incremento de la capacidad de multiplicación del callo ...

Centro de Investigación Científica de Yucatán, A.C.

Posgrado en Ciencias Biológicas

INCREMENTO DE LA CAPACIDAD DEMULTIPLICACIÓN DEL CALLO EMBRIOGÉNICO APARTIR DE EXPLANTES OBTENIDOS DE TEJIDO

FLORAL DE COCOTERO

Tesis que presenta

GABRIELA SANDOVAL CANCINO

En opción al título de

DOCTOR EN CIENCIAS

(Ciencias Biológicas: Opción Biotecnología)

Mérida, Yucatán, México

2016

DECLARACiÓN DE PROPIEDAD

Declaro que la información contenida en la sección de Materiales y Métodos

Experimentales. los Resultados y Discusión de este documento proviene de las

actividades de experimentación realizadas durante el período que se me asignó para

desarrollar mi trabajo de tesis, en las Unidades y Laboratorios del Centro de Investigación

Científica de Yucatán, A.C., y que a razón de lo anterior y en contraprestación de los

servicios educativos o de apoyo que me fueron brindados, dicha información, en términos

de la Ley Federal del Derecho de Autor y la Ley de la Propiedad Industrial, le pertenece

patrimonial mente a dicho Centro de Investigación. Por otra parte, en virtud de lo ya

manifestado, reconozco que de igual manera los productos intelectuales o desarrollos

tecnológicos que deriven o pudieran derivar de lo correspondiente a dicha información, le

pertenecen patrimonialmente al Centro de Investigación Cientffica de Yucatán, A.C., yen

el mismo tenor, reconozco que si derivaren de este trabajo productos intelectuales o

desarrollos tecnológicos, en lo especial, éstos se regirán en todo caso por lo dispuesto por

la Ley Federal del Derecho de Autor y la Ley de la Propiedad Industrial, en el tenor de lo

expuesto en la presente Declaración.

!JIFirma: ----TtJtL~--'---------Nombre: I.B.T. Gabriela Sandoval Cancino

Este trabajo se llevó a cabo en la Unidad de Biotecnología del Centro de Investigación

Científica de Yucatán, y forma parte de los proyectos Fomix-Yucatán (México, YUC-2011-

C09-169886), CONACYT-Ciencia Básica (México, CB-2009-01129717), SAGARPA-Fibras

Naturales y Biocombustibles (México, Acuerdo GTO-12-09-14/02), bajo la dirección del

Dr. Carlos Mariano Oropeza Salín y el Dr. Luis Alfonso Sáenz Carbonell.

ÍNDICE

i

AGRADECIMIENTOS

A mi asesor, el Dr. Carlos M. Oropeza Salín por permitirme ser parte de su grupo de

trabajo, por todo el apoyo brindado y tiempo invertido en dirigir el presente trabajo de

investigación. También le agradezco los consejos dados a lo largo de mi estancia en el

Laboratorio de cocotero, los cuales me ayudaron a crecer a nivel profesional y personal.

A mi coasesor, el Dr. Luis A. Sáenz Carbonell, por complementar todo el conocimiento

adquirido durante el presente trabajo de tesis. Además por todo el apoyo y consejos

brindados.

A mi comité tutoral, formado por el Dr. Carlos M. Oropeza Salín, el Dr. Luis A. Sáenz

Carbonell, el Dr. Manuel Robert Díaz y la Dra. Elizabeth Ortíz Vázquez por la constante

evaluación del presente trabajo y las valiosas aportaciones realizadas.

Al Centro de Investigación Científica de Yucatán A. C., por prestar sus recursos humanos

y materiales para llevar a cabo mis estudios de posgrado y desarrollo de trabajo de

investigación en la Unidad de Biotecnología.

Al Centro de Investigación Científica de Yucatán A. C. por el apoyo de movilidad otorgado

para participar en “The Workshop of Tissue Culture and Cryopreservation” que se llevó a

cabo los días 11 y 12 de marzo de 2015.

Al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología, por el apoyo económico mediante la beca

otorgada No. 300614.

A los técnicos MC. María Narváez, IBQ. Guillermo Rodríguez, ING. José Luis Chan, MC.

Iban Córdova y Biol. Felipe Barredo por el apoyo técnico y los consejos brindados.

ÍNDICE

iii

DEDICATORIA

A mi amado esposo, por amarme incondicionalmente y creer en mí, aún en los días en los

que yo no podía hacerlo. Gracias por darme alas para volar cuando no podía caminar.

Estando juntos las cargas se vuelven ligeras y la felicidad infinita. Te amo.

“Si te quiero es porque sos mi amor mi cómplice y todo,

Y en la calle codo a codo somos mucho más que dos”

Te quiero, Mario Benedetti

A mi amado hermano, por cobijarme con su firme dulzura. Gracias por la compañía

incondicional, nunca me siento sola porque nuestros corazones siempre están juntos.

Gracias por siempre decir lo que mi alma necesita escuchar. Gracias por tanto amor.

“If the sun refused to shine I would still be loving you”

Thank you, Led Zeppelin

A mi amado padre, por darme cuanto podía y después seguir dando. Gracias por tu guía,

bajo la cual mis sueños se convirtieron en metas y estas a su vez en logros. Cuando

pienso en justicia, cariño e integridad pienso en ti. Gracias por tanto amor.

A mi amada madre, por enseñarme que la vida no es justa ni fácil pero si bella y cada día

es un regalo que no se debe desperdiciar. Por enseñarme, cual alquimista, a convertir

plomo en oro. Gracias por confiar en mí desde que estaba en tu vientre. Gracias por tanto

amor.

A mis queridos amigos, Ángeles, Pepe, Víctor, Gustavo, Claudia Torres, Claudia Arias,

Marta, Mickel, Mario y Camilo por tantas risas y tantos momentos que hacen que la vida

valga la pena.

“No te rindas, por favor no cedas, aunque el frío queme, aunque el miedo muerda, aunqueel sol se ponga y se calle el viento. Aún hay fuego en tu alma, aún hay vida en tus sueños,porque cada día es un comienzo nuevo, porque ésta es la hora y el mejor momento;porque no estás solo, porque yo te quiero.”

Mario Benedetti

ÍNDICE

v

ÍNDICE

AGRADECIMIENTOS......................................................................................................... i

DEDICATORIA .................................................................................................................. iii

ABREVIATURAS ..............................................................................................................xv

RESUMEN...................................................................................................................... xvii

ABSTRACT ..................................................................................................................... xix

INTRODUCCIÓN............................................................................................................... 1

CAPÍTULO I....................................................................................................................... 7

1.1 ANTECEDENTES........................................................................................................ 7

1.1.1 ORIGEN DEL COCOTERO ................................................................................................................7

1.1.2 CLASIFICACIÓN Y DESCRIPCIÓN TAXONÓMICA DEL COCOTERO .........................................................7

1.1.3 IMPORTANCIA DEL COCOTERO........................................................................................................9

1.1.4 PLAGAS Y ENFERMEDADES DEL COCOTERO ..................................................................................14

1.1.5 GERMOPLASMA DE COCOTERO ....................................................................................................17

1.1.6 CULTIVO DE TEJIDOS VEGETALES.................................................................................................19

1.1.6.1 CONCEPTOS GENERALES .........................................................................................................19

1.1.6.2 EMBRIOGÉNESIS SOMÁTICA ......................................................................................................19

1.1.6.3 EMBRIOGÉNESIS SOMÁTICA DE COCOTERO................................................................................22

1.1.6.4 CARACTERIZACIÓN DE EMBRIOGÉNESIS SOMÁTICA DE COCOTERO. .............................................25

1.1.6. 5 USO DE EXPLANTES DE TEJIDOS FLORALES...............................................................................27

ÍNDICE

vi

1.2 JUSTIFICACIÓN........................................................................................................ 28

1.3 PREGUNTAS DE INVESTIGACIÓN.......................................................................... 29

1.4 HIPOTESIS................................................................................................................ 29

1.5 OBJETIVO GENERAL. .............................................................................................. 30

1.6 OBJETIVOS ESPECÍFICOS...................................................................................... 30

1.7 ESTRATEGIA EXPERIMENTAL................................................................................ 31

CAPÍTULO II MUESTREO DE INFLORESCENCIAS DE COCOTERO ........................... 33

2.1 INTRODUCCIÓN....................................................................................................... 33

2.2 MATERIALES Y MÉTODOS...................................................................................... 34

2.3 RESULTADOS .......................................................................................................... 37

2.4 DISCUSIÓN............................................................................................................... 41

CHAPTER III IMPROVED formation of embryogenic callus from coconut IMMATURE

INFLORESCENCE EXPLANTS....................................................................................... 43

3.1 INTRODUCTION ....................................................................................................... 43

3.2 MATERIALS AND METHODS ................................................................................... 45

3.2.1 PLANT MATERIALS.......................................................................................................................45

3.2.2 MEDIA PREPARATION AND CULTURE CONDITIONS ..........................................................................46

3.2.3 EXPERIMENTAL DESIGN ...............................................................................................................47

3.2.4 HISTOLOGY ................................................................................................................................48

3.2.5 STATISTICAL ANALYSIS ................................................................................................................48

ÍNDICE

vii

3.3 RESULTS .................................................................................................................. 48

3.3.1 INDUCTION OF CALLUS FROM RACHILLAE EXPLANTS ......................................................................48

3.3.2 HISTOLOGICAL ANALYSIS OF CALLUS INDUCED FROM RACHILLAE....................................................51

3.3.3 FORMATION OF FULLY DEVELOPED EMBRYOGENIC CALLUS FROM EMBRYOGENIC STRUCTURES........52

3.3.4 HISTOLOGICAL ANALYSIS OF EMBRYOGENIC CALLUS FORMATION FROM EMBRYOGENIC STRUCTURES55

3.3.5 FORMATION OF SOMATIC EMBRYOS AND CONVERSION INTO PLANTLETS..........................................57

3.3.6 FORMATION OF EMBRYOGENIC CALLUS FROM SELECTED COCONUT PALMS .....................................59

3.3.7 HISTOLOGICAL ANALYSIS OF RACHILLAE USED FOR THE STUDY ......................................................62

3.4 DISCUSSION ............................................................................................................ 63

3.5 CONCLUSIONS......................................................................................................... 67

CAPÍTULO IV RELACIÓN ENTRE EL TAMAÑO DE LA INFLORESCENCIA COMO

FUENTE DE EXPLANTE Y LA RESPUESTA EMBRIOGÉNICA...................................... 69

4.1 INTRODUCCIÓN....................................................................................................... 69

4.2 MATERIALES Y MÉTODOS...................................................................................... 70

4.2.1 MUESTREO Y CARACTERIZACIÓN DE INFLORESCENCIAS.................................................................70

4.2.2 ESTABLECIMIENTO DE EXPLANTES INICIALES E INDUCCIÓN DE FORMACIÓN DE ESTRUCTURAS

EMBRIOGÉNICAS. .................................................................................................................................70

4.3 RESULTADOS .......................................................................................................... 70

4.4 DISCUSIÓN............................................................................................................... 72

CAPÍTULO V DISCUSIÓN GENERAL............................................................................. 75

CAPÍTULO VI CONCLUSIONES Y PERSPECTIVAS...................................................... 81

ÍNDICE

viii

6.1 CONCLUSIONES GENERALES.................................................................................................81

6.2 PERSPECTIVAS .........................................................................................................................82

BIBLIOGRAFÍA................................................................................................................ 83

ix

LISTADO DE CUADROS

Cuadro 1.1 Producción y área cosechada de los principales cultivos a nivel mundial. ..... 12

Cuadro 1.2 Valor de la producción por hectárea de los principales cultivos a nivel mundial.

........................................................................................................................................ 13

Cuadro 1.3 Cepas de referencia de especies candidatas de ‘Candidatus Phytoplasma’ y

su clasificación por grupo/subgrupo RFLP del gen 16S rRNA (Harrison et al. 2014). ...... 14

Cuadro 1.4 Principales trabajos de investigación realizados en embriogénesis somática de

cocotero........................................................................................................................... 24

Cuadro 2.1 Medidas de inflorescencias del híbrido MYD x MXPT.................................... 38

Cuadro 2.2 Medidas de inflorescencias del híbrido MRDxTAGT...................................... 40

Table 3.1 Media with different combinations of concentrations of 2,4-D and BAP used for

somatic embryogenesis induction. ................................................................................... 47

Table 3.2 Formation of callus with embryogenic structures from coconut rachilla explants

(inflorescence stage −6) after 90 d of in vitro culture in 25 different treatments................ 50

Table 3.3 Formation of callus with embryogenic structures from coconut rachilla explants

(inflorescence stage −5) after 90 d of in vitro culture in 25 different treatments................ 51

Table 3.4 Embryogenic callus and somatic embryo formation from different starting tissues

originally obtained from rachilla explants from inflorescences at developmental stages −5

and −6 of a MYD × MXPT hybrid coconut palm. .............................................................. 53

Table 3.5 Callus with embryogenic structures formed from different starting tissues

originally obtained from rachilla explants from inflorescences of two MRD × TAGT hybrid

coconut palms.................................................................................................................. 60

Table 3.6 Embryogenic callus formation from coconut rachilla explants from inflorescences

at different developmental stages of the coconut hybrid MRD × TAGT. ........................... 61

x

LISTADO DE FIGURAS

Figura 1.1 Palma y nuez de cocotero................................................................................. 7

Figura 1.2 Principales productores de cocotero a nivel mundial (FAO, 2013) .................... 9

Figura 1.3 Importaciones a nivel mundial de cocotero de 1990 a 2013 (FAO, 2013).......... 9

Figura 1.4 Exportaciones a nivel mundial de cocotero de 1990 a 2013 (FAO, 2013). ...... 10

Figura 1.5 Sintomas del amarillamiento letal en palmas de cocotero. A. Palmas sin frutos

muestran amarillamiento en el follaje. B. Palmas con frutos presentan caída de nueces. C

y D. Necrosis de inflorescencia. Amarillamiento de follaje empieza en las hojas más viejas

(E) y continua hacia las jóvenes (F) (Zizumbo-Villarreal et al. 2008)................................ 16

