năng sống của tế bào tăng đáng kể

từ 63,9% lên 73,9% khi 316 nM astaxanthin tự do được ủ trước khi các tế bào

thần kinh được cảm ứng stress oxy hóa bằng H2O2. Wang và cộng sự (2017)

và Oh và cộng sự (2020) [80, 88] lại không phát hiện thấy bất kỳ tác dụng bảo

46

vệ nào của astaxanthin tự do ở nồng độ từ 10 đến 40 µM với tế bào ruột Caco-

2 và tế bào thần kinh ARPE-19 được cảm ứng stress oxy hóa bằng H2O2. Tuy

nhiên, trong nghiên cứu này, chúng tôi thấy rằng 8,3 nM astxanthin được

nano hóa đã có thể bảo vệ được tế bào khỏi stress oxy hóa cảm ứng bởi H2O2.

Sự tăng khả năng hấp thu nội bào do astaxanthin được nano hóa được cho là

lý do chính để cải thiện khả năng chống oxy hóa của nano astaxanthin. Dựa

trên các kết quả thu được, nghiên cứu đã chứng minh được nano astaxanthin

tăng cường tác dụng bảo vệ tế bào HepG2 khỏi tác hại của quá trình oxy hóa

và có khả năng bảo vệ tế bào mạnh nhất trong số các mẫu thử nghiệm.

3.2.5. Tác dụng của nano-astaxanthin lên sự thay đổi hàm lượng lipit nội bào trong tế bào gan HepG2

Một trong những tác dụng sinh học quan trọng được biết đến rộng rãi

của astaxanthin là tác dụng giảm lipit. Các nghiên cứu trên tế bào, động vật và

người về astaxanthin đã được công bố. Jia và cộng sự [90] chỉ ra rằng

astaxanthin ở nồng độ 10 µM có tác dụng giảm cholesterol và triglyceride nội

bào tương ứng -14 và -20% trong tế bào HepG2. Hussein và cộng sự [91] đề

xuất rằng việc sử dụng astaxanthin đã làm tăng mức cholesterol tốt (HDL-C)

và giảm hàm lượng axit béo nonesterified và triglyceride trong mô hình động

vật của họ. Ngoài ra, chế độ ăn có bổ sung chiết xuất giàu astaxanthin từ tảo

lục trong bốn tuần ở chuột bị đột biến gen apoE đã làm giảm đáng kể nồng độ

triglyceride trong huyết tương [92]. Trong một nghiên cứu khác, cả nồng độ

triglyceride trong gan và huyết tương và nồng độ cholesterol trong huyết

tương đều giảm đáng kể ở nhóm bổ sung astaxanthin so với nhóm chứng [93].

Năm 2011, Yoshida và cộng sự [94] báo cáo kết quả thử nghiệm lâm sàng

trên 61 người bị tăng lipit máu nhẹ cho thấy điều trị astaxanthin với liều 12 và

18 mg/day có tác dụng giảm nồng độ triglyceride trong huyết tương và

astaxanthin với liều 6 và 12 mg/day có ý nghĩa tăng hàm lượng HDL-C.

Trong nghiên cứu này, tác dụng giảm lipit của nanoastaxanthin đã được xác

định. Kết quả phân tích hàm lượng cholesterol và triglyceride trong tế bào

HepG2 được đo bằng phương pháp enzyme và đo trên máy phân tích tự động

Olympus AU400; khả năng tích lũy lipit nội bào được phân tích bằng phương

pháp nhuộm Oil Red O và đo mật độ quang ở bước sóng 500 nm trên máy

quang phổ Hitachi U-1100 được thể hiện ở hình 3.10 và 3.11..

47

Hình 3.11. Tác dụng của nano astaxanthin lên hàm lượng cholesterol (A) và

triglycerid (B) trong tế bào HepG2. *, ** cho thấy sự khác biệt có ý nghĩa thống

kê (*P < 0,05; ** P < 0,01) giữa các nhóm thí nghiệm với nhóm đối chứng

Kết quả trong Hình 3.11 cho thấy, tương tự như đối với chất chuẩn

fenofibrate, nồng độ triglyceride và cholesterol nội bào trong các tế bào được ủ

với nano astaxanthin giảm có ý nghĩa thống kê phụ thuộc vào nồng độ so với

đối chứng. Nano astaxanthin có tác dụng giảm đáng kể nồng độ cholesterol từ

100% trong tế bào đối chứng xuống 78,3% (P<0,05) và 72,2% (P<0,01) trong

tế bào được ủ với 50 và 100 µg/mL nano astaxanthin (Hình 3.11 A). Bên cạnh

đó, hàm lượng triglyceride trong tế bào được ủ với nano astaxanthin với các

nồng độ 10, 50 và 100 µg/mL còn có tác dụng giảm nồng độ triglyceride tương

ứng -12,5%, -17,1% và -20,5% so với đối chứng (Hình 3.11 B).

