Integrated bioprocessing inSaccharomyces cerevisiae using green fluorescent protein as a fusion...

12
Integrated Bioprocessing in Saccharomyces cerevisiae Using Green Fluorescent Protein as a Fusion Partner Jincai Li, 1,4 Haixin Xu, 2 Wayne K. Herber, 6 William E. Bentley, 3,5 Govind Rao 1,4 1 Department of Chemical and Biochemical Engineering, University of Maryland, Baltimore County, Maryland 21250; telephone: (410) 455-3415; fax: (410) 455-1049; e-mail: [email protected] 2 Molecular and Cellular Biology Program, University of Maryland, Baltimore County, Maryland 21250 3 Department of Chemical Engineering, University of Maryland, College Park, Maryland 20742 4 Medical Biotechnology Center, University of Maryland Biotechnology Institute, Baltimore, Maryland 21201 5 Center for Agricultural Biotechnology, University of Maryland Biotechnology Institute, Baltimore, Maryland 21201 6 Department of Biologics Fermentation Development, Merck Research Laboratories, West Point, Pennsylvania 19486 Received 16 August 2001; accepted 7 March 2002 DOI:10.1002/bit.10331 Abstract: In this study, we examine the use of green ¯uorescent protein (GFP) for monitoring a hexokinase (HXK)±GFP fusion protein in Saccharomyces cerevisiae for various events including expression, degradation, puri®cation, and localization. The fusion, HXK-EK-GFP- 6 ´ His, was constructed where the histidine tag (6 ´ His) would allow for convenient af®nity puri®cation, and the enterokinase (EK) cleavage site would be used for sep- aration of HXK from GFP after af®nity puri®cation. Our results showed that both HXK and GFP remained active in the fusion and, more importantly, that there was a linear correlation between HXK activity and GFP ¯uo- rescence. Enterokinase cleavage studies revealed that both GFP ¯uorescence intensity and HXK activity re- mained unchanged after separation of the fusion pro- teins, which indicated that fusion of GFP did not cause structural alteration of HXK and thus did not affect the enzymatic activity of HXK. We also found that degrada- tion of the fusion protein occurred, and that degradation was limited to HXK with GFP remaining intact in the fusion. Confocal microscopy studies showed that while GFP was distributed evenly in the yeast cytosol, HXK- GFP fusion followed the correct localization of HXK, which resulted in a di-localization of both cytosol and the nucleus. GFP proved to be a useful fusion partner that may lead to the possibility of integrating the biopro- cesses by quantitatively following the entire process vi- sually. ã 2002 Wiley Periodicals, Inc. Biotechnol Bioeng 79: 682±693, 2002. Keywords: green ¯uorescent protein; Saccharomyces cerevisiae; fusion protein; protein localization; fusion effect; integrated bioprocessing INTRODUCTION Green ¯uorescent protein (GFP) has seen tremendous applications since its cloning in 1992 (Prasher et al., 1992). Its main characteristics include its stability, au- to¯uorescence, and quanti®able signal, to name a few. In recent years, GFPÕs application has expanded from areas of cell and developmental biology to new areas such as drug discovery and high-throughput screening (Albano et al., 2001; Deo and Daunert, 2001; review by Kain, 1999). On the other hand, GFPÕs application in biopro- cess research and development has also been realized. Quantitative correlation between GFPÕs ¯uorescence intensity and its actual protein amount has been dem- onstrated in Escherichia coli (Albano et al., 1998; DeLisa et al., 1999), yeast (Li et al., 2000), insect larvae (Cha et al., 1997), and mammalian cell culture systems (Subramanian and Srienc, 1996). GFP has also been extensively used as a fusion tag to allow researchers to visualize intracellular activities, e.g., protein tracking and localization (Chal®e and Kain, 1998; review by Tsien, 1998). Detailed studies focusing on the properties of GFP fusion revealed some interesting results. Wu et al. (2000) and Cha et al. (2000) found a linear correlation between GFPÕs ¯uorescence intensity and its fusion partnersÕ protein amount/activity in E. coli cultures, which meant that GFPÕs ¯uorescence intensity could be used to quantitatively predict its fusion partnerÕs expression level. They also found that fusion of GFP aected its partnerÕs solubility. It increased its partnerÕs solubility in one case and reduced another fusion partnerÕs solubility. Correspondence to: Govind Rao Contract grant sponsor: Merck & Co., Inc. ã 2002 Wiley Periodicals, Inc.

Transcript of Integrated bioprocessing inSaccharomyces cerevisiae using green fluorescent protein as a fusion...

���������� ���� ����� ������������ ������ ���� ������������ ��� ������ �� � ����� �������

�� � ����� ���� ���� ����� ! ���"���# ����$ %! �������&�'

��(�� )�����

���������� � � ������ �� ��� ������ ��������� ��������� ��������� �������� ����� ������� ������ ����� � !"��# "��$%"�����& !"��# "��$��"'� �$���� ���(��)�*������������ �� �������� ����� +������ ��������� � ���������������� ����� ������� �����%��������� � � ������ ��������� ��������� � �������� ������ +��,�������� ��-"�"������� ����� ��� ������ ��������� � ������� ����� ���.�������� ��������� ������� ����������� �� /����������� ����� ���� ��������� � ������������ ��� .�������� ��������� ������� �����0��������� � ������� 1�������� ���������� ����, 2������ 3�)�������� 4��� +��� +�������� �'"50

2������� �0 /����� ����� �������� - ���� ����

�6. ��*����7)��*��%%�

*"���� �� �� ���� ���� � ����� �� �� �� �� ����� �� �� ���� �� ����� ��� ���������� � � ������� ��� �!��� ������ ���� �� �� 8��� ������� ������������� "������ " ��� ���#���� ��� ������ �������������$������� �� #���#�%�����& '� ������� �� () (���(* � ���� ��� ��������� �� � �� ������� ��� �* � �������# �##�� ��� ���" �� �� ��$��� ����$������� �� �� �� ������� �) � �# �"�� ��� ���# + �� ��� � �(������� �� �� ���� ��� ��� � ��$��� ����$������& ,��� ��#�� ���� ���� +��� �� �� ��� � ���� ����" �� �� ������ ��� ��� ���������#� ���� �� � ��� �#�� �� ���� #����� + �� � �� ����"�� �� ��� ���(� �� �� & )�� ������� �# �"�� ���� � � " �# ����+��� ��� ���� �� �� ��� ���� �� �� ����"�� � (���� ������� ��� � � �������� �� �� ������ ���(� ���� ����� ������ ���� ������ �� ��� � ��� ���� ���������# �#� ������ �� �� �� ���� � ��� ��� �� �� �%����� ����"�� �� �� & - �#�� ���� ���� ����(���� �� �� ������ ���� �� ������ � �� ���� ����������� #���� �� �� ���� ��� � ������� ������ �� �� ������& .������# ��������� ���� � ���� ���� ���# ��� ��� �����+�� " �# �� �� ��� �����#� �� (��� ������ ��##�� �� ���� �� #���#�%����� �� �� ������ � ��#� �� � �(#���#�%����� �� +��� �����# �� �� ���# ��& ��� ���" �� + � �� ��# ������ ����� � ������ # � �� �� �����+�#�� �� ��� ������� �� +�����(� �� � + /���������" # ��##����� �� ���� ���� �� "�(���##& � 0110 -�# � ������#�� ���& ����� � ����+,- *20!*34� 0110& ��.����- �� � ���� �� �� ���� ��5 8��� �����������������5 ������ ���� ��5 ���� �� #���#�%�����5 ������ �� ��5 ��� ���� +������ �����

�/0)12�30�1/

����� �������� ������ ���� ��� ���� ������������������� ���� �� ������ �� ���� ������� � ���������� �� ���� ���������� ������ �� �������� �������������� ��� ����!���� ������� � ���� � "�#� ������ ������ ����� ��������� ��� �$������ "��� ������" ��� ��� ��%��������� ������� � ��# ����� ��� ������ ����%��� ��� ������������� �������� &������ ���� �''�( )�� ��� )������ �''�( ��%��# �� *���������� +� �� ���� ����� ����� ��������� �� ���������� ������� ��� ��%������� ��� ���� ���� �����,���-������%� ��������� ��#��� ����� ���������������� ��� �� ���� ������ ����� ��� ���� ����������� �� ����������� �� &����� � ���� ���.( )�/���� ���� ������ ���� /� � ���� �'''�� ���� ���%�� 0��� ���� ���1�� ��� ��������� ��� ����� ������ 2���������� ��� 2����� ���3�� ��� ��� ���� �����$����%��� ���� �� � "����� �� � ����# ���������� �%������,� ����������� ��%����� ����� ������ ��45������ �����,���� 0���!� ��� *���� ���.( ��%��# ��6����� ���.��)������ ������ "������ �� �� ��������� �" ���

"����� ��%����� ���� ��������� ������� 7� � ��� �'''���� 0�� � ��� �'''� "���� � ������ ��������� ��#�������� ��������� ������� ��� �� "����� �������������� �����8��%�� �� �� �� ������� #��� ������ ����� ��������� ������� ���� �� ���� � ������%��� ����� �� "����� �������� �$����������%��� 6��� ���� "���� �� "����� �" ��� �9��� ���������� ���������� � �������� �� �������� ��������� ����� ��� ��� ������ ������ "����� �������� ����������

����� ������ �� ��%��� :��

0���� ���� �������; <��5 = 0��� ���

� 0110 -�# � ������#�� ���&

�� �� ������� ����� #� ���������� �� ��� �" ����� � ����!���� ������� �" �� ������������ ����������� ���� ������� /� � ���� �'''�� �� �� ������#��5� #� "����� �$����� ����� ���� �� � "����� �������� �� �� ���������� ������ 6�� ����� ������ ����� �"��� #�� ��� �� �� ���� ���%� ��$�5����� ��� >$5�������� ������ �� �� >?*� ���� ������� � ������.@( 2�����5 � ���� ��.3�� >$5� ������������� ������� � �������3��������� �� �� ������� ���#��� ���� ���� ���� �����!�� �� �������� "�� �� #����5��#������� ���������� ��������� A����� ��.'( �����������( *���5��� � ���� ������ �� ��� ����� #� ������� �BC��>?*�A*�����3 � >�� �����"������ #�����BC� �� �� ������ ������ �" �� ������� ������ ���������� 0���� � ���� ���3( /����$ � ���� ������ A* ���� �����5����� ���%��� ��� ��� 3 � >�� �� �� ��������� ��� 6�� ��D��%� �" ��� #��5 �� � ���� �� "������������� ��������� �� �� ����������� ����� �� �9� �""����� �� �� ��������� �" >?* ��� ���� �����������#��� ����� ��������� ������� ��� >?*�� ��,����� ��%��� ������� �" �� "����� ������� ��� ������,���� �" �� "����� ������� 7� ���� ��� �������������� �� ��# "����� #�� ��� ���� ���� ������������������� 6��� �� �������� ������ �������� ������������� �� ������ �� �� ��%���� ������ ���������"��� ������ � ����!����� ��� ���%���� �� ��#��"������������ �" ������%��� "����#��� �� ����� ������%��������

4*0%)�*�5 */2 4%0�125

6���� 5����� ��� ����$��

E��� ����� FF@ <&6����� �����F���� ���� ���F�G����@�F ��������� �����G'�� #�� 5����� ������ �� B�&�)� 2��%� C��%����� �" 0���"������ ��%����� 6�� �������� � ��� ������ ��� ��� �� ���� � ��� ������� �� ��������� ������ B��� ��� )� 2��%�� ���@�� 6�� ��������� %��� �EA2���8HG�>���6+�+ ���� �� #���������� "��� ��%������ 0�������� 0&� �� ��� �" ���EA2��� 6+�+ 6& 0������ *�� 6�� %��� ��� ���&/� ������� #��� ������ ����� ���� �$���������� ���� ��� � C:&F ���� "�� ������ �������� 6�� HG������ ��� �� ������������ 3 � >��� ������ �� ��%��� #��� �� ����,�� �� ��� ����� ����� ��� #��� ��������� �� �� ���� ������� "���� �� �� ������������ 6�� �I&)���� ������� �� �� �� �� %��� 0������ ���� �� �� ���������� ������ �� ������������� 6�� ��� ���� �� ����� ����� �" �� ���������� ��� ������� ���� �� �������� �� ��������" ����������

3������ � 2���� ��� 3�����

& #����� ������ ������ #�� �������� � ������� �BC��>?*�A*�����3 � >�� ������� "�����

���� ��� 6�� ������ ������ �� ���� �" �BC� #������������ ��� �0: ������� �� #� ����� �� ��!�� ���� �� ���� �" ��$�5����� I� ������ #�� ��

������ �� � 2������ �" �EA2���BC�;>?*;��� ���������

�� �� !�� ���� �� >?* I ���� #�� �0: �����!�� #�� �� ���5���

A* ��� ��� ��� �" �� �BC� ������� 6�� �0: ����� #�� ���

������� ��� �� �I&)���� ������� � ����� �� �I&)�>?*;����

�� �� ����� ���� �0: �����!���� �������� �� ������ �B�

C�;>?*;A*;���; >��� 3 ���� #�� �� ���5��� JJ&KK �%�������� 6��

���� #�� ��� ��$�� #�� �� �������,�� �EA2����6+�+ %��� #��

�� ���5��� JJ6KK �%�������� 6�� ������� ������� �� ����� �EA2��

�BC�;>?*;���� � 2������ �" �� ������ ���� �� �� �����

&�� ������ #��� �� �� ���� ����� ������� ��� ����� ����� �"

�� �&/� �������� �BC�� ������ �� ���� �" �� ��������� ����( A*�

�����5����� ���%��� ���( >���3 �� 3 � >���� 3 � ������������ ���

6� )' 76&� 89) ,� �:)); �68,:)9.);' �:,')�; 9'8<= �:,')�; �; )��:)99�,; 7;< 6,.76�>7'�,; *24

��L�F ����� ���� �" �BC� ������ � �� B����������� �� A* ���%��� ��� � �� 0��������� #�� "���� ��� G� ��� �" �� ��� ���� �� �� �I&)���� ���������������� �� ������� �I&)�>?*;���� �� ������ �0:������� �BC� F��3���>?*� G� ��� >?*�A*� F� 6������ #��� ���� � �����"� �� >?*� ���� "��� ��������I:�F.� #��� #�� ���%��� �� )� I����� 2��"���C��%������� 6�� �0: ����� #�� ���5��� ���� ����#�� ������� #�� ���� I:/� ��� ��� ������ #���� ������������ �I&)���� �������� 6�� "��������� �� ������ ����� ���� ������� "���� ������ ������ ��� ���� � �� @� ���� ���� �� �� �������� ���+:�� �� �� ����� )> G� I:/� #�� ���� "�� �������� ����"�������� 6�� �������� ������� #�� ������I&)�>?*;������ �� ����� ���� �� ������� �I&)�>?*;��� #��

���� �� �0: ������� 6�� !�� �' ����� ���� �" ���BC� ������ ������ #��� ����� ������ �� �0: ������� � ����� � ������ �BC� ������ ������� <����#����� � 3 � >������� �� #�� ����� � �� 0�������� �">?*;��� "������ �� ������ �0: ������� �BC� �LG���G� ��� ���� >���3� F� 6���� �� #��� ���� � �����"� ��>?*���� ����� "��� ������� �I&)�>?*;���� 6���0: ����� ��� ������� "��������� �BC��>?*�A*�����3 � >�� "������ 6+�+ ������ ���� �� ���%������� #�� ���� � ���� �� �0: ����� ��� ��������� �EA2���8HG�>���6+�+� 6�� ������� #�������� #�� 6������������ �� � #�� �������� �������,��#�� ������ G� �������� 6� �%������� "�� 6+�+ ������ ���� �� ��� � ��� ������������ �%������ ����� � ��%���� 6�� �0: ����� ��� ������ ���$���������� &������ � �� F� ���� ��� � �� ���������������������%�� �" ��� ����������� 7��� ��$��� �� 6 �%�������� �� ������� �EA2���8HG�>���6+�+ ��� �� &�%������� �� �� �0: ����� ����# ��� � ����� �4������� �� �� ����� 6+� �'�� #�� ���� "�� �����������"�������� 6�� �������� ������� #�� ������EA2���BC�;>?*;����

0������ �" �������� �EA2������ �EA2��>?*;���� ��� �EA2���BC�;>?* #�� ���� ������ �� ������ 6+�+ ������ ������ ��� �������� �EA2������ �0: ������� ��� G� ��� ��� F� 6���� �� #������� � �����"� �� ��� ���� "��� �I&)���� ��������� 6�� �������� �0: ����� #�� ����!�� ������������ ��� ��� ��� ������� � �� ��������� �������EA2���8HG�>���6+�+ %���� 2��������� � ������EA2��>?*;���� ������� >?* G� ��� ��� F� #������� � �����"� �� >?*�A*���� ���� "��� ��������I&)�>?*;���� &�� � ����� �EA2���BC�;>?*�������� �BC��>?* G� ��� >?* F� #��� ���� � ������"� �� �BC�;>?* ���� "��� ������� �EA2���BC�;>?*;���� 6�� �0: ������ #��� ��� ���������� �� ������ �EA2���8HG�>���6+�+ %��� � ����������������� ���������&�� �� �������� ������� #��� ��5�� #�� ������

��� ��,��� �������� "�� ���� ��������� �" �� �������� ������ 6��� #��� ���� �� ����� ��� ��5�� ���5� ���� �� �� ������ ������ ������ �� ������������� E��� ����"������� #�� ���� ����� �� /�&����� ������� � �� � ��� ��.F�� C��� EBI �������� #�� ���� "�� ������ ��������

4��� 3�$������

6����������"��� ������#��� ���#� ��E�)���������� �� ���� �$��� �� ��� ������� ��� �� ������� �������� ��1��0�E�)������#�� ���� ���� �� ���������"�� ���� ����"�������� 6�� �����%� ���� ���� "�� ��������"������� #�� �����������%� EBI ������� ������� #8%� �� ��������� �� ������� '�31� ����������� ���� #���� ����� ����� ��� @' �� �������/��� �' �� �������� /��� �' �� �������� /��� 3' �� ���������� /��� �'' �� ������ /��� @' �� ������ /��� �' ����������� /��� 3' �� ������������� /��� 3' �� ��������� /��� @' �� �������� /��� ��� G' �� /��������/��� 6�� �����$� �������!��� ������ ���� �� �� 2)0

��� � ������ ������ "�� "����� �BC�;>?*;����M

������ ���� ������ ������ G�LF������� �����

���� �����

�BC� F�L3��L

>?* G�0&6��0 N ������ N 66� �0& ��& �60 &�6 �06 60& �6� &60 &&6 6&0 &&� &�&

�BC�;F�L3�� N ������ N ��� N �66 0&6 66& ��6 00& &&& &&& >?*�;@L�@�

.�

>?*LA* F� ���&�& N ������ N ��� N ������ N �&6 066 &60 �60 &60 �60 A* ����

N &�0 &00 �&6 �&6 &00 &&0 ��& 066 >?*�; ��� �@�

3F

�BC� �LG�� G� � N ������ N 0&0&&&&0&&& N ��� N &&� 660 �0& 6&0 600 060 66� 066 00&

66� �0& ��& �60 &�6 �06 60& �BC�;@LG��

3�

���L3 � >�� F� � N �������� N &6� �6� &6� �6� &6� &6� 3$ >�� ��� N 666 �6& �&� 060

&60 0&6 �00 ���; ��� ���

@.

��� G� � N 0&0 &&& &0& && N ��� N �06 &�0 &&& ��& �&& ���;@L�.� F'

��� F� �0� N ��� N 666 �6& �&� 060 &60 0&6 �00 &6� 6�6 &&6 ���;��� F'� F3

>?* G� � N 0&0 &&& &0& && N ��� N �66 0&6 66& ��6 00& &&& >?*�;@L��� FF

�BC�L>?*� G� � N 0&0 &&& &0& && N ��� N &&� 660 �0& 6&0 600 �BC�;@L�.� F'

>?*� F� �0� N ��� NN &�0 &00 �&6 �&6 &00 &&0 ��& 066 >?*�;��� �@� F'

MB��; :������� ���� ��� �����,�� ����� �06&�0( ���>��� �0�0�0( ����� &�&606�� 6��������� ��� ���� ��� ��� ���� ��� ��

����"�� ���� 6�� G� ������������ ���� ��� ���������� ��� ��%� ���� �������� ��"��� /� � ���� �'''��

*2? @�,').�;,6,�= 7;< @�,);��;)):�;�� A,6& B3� ;,& *� 9)�')C@): 01� 0110

������� #��� ������ #8%� '�31� ���� ������� ����#���� ����� ����� '�G� ������� ����� ��� �� �������� 0������� ���� ��5 ������ ��� ��� �� 2)0 ������� ���%���� ������ ������� ������� 2�0 ������ ��������� � 2)0 ������ �$�� �� � ������ �� �������� ������ �" ������� E�)� 2)0� ��� 2�0 �����#��� ��9���� � �> G�' #�� ���� ��9�� � !��� ����������� �" '�'�� '�'G� ��� '�'G � ������%����

3��� ���.�7

6� ��� ������ ���� ������� #��� ��5�� "��� �������� ���#� �� G' �/ ����"��� ���� 0������ ����0������� BE� �������� G �/ �" ������ 6�� ������#��� ���#� "�� ���� �' � ��� ���%�� �� ���� �������6�� ��� "���������� #��� ������ �� �� �G' �/A��������� ���5� ���5� #�� G' �/ �" ������ �� G''��/ A��������� ���5� ���5� #�� �'' �/ �" ������ "����������� �������� �������� � ������ +)3'' �" '�'G#�� ���� ������� 6�� ���� #��� ���#� � F'�0� �G'��� �� � ������ ���5�� /������� ���������� ����<������ ���5� �/�� ��� �������� ������� ���������� �" ��G �8/ !���� #�� ���� "�� ����� FF@� #��� ������ �������,� ��������

*����� �� 4��7���

+���� ������ +)3''�� 7����� ��� ������ ��� 2)2��&�A �������� ��������� #��� �������� ���%������ /� � ���� �'''�� ��� 7����� ��� ������ �" >$5�� �������������� #�� ������ #�� � �;.�''' ������� �"��������� ������$�5����� ����� :�5���� ���� ��������%����� �&� ��� � �;F'�''' ������� �" ��� ��������� ��� ��D����� � ��5����� ����������� B��%���&�A �������� #�� ���"����� ������� � 2)2��&�A��$�� �� �� ������� #��� �� ������ ��� �� ��������9�� ��� �� ����� 2)2� C���� ���� ��������� ��������� #��� �� �������� ��� ��� ��������� ������������ ������ �$����� #�� E��A: ������#�� ���� �������� ���%������ /� � ���� �'''� �$�� ��F'' �/ �" E��A: #�� ���� "�� ������ "��� ��� ���������� �" ������� ������� ��������� �<2� � � ��A)6& � � �� ��� ������� 1�G ��8�/� #��� ������ �� �$����� �������� #�� �<2� ����� #��; ����� �� ��������� �" �$����� ��� ����� �"�� �� F'������������� 6� ������� ��������� �������� �'' �/ �"������� #�� ����� � �3�#��� ����� ��� ��� �������� 2�A06:&��$ �A<�B� �������� ���������������� <������� )�%���� 2����%���� 0&��

������ ���8 ����

6�� 3 � >�� �� � �� 0�������� �" �� "����� ������#�� �������� "�� �4��� ����!���� �" �� "������������ 6&/+B <��� &4��� :���� 0����� /������������ ���� ���� &��� 0&� #�� ����� ��� �������� "�� ���������� ��� ����!���� #�� "�����#��� 6� ������� "�� �� ����!����� ������� #���

�$���� #�� E��A: ������ "��� ��� ������ �" �G'��/ ������� 6�� �������� ������ ������� #�� ��������� � � �;� ���� #�� �$�����8#��� ��9�� G'� ������ ��������� F'' � B�0�� �> 1�'� ���������� "�� �� ����!���� ���������( @ �/ �"6&/+B ����� #�� ����� 6�� ������ ��9�� ������ G'� ������ ��������� F'' � B�0�� ��� �G' � �����,��� � �> 1�'� 6�� ����!�� ������ #�� �����������8������� #�� <����� E<��' ����"����� !��� ��%��� <�������� 0��� I��"���� <&� � �!��� ��������� O� ��8�/�

%�����9���� 3���(���

6� ������� �� "����� ������ ��� >?* ��� ���� �'�� �" ����!�� "����� ������ #�� ���� �� � ��� %������" F' �/� 6�� ������� #�� ��� ������� � @�0 "�� �3�( '�'�� '��� '�@� ��� '�1 C �" �����5����� ��,���A*<�$ ��%������� 0������� 0&� #��� ���� � ��������� �� ���� ��� ������� 6�� ������ ��9�� #������!�� ��� ������� ���� � � 0�0���

����9���� * �(�� *����

>�$�5����� ��,���� ��%�� ������ #��� ���"������������ � �� ������ ���%���� �� 2���� 2� /�����<+� #�� ����!������ �� ��������� "�� �� ���������11�G � ������ #�� �������� �� G' � �������������� ��9�� #�� �> 1�3 ��� ����� � @�0( �G � G��&6� 2����� &��F.F� ������� ��� 1' � G�� ��B&)� 2����� B�'G'G� ������� #��� �������� ���������� �� )� #��� ��� ����� � ��'�0� �������3��������� ������������� ��3��)>� 2���� ��@�F@�#�� �������� � �� ��������� �" ��G ����8�/ ��'�'� < 6����>0� ��9��� �> 1�G� ��� #�� ���� ����� ���'�0� <�������� ������� <�0��� 2���� <�'�G'�#�� �������� � �'' � �� )� #��� ��� ����� � �������������� 6�� ������� ��$�5����� ������� 2�����>�G'''� #�� �������� � � ����8�/ ���������#�� )� #��� ��� ����� � L�'�0� 6�� ������� #�������� #��� ����� � ������� ��������� 7��� �����"�� ������������ &6� ��� ��B&)� #��� ������ ��� ������� !��� ��� ��� �� ������� #��� ��$��������� ��� �$������ � ��5� �' ������������ �' �/�" ������� '�G �/ �" &6�� � �/ �" ��B&)�� ��� � �/�" <�0�� #��� ��$�� ��� ������� � �G�0� P�� ������ ����������� �' �/ �" ��3��)> #�� ����� � ������G �/ �" ������ ��$ �� #��� �� �G �/ �" ������ #������������ �������� 2������ ��$�5����� ������� #������ "�� ��������� ��������� ��%�� ��� ��� ������������� #��� ���"������

3��:� �� ����� 5 ����� 4 ��� ���

0��"��� ����� ������� �������� #�� ���"����� #��� Q���� ��"��� �������� /2< G�' +���5������������� � ������ #�� � �''�� B&��@� ��� ��D��%�

6� )' 76&� 89) ,� �:)); �68,:)9.);' �:,')�; 9'8<= �:,')�; �; )��:)99�,; 7;< 6,.76�>7'�,; *2D

��� ��9������� ����"����� ����� )�0� ����� ������������ ������ #��� ������� �� ����� ������������ @.. �� ����� ������ ������ � ������� !��� /�G�'�

)%5��05 */2 2�53�55�1/

3������ � 2����

���� ������ #��� ���� �� ��� ���� ���� ���� 6�������� �" �� ��$�5��������� "����� ������ #�����%�� �� �� ������ "�� ������ ���������� &� ������5����� A*� ���%��� ��� #�� ���������� ��#��� ��>?*� ���� ��� �� ��� ����� & 3 � �������� �� #������ ���������� � �� 0�������� ��� �" �� "������6�� �������� �� #�� �������� � "������ �4��� �����!���� �" �� "����� ������� ��� �� A* ���%��� ���#�� �������� � ������� ��� ���%�� �� >$5� ��������� �� ��� ������ �"�� �4��� ����!����� 6��� #�����#� �� ��%���� ����� ���%������ �� � >���3�����A*����������������� +�>� "����� �$������� �� �� �� 7� � ���� �'''�� 6�� ��������� �BC�� ������ ������#�� �������� � ����� ������� �" �� "����� ��������� �� !�� ��� �" �� ������ ������� #��� #��

�������� �" �� >?*� ���� ��� ������� �I&)������������� �" �����%� ������� #�� ������ "������� ���� ������� �" ���� �� �� ����"������� ����� #������������ ������� ��%��� ����� ������� �I&)������ �I&)�>?*;��� ����� ����� #��� �$����� � ���������� CH ����� >�#�%��� ������� #�� �I&)�>?*;��� ����� #��5�� ��������� ��� ���� #���I&)����� ���������� ������ �$�������� ��%�� #����#�� #�� �� >?*;��� "����� ������� � D�� �������" ��� JJ������ ������ A$���������KK ����#�� ������������ ������� ��%��� ������� #�� >?*;��� "������ �� #�� >?*� ���� �� �� #���� ��������� �������� �" >?*� ���� #�� ������ ������ ����������� ������� ��� ��� ���� ����� �� #���� ����������#���� �� ��� ����� ��������� ������ �� "�����#���� �� �� �� �� ���� ���� ������� "�����

����� ������ %�������� ��� 5� �����

�EA2���BC�;>?*;��� ������� #�� ����"����� ������ FF@ ��� ���#� ����� ��9���� ����� � ��

#����� ���� �� ������� �" �� "����� ������� 7�"���� �� ���� #�� ������� ���� ��� G��� �" ����������� ����� � �� ����� ����� �� � �� ����������� ���� ��� �� ���#��� 6���� #�� ���� �������������� "�� ����� ����� �BC�;��� �� ������BC�;>?*� 6�� ��� ������� �" ���8����"����� ������%�� � �� ��4�� �� ���� ������� *��,� � ��������( /��55���� � ���� ���3( ����� � ���� ���.�� ����$������ *��,� � ��� ����� "���� �� ��� ������ ��������������� ���8����"������ #��� ������ � ��%����� �" �� �����������6���� �� ���#�� �� �$�������� ��%��� �" ��9����

������ ���#� ����� ��9���� ������ ����� #� "������ ����� ����� ��� � �����!�� ���� �� �$��������� ��%��� �" ��� ������� #�� ��� ������ E�)������ ��� �9��%�� 6�� ������� ������ EBI����������� ��%� ������� �$�������� �" �� �BC�;>?*���� "������ #���� ��� ��� ��� >?* �������%�� #��� �������� � ������ ��%���� 0����������" �$�������� ��%��� ����� ���� �BC�;>?*;���� ����BC�;>?* ���#�� ��������� ������ 6���� ���� C������ ���� ���#� ������� ����� 2)0 ������� �� ����$�������� ��%��� �������� �� ��������� �������� #����� ������ ���� ����"���� �� ��� ����" ������� ��� �BC�;>?*;��� "������ 2��������� >?* �$����������%��� �������� �� >?* ��%��� #�� ��� ������ ���� ��3�"���� �� �BC�;>?* ��� �� �BC�;>?*;��� "������ 6��� ������� �� "����� �" ��� � >?*������� �������� �" ��� ��� ��� >?*� � ������������ � �� �" 7� � ��� �'''� ��� 0�� � ��� �'''��6�� "����� ��� �� ������ ��� ���#�� #�� �� !��� ��������� �� ����� �����!���� ��9���� ����� ��� ������ �� ���#���A$�������� ��%�� �" ����� >?*;��� ���#��

����#�� ���������� ���������� ����� � ����� %�������#�� �����%�� �����������>?*;��� "������� #���������$�������� ��%�� ��� ����� �" 6���� ���� � �� �� ���� ��� #�� ��� ����� %������� ������� +�� �" �� ����������� �� ��� � �� �����,���� ����� �" >?*;��������� �� ����� #��� ���#�� � ������ ����� ���JJ/����,�����KK ����#�� & �� ���������� ��%��� �� ������������ ��������� �" ���8����"����� ��%��������� ��������� ������ #��� ��� �� �������� ��� ��� �������� ���� ����� �� ������� ������� � �����

��� � A$�������� ��%��� �" ��9���� ������ #�� ��9���� ������M

<����� ��� �BC�;>?* �BC�;>?*;��� >?*;���

���������� ������� &C� E�) ��.3GR�3�� ' �'�FR���� F�.FR.�

2)0 @1G3R�.'' ' �3�R�� ��G1R@3' @�1GR�133

EBI 31GR@�@ ' �31R@� ��R��

>?* ��%�� ���8�/� E�) ' ��GGR'���� �.�3�N'�1� ���GN'�3@

2)0 ' F���R'��3� ��.FN��'F G���N'�G� ��33RF�'�

EBI ' '��'R'�'�� '�@�N'��F '�'1N'�''@

MB��; )�� ��� �%������ �" � ���� ���� �$�������� EBI ������ ������ #�� #� �$���������� &�� %����� ��� ������� "��� ��

��5������ ��������� ������� �� >?* ��%�� #��� �� ������� �� ���� !����� ������ �� ������������ ���������� ��������� #���

�������� "��� #�������� �������� #������ >?* ��%���� #��� �������� "��� ������ �$����

*2* @�,').�;,6,�= 7;< @�,);��;)):�;�� A,6& B3� ;,& *� 9)�')C@): 01� 0110

���"����� ��������� B��#����� � ���� ���G�� I� � ���� ���� � �� #����� �����,���� �" ��� #���� �9���������� ������� �" ������� �������� �������� �"����� +�� ���� �$�� �� �����,���� �9� � �� �%������ �� ����� ��� ��������� 2����� �� ������ �������� ���� ������ � ��5� E��A: �$����� �" ��>?*;��� "����� ���4���� A$����� �" >?*;���������� @'� ���� "����� ������ #��� �� ��������������� #�� ���� ������ �" �� E��A: �$����� ������� #���� �BC�;>?*;��� ���#�� ���� ��%�� �" �$������ #�� �� #� ������ ��� �� ���#���&��������� �� ���������� ����� #�� ���� � ����5 �������� ��%����� ���� �4����� ��� �� E��A: �������� ��� ��������� ���� ����� "��� �� �������6����� �� ��%�� �" >?* ����� "��� �����>?*;��� #�� ��� ��#�� ��� �� "��� ������BC�;>?*;��� 6���� ���� #���� �� ��� ���������������� #�� ������ ������ "��� ����� >?*;����& ���� ������� ���� #�� ���� ������ �� #����

��� ��� >?* ��%��� #��� ��� �������� "��� �������$��� �" ����� >?*;��� ��� �BC�;>?*;�����5�� "��� ��9���� ��� ����� �" �� ������� &����#� �� ������ �� >?* ��%��� #��� ��#��� ������ ���BC�;>?*;��� ��� �� >?*;��� ����� ���������� ��%���� &� ����� ��� ��������� >?* ��%�� ��������� ���� "��� �BC�;>?*;��� #���� � ����������� ���� "��� >?*;���� I����� >?* ��� ���#��� �� ������������ "����� �� ��� ������� ��

%������� �" �����%� >?* ��%�� �%�� ��� ��%�� ��������� ������������������ 7�� �������� #�� ��������� �� ���������� �" >?* �� ����� >?*;���#�� ���� ��%��� ��� �� ����� �BC�;>?*;��� ��� �������� ����� �� ��� �������� ��� ���������� � ��#�� >?* ��%�� �� �� >?*;��� ����� #��������� ��� ��%�� �� ��� ������� � #���� ��� ����������� � !�� �� #�� >?* #�� ���D� � ������%��� ���������� �� ����� >?*;��� ��� ���BC�;>?*;���� � ����� ���������� � ������ ������� �� ��9���� �����,���� ������ �" �� #������� ���� >?* ���D� � ��9���� ���������������� �BC�;>?*;��� ����� ����� �� �� A: ��������� #������ >?*;��� #�� "���� ��� �� �������� �� ������( ��� JJ/����,�����KK ����#��

����� ������ ���8 ���� ��� % 3���(���

����!���� �" �� >?*���� "����� ������ #�� �������� �� � ��� ���� #���� ����� � ������ �9��������� �������� ��� ������ &������ �� ��%���� �� ����� ����!���� ����� ��� ���� ���� "������ �����!���� �������� #�� �� "���� ������� ����� ������"� ������������ ������ "������� & �����%������� "����� ������ #�� ������� �� ���#� �� ������ F��� #�� ���� "�� �����5����� ���%��� ������� ������ @����#�� �� �� "����� ������ #�� �����"���� ���%���7�� '�1 ��� �" A5��$ ����� �� "����� ���� ������������ �������� ��� #� ��D�� ����� �������� ������������� � ��� ��� >?*� 6�� ���%�� ��� ���#��� ���� �" ���� �. 5)�� ��� �� ���%�� >?* ���#�� �

������ �� 0��������� �" >?* ��%�� ��#��� ����� >?*;���

��� �BC�;>?*;���� ������� #��� �$���� #�� ���������� �����

��� E��A: ������ "�� ������ >?*;��� ��� �BC�;>?*;����

������%���� 2������ #��� �5�� � ��9���� ��� ����� ������ ���

"���������� �" ��� ������ ��������� ��� ��������� �������

����������� � ��������� ����� ���� I�� >?* ��%�� ��� ���

��������� ������� #��� �������� "�� ��� ������ �$���

������ �� &4��� ����!���� �" �� "����� ������� 0���� ������

����� �" �BC�;>?*;���� �$���� #�� �� E��A: ������� #��

������ #�� �� �$�����8#��� ��9�� � � �;� ����� 6�� ������� #��

��� ��$�� #�� �� 6&/+B ����� � ����# "�� �4��� �������� 6��

��$��� #�� ������ ������ � !��� ������ �� ����� #����� ��� ���

����� #�� �� ������ ��9��� /��� �� ��� �������( ���� �� ������

��,� ���5��( ���� F� ���� ������ �$��( ���� @� ����������� �����

���( ���� G� ����!�� "����� �������

6� )' 76&� 89) ,� �:)); �68,:)9.);' �:,')�; 9'8<= �:,')�; �; )��:)99�,; 7;< 6,.76�>7'�,; *2B

��D�� ���� �" ���� 3' 5)� ��� � ��� ���� � ���� G'5)�� 6�� �������� ��,� �" ����� >?* �� ���� G'5)�� �� �� ������� ��,� �� �� 2)2 ��� ��� ���� �������� � �� ���� G. 5)� ��������, � ���� ��..�� 6����D�� ���� � ���� 3' 5)� �������� ����� �� ��,� �"����� >?* ���� ��$ ����� ���� ������� �� �� ������������ �� �BC� ������ #�� ���%�� �"�� ������� A:�������� ��� ��� #�� �� ������ �� �� �����"����� S����� �� ���#�T�� ������ @� ��� ���#7�������� ������ �" ��� ��� >?* #�� ������� �������>?* �������� ������%���� 6�� ��� ����� ���#��� ������ @ �������� ��������� � �������� ���%��>?*� #��� ������ ������ ����� �������� �� �������� �� ������ 7����� ��� ������ �" ��� ��� ����%��� ������ ���������� �" ��� ���� @��� 6�� ��������" �� "����� ������ #�� "����� ������ ���� �� ���JJ������ ������ 2�������KK ����#��

%::� � �: ����� �� ��� ��� �� ����� �������;* �(��

� �� ��������� � ��� ��# "����� ������� ���� �����#�� ��� ���� ��� ����"��� �9� ���� ����%��������������� 6� ���� ���� ��� �������� ������� ���>?* ��,���� ��%�� #��� !�� ��� �������� "����� ����!�� "����� ������� 6�� "����� #�� ��� ���%��#�� A*<�$ ��� �� �������� >?* ��� ��� ������������ 6�� ������ "��� ��"��� ��� �"�� A* ���%�

��� #��� ������� ��� ��� �� ���� �" "����� ����� ��� >?* ���� �� �������� ������%���� >���#� #�� � ������ �� �� �������� A* ��9�� G' � 6����>0� �> .�'�� � � 0�0��� ��� '��� 6#��� �'�����" ��� ���� �9� �� ��� ��� ��������� ���>?* ��%��� & ��������� ��#��� �������� #����� #���� �� A* ��9�� ��%����� �� �� A* ��9���������� ����� ��������� ������� ��� � �� ������� �������� >?*�� ��,��� ��%�� ��� �� ���#���7� "���� �� �� ������� �" ����� ��������� �������� #�� ��� � �� ������� �" '��� 6#��� �'� ����������� ������ 6#��� �' �� � ���"���� 6�� ��������������� �" >?*�� ��%�� #�� ��� � �� ������� �"�� G' � 6����>0�� �> .�' ��� �� ���#���& ����!�� A* ��9�� #�� ��� ��%������ #����

6#�����' �� 6����>0� ��� ������� ���� � � 0�0���� )� #���� 6�� ����!�� ��9�� ����" ��� �� ���� ����9� �� ����� ����� ��������� �� >?*�� ��%����� #�� ���� � ������ A* ���%��� � �� ��������� �" A*<�$ ����U'�1 ��� ����� �����#��U��� ��� ����#�� ������ �" ���� "����� ������ ������ G ���#�� �� "����� �9� #�� ����!��A* ��9��� ������������ ���� �� �� �����!�� ������� ����� ����� ��������� ������� �� >?*�� ��%����"��� ��� �"�� �� ��������� �" >?* ��� ���� 6������� �� "����� �" ��� � >?* ��� �� ���� ������" ����� ��������� �� >?*�� ��,���� ��%��� �#���� ���� ������ �� "����� ��� �� ���� �������

������ �� ������ ������ ��������� #�� �� �����5����� ���%��� ��,���( �' �� �" ����!�� "����� ������ #�� ����� � �� A* ��9�� �� #��� ��

��9���� ����� �" A*<�$� 6�� ��$��� #�� ������� � @�0 "�� �3 � ��� ��� ������� � � 2)2 �&�A� � 7����� ��� ������ #�� ����

��� �������� ��� �� 7����� ��� ������ #�� ����>?* �������� &����� �" A*<�$ ���� #��� '�1� '�@� '��� '� ' ��� "�� ���� �� ���� �� ����

F� ���� G� ��� ���� 3� ������%���� )� #���� ������ �" A* ��9��� #�� ���� �� ���� 3 � ������ #�� ���� G� /��� @ �� ������ ��,� ���5���

*22 @�,').�;,6,�= 7;< @�,);��;)):�;�� A,6& B3� ;,& *� 9)�')C@): 01� 0110

����� �" ��� �� >?*( ��� ��������� �� "���"���������� 6��� �� ����#�� ���������� ������ ����� �� ����� �1 5)�� #��� ��������� �� � "����� ������ >?*�� ��,���� ��%�� �� ����� ��%���� �" ��#� ��D�� ���"� 2��, � ���� ��11�� � �� �������� ������� �������� ��� ������ ������ ����� � �������������� �" >?* ��� ������� >?*�� ���" ��%�����

3��������� ��.��� �� ��� ���-����� ������ 5��"���

������ 3 ���#� �� ��� ����� �" >?* ��� ������$��������� &"�� �� � F' � ������������ ������� �"��� ��������� ������� ���������� %��� #��� #�� �������� �" >?* ��%��� I� ��� �� �� ������ �� ������#� ���#�� ��#�� �� >?* ��%�� ������ � ������� #���� ��� ��������� ������� � ����������������� ���������� �" >?*� 6�� ������� ��� �������� 3 ���#� �� ��������� ��#��� ��� ��� >?*�6�� ��������� #���� �� !�� F' � ��������������#�� � ���� ������ ����������� ��#��� ����� ���������� ������� ��� >?*�� ��%��� 6��� ���� �������� �� !�� F' � �"�� �������� ����� ���������������� ���� �� ���� � ������%��� ����� >?*���$��������� I� ����� ��� � �� ���#� � ��� ��������� #��� >?*�� ��%�� ������ ����� �������6�� ������ ���� �������� �� ��� �������� �����

�%�� #��� >?* #�� ���D� � ����������� ������ 1�

���#� �� �"�� �$����� ������ �" �� "����� ������� @�0� �� "����� ���� ����������� ��������� #�� ����������� �" � ������ ���� �� ����������� � ����,� �" ��� ���� F�� 6��� ���� �� >?* #�� ��������� �������� �� �� ��� �������� ���� )���������� �" �� "����� ������ #�� "����� ��!���� "����� ���%� �&�A ����� �� ���#� �� ������ 1�� 6��������� ����� �" �� "����� "������� #��� ����� ������������ �" �� "����� ������� 6�� "� �� ����"������� �������� �������� ��!��� �� ��� ��������� ��� ��� �������� #���� >?* #�� ���������� �������� �������� �%�� ������ ���%��� �" ���#���� ���� ��� ���� �" �� ��������� S)��" ���>�������� ���3T�� 2� #��� "���� #�� �� ����������>?*� ����� ������� ���� �� ��� �� ���� � �������� "����� �������� ���������� ����%����

�� ��<���� 5����� �: ��� ����� =��� �����

6�� �������� ����� �" ��� ��5�� � �� �$���������"�� ��� "�� ������� ������ ������� ��� �����,����� 6����� ���.�� 0��"��� ����� ������� �������� ���� ����� ��� "�� F) �����,���� �" ����!� �������������� �� ��������� �������� ��#���� ���G�� 6�� ���������� �" ��� ��� ��"��� �������� ������� %�������,���� �" ������ �����,���� �� ��%� ����� ������ .���#� �� �����,���� �" ��� ����"� #��� ����������%���� �� �� ������ ��� #�� �$����� "��� �� %��

������ �� 0��������� �" ��� ��������� ������� ��� >?* ��

�%�� ��#��� �� "����� ��� �� �������� ��� ��� >?*� ���

��������� ������� ��� >?* ��,���� ��%�� #��� ��� ����

����� "��� �� ����!�� "������ 6�� "����� #�� ��� ���%�� #��

A*<�$ ��� ��� ��� >?* �������� ���������� 6�� ������ #���

�������,�� #�� ��� ��������� ��� >?* ��%�� ����� �''� ��

�� "������ 6�� ����!�� A* ��9�� ������� D�� � � 0�0���

������ �� 6��� ����� �" >?* ��� ��� �$�������� ��� �� �����

����� ��#��� ���� 0����� �BC�;>?*;��� #�� ����� 0�����

������� #��� �5�� � ��9���� ��� ����� ��� ��� ������ ����� �

�1��0 ���� ����� "�� ������ ��� ��������� ������� ��� >?*

��%�� #��� �������� "��� �� E��A: �$��� 6�� ������ ���� �"

��� ��� ��������� ��� >?* ��%�� � ��� �" ���� F' � #��

�������� ��� � ���� �4��� E��A: �$����� �" �� ��������

������� 6�� ������� !���� ���#�� �� ��������� ��#��� >?* ���

��� �$�������� ��%���

6� )' 76&� 89) ,� �:)); �68,:)9.);' �:,')�; 9'8<= �:,')�; �; )��:)99�,; 7;< 6,.76�>7'�,; *23

������ �� � �� ������ #����� � #�� ��� �� �������6�� �����,���� ����� �" >?*���� "����� �� �����9���� ���� ��� ���#��� � ���� ��������,���� �" �������� ��� �� ������� 6�� ������� �" �� ������������� %����� ����� ��9���� ����� ���� #�� %�������� ������� �� ��� ������� ����� �� ���� ����� ������� #���� �� �%���� ��������� ������ ������������

#� ���� "���� �� �� ���������� ������ �" �� >?*���� "����� ���� %����� �%�� ��9���� ����� ������ &����� ����� ����� ���� #�� �� ��%���� ������ �������� ������ �� ���#��� &� �$�������� ������������ ��� ���� ���� ���#�� ����� ������ ��������&"�� ���� @. � ��� �������� ���� �'� �" �� ������� ����� ������ �������� 0��������������� �������� ��� � #��5���� ������ ������� <��� ���5������#��� �� ��� ����� ���� ���� #�� ����� ������������� #��� ����"����� � ������ ����� ��� ��� "����2)0 ������ ����� 3� ��������� �� ������ �������� ����������� �"�� ���� . � ��� �� �������� ����������� �%���� ��������� ������ 6�� ������ "�� ��� ���%���� ���� �� ������ � ��� �� � ������ �� ���� ���� ����� "���� ������ #���� ������ ��� ���#� �������� � #���� �� ����# "����� >?*���� �$�������������� �" �� ������� �" �������

)��� �: �� �� 2=�� ��<����- 2� �����

6�� ��������,���� ����� �" >?*���� �� ����� ���� �� "� �� >$5� ����" �� �����,�� �� ��� �� ������ ��� �� ������ :����,����� � ���� ���.�� � #����������� �� �� ���%�� ��� �� �� �� ���� �� >$5��� ���� ���� � ������ ������� �� /��.���������&���&���� :����,����� � ���� ���.�� 6�� ����� �" �������� ������� ������� ������ ��9���� ����� ������������� �� �� "����� ������ ���������� �� � ������� ������� ��� #�� ���#� �� ��� ���� � �� ����� ������ "����# �� �����,���� �" �� "����� ������>$5�� 6�� "����� �" ��� ������ ���� �� �����,�����8���������� %������ ��� �� ������� ���� � "����#�6�� ����%��� �" >$5��� ��������,���� ���� ����

��� ������� ��������� ��%��%�� �� ������ ������������ ������� �� ���� ���� �� �� ������ �� ������ ����� :����,����� � ��� ���.� �������� �� >$5����� �������� �� �� ��������� �" �� ���������������� ������ �� �������� #�� ������������"���� ������ � ��� ��������� ��������� 6��� ������������ �� �� ������������ "���� �9��� ��>$5� ���� ������ <���� 6���� �� 2��3� ���������������� �� ������ �� ������ ������ �� "����������� �$�������� ������ �� ��� ����� ������ �������� �" �� �&/� ������� ���� ���� �"�� ��������������� � �� ������� ���� #�� �� ������� �" ��"����� ������ �����,���� ������ ������ �� �������" ������� +�� ����������� ������� �� ���%��� ���� ������ ������� �� >$5� ��������� ���������� ��� �� �� �$�������� ��������� ���� >$5�;����� ������ � �� ������� � �� ���� ��������� �� �������� ������� ����������� �"�� ���������������"���� ������ #�� ������ 2���������� ������ ����������� #���� ������ ������ ��� ������ ��� >$5�#���� �� ��%��%�� �� �� ����� >�#�%��� �� ���� ��������� �� :����,����� � ��� ���.�� �� ����%� ��������� ��#��� >$5� ��� �� ������������ "���

������ �� )��������� �" �� "����� ������ � 7����� ��� ����

��� #�� ������� �������� /��� �� �BC�;>?*;���( ���� ��

>?*;���( ���� F� �BC�;>?*;���� ������ �$�� ����� � @�0 "��

� #��5�( ���� @� ������ ��,� ���5��( ���� G� ��� �������� � B��%��

�&�A �������� �" "����� ����������� /���� �LF ��� �BC�;>?*;���

�5�� � ��9���� ����( ���� @ �� ��� �������� B��%� ������� ��9��

#���� 2)2 #�� ����� ��� �� ������� #��� �� ������� <������� �"

�� ����� #�� �� ������� � ������ ��,� ������ �� ������� #���

�� ��������� 6�� ���%� ��� #�� �$��� #�� CH ����� ��� ��

����� #�� �5�� #�� � ������ ������

*31 @�,').�;,6,�= 7;< @�,);��;)):�;�� A,6& B3� ;,& *� 9)�')C@): 01� 0110

���� �� �������� ��� �� �� ������ ������ � #�����#� �� �� <��� ������ ���� ��%� "��� �������� � �� ����� �� �������� � ����� ����� )�%� � ���� ���1��

31/3��5�1/5

7� ��%� �������� ��� ���� � ����"����� ����� ������#�� ��������� �" �� �������� "��� �������� �

"��������� ��� ���� �$�������� ��� � ��#���������������� ������ �" ��� ��� �� ��� �" � �������� ������#�� ��%����� ��������� �" ������ �$�������� ����4��� ����!����� ���������� ��� >?* ��� ���������� ���� "��������� #��� "���� ������� &��������������� ��� ������ ���#�� �� ��� ��� ���������� ������� ��� >?* ��%�� �������� �������� ���� "����� ������� � �� �������� ��� ��� >?*�"�� A* ���%���� 6��� !����� �� �� ����� #�� 7�� ��� �'''� ��� 0�� � ��� �'''�� #�� "���� �� ���

������ �� /����,���� �" ���� 0����� ��� #�� ���#� �� 2)0 ������ #�� ��G �8/ ������� ������ 2����� #�� �5�� F' � �"�� ���#��

���������� ����� �� �� ���� ����� 6����������� ����� #�� �5�� #�� ��9������� ����"����� ����� )�0� ����� )�0 ������ ��� �"�� ����

� ��!�� ����������� ��� �� �� %����� ��� �������� �� �������

������ �� /����,���� �" >?*;���� ���#� ��� ������ �������� #��� �� �� ������ .� 6�� ����# ���� ����� � �� ������ �" � ������ ��� �

%������ & �������������� ��� ���� �� ���� � ��!�� �� ������ �����,�����

6� )' 76&� 89) ,� �:)); �68,:)9.);' �:,')�; 9'8<= �:,')�; �; )��:)99�,; 7;< 6,.76�>7'�,; *3E

��� ��� �� "����� �������� ���������8��%�� #��������� �� �� "������ 7� �� �� 5��# #����� ��� ����� � ������ ��� ������ ���� ��� �� ���� ������ �" ���5���� &���� ��� #�� "���� � �� 0�������� �" >?* ����� ����� #��� ���#�� � ���� ��$���� ������ �������� � �� B��������� #������ � #�� "���� � �� B�������� �" �� ������� �� ���� �������& ������ ��������� ��#��� ����� ��������� ���

����� ��� >?*�� ��,���� ��%�� #�� ���� �������� �� ��� ����� #��� ���������� �� ������� �� ���� �� �� ������%� "����� ���5�� ������� �� "����� �������� �$��������� 6��� ���� ������ �" ��������� ��� ��������� ������� ��������� ��������� ��%������ �� ������ �$�������������� ��%�������� >�#�%��� ��� ��� � �� ���������� �� "����� �������� �������� ���������� ����9������� ������� ��#��� ��� ��� �� "����� �������� �� ��� ����� �� "����� ������ #�� �������� ����� ����� ���� ������ �" �� ���������� �" >?*�� �� "������ #������ ��� �������� ����� ��� ����������� ������� ������� � �������� 6��� ������� ���� �������� �� ��������� ����� ������ "������� ���%�� �� "�� ������� ������ ������ 6���!����� �� ����� ��9���� ��� �� �� ������ �" 7�� ��� �'''� ��� 0�� � ��� �'''�� #�� "���� �� ������� ��� "������ �������� ����� �������� ������� ������� I� � �� ��5��� �� ���� ��� "���������� �� �� �� ����� �� ��� ����"� ��������� �" ��"����� ������ ����" �� �� %��� ����� >����� � �������3�� >�#�%��� ��� �� �� ��� ��� ��� ��9�������������� ��#��� ��� ��� �� "����� ������ � ������� �� ��������"��������� ������� #��� ����� �����"� �� �$�������� ������ ����� � �$����� �� �"�"� �" ������� ������� 5��5���� � #���� ���� ����������� � ��� ��# �� "����� �������� ����������� �� �9��� #��� "���� #�� ���� & �����$������� ��������0�& ������� ��� ��� "����� ���#��������� ���������� ���� �" ���%� ��� "����� ������� >����� � ���� ���3������ ��������� ������ ������� #�� ��"���

�������� ���#�� ���� ������ �� ������� �����������,���� ��� ��45��� ��%��#�� �� *���#�����'''�� +�� ���� ���#�� �� �� >?*���� "����������� "����#�� �� �����,���� �" >?*� ������������ "����� �" ��� ����#�� �� � %������,� �� �������� �" �� �����,���� ����� �� ��� ��� �� ���������

6��� ���D� #�� ��������� �� ��������� "������ "���

<��5 = 0��� ��� 7� �������� �� ������� �" ����� FF@

"��� )�� B� &� )� 2��%� C��%����� �" 0���"������ ��%����

��� ����"�� ���������� #�� ���� 7� ��� ���� ���5"�� � 0���

Q����� ���� "�� ��� �" �� /2< G�' ��"��� ���������

)�:���� ��

&����� 0:� :�������A������ /� I����� 7A� :�� �� ���.� �����

�������� ������ �� � ���� ��� ������%� ������� �" ������

������ ������ ��������� I������� ���� �@;FG�LFG@�

&����� 0:� /� 0� I����� 7A� :�� �� �''�� >��� �������� ������

�" ���� �$�������� ����� ����� �������� ��������$����%� �����

������� ����� �����; �� ������� "�� ��%��� ����� P I�����

2���� 3;@��L@�.�

0�� >P� ���� <-� :�� �� I����� 7A� ���1� A$�������� �" �����

�������� ������ �� ���� ���%�� ��� �� ��������� "�� "������

������ ��������� I������� I����� G3;�F�L�@1�

0�� >P� 7� 0�� H����� PP� :�� �� I����� 7A� �'''� +����%�����

�" ����� �������� ������ �� � "����� ������ �� ��������� ���

�������� ����������� ��; ��������� ������ �$�������� ��� ����

������� I������� I����� 31;G3GLG1@�

0���!� <� *��� 2� ���.� ����� �������� ������; ���������� ���

��������� ��� �������� B�# E��5; 7�����/����

0���� I>� B�� 27� *�� I<� ���5 E>� ���3� >����� �4��� ���

����� �" ����������� ������� "��� ������������ ����������

����� ��������� ������ �������� I������� I����� @�;@1FL@1��

)�/��� <�� /� P� :�� �� 7������ 7&� I����� 7A� ����� <����

����� ���������� "����� ������ �$�������� ������ ���� ���

������ ���%���� �" ����������� �� ����� ������� ����� �������

I������� I����� 3G;G@L3@�

)�� 2*� )����� 2� �''�� /�������� ������� "��� � �!��� ����

����; ���������� �� ���� ����%��� ��� �� ���� ��������

��������� ��������� P &��� 0��� F3�;�G.L�33�

)� H� <P� 7����� P&� P������ <� ���1� :������� ������ �����

������ �" �� <��� ������ ���������� <�� I��� 0��� .;�3'FL�3�.�

)��" P� >������� 6<� ���3� )������ ������� �" �� �� �����

%����� ����� �������� ������� ���� �1F;F�L@@�

A���� *)� ��.'� ����� ��� ��������� �%����� "�� >�$�5�����

��� �� � 5�� ��,��� ��%��%�� �� ����� ������� ���������� ��

����� <�� ��� ���� �1.;3FFL3F1�

��������, :� >������ �� ��������, A� ��������, 6� /���,�I����

E2� <����� �� ��..� &���������������� �" ���� >�$�5�����

���� P ��� <������� �F@;�@�FL�@�.�

������� *� A���� *� <�5� )� ��.@� 0������ ��� �������� ��������

�" �� >�$�5����� ��� ���� �" �� ���� ������������ �����������

<�� ��� ���� ��@;�@@L�@.�

������ P<� ����� 0����� ������� ���������� �� ����� A�� P I���

��� �'3;��1LF�F�

>����� :E� *����� &� 7���� :� :��� P� ���3� �� %�%� �$��������

�" �������� ������ �����,���� ��� ���������� #�� ����� ���

������ ������� ��� B�� &�� 2� C 2 & �F;.�.L.FF�

�� >� ��5���E�<����*� *����� &� ��.F� 6����"������� �" ���

���� ���� ����� #�� ��5��� ������ P I������ �GF;�3FL�3.�

*��� 2:� &���� <� *�������� &� E��� 66� 7��� 77� *�� ��

���G� ����� �������� ������ �� � ������� �" ���� �$��������

��� ������ �����,����� I��6���� ��� ��;3G'L3GG�

*��� 2:� ����� ����� �������� ������ ����; ���������� �� ����

����� ������ "�� ���� ����%���� )��� )���%��� 6���� @;F'@L

F���

*���#��� 2)� �'''� 6�� ����� �" �� ����; ��%� ��� �������� � ��

����� �" ����� ���������� <���� :�� 6��� G�;G��LG���

*���5��� /2� 7������5$ P� 6��%����� P<� )� 7���� P>� �����

2�����L"����� �������� �" ���� ��$�5�����; ������� ���

�������� "�� ��������� &<� ��������� ��� ������� �������

����� I����� P F@F;�G�L�3.�

*��,� �� >����� �� &���� *� I������ P� B������ I� B������ 0�

2�������� :� *���#��� 2)� *��,� �� ����� 6�� ����� �������

�� ������ ����� ������� ������� � �� ���� %������ I���

��� I������ &� �@�';�.1L��.�

/����$ +� 0����� P��� )����� P� I������ PH� H��������� P� �����

0������ ��� �� ������ �" �� ��������� ���� �" "!���������

���#���!� %��� ���#���!� &600 ��@�@� �AI2 �.�;3@L3.�

/��55���� </� +5���I��� 0� *������� *� ���3� 2������ �" �����

�������� ������ "��� ��������� �����%�������"��� ����

����� I����� I������ :�� 0����� ��3;1GGL13��

/� P� 7��� 2� H��)���� 7P� 2���, /)� ������ >&� >����� 7*�

0��� >P� I����� 7A� :�� �� �'''� ����� �������� ������ ��

*30 @�,').�;,6,�= 7;< @�,);��;)):�;�� A,6& B3� ;,& *� 9)�')C@): 01� 0110

������������ ����������; ���� ��� ������ �" �� ���� ��������

I������� I����� 1';�.1L��3�

B��� 2P� )� 2��%� B&� ���@� A������ ������%�� ������ �����

���� ������� �� ��������� ���� "����������� I�������

���� �';��GL��.�

B��#����� *)� I��5��� 2<� :���� /� <������� <&� ����� )7�

���G� -������%� ������� �" ����� �������� ������ �� ������

����; ��������� �" �������� ���� ���� ��� �� "����� �������

��� ������ ������ P <������� �.';�'�L��3�

��#��� PI ������� ���G� >������5 �" ��������� ��"��� �������

��� B�# E��5; ������ ������

����� �A� *������ >P� 2��!��� P�� :��� �&� ���.� ������� ���

����� � �� �������� ������� ���#�� �"�� "����� #�� �����

�������� ������ ��� !���� ���"������ I����� P FF�;33�L31G�

������� ))� A5������ H*� 7��� 77� ���������� ��� 0������

<P� ����� ������� ������ �" �� � �!��� ������� ����������

����� ������� ���� ���;���L�FF�

:����,���� �� >������ �� 2��, �� ����� P&� <����� �� ���.�

>�$�5����� ��� ��� � ������ ������������� �����,���� ��

������������ ����������� �AI2 /� @�G;@1GL@1.�

2�����5 0� 2�����5 P� 2#�� P� I����� )� *��������� 7� ��.3�

�����!����� ������ ��� �� ������ �" �� ����� ����"����

>�$�5����� & ��� I "��� ����� B���� &��� :�� �@;�@GL

�3F�

2��, 6&� &������� 7�� ������5 :P� &������� 0<� ��11� >����

��������� ����� ������� �" ���� >�$�5����� �����$�� #��

��������� ��%����� ��� ���������� A%����� "�� �� ��������

����� ���� P I��� 0��� �G�;@@�@L@G''�

2���������� 2� 2���� �� ���3� -������%� �������� �" ������� ����

�$�������� �� ��������� ���� ����� �� ����� �������� �������

P I������� @�;�F1L�G��

6���� :E� ���.� 6�� ����� �������� ������� &��� :�% I�����

31;G'�LG@@�

7���"��� P� /����� 2� ������� 6� >�55������� 6� �''�� ����� ����

����� ������ ���� "����� ������ �� ���� ������ ��������

>������ 0��� I��� ��G;G�L33�

7� 0�� 0�� >P� :�� �� H����� PP� I����� 7A� �'''� & ����� ���

������ ������ "����� ������ "�� ��������� �� �$���������

������� ������� ��� ��������� �" ����������� ��%� �������

���������� ���������� &��� <������� I������� G@;1.L.F�

6� )' 76&� 89) ,� �:)); �68,:)9.);' �:,')�; 9'8<= �:,')�; �; )��:)99�,; 7;< 6,.76�>7'�,; *34