Figura 1.6 Mortalidad total acumulada debida a amarillamiento letal por ecotipo en el

ensayo de San Crisanto, Yucatán, México (Zizumbo-Villarreal et al. 2008). .................... 17

Figura 1.7 Porcentajes de pérdidas debidas al amarillamiento letal y rendimiento de

palmas híbridas en Pailebot, Tabasco, México. Datos mostrados se obtuvieron entre

finales de 2005 e inicios de 2010 (Castillo et al. 2012)..................................................... 18

Figura 1.8 Embriogénesis cigótica vs somática (Solís-Ramos et al. 2012)....................... 21

Figura 1.9 Regeneración de plántulas de cocotero mediante embriogénesis somática

(Chan et al. 1998). ........................................................................................................... 23

Figura 1.10 Representación esquemática de los cambios que ocurren durante la

formación inicial de callo obtenido de explantes de plúmula cultivados in vitro. Al día 15,

se representa la fusión de las hojas plumulares (PL) externas. Al día 30 las PL crecieron y

formaron callo inicial. Al día 45 se observa la formación de la zona meristemática (MZ)

cerca de la periferia de callo. El callo forma estructuras traslucidas (TS). Al día 60 se

observa la formación de centros meristemáticos (MC) en las TS. Al día 75-90 se forman

estructuras embriogénicas globulares (GES) y alargadas (EES). Las áreas blancas

corresponden a otro tejido. SM, meristemo (Sáenz et al. 2006). ...................................... 26

xi

Figura 1.11 Estrategia experimental ................................................................................ 31

Figura 2.1 Diagrama esquemático del desarrollo de las inflorescencias dentro de la corona

de palma de coco. Las espatas se localizan en cada base de hoja y llegan hasta el

meristemo apical de la palma (Perera et al. 2010). .......................................................... 35

Figura 2.2 Muestreo de inflorescencias de híbridos de cocotero. (A y B) Separación de

hoja de cocotero con inflorescencia unida, (C) Inflorescencia antes de ser separada de la

hoja ejemplo en campo y (D) representación esquemática, las líneas rojas representan los

sitios en los cuales se debe cortar para separar la inflorescencia de la hoja. (E) Sitios de

medición de diferentes inflorescencias............................................................................. 36

Figura 2.3 Inflorescencias del híbrido MYD x MXPT. ....................................................... 37

Figura 2.4 Inflorescencias del híbrido MRD x TAGT. ....................................................... 39

Figure 3.1 Formation of callus from rachilla explants of a Malayan Yellow Dwarf × Mexican

Pacific Tall (MYD × MXPT) hybrid palm. (A) Rachilla explants (inflorescence development

stage −6) after 90 d of in vitro culture on mediun I. (a, b) Explants that formed calluses with

embryogenic structures. (c, d) Explants that formed spongy callus (c) or without callus

formation, showing necrotic tissue (d). (B) Rachilla explants (inflorescence development

stage −5) after 90 d of in vitro culture on medium II. (a, b) Explants that formed calluses

with embryogenic structures. (c, d) Explants that formed spongy callus (c) or without callus

formation, showing necrotic tissue (d). ............................................................................. 49

Figure 3.2 (A) Callus with pearly white structures formed after 30 d of culture on rachilla

explant of a Malayan Yellow Dwarf × Mexican Pacific Tall (MYD × MXPT) hybrid palm, and

(B) corresponding histological section. (C) Magnification [40×] of section designated in (B),

showing vascular cambium and xylem tissues. (D) Callus after 60 d with formations

resembling embryogenic structures, and (E, F) corresponding histological sections of

these formations. (G) Magnification [40×] of part of section shown in (F). ES embryogenic

structure, TS translucent structure. .................................................................................. 52

Figure 3.3Morphological changes occurring during the development of embryogenic callus

xii

induced from embryogenic structures used as explants. These embryogenic structures

were isolated from embryogenic calluses originally obtained from coconut rachilla explants

of a Malayan Yellow Dwarf × Mexican Pacific Tall (MYD × MXPT) hybrid palm. Explants

were cultured in vitro on medium II for the formation of embryogenic callus (T0–T90 culture

times from 0 to 90 d). Embryogenic calluses were subcultured on medium III for somatic

embryo induction (SEI T30-T60 culture times 30 and 60 d). TS translucent structure,

TS+ES translucent structure with embryogenic structure, GES globular embryogenic

structure, EES elongated embryogenic structures, SE Somatic embryo, SEI Somatic

embryo induction. ............................................................................................................ 54

Figure 3.4 Histological sections of embryogenic structures and callus from rachilla explants

of a Malayan Yellow Dwarf × Mexican Pacific Tall (MYD × MXPT) hybrid palm. (A) An

embryogenic structure at day 0. If used as an explant, this type of structure would produce

embryogenic callus. (B–E) Callus obtained from an ES explant, forming embryogenic

structures after 30 d (B), 60 d (C), 75 d (D), and 90 d (E) of culture. (F, G) Magnification

(40×) of embryogenic callus after 75 d (F) and 90 d (G). ES embryogenic structure, VT

vascular tissue, TS translucent structure, GES globular embryogenic structure, EES

elongated embryogenic structure. .................................................................................... 56

Figure 3.5 (A) Calluses with somatic embryos (SE) and germinating somatic embryos

(GSE). (B) Globular and torpedo-shape embryos, isolated from the callus for illustrative

purposes. (C) Germinating embryo, isolated from the callus for illustrative purposes. (D)

Shoots developing from GSE of a callus. (E) Batch of coconut plantlets in growth room. (F)

A coconut plantlet obtained through SE conversion. The embryogenic calluses producing

the development stages shown here were obtained from embryogenic structure explants

isolated from embryogenic calluses originally induced from rachilla explants of a Malayan

Yellow Dwarf × Mexican Pacific Tall (MYD × MXPT) hybrid palm. ................................... 58

Figure 3.6. Subculture cycles for the formation of embryogenic callus. Each cycle

consisted of three subcultures of embryogenic structure explants, corresponding

embryogenic callus production, and a final step for the induction of somatic embryos,

which in turn were finally used as explants for the formation of additional embryogenic

callus. Original explants were from rachillae of inflorescences from a Malayan Yellow

xiii

Dwarf × Mexican Pacific Tall (MYD × MXPT) hybrid coconut palm. Tissues were cultured

for 90 d on medium II. Bars represent SD. ....................................................................... 59

Figure 3.7 Histological sections of rachilla explants obtained from immature inflorescences

of different developmental stages, excised from two coconut hybrids. (A–C) Malayan

Yellow Dwarf × Mexican Pacific Tall (MYD × MXPT) hybrid, developmental stages −4 (A),

−5 (B), and −6 (C). (D–F) Malayan Red Dwarf × Tagnanan Tall (MRD × TAGT) hybrid,

developmental stages −8 (D), −9 (E), and −10 (F). (G, H) Magnification [40×] of floral

meristems corresponding to box in (C) and box at right in (E), respectively. (I)

Magnification [40×] of center of rachilla corresponding to center box in (E). Fp floral

primordia, S sepal. ........................................................................................................... 63

Figura 4.1 Inflorescencias usadas como fuente de explantes de raquilla en el presente

trabajo, estas se encontraban en diferentes etapas de desarrollo como se muestra en (A).

Las mejores respuestas en porcentaje de explantes que formaron callo embriogénico y la

longitud de la respectiva inflorescencia usada como fuente de explantes se muestra en

(B). Las palmas usadas para el presente estudio fueron una planta híbrida MYD x MXPT y

dos plantas híbridas MRD x TAGT................................................................................... 71

xv

ABREVIATURAS

Ha Hectárea

Ton Toneladas

AL Amarillamiento letal

MYD* Enano malayo amarillo

MXPT* Alto del pacífico mexicano

MRD* Enano malayo rojo

TAGT* Alto de Tagnanan

VTT* Alto de Vanuatu

2,4-D Ácido 2,4-diclorofenoxiacético

BAP 6-benciladenina

GA3 Ácido giberélico

*Las siglas señaladas corresponden al nombre en inglés.

xvii

RESUMEN

El cocotero es un cultivo de gran potencial económico. Sin embargo, la producción está

disminuyendo debido principalmente a la senescencia de las palmas y enfermedades

como el Amarillamiento Letal. Por lo tanto, existe una gran demanda de palmas

seleccionadas por su alta productividad y resistencia a enfermedades, y la mejor

estrategia para su producción es la micropropagación través de embriogénesis somática.

Actualmente se puede micropropagar cocotero con protocolos altamente eficientes

utilizando plúmula como explante inicial, sin embargo, dichos protocolos no son útiles para

propagar palmas con características conocidas y rendimiento medido. El objetivo del

presente estudio es definir las condiciones para la producción de callo embriogénico a

partir de explantes de tejido floral masculino, la multiplicación de este y determinar su

capacidad para formar embriones somáticos y su conversión a plántulas. Se probaron

veinticinco medios de cultivo que contienen los reguladores de crecimiento de 2,4-D y

BAP combinados en diferentes concentraciones para inducir la embriogénesis somática.

El medio que contiene 0,65 mM de 2,4-D indujo de manera más eficiente la formación de

callos con estructuras embriogénicas, y por medio de subcultivo de estas estructuras, se

obtuvieron callos embriogénicos y se multiplicaron. La caracterización morfológica e

histológica mostró que el callo obtenido es de hecho embriogénico similar al obtenido a

partir de plúmula. Los resultados son alentadores y representan una base sólida para

posteriores estudios con el objetivo de elaborar un protocolo para propagación masiva

utilizando explantes de raquilla de inflorescencias inmaduras, lo que permitirá la clonación

de palmas con características y rendimiento conocido.

xix

ABSTRACT

Coconut is a crop with high economic potential. However, production is decaying due

mainly to palm senescence and diseases such as Lethal Yellowing. Therefore, there is

great demand for palms selected for high productivity and resistance to diseases and the

best strategy for their production is micropropagation through somatic embryogenesis. We

are currently able to micropropagate coconut with highly efficient protocols using plumule

as explant, but they are not useful for propagating an already bearing palm with known

traits and measured performance. The objective of the present study is to define the

conditions for the production of embryogenic calli, the multiplication of these embryogenic

calli, and to determine their capability to form somatic embryos that convert into plantlets.

Twenty-five media containing the plant growth regulators 2,4-D and BAP combined in

different concentrations were tested to induce somatic embryogenesis. A medium

containing 0.65 mM 2,4-D induced more efficiently the formation of callus with

embryogenic structures, and through subculturing these structures as explants,

embryogenic callus was produced from them and multiplied. Morphological and

histological characterization showed that the callus obtained is indeed embryogenic similar

to the callus obtained from plumule. The results are encouraging and represent strong

basis for further studies aiming at the development of a protocol for massive propagation

using rachilla explants from immature inflorescences, therefore allowing the cloning of

mature palms of known traits and measured performance.

INTRODUCCIÓN

1

INTRODUCCIÓN

El cocotero (Cocos nucifera) es un cultivo de gran importancia tanto económica como

social. Según datos oficiales de la FAO (Food and Agriculture Organization of the United

Nations), en el 2013 mundialmente se cosecharon 12,056,338 Ha de cocotero, de las

cuales se obtuvieron 62,185,314 ton de coco con valor de producción neta de $

6,883,220,580 USD, lo cual muestra el gran valor económico del cultivo de cocotero para

los países productores. Uno de estos países es México en donde, en el 2013, se

cosecharon 1, 064,400 ton de fruto; gracias a dicha producción, México figura entre los

diez principales productores de coco a nivel mundial.

Si bien resulta indiscutible la importancia del cultivo de cocotero, al comparar la

producción obtenida de este cultivo con la de otros cultivos de importancia mundial, como

lo son caña de azúcar, maíz, arroz, trigo, y soya entre otros, esta resulta menor; sin

embargo, el cultivo de cocotero es el quinto cultivo frutal más importante a nivel mundial

(Food and Agriculture Organization of the United Nations 2013). Además, los productos

con alto valor agregado derivados de materiales de palma de cocotero, la cual se puede

aprovechar íntegramente, hacen de este cultivo uno de los más importantes a nivel

mundial.

Tanto la palma como el fruto del cocotero pueden aprovecharse íntegramente, es de este

último que se saca más provecho, por los ingresos que genera por exportación como por

los productos derivados del coco, los cuales son ampliamente usados en diversas

industrias a nivel mundial y nacional.

Los principales productos obtenidos del cocotero son agua, aceite (virgen, crudo y RBD),

leche, azúcar y fibra (Kalam et al. 2003; Monteiro et al. 2005; Carandang 2008; Quality

First International 2010; Philippine Coconut Authority 2014a; Philippine Coconut Authority

2014b; Cespedes 2015; Big Tree Farms 2016).

El agua de coco es el centro de grandes negocios trasnacionales, ya que compañías

como Coca-Cola y Pepsi-Cola han hecho grandes inversiones al introducir el agua de

coco en sus líneas de productos, Brasil, EU y Europa son los principales promotores de la

INTRODUCCIÓN

2

industria de agua de coco embotellada (Roolant 2014).

Igualmente, es importante el uso del aceite obtenido a partir de la pulpa de coco.

Dependiendo del tipo de tejido y el tratamiento físico o químico al cual se somete, existen

diferentes tipos de aceite de coco. El aceite de coco virgen se usa en tratamientos

médicos alternativos para diversas enfermedades debido a sus propiedades

antimicrobianas (Domínguez Rosales et al. 2008). El aceite de coco crudo es usado para

la obtención de biodiesel, cuyo uso tiene grandes beneficios en cuanto al impacto

ambiental ya que reduce significativamente las emisiones de gases contaminantes (Lujaji

et al. 2010). El aceite RBD (Refinado, blanqueado y desodorizado) se usa principalmente

en la industria de alimentos y cosméticos debido a sus propiedades fisicoquímicas

(Quality First International 2010)

La leche de coco es otro importante producto obtenido a partir del endospermo sólido

fresco de la nuez; a partir de este producto, se puede obtener aceite de coco (Philippine

Coconut Authority 2014b) o puede usarse como sustituto de leche animal (So Delicious

Dairy Free 2016).