48

Tác dụng giảm hàm lượng lipit nội bào có thể so sánh tương đương

giữa nano astaxanthin và chất chuẩn fenofibrate. Kết quả nhuộm ORO cũng

cho kết quả tương tự như kết quả phân tích hàm lượng lipit nội bào (Hình

3.12). Tương tự như đối với các kết quả thu được trong mục 3.2.4, nano

astaxanthin ở nồng độ từ 1 đến 8,3 nM đã cho các kết quả giảm lipit tương tự

hoặc cao hơn so với tế bào được hấp thu astaxanthin ở nồng độ từ 10 đến 100

nM như trong công bố của Jia và cộng sự [22].

Hình 3.12. Khả năng tích lũy lipit nội bào được phân tích bằng phương pháp

nhuộm Oil Red O (A) và đo mật độ quang ở bước sóng 500 nm trên máy

quang phổ Hitachi U-1100 (B). *, ** cho thấy sự khác biệt có ý nghĩa thống

kê (*P < 0,05; ** P < 0,01) giữa các nhóm thí nghiệm với nhóm đối chứng.

Một số nghiên cứu cho thấy các hợp chất Cremophors thường liên quan

đến phản ứng quá mẫn phản vệ nghiêm trọng, tăng lipit máu, các dạng

49

lipoprotein bất thường, kết tập hồng cầu và bệnh thần kinh ngoại vi [95]. Và

để giảm các tác dụng phụ này, một số phương pháp đã được áp dụng, chẳng

hạn như thay thế Cremophor bằng Solutol HS 15 [96] và thêm chất hoạt động

bề mặt hoặc dung môi [97]. Trong nghiên cứu này mẫu trắng là nano không

có chứa astaxanthin, ở các nồng độ khác nhau (10 µM, 50 µM, 100 µM) đều

không có sự thay đổi về nồng độ triglyceride và cholesterol nội bào (Hình

3.11). Kết qủa đo OD khi các tế bào được nhuộm ORO cũng cho kết quả

tương tự (Hình 3.12). Do đó, phương pháp tạo nano trong nghiên cứu này có

tác dụng hạn chế các hiệu ứng phụ không mong muốn của hợp chất

Cremophors.

50

CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

4.1. KẾT LUẬN

- Đã chế tạo thành công hạt nano astaxanthin sử dụng chất hoạt động bề

mặt cremophor RH40 với tỷ lệ astaxanthin/chất hoạt động bề mặt là 1/2; hạt

nano có dạng hình cầu và kích thước trung bình của hạt là 90 nm.

- Nano astaxanthin có tác dụng sinh học vượt trội so với astaxanthin tự do:

+ Ở 4, 20, 100 và 250 µg/mL, tỉ lệ % hoạt tính bắt gốc DPPH của nano

astaxanthin tương ứng cao hơn so với astxanthin tự nhiên là 4,5; 2,3; 1,7 và

1,9 lần;

+ Nano astaxanthin không gây độc tế bào và có khả năng hấp thu vào

trong tế bào HT29 cao gấp 5 lần so với astaxanthin tự do;

+ Nano astaxanthin có tác dụng bảo vệ tế bào khỏi stress oxy hóa và

giảm lipit (giảm cholesterol, tryglyceride nội bào).

4.2. KIẾN NGHỊ

Để hướng tới sử dụng nguyên liệu nano astaxanthin trong sản xuất thực

phẩm chức năng phục vụ cho sức khỏe con người, chúng tôi mong muốn

được tiếp tục nghiên cứu:

- Xác định độ bền, độc tính cấp và độc tính bán trường diễn của nguyên

liệu nano astaxanthin;

- Nghiên cứu cơ chế phân tử tác dụng chống oxy hóa và giảm lipit của

nano astaxanthin trên mô hình in vivo.