Otro producto derivado del cocotero es el azúcar de coco es uno de los productos que ha

tomado gran importancia comercial en la industria alimenticia, ya que a diferencia de otros

edulcorantes, ésta tiene trazas de nutrientes, bajo contenido de fructosa y bajo índice

glucémico (Cespedes 2015; Big Tree Farms 2016).

La fibra de coco, se usa actualmente para manufacturar piezas de carros para

importantes compañías como Mercedes-Benz® (Monteiro et al. 2005). Además, se puede

usar para la fabricación de sustrato para plantas debido a sus propiedades físicas

(Philippine Coconut Authority 2003).

A pesar de sus múltiples usos en las diversas industrias, el cultivo de cocotero enfrenta

diferentes plagas y enfermedades. El problema fitosanitario más serio es la enfermedad

del amarillamiento letal (AL), la cual ha tenido gran impacto negativo en las plantaciones

en América. Esta enfermedad es causada por fitoplasmas, los cuales colonizan las células

del floema de la planta, y es transmitida por Hapaxius crudus Van Duzze, el cual dispersa

INTRODUCCIÓN

3

los fitoplasmas de planta en planta (Howard 1983; Harrison y Elliott 2005). El AL es una

de las múltiples enfermedades causadas por fitoplasmas (McCoy 1982), las cuales

causan grandes estragos no sólo en América, sino también en África y Asia (Howard

1995; Harrison et al. 2014).

Otro problema que enfrenta el cocotero es que la gran mayoría de las plantaciones a nivel

mundial están formadas por plantas viejas, lo cual no permite incrementar la producción

de cocotero. Dicho incremento en la producción es necesario para poder cubrir la gran

demanda de productos de cocotero que aumenta anualmente, por lo tanto es de suma

importancia la obtención de plantas para renovar dichas plantaciones y reforestar las

zonas devastadas por plagas y enfermedades.

Tomando en cuenta la problemática que enfrenta el cultivo de cocotero, surge la

necesidad de obtener grandes volúmenes de plantas resistentes a plagas y enfermedades

que enfrenta el cultivo para renovar las plantaciones de cocotero; dichas plantas deben

además provenir de genotipos seleccionados con base en sus características

agronómicas, tales como alta productividad, precocidad, talla baja, dosel pequeño.

Para obtener grandes volúmenes de plantas provenientes de genotipos seleccionados, es

necesario utilizar la alternativa biotecnológica de cultivo in vitro de tejidos vegetales vía

embriogénesis somática (Thorpe 2007). La embriogénesis somática es una forma de

reproducción asexual a partir de células somáticas o gaméticas; en condiciones

experimentales favorables, dichas células son inducidas para formar un embrión somático

in vitro (Quiroz-Figueroa et al. 2006). El proceso es posible porque las plantas poseen

totipotencia celular por la cual las células somáticas individuales pueden regenerar una

planta entera (Steward et al. 1958; Reinert 1959). El uso de la embriogénesis somática

ofrece la posibilidad de obtener gran cantidad de plantas con características deseadas en

menor tiempo y puede asegurar que las plantas estarán libres de enfermedades.

Sin embargo, la multiplicación masiva de cocotero vía embriogénesis somática es difícil ya

que la respuesta de este cultivo en condiciones in vitro es recalcitrante, por lo cual en los

últimos años se han hecho trabajos para encontrar explantes altamente responsivos en

condiciones in vitro e incrementar la cantidad de embriones somáticos. A lo largo de las

INTRODUCCIÓN

4

últimas décadas se han realizado múltiples trabajos, en los cuales inicialmente se

trabajaba con explantes florales de hojas y ápices (Eeuwens 1976; Eeuwens y Blake

1977; Eeuwens 1978; Branton y Blake 1983; Verdeil et al. 1993) para inducir la formación

de callo embriogénico, sin embargo, la eficiencia de inducción era baja, no reproducible y

no se contaba con un proceso de multiplicación. Además, los pocos callos embriogénicos

obtenidos contaban con pocas estructuras embriogénicas con baja viabilidad. Después en

otros estudios usaron plúmulas como explante inicial y obtuvieron protocolos que

resultaron altamente eficientes e incluso en la actualidad el explante inicial de plúmula es

el más responsivo en condiciones in vitro; además es el explante inicial con el cual se han

obtenido los mejores rendimientos en cuanto a inducción y multiplicación de callo

embriogénico así como obtención de embriones somáticos. (Chan et al. 1998; Azpeitia

et al. 2003; Pérez-Núñez et al. 2006; Azpeitia et al. 2009)

Si bien el protocolo de micropropagación de cocotero usando plúmulas como explante

inicial es reproducible y altamente eficiente, este sólo permite clonar hijos de padres de

gran interés, resultantes de polinización cruzada o autopolinización. En los casos donde

no existe la posibilidad de llevar a cabo la polinización controlada y se desea clonar

plantas maduras en producción cuyas características de interés han sido observadas en

campo, es necesario usar tejido de dicha planta que no provenga del embrión cigótico.

Debido a lo anterior, en los últimos años se realizaron trabajos usando principalmente

explantes florales (Perera et al. 2007; Perera et al. 2008; Perera et al. 2009b), de los

cuales se obtiene material vegetal clonado idéntico al individuo seleccionado; cuyas

características tales como el desempeño en campo y resistencia a enfermedades han

sido previamente observadas. Así mismo, el uso de explantes florales permitiría la

clonación de individuos híbridos élite, como el Enano Malayo Amarillo x Alto del Pacífico

Mexicano 09 (MYD x MXPT09), Enano Malayo Rojo x Alto Vanuatu (MRD x VTT) y Enano

Malayo Rojo x Alto Tagnanan (MRD x TAGT), los cuales fueron seleccionados en el

ensayo hecho en Pailebot, Tabasco, México entre finales de 2005 e inicios de 2010

(Castillo et al., México, datos no publicados). Tales materiales vegetales no pueden ser

propagados usando plúmulas como explantes debido a la segregación del material

genético que poseen (Namboothiri et al. 2008).

INTRODUCCIÓN

5

En el laboratorio de cocotero del CICY se han realizaron estudios preliminares en cuanto

al uso de inflorescencias. Se usaron como explante inicial tanto ovario como raquilla, y los

resultados (no publicados) mostraron que los explantes de raquilla tuvieron mejor

respuesta, sobre todo en la etapa de multiplicación; además resulto evidente la ventaja

del uso de raquillas ya que presentó de manera significativa mayor número de explantes

comparado con ovario y plúmula.

A pesar de que los resultados preliminares resultan prometedores, surge la necesidad de

evaluar la capacidad de los explantes de raquilla para inducir la formación de callo

embriogénico. Si se logra obtener callo embriogénico, necesita caracterizarse morfológica

e histológicamente, de tal manera que se pueda comparar con las características

presentes en el callo embriogénico obtenido a partir de plúmula, las cuales han sido

ampliamente descritas en el trabajo de Sáenz y colaboradores (2006). Tomando en

cuenta que el protocolo de micropropagación de cocotero basado en el uso de plúmulas

como explante inicial es eficiente y reproducible, si se logra obtener callo embriogénico

similar al obtenido de plúmulas pero a partir de raquillas, se podría obtener un protocolo

reproducible de micropropagación y clonación de plantas maduras en producción basado

en la multiplicación de callo embriogénico, formación de embriones somáticos y su

conversión a plántulas de cocotero.

CAPÍTULO I

7

CAPÍTULO I

1.1 ANTECEDENTES

1.1.1 Origen del cocotero

El centro de origen del cocotero se encuentra en la zona del Pacífico sur, se cree que

principalmente en las costas de Sudamérica y se extendió sobre toda la zona tropical

mediante una mezcla de semillas de cocotero flotantes y transporte de semillas por

humanos, sobre todo en la época de la colonización de América (Cook 1910; Harries

1978; Zizumbo-Villarreal 1996; Gunn et al. 2011).

1.1.2 Clasificación y descripción taxonómica del cocotero

El cocotero se clasifica botánicamente como:

Clase: Monocotyledoneae.

Orden: Palmales

Familia: Palmae

Subfamilia: Cocowsideae

Género: Cocos

Especie: Cocos nucifera.

Figura 1.1 Palma y nuez de cocotero

El cocotero es una planta monocotiledonea que está formada por el tronco, el cual es un

tallo no ramificado grisáceo de cuyo extremo inferior surgen las raíces y del superior la

parte foliar y floral de la planta (Figura 1.1).

El sistema radicular del cocotero se divide en tres principales tipos de raíces, las cuales

CAPÍTULO I

8

cumplen con funciones específicas. Las raíces primarias son las encargadas de la fijación

de la planta y de la absorción de agua, las secundarias, que dan lugar a las raíces

terciarias que a su vez se encargan de la absorción de nutrientes. Las raíces se localizan

en un radio de 2 metros del tronco, a una profundidad entre los 0.2 a 0.8 metros,

dependiendo de la profundidad del suelo y de la disponibilidad de agua (Alfonso y

Ramírez 2008).

En su extremo superior o ápice presenta un grupo de hojas que protegen el único

meristemo apical que posee la planta. La hoja del cocotero o frondo está formada por un

pecíolo que casi circunda el tronco, continúa un raquis del cual se desprenden de 200 a

300 folíolos. El largo de la hoja puede alcanzar los 6 metros y es menor al aumentar la

edad de la planta. En las variedades altas, la hoja puede pesar entre 10.0 y 12.0 kg. Una

planta madura emite de 12 a 16 hojas por año y la copa presenta de 25 a 30 hojas

abiertas permanentemente (Lever 1969; Alfonso y Ramírez 2008).

La palma de cocotero también posee inflorescencias paniculadas, que se desarrollan en

la parte axilar de las hojas. Cada inflorescencia de cocotero está formada por un raquis,

del cual se desprenden múltiples raquillas, las cuales a su vez tienen múltiples flores

masculinas a lo largo y una flor femenina en la base. Tanto las flores femeninas como

masculinas están protegidas por una bráctea llamada espádice, la cual a su vez se

encuentra dentro de una espata. La espada se desarrolla en 3 o 4 meses, después se

abre y libera las raquillas (Wickremasuriya 1968; Lever 1969; Perera et al. 2010).

El fruto del cocotero es una drupa monosperma, formado por una epidermis lisa, con un

solo hueso que puede pesar de 1 a 1 ½ kg rodeado de un mesocarpo fibroso y espeso

(también conocido como estopa) del cual se extrae fibra. Más al interior se encuentra el

endocarpo que es una capa fina y dura de color marrón llamada hueso o concha, envuelto

por él se encuentra el endospermo sólido (Figura 1.1) que forma una cavidad grande de

color blanco o crema de 1 a 2 cm. de espesor donde se aloja el endospermo líquido,

también conocido como agua de coco. El embrión se encuentra próximo a dos orificios del

endocarpo, envuelto por el endospermo sólido (Alfonso y Ramírez 2008).

CAPÍTULO I

9

1.1.3 Importancia del cocotero

El cultivo de cocotero es de gran importancia a nivel mundial y nacional. En la figura 1.2,

se observa que México ocupa el octavo lugar de producción de coco a nivel mundial.

Figura 1.2 Principales productores de cocotero a nivel mundial (FAO, 2013)

Por otro lado, las figuras 1.3 y 1.4 muestran que tanto las importaciones como las

exportaciones se han incrementado de manera importante a lo largo de las últimas dos

décadas lo cual nos indica que a pesar de los problemas de plagas y enfermedades el

cultivo de cocotero va en aumento junto con su uso en diversas industrias.

Figura 1.3 Importaciones a nivel mundial de cocotero de 1990 a 2013 (FAO, 2013).

CAPÍTULO I

10

Figura 1.4 Exportaciones a nivel mundial de cocotero de 1990 a 2013 (FAO, 2013).

El aumento de la exportación e importación de cocotero deja en evidencia la gran

importancia de este cultivo en la industria, debido a los múltiples productos de valor

agregado obtenidos a partir del cocotero, la demanda sigue una tendencia de aumento.

Uno de los principales productos obtenidos del cocotero es el agua de coco, la cual tiene

múltiples beneficios para la salud humana (Yong et al. 2009) y es reconocida por la FAO

como alternativa para las bebidas hidratantes debido a su contenido natural de electrolitos

(Food and Agriculture Organization of the United Nations 2000).

Otro producto es la pulpa de coco, la cual se puede usar con fines gastronómicos

(Consejo Nacional del Cocotero 2006; Philippine Coconut Authority 2014c). Además, se

puede extraer aceite de coco, el cual es de los productos de cocotero con mayor valor

agregado.

El aceite de coco virgen se extrae a parir de pulpa fresca o leche de coco sin agregar

químicos ni calentar (Quality First International 2010; Philippine Coconut Authority 2013).

Este tipo de aceite tiene usos importantes, ya que contiene altos niveles de ácido láurico,

el cual le confiere propiedades antimicrobianas que se usan en tratamientos médicos

alternativos para diversas enfermedades como el SIDA, acné bacteriano y enfermedades

cardiacas (Basri Wahid et al. 2005; Uragoda et al. 2006; Domínguez Rosales et al. 2008;

Hardon et al. 2008; Yang et al. 2009)

CAPÍTULO I

11

Otro tipo de aceite es el tipo RBD (refinado, blanqueado y desodorizado), el cual se usa

en la industria gastronómica. Cuando el aceite de coco es crudo, es decir, refinado con

procesos químicos y calentado (Quality First International 2010; Philippine Coconut

Authority 2013), es usado para la obtención de biodiesel, el cual se usa como aditivo para

reducir las emisiones contaminantes (Kalam et al. 2003; Lujaji et al. 2010).

Además de ser otra fuente de aceite de coco, la leche de coco es ampliamente usada

como sustituto de leche de origen animal (Philippine Coconut Authority 2014b; So

Delicious Dairy Free 2016).

El azúcar de cocotero es de los subproductos cuya importancia va rápidamente en

aumento, debido a sus beneficios para la salud humana al ser usada como edulcorante

debido a su bajo contenido de fructosa y bajo índice glucémico. El azúcar de coco

contiene trazas de vitamina C, potasio, fósforo, magnesio, calcio, zinc, hierro y cobre.

También aporta polifenoles, flavonoides, antocianinas, antioxidantes y vitamina B

(Cespedes 2015; Big Tree Farms 2016).

Otro producto es la fibra de coco, de la cual se obtienen sustratos (Philippine Coconut

Authority 2003), carbón activado (Consejo Nacional del Cocotero 2006) y autopartes para

importantes marcas como Mercedes-Benz® (Monteiro et al. 2005; Finkbeiner y Hoffmann

2006).

Debido al gran valor agregado de los productos obtenidos a partir del cocotero, este se

encuentra entre los primeros 30 cultivos a nivel mundial tanto en producción de fruto como

en área cosechada (Cuadro 1.1).

CAPÍTULO I

12

Cuadro 1.1 Producción y área cosechada de los principales cultivos a nivel mundial.

Clas. Cultivo Producción(Ton) Clas. Cultivo

Áreacosechada

(Ha)1 Caña de azúcar 1,905,004,434 1 Trigo 218,423,2822 Maíz 1,017,750,854 2 Maíz 186,020,5733 Arroz 738,089,040 3 Arroz 164,092,9574 Trigo 711,407,394 4 Soya 111,630,4955 Patatas 374,806,639 5 Cebada 49,192,5376 Verduras frescas 280,640,040 6 Sorgo 42,778,7437 Soya 278,092,981 7 Colza 36,295,9828 Mandioca 263,439,862 8 Semilla de algodón 32,163,510

9 Remolachaazucarera 247,382,251 9 Caña de azúcar 26,944,957

10 Tomate 164,492,970 10 Cacahuate 25,891,16911 Cebada 143,600,051 11 Semillas de girasol 25,602,05012 Sandía 109,601,914 12 Mandioca 23,939,30113* Banano 107,401,205 13 Verduras frescas 19,839,20414 Camote 102,941,357 14 Patatas 19,197,75115 Cebolla 86,974,191 15 Palma de aceite 17,983,97716* Manzana 80,822,521 16 Cocotero 12,056,33817* Uva 77,181,122 17 Batata 8,047,26818 Colza 72,844,046 18 Camote 7,247,11019* Naranja 71,579,503 19 Uva 7,155,187

20 Repollo y otrasbrasicas 71,439,100 20 Mango, mangostán

y guayaba 5,470,650

21 Pepino y pepinillo 71,395,573 21 Manzana 5,217,60122* Cocotero 62,185,313 22 Banano 5,103,03323 Sorgo 60,725,369 23 Tomate 4,762,45724 Batata 57,738,754 24 Cebolla 4,502,644

25 Palma de aceite 54,413,101 25 Remolachaazucarera 4,349,837

26 Berenjena 49,495,062 26 Naranja 4,091,28027 Semilla de algodón 45,466,502 27 Sandía 3,506,175

28 Cacahuate 44,732,856 28 Repollo y otrasbrasicas 2,443,972

29 Semillas de girasol 44,595,595 29 Pepino y pepinillo 2,120,720

30 Mango, mangostány guayaba 43,930,947 30 Berenjena 1,871,382

Clas. Clasificación; * Frutales FAO, 2013

Desde el punto de vista de valor de producción, según la FAO (2013) el cocotero 576.40

dólares por hectárea, sin embargo, los datos registrados por PROCOCO (Programa

Estratégico para Impulsar la Cadena de Valor del Cocotero 2016) indican que si se tiene

CAPÍTULO I

13

una densidad de 200 plantas por hectárea y de cada planta se cosechan 200 frutos por

año en condiciones óptimas se obtiene una producción de 40,000 nueces de coco por

año, al venderse cada nuez por $6 MN esto nos da un valor de producción de $240,000

MN por hectárea, o sea aproximadamente 12,000 dólares lo cual colocaría al cocotero

entre los primeros tres lugares en cuanto a valor de producción según los datos de FAO

(Cuadro 1.2).

Cuadro 1.2 Valor de la producción por hectárea de los principales cultivos a nivel mundial.

Clas. Cultivo Valor de la producción(Dólares/Ha)

1 Tomate 12575.832 Pepino y pepinillo 6527.783 Manzana 6488.914 Uva 6165.695 Banano 5827.786 Berenjena 5644.08

7 Mango, mangostán yguayaba 4741.89

8 Repollo y otras brasicas 3998.769 Cebolla 3994.6

10 Naranja 3373.1511 Sandía 3276.0112 Patatas 2575.1413 Verduras frescas 2396.2814 Remolacha azucarera 2320.3615 Caña de azúcar 2255.3216 Batata 1772.9317 Palma de aceite 1315.5418 Arroz 1161.3819 Mandioca 1135.6620 Cacahuate 762.9621 Camote 700.2822 Soya 622.2923 Cocotero 570.4624 Colza 489.2925 Semillas de girasol 431.8126 Trigo 393.4427 Maíz 360.5528 Semilla de algodón 355.6629 Sorgo 130.0230 Cebada 108.3

Clas. Clasificación FAO, 2013

CAPÍTULO I

14

1.1.4 Plagas y enfermedades del cocotero

Las principales plagas y enfermedades del cocotero son el amarillamiento letal (grupo

16SrIV de fitoplasmas), picudo negro (Rhynchophorus palmarum L.), ácaro del cocotero

(Eriophyes guerreronis), pudrición del cogollo (Phytophthora palmivora Butler), quemazón

de la hoja (Pestalotia palmarum) y el anillo rojo (Rhadinaphelenchus cocophilus) (Alfonso

y Ramírez 2008).

Si bien el cocotero es afectado por diferentes plagas y enfermedades, aquellas

enfermedades causadas por fitoplasmas son las que causan mayor daño en las

poblaciones de cocotero. Los principales fitoplasmas responsables se muestran en el

cuadro 1.3, en el cual se puede observar que existe gran diversidad de fitoplasmas y que

su distribución se extiende por América, Asia y África.

De todas las enfermedades causadas por fitoplasmas en palmas, las más dañinas son el

AL en América causado por el fitoplasma del grupo 16SrIV y la marchitez de cabo San

Paul (CSPW por sus siglas en inglés causada por el fitoplasma del grupo 16SrXXII en

África y que han ocasionado la perdida de millones de plantas (Harrison y Elliott 2005;

Harrison et al. 2014).

Cuadro 1.3 Cepas de referencia de especies candidatas de ‘Candidatus Phytoplasma’ y suclasificación por grupo/subgrupo RFLP del gen 16S rRNA (Harrison et al. 2014).

Cepa o taxón Clasificación Grupo RFLP 16SMiembros formalmente descritos de ‘Ca. Phytoplasma’‘Ca. Phytoplasma palmicola’ strain LYDM 178R 16SrXXII A‘Ca. Phytoplasma asteris’ 16SrI B‘Ca. Phytoplasma aurantifolia’ 16SrII B‘Ca. Phytoplasma australasia’ 16SrII D‘Ca. Phytoplasma pruni’ 16SrIII A‘Ca. Phytoplasma ulmi’ 16SrV B‘Ca. Phytoplasma ziziphi’ 16SrV B‘Ca. Phytoplasma rubi’ 16SrV D‘Ca. Phytoplasma balanitae’ ND‘Ca. Phytoplasma trifolii’ 16SrVI A‘Ca. Phytoplasma sudamericanum’ 16SrVI I‘Ca. Phytoplasma fraxini’ 16SrVII A‘Ca. Phytoplasma phoenicium’ 16SrIX D‘Ca. Phytoplasma mali’ 16SrX A‘Ca. Phytoplasma pyri’ 16SrX C

CAPÍTULO I

15

‘Ca. Phytoplasma spartii’ 16SrX D‘Ca. Phytoplasma prunorum’ 16SrX F‘Ca. Phytoplasma oryzae’ 16SrXI A‘Ca. Phytoplasma solani’ 16SrXII A‘Ca. Phytoplasma australiense’ 16SrXII B‘Ca. Phytoplasma japonicum’ 16SrXII D‘Ca. Phytoplasma fragariae’ 16SrXIIE‘Ca. Phytoplasma cynodontis’ 16SrXIV A‘Ca. Phytoplasma brasiliense’ 16SrXV A‘Ca. Phytoplasma graminis’ 16SrXVI A‘Ca. Phytoplasma caricae’ 16SrXVII A‘Ca. Phytoplasma americanum’ 16SrXVIII A‘Ca. Phytoplasma castaneae’ 16SrXIX A‘Ca. Phytoplasma rhamni’ 16SrXX A‘Ca. Phytoplasma pini’ 16SrXXI A‘Ca. Phytoplasma omanense’ 16SrXXIX A‘Ca. Phytoplasma tamaricis’ 16SrXXX A‘Ca. Phytoplasma costaricanum’ 16SrXXXI A‘Ca. Phytoplasma malaysianum’ 16SrXXXII A‘Ca. Phytoplasma allocasuarinae’ ND‘Ca. Phytoplasma lycopersici’ ND‘Ca. Phytoplasma convolvuli’ NDEspecies candidatas provisionales de ‘Ca. Phytoplasma ’ y otras cepas incidentalmentecitadas‘Ca. Phytoplasma palmae’ (AL América) 16SrIV A‘Ca. Phytoplasma cocostanzaniae’ 16SrIV CSabal palm decline phytoplasma 16SrIV D‘Ca. Phytoplasma vitis’ 16SrVIII A‘Ca. Phytoplasma luffae’ 16SrXII ACepas de ‘Ca. Phytoplasma palmicola’LDN phytoplasma, Nigeria 16SrXXII ALYDM 182 phytoplasma, Mozambique 16SrXXII ALYDM 185 phytoplasma, Mozambique 16SrXXII ACepas relacionadas con ‘Ca. Phytoplasma palmicola’CSPW (LDG) phytoplasma, Ghana 16SrXXII BCSPW phytoplasma (DNA31), Côte d’Ivoire 16SrXXII BCSPW phytoplasma (DNA19), Côte d’Ivoire 16SrXXII BCSPW phytoplasma (DNA43), Côte d’Ivoire 16SrXXII BCSPWB phytoplasma, Ghana 16SrXXII BCILY phytoplasma, Côte d’Ivoire 16SrXXII BND=No determinado

El AL, principal enfermedad en América, es causada por un fitoplasma que llega a la

planta por medio del vertor Haplaxius crudus, este homóptero transporta el fitoplasma de

una planta a otra cuando se alimenta del floema de la palma. El fitoplasma causante del

AL provoca la muerte de la palma, primero se presenta una coloración amarilla en las

hojas viejas de la palma infectada si esta no tiene frutos, en caso de tener frutos, primero

CAPÍTULO I

16

ocurre la caída de estos y después comienza la aparición del amarillamiento en las hojas,

enseguida se observa el ennegrecimiento de las inflorescencias y la coloración

amarillenta de las hojas sigue progresando hasta culminar en la defoliación total de la

palma hasta quedar como “poste de teléfono” (Figura 1.5; Tsai et al. 1976; Howard 1983;

Howard 1995; Harrison y Elliott 2005; Zizumbo-Villarreal et al. 2008)

Figura 1.5 Sintomas del amarillamiento letal en palmas de cocotero. A. Palmas sin frutosmuestran amarillamiento en el follaje. B. Palmas con frutos presentan caída de nueces. C yD. Necrosis de inflorescencia. Amarillamiento de follaje empieza en las hojas más viejas (E)

y continua hacia las jóvenes (F) (Zizumbo-Villarreal et al. 2008).

Si bien existen ecotipos de cocotero que presentan resistencia ante esta enfermedad, la

selección de dicho germoplasma debe ser realizada cuidadosamente, ya que existen

CAPÍTULO I

17

diversos grupos del mismo fitoplasma responsable del AL (Cuadro 1.2) y mismo genotipo

puede no ser resistente a todos los grupos; por ejemplo, el ecotipo Alto de Vanuatu es

altamente susceptible al AL en Jamaica, mientras que el Enano Malayo Amarillo presenta

resistencia. Por el contrario, en Ghana, el Alto de Vanuatu es resistente a CSPW mientras

que el Enano Malayo Amarillo es altamente susceptible (Dollet et al. 2009). Lo anterior

nos indica que se tiene que determinar a qué grupo de fitoplasma es resistente el ecotipo

antes de introducirlo en un área geográfica determinada.

1.1.5 Germoplasma de cocotero

El germoplasma de cocotero se divide en dos grupos principales de ecotipos: enanos y

altos. Existen diversos trabajos en los cuales se ha evaluado el rendimiento y la

resistencia a plagas y enfermedades de diversos ecotipos como el de Zizumbo-Villarreal

et al. en el 2008, en donde se establece que los ecotipos más resistentes a AL es el

enano malayo amarillo, los altos del pacífico mexicano 1 y 2 mientras que el alto del

pacífico mexicano 3 es medianamente resistente y los altos del atlántico son altamente

susceptibles (Figura 1.6).

Figura 1.6 Mortalidad total acumulada debida a amarillamiento letal por ecotipo en el ensayode San Crisanto, Yucatán, México (Zizumbo-Villarreal et al. 2008).

CAPÍTULO I

18

Con este tipo de información, se realizaron cruzas controladas de las cuales ha surgido

gran variedad de híbridos, los cuales han sido caracterizados como en el trabajo realizado

en Pailebot, Tabasco, México por Castillo y colaboradores (2012).

En este ensayo, los híbridos que mostraron mayor resistencia a AL y mayor producción

fueron las cruzas entre Enano Malayo Rojo x Alto de Tagnanana y Enano Malayo Rojo x

Alto de Vanuatu (Figura 1.7). Estos dos últimos ecotipos fueron traídos desde África y

debido a su baja disponibilidad, la multiplicación de los híbridos resultantes resulta de

gran importancia.

Rendimientos equivalentes de copra (kg/ha) dehíbridos en Pailebot, Tabasco, Mexico.

Híbrido 2008 2009 Promedio

MRD x VTT 2398 2629 2513

MRD x TAGT 2372 2266 2319

MYD x PNT01 1980 2475 2227

MYD x PNT02 1930 2076 2003

MYD x WAT+ 2012 1906 1959

MYD x MXPT14 1448 2067 1757

MYD x MXPT10 1418 1996 1707

MYD x MXPT09 1480 1825 1652

CRD x RIT+ 1366 1273 1319

MYD x MXPT02 1083 1298 1190

SLT x TAGT 916 1361 1138

VTT x TAGT 1072 1110 1091

Figura 1.7 Porcentajes de pérdidas debidas al amarillamiento letal y rendimiento de palmashíbridas en Pailebot, Tabasco, México. Datos mostrados se obtuvieron entre finales de 2005

e inicios de 2010 (Castillo et al. 2012).