51

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Higuera-Ciapara I, Felix-Valenzuela L, Goycoolea F, 2006,

Astaxanthin: a review of its chemistry and applications, Crit Rev Food Sci,

46: 185-196.

2. Ambati, R., Phang, S.-M., Ravi, S., & Aswathanarayana, R, 2014,

Astaxanthin: Sources, Extraction, Stability, Biological Activities and Its

Commercial Applications—A Review, Marine Drugs, 12(1), 128–152.

3. Sarada R., Tripathi U., Ravishankar G.A, 2002, Influence of stress on

astaxanthin production in Haematococcus pluvialis grown under

different culture conditions, Process Biochem, 37:623–627.

4. Kidd P, 2011, Astaxanthin, cell membrane nutrient with diverse clinical

benefits and anti-aging potential, Altern Med Rev, 16:355–364.

5. Miao F, Lu D, Li Y, Zeng M, 2006, Characterization of astaxanthin

esters in Haematococcus pluvialis by liquid chromatography–

atmospheric pressure chemical ionization mass spectrometry, Anal

Biochem, 352 (2): 176-181.

6. Brotosudarmo, T. H. P., Limantara, L., Setiyono, E., & Heriyanto, 2020,

Structures of Astaxanthin and Their Consequences for Therapeutic

Application, International Journal of Food Science, 1–16.

7. Eiji Yamashita, 2015, Let astaxanthin be thy medicine, Pharma

Nutrition, Volume 3, Issue 4, October 2015, 115-122.

8. Pubchem, Astaxanthin, National Center for Biotechnology Information -

https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/Astaxanthin#section=Infor

mation-Sources.

9. Gimpel, J. A., Henríquez, V., & Mayfield, S. P, 2015, In Metabolic

Engineering of Eukaryotic Microalgae: Potential and Challenges Come

with Great Diversity, Frontiers in Microbiology, Dec 15;6:1376.

10. Jin E, Lee CG, Polle JEW, 2006, Secondary carotenoit accumulation in

Haematococcus (Chlorophyceae): biosynthesis, regulation, and

biotechnology, J Microbiol Biotechnol, 16(6): 821-831.

52

11. Schoefs B, Rmiki N, Rachadi J, Lemoine Y, 2001, Astaxanthin

accumulation in Haematococcus requires a cytochrome P450

hydroxylase and an active synthesis of fatty acids, FEBS Lett, 500(3):

125-128.

12. Nguyen Khoa Dang, 2013, Astaxanthin: A Comparative Case of

Synthetic VS. Natural Production, Chemical and Biomolecular

Engineering Publications and Other Works.

13. Berhard K, Müller RK, Spruijtenburg R, 1984, Process for the

reparation of astaxanthin and intermediates in the astaxanthin

synthesis, European Patent EP 0101597.

14. Rüttimann A, 1999, Dienolether condensation - a powerful tool in

carotenoit synthesis, Pure Appl Chem, 71(12): 2285-2293.

15. Schloemer GC, Davis JL, 2001, Preparation of astaxanthin,

International Patent, WO0181301.

16. Rammuni MN, Ariyadasa TU, Nimarshana PHV, Attalage RA, 2019,

Comparative assessment on the extraction of carotenoit s from

microalgal sources: Astaxanthin from H. pluvialis and β-carotene from

D. Salina, Food Chemistry, 277: pp 128-134.

17. Iwamoto, T., Hosoda, K., Hirano, R., Kurata, H., Matsumoto, et al.,

2000, Inhibition of low-density lipoprotein oxidation by astaxanthin, J.

Atheroscler Thromb, 7, pp 216–222.

18. Barros, M.P.; Marin, D.P.; Bolin, A.P.; de Cássia Santos Macedo, R.;

Campoio, T.R.; Fineto, C., Jr.; Guerra, B.A.; Polotow, T.G.; Vardaris,

C.; Mattei, R.; et al., 2012, Combined astaxanthin and fish oil

supplementation improves glutathione-based redox balance in rat

plasma and neutrophils, Chem Biol Interact, 197, pp 58–67.

19. Ranga Rao, A.; Baskaran, V.; Sarada, R.; Ravishankar, G.A, 2013, In

vivo bioavailability and antioxidant activity of carotenoit s from micro

algal biomass—A repeated dose study, Food Res Int, 54, pp 711–717.