Además de los híbridos generados con germoplasma que está presente en México, se

cuenta con individuos sobrevivientes al AL de híbridos de ERM y de Alto de Vanuatu, los

cuales podrían teóricamente sobrevivir al AL de México y de África (Gana, Mozambique).

Por lo que pueden considerarse como candidatos muy importantes a clonar a partir de

tejido de plantas maduras en producción como raquillas de inflorescencia inmadura.

CAPÍTULO I

19

1.1.6 Cultivo de tejidos vegetales

1.1.6.1 Conceptos generales

El cultivo de tejidos vegetales se refiere al cultivo aséptico de células, tejidos, órganos y

sus componentes bajo condiciones físicas y químicas definidas (Thorpe 2007). Desde el

primer reporte realizado sobre experimentos enfocados a la obtención de cultivos de

tejidos de plantas en 1902, se han desarrollado a lo largo de los años protocolos de

cultivos de tejidos de diferentes plantas, los cuales tienen como principales aplicaciones la

modificación y mejoramiento de plantas, obtención de plantas libres de patógenos y

resguardo de germoplasma (permite el trasporte de plantas a través de fronteras sin

dispersar plagas y enfermedades), producción de metabolitos, propagación clonal (Thorpe

2007) y propagación masiva para programas nacionales de replantación.

La propagación clonal se puede llevar a cabo de dos formas organogénesis (directa o

indirecta) y embriogénesis somática (directa o indirecta) (Thorpe 2007; Elmeer 2013) y se

puede partir de diferentes explantes como hoja, cotiledón, hipocotilo, tallo, meristemo,

entrenudo, raíz, células gaméticas (anteras y ovarios), protoplastos mesófilos,

protoplastos cotiledonares, embriones inmaduros y suspensiones celulares (Elmeer

2013). Sin embargo en el caso específico de la propagación clonal de plantas maduras en

producción, el explante inicial debe provenir de tejido somático que no sea resultado de

polinización cruzada como los embriones cigóticos.

Otro factor de gran importancia son los reguladores de crecimiento vegetal, los cuales

regulan la respuesta del tejido vegetal introducido a condiciones in vitro. Si bien existen

diferentes grupos de reguladores de crecimiento vegetal, los que tienen mayor influencia

en los procesos de propagación clonal son las auxinas y citocinias (Gaspar et al. 1996).

1.1.6.2 Embriogénesis somática

En las plantas se pueden llevar a cabo dos procesos de embriogénesis: cigótica y

somática. La embriogénesis cigótica es uno de los pasos más importantes en el ciclo de

vida de las plantas. Este proceso inicia con la doble fertilización, seguida de la

determinación de tres ejes en el embrión cigótico (longitudinal, lateral y radial) así como

CAPÍTULO I

20

de cambios morfológicos en este (forma globular, corazón, torpedo; Figura 1.8).

Posteriormente, las proteínas de almacenaje se acumulan en el embrión para que

finalmente el embrión se deshidrate y entre en dormancia. El proceso anteriormente

descrito está regulado por numerosos factores como lo son reguladores de crecimiento

vegetal, enzimas y otras sustancias relacionadas con la embriogénesis (Solís-Ramos

et al. 2012).

Por otro lado, la embriogénesis somática es el proceso mediante el cual células somáticas

generan células embriogénicas bajo condiciones de inducción (Verdeil et al. 2001; Quiroz-

Figueroa et al. 2006) que dan lugar a estructuras bipolares sin conexión vascular con el

tejido de origen. La embriogénesis somática demuestra la persistencia de la totipotencia

celular en las plantas superiores, esta cualidad permite la regeneración de plantas

completas a partir de células (Quiroz-Figueroa et al. 2006; Elmeer 2013).

Las principales diferencias entre un embrión cigótico y uno somático son la falta de

diferenciación de endospermo, la falta de desarrollo de suspensor, la falta de inducción de

dormancia y deshidratación, la fase de adquisición de competencia embriogénica de una

célula somática previa al inicio del desarrollo del embrión (Feher et al. 2003).

Los primeros reportes de inducción de embriogénesis somática se realizaron en los años

50 teniendo como modelo de estudio a la zanahoria (Steward et al. 1958; Reinert 1959) y

desde entonces numerosos reportes se han realizado para otras especies de plantas

(Elmeer 2013).

Además de la apomixis, la cual es la forma in vivo de la embriogénesis, existen tres

formas de inducir la formación de embriones somáticos: fertilización in vitro, a partir de

microesporas y embriogénesis somática in vitro (Feher et al. 2003). La embriogénesis

somática puede generarse indirectamente con la formación de callo intermedio a partir del

explante inicial (tejido a partir del cual se induce por primera vez la formación de

estructuras embriogénicas) y de manera directa, es decir sin generar callo intermedio

(Solís-Ramos et al. 2012). Otro fenómeno relacionado con la embriogénesis somática, es

la embriogénesis somática secundaria, la cual consiste en la obtención de embriones

somáticos secundarios partiendo de embriones somáticos primarios, estos últimos

CAPÍTULO I

21

generados a partir de un explante inicial (Raemakers et al. 1995).

Figura 1.8 Embriogénesis cigótica vs somática (Solís-Ramos et al. 2012)

Las ventajas de la embriogénesis somática son la alta tasa de proliferación (millones de

embriones), singularización (al estar separados del tejido de origen, los embriones pueden

ser manipulados sin la separación física requerida en sistemas de organogénesis) y

bipolaridad (los embriones desarrollados cuentan con meristemos apicales y radiculares,

indicando que la conversión a brote puede obtenerse en un solo paso) (Elmeer 2013).

Las principales aplicaciones de la embriogénesis somática son la clonación y propagación

vegetativa de una planta individual seleccionada, puede servir como sistema modelo para

el estudio molecular, citológico y fisiológico de la embriogénesis en plantas. Además es un

sistema que se puede usar para llevar a cabo mejoramiento genético y generar semillas

sintéticas a partir de los embriones somáticos (Feher et al. 2003).

CAPÍTULO I

22

1.1.6.3 Embriogénesis somática de cocotero

El cocotero es uno de los cultivos en los cuales se han desarrollado diferentes procesos

de embriogénesis somática indirecta. Los primeros trabajos fueron realizados por

Eeuwens en 1976 (Cuadro 1.4) e inicialmente consistieron en la elucidación de las

necesidades nutrimentales del cultivo in vitro de cocotero. En este trabajo se concluyó que

el medio de cultivo Y3 fue en más favorable para el desarrollo de callo embriogénico de

cocotero partiendo de hoja, meristemo e inflorescencia.

Posteriormente la investigación se enfocó en encontrar el balance de reguladores de

crecimiento necesarios para la inducción y mantenimiento de callo embriogénico de

cocotero (Eeuwens y Blake 1977; Eeuwens 1978) y se concluyó que dicho mantenimiento

se podía llevar a cabo con concentraciones de 10-6 M de auxinas; después de esta etapa,

el callo obtenido a partir de diferentes tejidos (endospermo, hoja, meristemo,

inflorescencia) se terminaba perdiendo, por lo cual se requería realizar investigación

adicional.

En 1983 Branton y Blake obtuvieron por primera vez estructuras cuya descripción coincide

con la de embriones somáticos, estas estructuras se lograron obtener en presencia de

2,4-D (10-4 M) a partir de callo inducido de tejido maduro (hoja, meristemo, inflorescencia).

En este trabajo se observa que en ausencia de 2,4-D se generaba callo de tipo

esponjoso, lo cual deja en evidencia la importancia de la auxina en el proceso de

obtención de embriones somáticos.

En los trabajos de Verdeil y colaboradores (1993 y 1994; Cuadro 1.4) se hicieron avances

que permitieron eficientar la micropropagación de cocotero vía embriogénesis somática al

determinar que las inflorescencias más jóvenes (15 y 40 cm de longitud) eran las más

responsivas en presencia de 2.5 o 3 mM de 2,4-D; a pesar de ser el primer reporte de un

sistema de regeneración de cocotero, aún no era eficiente para poder multiplicar

masivamente plantas de cocotero.

Ningún sistema de micropropagación reproducible se generó hasta el trabajo de Chan y

colaboradores en 1998 (Laboratorio de cocotero, CICY) en donde se logró la

CAPÍTULO I

23

micropropagación eficiente basada en el uso de plúmulas de embriones cigóticos como

explante inicial usando 1 µM de 2,4-D (medio 1) en condiciones de oscuridad y después

combinado con 50 µM de BAP (medio 2) en fotoperiodo. Este protocolo logró obtener

rendimientos de 57 % de inducción de callo, comparado con Verdeil y colaboradores 1994

quienes obtuvieron 30 %; además se obtuvieron 22 % de callos con embriones somáticos

los cuales germinaron y se obtuvieron 11.5 brotes por callo, de los cuales el 50 % logró

desarrollarse hasta plántula (Figura 1.9).

Figura 1.9 Regeneración de plántulas de cocotero mediante embriogénesis somática (Chanet al. 1998).

CAPÍTULO I

24

Una vez que se obtuvo un protocolo reproducible y más eficiente para la propagación de

cocotero en el Laboratorio de cocotero del CICY se continuó mejorando el proceso.

Dentro de los trabajos más relevantes se encuentran el realizado por Pérez-Núñez y

colaboradores en 2006, en el cual se implementó la multiplicación de callo embriogénico

combinado con la embriogénesis somática secundaria y se obtuvieron rendimientos de

1.3 millones de callos embriogénicos partiendo de 100 plúmulas y 9.8 millones de

embriones somáticos o 13 000 callos embriogénicos y 98 000 embriones somáticos por

cada plúmula. Cuando se comparó con los rendimientos antes obtenidos, se aumentó 35

000 veces la formación de callo embriogénico y 50 000 veces la formación de embriones

somáticos.

Con el objetivo de incrementar la generación de embriones somáticos, Azpeitia y

colaboradores realizaron trabajos de investigación en los cuales se observó que

agregando 90 µM de ABA y 15 gL-1 de PEG aumentaba 71 % la formación de embriones

somáticos, se formaban 4 veces más plántulas y la supervivencia alcanzaba el 90 %

cuando estas se aclimataban (Azpeitia et al. 2003); además en otro trabajo realizado, se

logró incrementar 3.36 veces el número de embriones somáticos tipo torpedo al subdividir

los callos de los cuales provenían (Azpeitia et al. 2009).

Cuadro 1.4 Principales trabajos de investigación realizados en embriogénesis somática decocotero.

Autor Explante Resultados

Eeuwens,1976

Meristemo,Hoja,

Inflorescencia

La división celular dio lugar a una capa superior de callo blanco. Elcrecimiento del callo fue mejor en medio Y3.

Eeuwens yBlake 1977

Meristemo,Hoja,

Inflorescencia,Endospermo

Se obtuvo callo a partir de meristemo, hoja e inflorescencia; sinembargo, este no pudo ser subcultivado. Por otro lado, se obtuvocallo a partir de endospermo del cual se aislaron protoplastos, loscuales nunca generaron pared celular durante los subcultivos.

Eeuwens 1978Tejido de

planta maduraen producción

El crecimiento celular se estimuló en presencia de auxinas (10−7 a10−6M), citocinias (10−6 a 10−5M), altas concentraciones desacarosa (0.2 M), en ausencia de NH4Cl.

CAPÍTULO I

25

1.1.6.4 Caracterización de embriogénesis somática de cocotero.

Se han realizado caracterizaciones morfo-histológicas de los sistemas de embriogénesis

somática de cocotero ya sea iniciando a partir de explantes foliares (Buffard-Morel et al.

Branton yBlake 1983 Inflorescencia Se formaron nódulos semejantes a embriones con tejido

diferenciado interno; sin embargo, no se obtuvieron embriones.

Buffard-Morelet al. 1992 Inflorescencia Obtención de callo embriogénico y embriones somáticos en baja

cantidad.

Verdeil et al.1993 Inflorescencia

Se formó callo blanco globular a partir de meristemos floralesinmaduros, dependiendo de la edad de la inflorescencia y laconcentración de 2,4-D.

Verdeil et al.1994 Inflorescencia Se indujo callo con 2.5 o 3 mM de 2,4-D y usando las

inflorescencias más jóvenes como fuente de explante inicial.

Chan et al.1998 Plúmula

Se desarrolló un protocolo para la regeneración de coco conplúmulas de embriones cigóticos maduros como explantes (Uso de2,4-D y BAP) vía embriogénesis somática.

Azpeitia et al.2003 Plúmula

Con 90 µM de ABA + 15 g L-1 de PEG: mayor formación deembriones (71 %); mayor formación de plántulas (x4); 90 % desupervivencia de las plantas obtenidas al ser aclimatadas.

Pérez-Núñezet al. 2006 Plúmula Aumento en la producción de embriones somáticos (embriogénesis

secundaria).

Perera et al.2007 Ovario

Inducción de embriogénesis somática (Uso de 100 µM de 2,4-D y0.1 % de carbón activado); sin embargo, presencia deanormalidades y la estabilidad genética no se pudo asegurar.

Perera et al.2008 Antera

Con el uso de citocininas se logró incrementar la frecuencia deembriones; sin embargo, la tasa de conversión de callo fue bajaaún con el uso de fitohormonas.

Azpeitia et al.2009 Plúmula Se incrementó 3.36 veces el número de embriones somáticos tipo

torpedo con respecto al control en los primeros 15 días de cultivo.

Perera et al.2009 Ovario

Obtención de aproximadamente 12.5 estructuras embrionarias bienformadas por ovario. Los resultados mostraron que no solopalmeras individuales, sino también explantes individualesresponden de forma diferente al cultivo in vitro.

LaboratorioCICY 2010 Raquilla Se ha generado estructuras embrionarias a partir de explantes de

raquilla (Resultados no publicados).

CAPÍTULO I

26

1992) o de plúmulas (Fernando y Verdeil 2003; Sáenz et al. 2006).

En todos los trabajos anteriores se documenta morfológica e histológicamente la

formación de callo embriogénico, la aparición de zonas meristemáticas, formación de

estructuras traslucidas, las cuales dan lugar a estructuras embriogénicas globulares y

posteriormente estructuras embriogénicas elongadas. En éstas estructuras embriogénicas

se forman los embriones somáticos, los cuales germinan y dan lugar a plántulas para así

cerrar el ciclo de regeneración de plantas de cocotero (Sáenz et al. 2006; Figura 1.10).

Figura 1.10 Representación esquemática de los cambios que ocurren durante la formacióninicial de callo obtenido de explantes de plúmula cultivados in vitro. Al día 15, se representa

CAPÍTULO I

27

la fusión de las hojas plumulares (PL) externas. Al día 30 las PL crecieron y formaron calloinicial. Al día 45 se observa la formación de la zona meristemática (MZ) cerca de la periferia

de callo. El callo forma estructuras traslucidas (TS). Al día 60 se observa la formación decentros meristemáticos (MC) en las TS. Al día 75-90 se forman estructuras embriogénicas

globulares (GES) y alargadas (EES). Las áreas blancas corresponden a otro tejido. SM,meristemo (Sáenz et al. 2006).

Cabe mencionar que ningún sistema de micropropagación de cocotero vía embriogénesis

somática iniciado a partir de explantes florales ha sido caracterizado.

1.1.6. 5 Uso de explantes de tejidos florales

Como ya se mencionó arriba, en el Laboratorio de cocotero del CICY se desarrolló un

proceso altamente eficiente, basado en adecuado balance de reguladores de crecimiento,

multiplicación de callo embriogénico y embriogénesis somática secundaria, partiendo de

plúmulas de embriones cigóticos como explante inicial, con el cual se pueden propagar

clonalmente plantas pertenecientes a genotipos élite; sin embargo, en el caso de palmas

híbridas de gran interés como las descritas en el apartado “Germoplasma de cocotero” del

presente trabajo, se necesita partir de tejido de planta madura en producción, para

asegurar propagación clonal de la planta madura en producción cuyas características han

sido determinadas. Si se llegaran a utilizar plúmulas de estos híbridos como fuente de

explante, se estarían micropropagando individuos cuyas características en campo no han

sido observadas. Debido a lo anterior, en los últimos años se han realizado trabajos de

investigación para generar un protocolo eficiente como el que existe partiendo de

plúmulas, pero partiendo de tejidos florales.

Los trabajos realizados por Perera y colaboradores se basan en el uso de ovarios (Perera

et al. 2007; Perera et al. 2009a) y anteras (Perera et al. 2008; Perera et al. 2009b) como

explante inicial. Si bien han logrado inducir formación de callo embriogénico (100 µM de

2,4-D) por problemas de contaminación y naturaleza del material no han podido

establecer un protocolo de propagación clonal eficiente.

Tratando de establecer un protocolo de propagación masiva de cocotero basado en el uso

CAPÍTULO I

28

de explantes florales, parte del trabajo de tesis doctoral de Andrade-Torres (2011)

realizado en el Laboratorio de cocotero del CICY se enfocó en hacer pruebas de

inducción de formación de callo embriogénico partiendo de explantes de ovario y raquilla

de cocotero. Los resultados de inducción no tuvieron altos porcentajes, se observó que,

en el caso de las raquillas, se podía obtener mayor número de explantes por palma a

diferencia de los embriones cigóticos y los ovarios. Los callos obtenidos fueron inducidos

a partir de explantes de raquillas y se obtuvieron resultados preliminares de multiplicación

de callo embriogénico usando el protocolo de multiplicación desarrollado para el callo

obtenido a partir de plúmula y se observó que la calidad y cantidad de callo embriogénico

aumento con los ciclos de multiplicación. Desafortunadamente este trabajo ya no se pudo

continuar y es muy importante darle seguimiento y determinar su potencial. Razón por la

cual decidió que este fuera el tema de trabajo de la presente tesis.

1.2 JUSTIFICACIÓN

El cultivo de cocotero está teniendo un resurgimiento debido a productos de alto valor

agregado. Al mismo tiempo desafortunadamente la producción mundial está decreciendo

debido a que la mayoría de las plantas viejas y por la mortífera enfermedad de AL,

poniendo en riesgo el resurgimiento comercial. Surge entonces la necesidad de reforestar

con plantas seleccionadas por su resistencia a plagas y enfermedades y alta

productividad. Para que esto se pueda dar en tiempos razonables y en forma masiva es

necesario hacerlo a través de la micropropagación, pues sería muy difícil lograrlo a través

de semilla. Además para poder micropropagar palmas elite de desempeño conocido,

necesitamos usar explantes de palmas que ya estén en etapa productiva. Basado en lo

anterior, el presente trabajo pretende establecer un protocolo eficiente de

micropropagación vía embriogénesis somática partiendo de explantes de raquilla de

inflorescencia inmadura.

CAPÍTULO I

29

1.3 PREGUNTAS DE INVESTIGACIÓN

Las preguntas de investigación del presente trabajo de tesis fueron:

¿Se pueden obtener a partir de explantes de raquilla de inflorescencia callos

embriogénicos como los obtenidos a partir de plúmula?

¿Cuáles son las condiciones más adecuadas para la obtención de callo embriogénico de

explantes de inflorescencia?

¿Se pueden generar embriones somáticos a partir de estos calos embriogénicos?

¿Los embriones somáticos pueden germinar y producir plántulas?

¿El callo embriogénico que se obtenga se puede multiplicarse como el callo embriogénico

obtenido a partir de plúmula?

¿Los embriones pueden ser usados como explantes para generar nuevo callo

embriogénico?

¿El desarrollo morfo-histológico del callo embriogénico de inflorescencia es similar al del

que se obtiene de plúmula?

1.4 HIPOTESIS

Usando raquillas como explante inicial se puede llegar a la formación de callo

embriogénico, la multiplicación de este; la posterior formación de embriones somáticos y

su conversión a plantas, lo que permitirá desarrollar un proceso de micropropagación para

la clonación de plantas maduras con desempeño conocido.

CAPÍTULO I

30

1.5 OBJETIVO GENERAL.

Establecer las condiciones para la obtención de callo embriogénico, su multiplicación, la

obtención de embriones somáticos y su conversión a plantas a partir de explantes de

raquilla de inflorescencias inmaduras de cocotero.

1.6 OBJETIVOS ESPECÍFICOS1. Establecer un protocolo para la selección y obtención de inflorescencias inmaduras

como fuente de explante inicial.

2. Establecer un protocolo para la obtención de callo embriogénico de cocotero usando

explantes de raquilla y diferentes concentraciones de reguladores de crecimiento

vegetal.

3. Determinar si las estructuras embriogénicas de los callos formados y los embriones

somáticos pueden ser usados como explantes para formación de nuevo callo

embriogénico.

4. Determinar si los embriones somáticos pueden germinar y formar plántulas.

5. Caracterizar morfológica e histológicamente el desarrollo de los explantes de raquilla

hasta la formación de callo embriogénico.

CAPÍTULO I

31

1.7 ESTRATEGIA EXPERIMENTAL

En la Figura 1.11, se puede observar en forma de diagrama la estrategia experimental.

Figura 1.11 Estrategia experimental

EstructuraEmbriogénica xn

[Explante]

[Explante]

Planta MaduraMaterial Elite

[Explante inicial]

Raquilla

Callo tipoembriogénico parcial

CalloEmbriogénico completo

EmbrionesSomáticos

Plántulas

Caracterizaciónmorfológica e

histológicaTratamientosmás eficientes

Condicionespreviamenterepotadas

25 tratamientos:5 [2,4-D]x 5 [BAP]

CAPÍTULO II

33

CAPÍTULO II

MUESTREO DE INFLORESCENCIAS DE COCOTERO

2.1 INTRODUCCIÓN

Existen diversos factores que son determinantes para la inducción de cualquier proceso

de micropropagación de plantas como lo son el genotipo de la planta a micropropagar, el

tipo de explante usado y su desarrollo fisiológico, el medio de cultivo utilizado, la fuente de

carbono y los reguladores de crecimiento vegetal (Elmeer 2013).

De todos los factores antes mencionados, la selección de explantes iniciales, así como la

fuente de estos y su desarrollo fisiológico es de vital importancia para el éxito de cualquier

proceso de micropropagación de plantas.

En múltiples trabajos de investigación, se ha demostrado el efecto significativo del tipo de

explante inicial sobre la inducción de embriogénesis somática en diferentes especies

como caña (Gandonou et al. 2005), aguacate (Zulfiqar et al. 2009), sorgo (Indra y

Krishnaveni 2009), gladiola (Tan Nhut et al. 2004), arroz (Khanna y Raina 1998), chile

(Grozeva y Todorova 2015), banano (Youssef et al. 2010) y cocotero (Eeuwens 1976;

Eeuwens y Blake 1977).

En el caso del cocotero, actualmente existe un proceso de micropropagación vía

embriogénesis somática en el cual se induce la formación de estructuras embriogénicas a

partir de plúmula (Chan et al. 1998; Pérez-Núñez et al. 2006); sin embargo, este método

de propagación masiva sólo resulta útil para clonar plantas de ecotipos como Altos del

Pacífico o Enanos Malayos. Las plantas maduras en producción de híbridos de alto

interés no pueden ser clonados a partir de tejido de embrión cigótico debido a la

segregación genética que presenta (Namboothiri et al. 2008). Mediante el uso de

plúmulas como explante inicial, sólo se puede clonar el embrión cigótico proveniente de

las semillas de las palmas de cocotero, el cual es un individuo distinto a la planta madura

del cual se obtiene.

Tomando en cuenta lo anterior, en el presente trabajo se decidió trabajar con explantes

CAPÍTULO II

34

provenientes de raquillas de cocotero de híbridos seleccionados con la finalidad de poder

inducir la formación de estructuras embriogénicas e iniciar un proceso de

micropropagación de plantas maduras en producción, incluyendo híbridos de cocotero

basado en el uso de tejido de rachilla de inflorescencias inmaduras como explante inicial,

con el cual se pretende clonar individuos adultos de desempeño conocido y obtener

plantas idénticas la planta madre que conserven las características agronómicas y de

resistencia a plagas y enfermedades.

2.2 MATERIALES Y MÉTODOSPara el presente trabajo, se eligió como fuente de explante inicial raquillas de cocotero

provenientes de inflorescencias. Para obtener las inflorescencias necesarias para los

experimentos se realizaron dos muestreos.

El primer muestreo se realizó en San Crisanto, Yucatán, México (21° 20’ LN, 89° 09’LW) y

se colectaron inflorescencias de una palma híbrido MYD x MXPT de 15 años, de estas

inflorescencias se eligieron aquellas usadas como fuente de explante inicial en el primer

experimento de inducción de embriogénesis somática.

El segundo muestreo se colectaron inflorescencias de dos palmas híbrido MRD x TAGT

de 10 años para realizar el segundo experimento de inducción de embriogénesis

somática. Este segundo muestreo se realizó en Pailebot, Tabasco, México (18° 14’ LN,

94° 0’LW).

Con la finalidad de extraer las inflorescencias, en ambos muestreos se cortó el tronco de

la palma para que esta caiga al suelo y se manipule con menos dificultad. Una vez

cortada la palma, el tronco se corta lo más cerca posible de la copa. Enseguida, se

procede a eliminar las hojas desde su base de forma envolvente hasta llegar a la primera

inflorescencia cerrada. La inflorescencia abierta más joven corresponde a la etapa 0, por

lo cual la primera inflorescencia cerrada que se encuentra corresponde a la etapa -1 y así

consecutivamente (Perera et al. 2010, Figura 2.1).

CAPÍTULO II

35

Figura 2.1 Diagrama esquemático del desarrollo de las inflorescencias dentro de la coronade palma de coco. Las espatas se localizan en cada base de hoja y llegan hasta el

meristemo apical de la palma (Perera et al. 2010).

Teniendo cuidado de no romper la capa superficial de la inflorescencia, la hoja a la cual

está pegada se separa desde su base (Figura 2.2 A y B). Una vez que la hoja está

separada de su base, se realizan tres cortes en la base de la inflorescencia para separarla

de la hoja (Figura 2.2 C y D). Ya que la inflorescencia se separó de la hoja, esta se mide

tomando en cuenta su ancho y largo (Figura 2.2 E). Cabe mencionar que las

inflorescencias para la obtención de explantes deben medir entre 5 y 40 cm de largo para

que su manipulación en campana de flujo laminar sea adecuada.

CAPÍTULO II

36

Figura 2.2 Muestreo de inflorescencias de híbridos de cocotero. (A y B) Separación de hojade cocotero con inflorescencia unida, (C) Inflorescencia antes de ser separada de la hoja

ejemplo en campo y (D) representación esquemática, las líneas rojas representan los sitiosen los cuales se debe cortar para separar la inflorescencia de la hoja. (E) Sitios de medición

de diferentes inflorescencias.

Después de medir las inflorescencias, se limpiaron superficialmente, enjuagándolas con

agua destilada. Después, cada inflorescencia se roció con solución de cloro comercial al

50 % y nuevamente se enjuagaron con agua destilada. Posteriormente, las

inflorescencias se rociaron con etanol al 70 % después de lo cual se enjuagaron con agua

destilada.

Una vez que se limpiaron las inflorescencias, se envolvieron de manera individual en

papel absorbente previamente humedecido con agua destilada.

CAPÍTULO II

37

Las inflorescencias envueltas se colocaron de manera individual en una bolsa de plástico

y se amarra con una liga. Ya que las inflorescencias se embolsaron, cada bolsa se

etiquetó con un trozo de cinta aislante sobre el cual se escribe con marcador permanente

los siguientes datos de identificación (Genotipo, Número de inflorescencia, Fecha de

muestreo).

Como ya se mencionó, cada inflorescencia se guardó en bolsas de plástico transparente

individuales y después de ser etiquetadas, se colocaron en una bolsa negra más grande.