20. Page, G.I.; Davies, S.J, 2002, Astaxanthin and canthaxanthin do not

induce liver or kidney xenobiotic-metabolizing enzymes in rainbow

53

trout (Oncorhynchus mykiss Walbaum), Comp. Biochem. Physiol. C

Toxicol. Pharmacol, 133C, 443–451.

21. Østerlie M, Bjerkeng B, Liaaen-Jensen S, 2000, Plasma appearance and

distribution of astaxanthin E/Z and R/S isomers in plasma lipoproteins

of men after single dose administration of astaxanthin, J Nutr Biochem,

2000 Oct, 11(10): pp 482-90.

22. Jia Y, Kim JY, Jun HJ, Kim SJ, Lee JH, Hoang MH, Hwang KY, Um

SJ, Chang HI, Lee SJ, 2012, The natural carotenoit astaxanthin, a

PPAR-α agonist and PPAR-γ antagonist, reduces hepatic lipid

accumulation by rewiring the transcriptome in lipid loaded hepatocytes,

Molecular Nutrition & Food Research, 56: pp 878- 888.

23. Olson, J.A, 2004, Carotenoit s: absorption, transport, and metabolism

of carotenoit s in humans, Pure Appl Chem, 66, pp 1011–1016.

24. Zhao T, Yan X, Sun L, Yang T, Hu X, He Z, Liu F, Liu X, 2019,

Research progress on extraction, biological activities and delivery

systems of natural astaxanthin, Trends in Food Science & Technology,

91: pp 354-361.

25. Sajad Fakhria, Fatemeh Abbaszadehb, Leila Dargahic, Masoumeh

Jorjani, 2018, Astaxanthin: A mechanistic review on its biological

activities and health benefits, Pharmacological Research, Volume 136,

October 2018, pp 1-20.

26. Hussein G, Nakagawa T, Goto H, Shimada Y, Matsumoto K, Sankawa

U, Watanabe H, 2007, Astaxanthin ameliorates features of metabolic

syndrome in SHR/NDmcr-cp, Life Sci, 80(6): 522-9.

27. Nakao R, Nelson OL, Park JS, Mathison BD, Thompson PA, Chew BP,

2010, Effect of astaxanthin supplementation on inflammation and

cardiac function in BALB/c mice, Anticancer Res, 30: 2721–2725.

28. Jia Y, Wu C, Kim J, Kim B, Lee SJ, 2016, Astaxanthin reduces hepatic

lipid accumulations in high-fat-fed C57BL/6J mice via activation of

peroxisome proliferator-activated receptor (PPAR) alpha and inhibition

of PPAR gamma and Akt, J Nutr Biochem, 28: 9-18.

54

29. Jyonouchi H, Sun S, Tomita Y, Gross MD, 1995, Astaxanthin, a

carotenoit without vitamin A activity, augments antibody responses in

cultures including T-helper cell clones and suboptimal doses of antigen,

J Nutr, 125(10): 2483-2492.

30. Stewart JS, Lignell A, Pettersson A, Elfving E, Soni M, 2008, Safety

assessment of astaxanthin-rich microalgae biomass: Acute and

subchronic toxicity studies in rats, Food and Chemical Toxicology, 46:

3030-3036.

31. Vega K, Edwards J, Beilstein P, 2015, Subchronic (13-week) toxicity

and prenatal developmental toxicity studies of dietary astaxanthin in

rats, Regulatory Toxicology and Pharmacology, 73: 819-828.

32. Lim, K. C., Yusoff, F. M., Shariff, M., & Kamarudin, M. S., 2017,

Astaxanthin as feed supplement in aquatic animals, Reviews in

Aquaculture, 10(3), 738–773.

33. Christiansen, R., Glette, J., Torrisen, O.J., Lie, O., & Waagb, R., 1995,

Antioxidant status and immunity in Atlantic salmon, Salmo salar L., fed

semi-purified diets with and without astaxanthin supplementation,

Journal of Fish Diseases, 18(4): 317–328.

34. Zhang, J., Liu, Y.J., Tian, L.X., Yang, H.J., Liang, G.Y., Yue, Y.R., &

Xu D.H, 2006, Effects of dietary astaxanthin on growth, antioxidant

capacity and gene expression in Pacific white shrimp

Litopenaeusvannamei, Aquaculture Nutrition, 19(6): 917-927.

35. Niu, J., Tian, L..X., Liu, Y..J., Yang, H..H., Ye, C. X., & Gao Wen,

2009, Effect of Dietary Astaxanthin on Growth, Survival, and Stress

Tolerance of Postlarval Shrimp, Litopenaeus vannamei, Journal of the

world aquaculture society, 40:795-802.

36. Alishahi, M., Karamifar, M., & Mesbah, M, 2015, Effects of

astaxanthin and Dunaliella salina on skin carotenoit, growth

performance and immune response of Astronotus ocellatus, Aquaculture

International, Issue 5, pp 1239-1248.

55

37. Hồ Sơn Lâm, Phan Thị Ngọc, 2017, Tổng quan về việc sử dụng

astaxanthin trong nuôi trồng thủy sản, An Giang University Journal of

Science, Vol. 15 (3), 21 – 30.

38. Palozza, P., Torelli, C., Boninsegna, A., Simone, R., Catalano, A.,

Mele, M. C., & Picci, N, 2009, Growth-inhibitory effects of the

astaxanthin-rich alga Haematococcus pluvialis in human colon cancer

cells, Cancer Letters, 283(1), 108–117.

39. Nagendraprabhu, P., & Sudhandiran, G., 2009, Astaxanthin inhibits

tumor invasion by decreasing extracellular matrix production and

induces apoptosis in experimental rat colon carcinogenesis by

modulating the expressions of ERK-2, NFkB and COX-2,

Investigational New Drugs, 29(2), 207–224.

40. Emanuela Camera, Arianna Mastrofrancesco, Claudia Fabbri, et al,

2009, Astaxanthin, canthaxanthin and beta-carotene differently affect

UVA-induced oxidative damage and expression of oxidative stress-

responsive enzymes, Exp Dermatol, 18(3):222-231.

41. Santocono, M., Zurria, M., Berrettini, M., Fedeli, D., & Falcioni, G.,

2007, Lutein, zeaxanthin and astaxanthin protect against DNA damage

in SK-N-SH human neuroblastoma cells induced by reactive nitrogen

species, Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology, 88(1),

1–10.

42. Rao AR, Sindhuja HN, Dharmesh SM, Sankar KU, Sarada R,

Ravishankar GA, 2013, Effective inhibition of skin cancer, tyrosinase,

and antioxidative properties by astaxanthin and astaxanthin esters from

the green alga Haematococcus pluvialis, J Agric Food Chem, 61(16):

3842–3851.

43. Kumi Tominaga, Nobuko Hongo, Mariko Karato, Eiji Yamashita,

2012, Cosmetic benefits of astaxanthin on humans subjects, Acta

Biochim Pol, 59 (1):43-47.

44. Ikeuchi, M., Koyama, T., Takahashi, J., & Yazawa, K, 2006, Effects of

Astaxanthin Supplementation on Exercise-Induced Fatigue in Mice,

Biological & Pharmaceutical Bulletin, 29(10), 2106–2110.

56

45. Baralic, I., Djordjevic, B., Dikic, N., Kotur-Stevuljevic, J., Spasic, S.,

Jelic-Ivanovic, Z., Pejic, S., 2013, Effect of Astaxanthin Supplementation

on Paraoxonase 1 Activities and Oxidative Stress Status in Young Soccer

Players, Phytotherapy Research, 27(10):1536-42.

46. Palozza P, Torelli C, Boninsegna A, Simone R, Catalano A, Mele AC,

Picci N, 2009, Growth-inhibitory effects of the astaxanthin-rich alga

Haematococcus pluvialis in human colon cancer cells, Cancer lett

283(1): 108- 117.

47. Gross, G. J., & Lockwood, S. F, 2004, Cardioprotection and myocardial

salvage by a disodium disuccinate astaxanthin derivative (Cardax™),

Life Sciences, 75(2), 215–224.

48. Shi J, Kantoff PW, Wooster R, Farokhzad OC, 2017, Cancer

nanomedicine: Progress, challenges and opportunities, Nature Reviews

Cancer, 17:20–37.

49. Nune SK, Gunda P, Thallapally PK, et al, 2009, Nanoparticles for

biomedical imaging, Expert Opinion in Drug Delivery, 6:1175–1194.