Enseguida, las bolsas que contienen las inflorescencias se introducen en una hielera en la

cual previamente se colocó hielo o bolsas de gel congeladas para finalmente ser

transportadas al laboratorio en el cual se establecieron in vitro.

2.3 RESULTADOS

Durante el primer muestreo se colectaron 13 inflorescencias de una palma de cocotero

perteneciente al híbrido MYD x MXPT. En la figura 2.3 podemos observar la diferencia

morfológica entre las inflorescencias de una misma palma dependiendo de su estado de

desarrollo.

Figura 2.3 Inflorescencias del híbrido MYD x MXPT.

CAPÍTULO II

38

Como parte de la caracterización morfológica de las inflorescencias, se tomaron medidas

de ellas (Cuadro 2.1) para poder tener otro factor que nos ayudara a establecer criterios

de selección de inflorescencias como fuente de explante.

En el cuadro 2.1 se puede observar que mientas el número de inflorescencia decrece,

también se reduce la longitud y el ancho de la inflorescencia. Otro punto importante es

que, el alto y ancho de la inflorescencia sin espádice y espata representa

aproximadamente el 40 % de las medidas tomadas con espata, lo cual se tiene que tomar

en cuenta ya que el tamaño de las raquillas expuestas influye en la cantidad de explantes

por inflorescencia que se obtendrán.

Cuadro 2.1 Medidas de inflorescencias del híbrido MYD x MXPT.

No. DeInflorescencia

Medidas con Espata(cm)

Medidas sin Espádice(cm)

Longitud Ancho Longitud Ancho-1 96.5 10.5 52.5 6.4-2 84 11 47.7 5-3 48.5 10.3 28.7 4.4-4 34.3 7.4 14.5 3-5 22.3 5.7 9 2-6 12.3 4.5 4 1.4-7 6.6 4.2 2.7 1.4-8 4.1 3.7 1.8 1.1-9 3.1 3.1 1.1 0.9

-10 2.8 2.7 0.8 0.7-11 2.1 2.3 0.5 0.5-12 1.8 1.9 0.4 0.4-13 1.4 1.4 0.2 0.2

En el caso del híbrido MYD x MXPT se seleccionaron las inflorescencias -4, -5 y -6 como

fuente de explante inicial, basándose en el trabajo de Perera y colaboradores (2010) ya

que según los autores estas inflorescencias inmaduras aún no tienen formación de células

gaméticas en el tejido masculino o sea las raquillas, por lo cual se asegura que todo el

material vegetal proveniente de estos explantes será genéticamente idéntico a la planta

madre.

CAPÍTULO II

39

Además, las inflorescencias -4, -5 y -6 de esta palma tenían un tamaño adecuado para su

óptima manipulación en la campana de flujo laminar y así reducir la posibilidad de

contaminación.

En el caso del segundo muestreo también se documentó la morfología de las

inflorescencias pertenecientes a dos palmas del híbrido MRD x TAGT (Figura 2.4).

Figura 2.4 Inflorescencias del híbrido MRD x TAGT.

CAPÍTULO II

40

Haciendo una comparación entre las inflorescencias colocadas en la misma posición en

palmas diferentes, se observa que el desarrollo morfológico no coincide con la posición en

la palma; es decir, no todas las inflorescencias -1 tienen las mismas dimensiones y eso

ocurre en el caso de todas las demás inflorescencias a pesar de que ambas palmas

pertenecen al mismo genotipo (Figura 2.4).

Al observar las medias de las inflorescencias de las palmas pertenecientes al híbrido

MRD x TAGT (Cuadro 2.2) se corrobora lo antes observado en la figura 2.4, ya que las

inflorescencias que se encuentran en la misma posición de la palma no tienen las mismas

dimensiones de longitud y ancho.

Cuadro 2.2 Medidas de inflorescencias del híbrido MRDxTAGT.

No. DeInflorescencia

Medidas Palma 1 (cm) Medidas Palma 2 (cm)Longitud Ancho 1 Ancho 2 Longitud Ancho 1 Ancho 2

-1 138.5 9 12.5 153.5 14 13.5-2 124 7 13 155 12 17-3 105 6 14 135 8.5 15.5-4 66.5 12.7 - 98 15 --5 53 11.5 - 78 14.5 --6 39 9 - 57.5 12 --7 21.5 6 - 38 7.5 --8 10 5.3 - 20 6 --9 6 4 - 9.8 4.5 -

-10 - - - 6 3.8 -

Basándose nuevamente en el trabajo de Perera y colaboradores (2010), en la óptima

manipulación de las inflorescencias en condiciones asépticas en la campana de flujo

laminar y en los resultados obtenidos en el primer experimento de inducción con las

inflorescencias -4, -5 y -6 del híbrido MYD x MXPT (presentados más adelante), se

seleccionaron las inflorescencias -6, -7, -8 y -9 de la palma 1 y -7,-8, -9 y -10 de la palma

2, ya que estas cumplían con las características adecuadas antes descritas, sobre todo el

tamaño de las inflorescencias.

CAPÍTULO II

41

2.4 DISCUSIÓN

Con la finalidad de optimizar la micropropagación de material vegetal de alta importancia

de cocotero, sobre todo híbridos, se realizó una selección meticulosa de la fuente de

explante usada. Para poder clorar palmas híbridas evitando la segregación que presentan

los embriones cigóticos (Namboothiri et al. 2008), se requería inducir la formación de

estructuras embriogénicas a partir de tejido maduro, por lo cual se seleccionaron

inflorescencias de cocotero.

En el trabajo realizado por Perera y colaboradores 2010, se describen las características

de cada inflorescencia, y establecen que a partir de la etapa -26 se reconoce una

pequeña masa celular ubicada en el eje de la hoja lo cual corresponde al primordio de la

inflorescencia el cual se diferencía a partir del meristemo apical de la palma.

Posteriormente, en la etapa -17 inicia la formación de la raquilla, sin embargo, hasta la

etapa -10, las células del tejido de inflorescencia presentan una baja relación núcleo-

citoplasma, lo cual indica inactividad. Es hasta la etapa -9 que estos grupos de células

inician actividad mitótica y dan lugar a los primordios florales, los cuales son centros de

células desdiferenciadas con gran actividad. A partir de la inflorescencia -4 la actividad

celular baja nuevamente ya que todos los tejidos florales, tanto masculino como femenino

se han diferenciado completamente.

Tomando en cuenta lo anterior, se determinó que el rango de desarrollo adecuado para

que el tejido floral se pudiera usar como explante inicial para inducción de embriogénesis

somática es de -5 a -9.

Si bien el trabajo de Perera y colaboradores 2010 sirve de guía para elegir la fuente de

explante inicial, este trabajo se basó en las inflorescencias de dos palmas del ecotipo Alto

de Sri Lanka, lo cual sólo nos da una idea de lo que puede ocurrir en otros ecotipos, ya

que durante los dos muestreos realizados en el presente trabajo se observó que el

desarrollo de las inflorescencias de ambos híbridos (Figura 2.3 y 2.4, Cuadro 2.1 y 2.2)

resulta evidente la diferencia de tamaños entre inflorescencias que se encuentran en la

misma posición, por lo cual la posición no parece indicativa de la etapa de desarrollo.

Tomando esto en cuenta, la posición de la inflorescencia en la palma no es un criterio

CAPÍTULO II

42

adecuado para seleccionar las inflorescencias que serán fuente de explante.

A pesar de que la posición de la inflorescencia en la palma no es un criterio adecuado

para la elección de inflorescencias para fuente de explantes iniciales, la longitud de las

inflorescencias resultó ser un marcador morfológico adecuado del desarrollo, sin importar

la posición en la palma y aparentemente genotipo. Debido a lo anterior, y como se

muestra más adelante, se puede decir que la longitud de las inflorescencias es un criterio

confiable para elegir inflorescencias con el mismo desarrollo fisiológico y obtener la mejor

respuesta en cuanto a formación de callo embriogénico se refiere.

La respuesta embriogénica de las diferentes inflorescencias se estudió y se reporta en el

capítulo 3. Tomando en cuenta esta información, la asociación entre el desarrollo

fisiológico, longitud de la inflorescencia y la respuesta embriogénica se describe

detalladamente en el capítulo 4.

CHAPTER III

43

CHAPTER III

IMPROVED FORMATION OF EMBRYOGENIC CALLUS FROM COCONUTIMMATURE INFLORESCENCE EXPLANTS

Authors: G. Sandoval-Cancino, L. Sáenz, J.L. Chan and C. Oropeza

Journal: In Vitro Cellular and Developmental Biology - Plant

Status: Online publication.

3.1 INTRODUCTION

The coconut palm (Cocos nucifera L.) is a crop species with a rising economic value,

cultivated in nearly 90 countries on 12 million ha (Solís-Ramos et al. 2012). Interest in

coconut products has been rapidly increasing around the world over the past 10 years; in

particular, the market for packaged coconut water has grown rapidly in Brazil, the United

States, and Europe (Roolant 2014). This positive and sustained market growth needs to

be matched with an increase in fruit production. However, losses caused by old age of

palms, pests, and diseases, in particular lethal yellowing (LY) diseases in the Americas

(Harrison and Oropeza 2008) and Africa (Eden-Green 1997) and cadang-cadang in the

Philippines (Harold and Randles 1991), are a significant challenge to increasing the scale

of production in most coconut-producing countries.

In order to sustain the required production for the current and future demand of coconut

products, producing countries need to renew their plantations and increase the cultivation

area. To achieve this goal, a very large number of plants propagated from germplasm

selected for disease resistance and high productivity is required. This increase in

production capabilities is difficult to achieve while depending only on propagation through

seed. For this reason, alternative means of propagation need to be considered, such as in

vitro propagation or micropropagation by somatic embryogenesis (Solís-Ramos et al.

2012).

The development of micropropagation protocols for coconut has progressed slowly as this

CHAPTER III

44

monocot species has been difficult to regenerate, but it has recently been achieved

through somatic embryogenesis (Sáenz-Carbonell et al. 2013). Among the explants

tested, plumules from zygotic embryos have been the most responsive tissue in terms of

embryogenic callus formation, somatic embryo production, and somatic embryo

conversion to plantlets (Chan et al. 1998; Azpeitia et al. 2003). A mass-propagation

protocol has recently been developed, starting with plumule explants through the

production of embryogenic callus and its multiplication, with estimated yields of 100,000

somatic embryos per explant (Pérez-Núñez et al. 2006).

This protocol, currently being scaled up in Mexico, can be used to propagate the progeny

of selected plants from seeds obtained by controlled pollination. However, it is not useful to

propagate hybrid palms using their seed because of segregation (Namboothiri et al. 2008).

Furthermore, to propagate adult palms that are already bearing fruit and have known

measured performance will require a different source of explant tissue such as rachillae

from immature inflorescences, as early reports showed the formation of callus from

rachillae (Brackpool et al. 1986; Sugimura and Salvaña 1989; Blake 1990). Further testing

of these explants showed reproducible formation of embryogenic callus (Verdeil et al.

1994; Vidhana Arachchi y Weerakoon 1997), but the efficiency of formation of somatic

embryos and plantlet conversion was not determined. More recent reports with other floral

tissues, namely, anthers (Perera et al. 2008) and unfertilized ovaries (Perera et al. 2009a),

allowed the consistent formation of embryogenic callus, although with low frequencies.

The abovementioned reports show that the use of floral tissue explants capable of forming

embryogenic callus represents an opportunity to develop highly efficient protocols based

on embryogenic callus multiplication, as reported for plumule explants (Pérez-Núñez et al.

2006).

Such a protocol could be very useful to clone elite hybrid palms already known for high

productivity and resistance to diseases. In a trial in Mexico, 12 coconut hybrids were

evaluated for disease resistance and productivity, including hybrids locally produced and

hybrids produced abroad and introduced into Mexico (Castillo et al. 2012). Two of the

introduced hybrids (Malayan Red Dwarf × Vanuatu Tall and Malayan Red Dwarf ×

Tagnanan Tall) showed the highest copra production and lowest rates of loss due to LY

disease (Castillo et al. 2012). Only a few plants of these two hybrids are present in Mexico.

CHAPTER III

45

Therefore, the objective of the present study was to define the conditions for the

production and multiplication of embryogenic calluses and to determine their capability to

form somatic embryos that are able to convert into plantlets. Rachilla explants obtained

from the hybrids of interest were used.

3.2 MATERIALS AND METHODS

3.2.1 Plant materials

Rachilla explants were obtained from immature inflorescences of different developmental

stages ranging from −4 to −10, with 0 corresponding to the youngest opened inflorescence

(Perera et al. 2010). Three batches of immature inflorescences were collected. The first

two batches were for experimental trials carried out to define conditions to induce

embryogenic callus formation, and the third batch was for testing the defined conditions.

Inflorescences used for the first batch (trial 1) were of stages −4, −5, and −6 from a 15-

year-old Malayan Yellow Dwarf × Mexican Pacific Tall (MYD × MXPT) hybrid palm growing

at San Crisanto, Yucatán, Mexico (21°21′03.7″N 89°11′07.9″W). For the second batch (trial

2), inflorescences used were from two 10-yearold Malayan Red Dwarf × Tagnanan Tall

(MRD × TAGT) hybrid palms: developmental stages were −6 to −9 for palm 1 and −7 to

−10 for palm 2, both palms growing at Pailebot, Tabasco, Mexico (18°16′04.4″N

93°56′49.6″W). The third batch of immature inflorescences, also from Pailebot, was

obtained from five additional MRD × TAGT hybrid palms and five Malayan Red Dwarf ×

Vanuatu Tall (MRD × VTT) hybrid palms. For all the plants in this third batch,

inflorescences were selected according to a size of approximately 10 cm in length.

Inflorescences obtained in the field were rinsed with distilled water and 70% (v/v) ethanol

for 3 min during collection. Under aseptic laboratory conditions, the immature

inflorescences were washed in 70% (v/v) ethanol for 3 min, rinsed three times with sterile

distilled water, washed again in Cloralex 50 % (v/v) (commercial bleach, 30 g L-1 NaOCl,

Alen, Monterrey, Mexico) for 20 min, and finally rinsed three times with sterile water. The

two spathes were excised and the rachillae were separated and placed in a sterile solution

of ascorbic acid (0.15 g L−1), citric acid (0.1 g L−1), and sucrose (30 g L−1). All chemicals

were reagent grade (Sigma-Aldrich®, St. Louis, MO, USA). Then, 0.3 to 0.5-mm rachilla

CHAPTER III

46

slices were obtained and placed directly on culture medium.