50. Leuschner C, Kumar C, 2005, Nanofabrication towards biomedical

applications : Techniques, tools, applications, and impact, In:

Nanoparticles for Cancer Drug Delivery, pp 289–326.

51. Bao G, Mitragotri S, Tong S, 2013, Multifunctional Nanoparticles for

Drug Delivery and Molecular Imaging, Annual Review of biomedical

engineering, 15:253–82.

52. Moghtaderi F., Abargouei A.S, 2018, Nanotechnology in food

industries: applications and safety, Journal of Environmental Health

and Sustainable Developmen, 3(3):551–553.

53. Shin G.H., Kim J.T., Park H.J, 2015, Recent developments in

nanoformulations of lipophilic functional foods, Trends in Food Science

& Technology, 46(1):144–157.

54. He X., Hwang H.M, 2016, Nanotechnology in food science:

functionality, applicability, and safety assessment, Journal of Food and

Drug Analysis, 24(4): 671–681.

57

55. Clements D .J.M., Xiao H, 2017, Is nano safe in foods? Establishing the

factors impacting the gastrointestinal fate and toxicity of organic and

inorganic food-grade nanoparticles, NPJ Science of Food, 1(1):1–13.

56. Pathakoti K., Manubolu M., Hwang H.M, 2017, Nanostructures:

current uses and future applications in food science, Journal of Food

and Drug Analysis, 25(2):245–253.

57. Pradhan N., Singh S., Ojha N., Shrivastava A., Barla A., Rai V., Bose S,

2015, Facets of nanotechnology as seen in food processing, packaging,

and preservation industry, BioMed Research International, 2015:1–17.

58. Ahn D, Lee J, Park S, et al, 2014, Doxorubicin-Loaded Alginate ‑ g ‑

Poly (N ‑isopropylacrylamide) Micelles for Cancer Imaging and

Therapy, ACS Applied Materials & Interfaces, 6:22069–77.

59. Ke JH, Lin JJ, Carey JR, et al, 2010, A specific tumor-targeting

magnetofluorescent nanoprobe for dual-modality molecular imaging,

Biomaterials, 31:1707–1715.

60. Sun M, Sun B, Liu Y, et al, 2016, Dual-Color Fluorescence Imaging of

Magnetic Nanoparticles in Live Cancer Cells Using Conjugated

Polymer Probes, Scientific Reports, 6:22368.

61. Charitidis, C. A., Georgiou, P., Koklioti, M. A., Trompeta, A.-F., &

Markakis, V, 2014, Manufacturing nanomaterials: from research to

industry, Manufacturing Review, 1, 11.

62. Rane, A. V., Kanny, K., Abitha, V. K., & Thomas, S., 2018, Methods

for Synthesis of Nanoparticles and Fabrication of Nanocomposites.

Synthesis of Inorganic Nanomaterials, 121–139.

63. Majid, A., & Bibi, M, 2017, Wet Chemical Synthesis Methods, Topics

in Mining, Metallurgy and Materials Engineering, 43–101.

64. Sudipta Seal, 2008, Functional Nanostructures: Processing,

Characterization, and Applications, Spinger.

65. Pinto Reis, C., Neufeld, R. J., Ribeiro,, A. J., & Veiga, F., 2006,

Nanoencapsulation I. Methods for preparation of drug-loaded polymeric

nanoparticles, Nanomedicine: Nanotechnology, Biology and Medicine,

2(1), 8–21.

58

66. Patra, J. K., Das, G., Fraceto, L. F., Campos, E. V. R., Rodriguez-

Torres, M. del P., Acosta-Torres, L. S., Shin, H.-S, 2018, Nano based

drug delivery systems: recent developments and future prospects,

Journal of Nanobiotechnology, 16(1), 71.

67. Meor Mohd Affandi MMR, Julianto T, Majeed ABA, 2011,

Development and stability evaluation of astaxanthin nanoemulsion,

Asian Journal of Pharmaceutical and Clinical Research, 4(1): 143–148.

68. Harada F, Morikawa T, Lennikov A, Mukwaya A, et al., Kitaichi N,

2017, Protective Effects of Oral Astaxanthin Nanopowder against

Ultraviolet-Induced Photokeratitis in Mice, Oxidative medicine and

cellular longevity, 2017(7):1-13.

69. Chengzhen Liu, Shuaizhong Zhang, David Julian McClements,

Dongfeng Wang, and Ying Xu, 2019, Design of Astaxanthin-Loaded

Core–Shell Nanoparticles Consisting of Chitosan Oligosaccharides and

Poly(lactic-co-glycolic acid): Enhancement of Water Solubility,

Stability, and Bioavailability, J. Agric. Food Chem, 67, 18, 5113–5121.

70. Guan, L., Liu, J., Yu, H., Wu, G., Liu, B., Tian, H., Liang, X, 2019,

Water-dispersible astaxanthin-rich nanopowder：Preparation, oral

safety andantioxidant activity in vivo, Food & Function, Issue 3.

71. Sun, R., Xia, N., & Xia, Q, 2019, Non-aqueous nanoemulsions as a

new strategy for topical application of astaxanthin, Journal of

Dispersion Science and Technology, 1–12.

72. Oh, H., Lee, J. S., Sung, D., Lim, J.-M., & Choi, W. I., 2020, Potential

Antioxidant and Wound Healing Effect of Nano-Liposol with High

Loading Amount of Astaxanthin, International Journal of

Nanomedicine, Volume 15, 9231–9240.

73. Ho Thi Oanh, Nhung Hac Thi, Thanh Nhan Nguyen, Tuyet Anh Dang

Thi, Tuyen Van Nguyen, and Mai Ha Hoang, 2021, Co-Encapsulation

of Lycopene and Resveratrol in Polymeric Nanoparticles: Morphology

and Lycopene Stability, Journal of Nanoscience and Nanotechnology,

1-9.

59

74. D.B Williams, C.B Carter, 2006, “Transmission Electron Microscopy: A

Textbook for Materials Science”, Springer 2nd ed, e-ISBN 987-0-387-

76501-3.

75. E.H.M. Sakho, E. Allahyari, O.S. Oluwafemi, S. Thomas, and N.

Kalarikkal, 2017, Dynamic Light Scattering (DLS), Thermal and

rheological measurement techniqus for nanometerials characterization,

Elsevier, Europe, 37-49.

76. Abramovič, H., Grobin, B., Poklar Ulrih, N., & Cigić, B, 2018,

Relevance and Standardization of In Vitro Antioxidant Assays: ABTS,

DPPH, and Folin–Ciocalteu, Journal of Chemistry, 2018, 1–9.

77. Hong J, Lu H, Meng X, Ryu JH, Hara Y, Yang CS, 2002, Stability,

cellular uptake, biotransformation, and efflux of tea polyphenol (-)-

epigallocatechin-3-gallate in HT-29 human colon adenocarcinoma cells,

Cancer Res, 15;62(24):7241-6. PMID: 12499265.

78. R. Xiao, X. Li, E. Leonard, et al, 2019, Investigation on the effects of

cultivation conditions, fed-batch operation, and enzymatic hydrolysate

of corn stover on the astaxanthin production by Thraustochytrium

striatum, Algal Research, 39 101475.

79. Crowley et al., Crowley LC, Marfell BJ, Christensen ME, Waterhouse NJ,

2016, Measuring Cell Death by Trypan Blue Uptake and Light

Microscopy, Cold Spring Harb Protoc, 2016 Jul 1;2016(7).

80. Wang Q, Zhao Y, Guan L, Zhang Y, Dang Q, Dong P, Li J, Liang X,

2017, Preparation of astaxanthin-loaded DNA/chitosan nanoparticles for

improved cellular uptake and antioxidation capability, Food Chem,

227:9-15.

81. Hoang TMH, Nguyen CH, Le TT, Dang DH, 2017, Squalene promotes

cholesterol homeostasis in macrophage and hepatocyte cells via

activation of liver X receptor (LXR) α and β, Biotechnol Lett,

39(8):1101-1107.

82. Israeli-Lev, G., & Livney, Y. D, 2014, Self-assembly of hydrophobin

and its co-assembly with hydrophobic nutraceuticals in aqueous

60

solutions: Towards application as delivery systems, Food

Hydrocolloids, 35, 28–35.

83. Anarjan, N., Tan, C., & Nehdi, I, 2012, Colloidal astaxanthin:

Preparation, characterisation and bioavailability evaluation, Elsevier,

135, 1303–1309.

84. Chen, F. P., Li, B. S., & Tang, C. H, 2015, Nanocomplexation between

curcumin and soy protein isolate: Influence on curcumin

stability/bioaccessibility and in vitro protein digestibility, Journal of

Agricultural and Food Chemistry, 63(13), 3559–3569.

85. Montero, P., Calvo, M. M., Gómez-Guillén, M. C., & Gómez-Estaca, J.,

2016, Microcapsules containing astaxanthin from shrimp waste as

potential food coloring and functional ingredient: Characterization,

stability, and bioaccessibility, Lebensmittel-Wissenschaft und -

Technologie- Food Science and Technology, 70, 229–236.

86. Edelman, R., Engelberg, S., Fahoum, L., Meyron-Holtz, E. G., &

Livney, Y. D, 2019, Potato protein- based carriers for enhancing

bioavailability of astaxanthin, Food Hydrocolloids, Volume 96, 72-80.

87. Liguori I, Russo G, Curcio F, Bulli G, Aran L, Della-Morte D, Gargiulo

G, Testa G, Cacciatore F, Bonaduce D, Abete P, 2018, Oxidative stress,

aging, and diseases, Clin Interv Aging, 26;13:757-772.

88. Oh S, Kim YJ, Lee EK, Park SW, Yu HG, 2020, Antioxidative Effects

of Ascorbic Acid and Astaxanthin on ARPE-19 Cells in an Oxidative

Stress Model, Antioxidants, 9: 833.

89. Y. P., Liu, S. Y., Sun, H., Wu, X. M., Li, J. J., & Zhu, L, 2010,

Neuroprotective effect of astaxanthin on H2O2-induced neurotoxicity in

vitro and on focal cerebral ischemia in vivo, Brain Research, 1360, 40-48.

90. Jia Y, Kim JY, Jun HJ, Kim SJ, Lee JH, Hoang MH, Hwang KY, Um

SJ, Chang HI, Lee SJ, 2012, The natural carotenoid astaxanthin, a

PPAR-α agonist and PPAR-γ antagonist, reduces hepatic lipid

accumulation by rewiring the transcriptome in lipid-loaded hepatocytes,

Mol Nutr Food Res, 56(6):878-88.

61

91. Hussein, G., Nakagawa, T., Goto, H., Shimada, Y., et al., 2007,

Astaxanthin ameliorates features of metabolic syndrome in

SHR/NDmcr-cp, Life Sci, 80, 522–529.

92. Yang et al., 2011; Yang, Y., Seo, J. M., Nguyen, A., Pham, T. X., et al.,

2011, Astaxanthin-rich extract from the green alga Haematococcus

pluvialis lowers plasma lipid concentrations and enhances antioxidant

defense in apolipoprotein E knockout mice, J. Nutr, 141, 1611–1617.

93. Yazawa et al., Yazawa, K., Ikeuchi, M., Koyama, T., Takahashi, J.,

2007, Effects of astaxanthin in obese mice fed a high-fat diet, Biosci.

Biotechnol, Biochem, 71, 893–899.

94. Yoshida, H., Yanai, H., Ito, K., Tomono, Y., et al., 2010,

Administration of natural astaxanthin increases serum HDLcholesterol

and adiponectin in subjects with mild hyperlipitdemia, Atherosclerosis,

209, 520–523.

95. Gelderblom H, Verweij J, Nooter K, Sparreboom A, 2001, Cremophor

EL: the drawbacks and advantages of vehicle selection for drug

formulation, Eur J Cancer, 37(13):1590-8.

96. Gorain B, Choudhury H, Kundu A, Sarkar L, Karmakar S, Jaisankar P,

Pal TK, 2014, Nanoemulsion strategy for olmesartan medoxomil

improves oral absorption and extended antihypertensive activity in

hypertensive rats, Colloids Surf B Biointerfaces, 115: 286-94.

97. Feng J, Wang Z, Zhang J, Wang Z, Liu F, 2009, Study on food-grade

vitamin E microemulsions based on nonionic emulsifiers, Colloids and

Surfaces A: Physicochemical and Engineering Aspects, 339: 1-6.

62

PHỤ LỤC

Phụ lục 1. Ảnh TEM của các mẫu nano astaxanthin chế tạo được

Ảnh TEM của mẫu A1


63



64

Phụ lục 2. Phiếu kết quả phân tích hàm lượng astaxanthin bằng HPLC

NGHIÊN CỨU ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA NANO ...

Documents

Transcript of NGHIÊN CỨU ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA NANO ...