3.2.2 Media preparation and culture conditions

Medium preparation and culture conditions were according to Pérez-Núñez et al. (2006).

The preparation of the different media was based on a medium defined as medium I,

prepared with Y3 medium formulation (Eeuwens 1976) supplemented with 3 g L−1 Gelrite™

and 2.5 g L−1 activated charcoal (Sigma-Aldrich®, C6289), without growth regulators.

Medium pH was adjusted to 5.75 with KOH before autoclaving for 20 min at 120°C. The

media for both trial 1 and trial 2, designed to define the best conditions for induction of

embryogenic callus, were prepared with the medium I formulation supplemented with

growth regulators combined at different concentrations for testing explant response

(details described in “Experimental design” section below). Explants were cultured for 90 d

in a 35-ml glass vessel (Vitro, Tlalnepantla, Mexico) with polypropylene closure (Möller,

Nezahuatcoyotl, Mexico) with 10 ml of medium, under complete darkness at 27±2°C and

without subculturing.

Callus multiplication was carried out by using embryogenic structures isolated from the

calluses as explants. They were cultured for 90 d in a 35-ml glass vessel with 10 ml of

medium II (prepared with medium I formulation supplemented with 0.65 mM 2,4-

dichlorophenoxyacetic acid [2,4-D]), under complete darkness at 27±2°C and without

subculturing. For induction of somatic embryo formation, embryogenic calluses were

cultured for 30 d in a 100-ml glass vessel (Vitro, Tlalnepantla, Mexico) with polypropylene

closure (Möller, Nezahuatcoyotl, Mexico) with 25 ml of medium III (prepared with medium I

formulation supplemented with 0.325 mM 2,4-D) under complete darkness at 27±2°C and

without subculturing.

For germination of somatic embryos and shoot formation, embryogenic calluses were

cultured in a 100-ml glass vessel with 25 ml of medium IV (prepared with medium I

formulation supplemented with 0.006 mM 2,4-D, 0.3 mM 6-benzylaminopurine [BAP], and

0.0046 mM gibberellic acid [GA3]) under a 16-h photoperiod (45–60 μmol m−2 s−1

photosynthetic photon flux density [PPFD] provided by Tri-Phosphor (F32T8, 6500K, 32W)

daylight tubes (MAGGMR, Tlatilco, Mexico) at 27±2°C and subculturing every 2 mo for a

CHAPTER III

47

total of 3 subcultures.

For plantlet formation, shoots were cultured in a 500-ml glass vessel (Vitro, Tlalnepantla,

Mexico) with polypropylene closure (Möller, Nezahuatcoyotl, Mexico) with 50 ml medium V

(prepared with medium I formulation supplemented with 0.006 mM 2,4-D and 300 mM

BAP), under a 16-h photoperiod (45–60 μmol m−2 s−1 PPFD) at 27±2°C, and subculturing

every 2 mo for a total of three subcultures.

The 2,4-D concentration of 0.65 mM used in medium II was defined experimentally from

trials I and II (see Results). The growth regulator concentrations in media III, IV, and V

were according to Pérez-Núñez et al. (2006).

3.2.3 Experimental design

As described above, two trials were performed to define conditions for the induction of

embryogenic callus from rachilla explants. For the first one, 25 media were prepared by

combining five concentrations of 2,4-D with five concentrations of BAP and were referred

to as treatments T1 to T25 (Table 1). These media were evaluated to determine from

which one the best embryogenic callus induction response could be obtained from rachilla

explants of immature inflorescences of stages −4, −5, and −6 of a MYD × MXPT hybrid

palm.

Table 3.1 Media with different combinations of concentrations of 2,4-D and BAP used forsomatic embryogenesis induction.

The three best treatments resulting from the first trial were evaluated in a second trial to

determine what conditions produced the best embryogenic callus induction response from

rachilla explants of immature inflorescences of stages −6 to −9 of palm 1 and stages −7 to

BAP (mM) 2,4-D (mM)0.01 0.05 0.2 0.4 0.65

0 T1 T5 T11 T16 T210.01 T2 T7 T12 T17 T220.02 T3 T8 T13 T18 T230.04 T4 T9 T14 T19 T240.05 T5 T10 T15 T20 T25

2,4-D 2,4-dichlorophenoxyacetic acid, BAP 6-benzylaminopurine

CHAPTER III

48

−10 of palm 2 of the MRD × TAGT hybrid.

3.2.4 Histology

Histological procedures followed Buffard-Morel et al. (1992) with slight modifications as

outlined by Sáenz et al. (2006) and Montero-Cortés et al. (2010). The samples of tissues

to be studied were placed for 24 h in a pH 7.2 phosphate buffer solution containing 4%

(w/v) paraformaldehyde. They were then subjected to dehydration in an aqueous solution

of ethanol, increasing concentration stepwise from 30% to 100% (v/v) within a 7-h period.

The samples were impregnated with JB-4R resin (Polyscience, Warrington, PA, USA), and

5-μm sections were obtained with a HM 325 Microtome (Thermo Fisher Scientific,

Waltham, MA, USA.) and stained with periodic acid-Schiff (PAS) reagent combined with

protein specific naphthol blue-black according to Fisher (1968).

3.2.5 Statistical analysis

A completely randomized design was used in both trials. The data presented correspond

to means. In every trial, one explant was considered an experimental unit and a replicate.

The number of replicates used per treatment varied between 30 and 105; the number of

replicates in each case is indicated in corresponding table legends. Data were subjected to

analysis of variance (ANOVA) and the procedure for mean comparisons (Tukey test at

P<0.05 or P<0.01) was performed with SAS version 9.0 software.

3.3 RESULTS

3.3.1 Induction of callus from rachillae explants

By the end of the 90-d culture period, some of the rachilla explants from batch one, stage

−6 (outer spathe length of 12.3 cm) inflorescence had formed calluses that had necrotic

tissue associated with pearly white tissue (Fig. 3.1A parts a and b).

CHAPTER III

49

Figure 3.1 Formation of callus from rachilla explants of a Malayan Yellow Dwarf × MexicanPacific Tall (MYD × MXPT) hybrid palm. (A) Rachilla explants (inflorescence development

stage −6) after 90 d of in vitro culture on mediun I. (a, b) Explants that formed calluses withembryogenic structures. (c, d) Explants that formed spongy callus (c) or without callus

formation, showing necrotic tissue (d). (B) Rachilla explants (inflorescence developmentstage −5) after 90 d of in vitro culture on medium II. (a, b) Explants that formed calluses with

embryogenic structures. (c, d) Explants that formed spongy callus (c) or without callusformation, showing necrotic tissue (d).

The formation of calluses with embryogenic structures (described in detail below) was

associated with certain treatments. Four of them were combinations of 0.4 mM 2,4-D with

or without BAP, five contained 0.65 mM 2,4-D with or without BAP, and the last one

contained 0.01 mM 2,4-D and 0.04 mM BAP (Table 3.2).

CHAPTER III

50

Table 3.2 Formation of callus with embryogenic structures from coconut rachilla explants(inflorescence stage −6) after 90 d of in vitro culture in 25 different treatments.

mM Percentage of explants producing embryogenic callus2,4-D

BAP 0.01 0.05 0.2 0.4 0.65

0 0 a 0a 0a 3.3 a 16.6 a0.01 0 a 0a 0a 6.6 a 16.6 a0.02 0 a 0a 0a 13.3 a 16.6 a0.04 3.3 a 0a 0a 10.0 a 10.0 a0.05 0 a 0a 0a 0.0 a 6.6 aC.V. 127.18

Each treatment was prepared with medium I formulation supplemented with different combinationsof 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D) and 6-benzylaminopurine (BAP) concentrations, asshown. The rachilla explants were obtained from an inflorescence of development stage −6 from aMalayan Yellow Dwarf × Mexican Pacific Tall (MYD × MXPT) hybrid coconut palm. Data shown areaverages of 30 repetitions Values followed by the same letter within the same column are notsignificantly different according to the Tukey test (P≤0.01). Significance and coefficient of variation(C.V.) were determined using a (√ + 1) transformation.

Similar results were obtained with rachilla explants from stage −5 (22.3 cm) inflorescences

(Fig. 3.1B parts a and b). Pearly white structures formed only on media with 0.65 mM 2,4-

D, with or without BAP (Table 3.3). In the rest of the treatments with explants from stage

−6 or −5 inflorescences, growth was observed, but it was spongy callus (part c of Figs

3.1A and 3.1B) or necrotic tissue (part d of Figs 3.1A and 3.1B).

In the case of explants from stage −4 (34.3 cm) inflorescence (not shown), no callus with

pearly white structures was formed; the calluses formed showed only the appearance of

spongy tissue as observed in some calluses from inflorescences of stages −6 and −5 (part

c of Figs 3.1A and 3.1B, respectively).

In the case of inflorescence stage −5, calluses with pearly white structures were formed

only on media with 0.65 mM 2,4-D, with or without BAP (Table 3.3). In the rest of the

treatments, with explants from either stage −6 or −5 inflorescences, growth was observed,

but it was spongy callus (part c of Figs 3.1A and 3.1B) or necrotic tissue (part d of Figs

3.1A and 3.1B). With explants from stage −4 inflorescence, no callus with pearly white

structures was formed with any of the 25 treatments used (not shown).

CHAPTER III

51

Table 3.3 Formation of callus with embryogenic structures from coconut rachilla explants(inflorescence stage −5) after 90 d of in vitro culture in 25 different treatments.

mM Percentage of explants producing embryogenic callus2,4-D

BAP 0.01 0.05 0.2 0.4 0.65

0 0c 0c 0c 0c 18.4 a0.01 0c 0c 0c 0c 0.0 c0.02 0c 0c 0c 0c 10.5 ab0.04 0c 0c 0c 0c 0.0 c0.05 0c 0c 0c 0c 2.6 bcC.V. 85.54

Each treatment was prepared with medium I formulation supplemented with different combinationsof 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D) and 6-benzylaminopurine (BAP) concentrations, asshown. The rachilla explants were obtained from an inflorescence of development stage −5 from aMalayan Yellow Dwarf × Mexican Pacific Tall (MYD × MXPT) hybrid coconut palm. Data shown areaverages of 38 repetitions Values followed by the same letter within the same column are notsignificantly different according to the Tukey test (P≤0.01). Significance and coefficient of variation(C.V.) were determined using a (√ + 1) transformation.

From a quantitative point of view, the percentages of rachilla explants from inflorescence

stage −6 forming embryogenic callus by day 90 varied from 3.3% to 16.6% among those

treatments that showed a response (Table 3.2). The highest yields were obtained using

0.65 mM 2,4-D combined with different concentrations of BAP, but the differences among

BAP levels were not statistically significant. In the case of rachilla explants from

inflorescence stage −5, the percentage of embryogenic callus formation varied from 2.6%

to 18.4% among those treatments that showed a response (Table 3.3). These responses

were obtained when 0.65 mM 2,4-D was used, regardless of the presence of BAP. The

highest percentage was obtained without BAP, which was significantly better than most

other treatments.

3.3.2 Histological analysis of callus induced from rachillae

At day 30 of culture, transverse sections showed that the body of the rachilla was still

present and that callus tissue (Fig. 3.2A) was formed from the floral meristem (Fig. 3.2B).

The center of the rachilla showed groups of procambium and xylem cells (Fig. 3.2C). At

day 60 transverse sections showed a compact structure (Fig. 3.2D) formed by stained

small meristematic cells at the periphery, and the inner body of the callus was formed by

parenchyma and xylem cells (Fig. 3.2E, F).

CHAPTER III

52

The peripheral cells had a visible nucleus of irregular shape, without a clearly defined

nucleolus. The cells also revealed densely stained cytoplasm, indicating high metabolic

activity (Fig. 3.2G).

Figure 3.2 (A) Callus with pearly white structures formed after 30 d of culture on rachillaexplant of a Malayan Yellow Dwarf × Mexican Pacific Tall (MYD × MXPT) hybrid palm, and (B)

corresponding histological section. (C) Magnification [40×] of section designated in (B),showing vascular cambium and xylem tissues. (D) Callus after 60 d with formations

resembling embryogenic structures, and (E, F) corresponding histological sections of theseformations. (G) Magnification [40×] of part of section shown in (F). ES embryogenic

structure, TS translucent structure.

3.3.3 Formation of fully developed embryogenic callus from embryogenic structures

The white pearly structures (referred to as embryogenic structures from here on) from the

calluses obtained with explants from inflorescence stages −6 and −5 were isolated and

subcultured on medium II. This operation was repeated two times, starting each time from

the embryogenic structures obtained from the calluses formed in the previous subculture

(Table 3.4 part A).

CHAPTER III

53

Table 3.4 Embryogenic callus and somatic embryo formation from different starting tissuesoriginally obtained from rachilla explants from inflorescences at developmental stages −5and −6 of a MYD × MXPT hybrid coconut palm.

Action induced Starting tissue forculturez

Subculture

Inflorescence-5 -6

% Explants responding

A. Embryogenic callusformation

Embryogenicstructure explants

1 9.3 11.12 30.0 30.23 57.1 44.9

% Calli respondingB. Somatic embryo

formation onembryogenic callus

Whole embryogeniccallus 4 NA 21.4

% Explants respondingC. Embryogenic callus

formation Somatic embryos 5 NA 18.1 Embryogenic

structure explants6 NA 15.67 NA 36.6

zEmbryogenic structure explants and somatic embryos were cultured for 90 d on medium II; fullyembryogenic callus was cultured for 30 d on medium IIIMYD × MXPT Malayan Yellow Dwarf × Mexican Pacific Tall, NA not available.

In each of the three subcultures, new calluses with embryogenic structures were formed

without necrotic or spongy tissues. Fig. 3.3 shows the development of embryogenic callus

from embryogenic structure explants during the last subculture. Within the first 45 d of

culture the explants grew and developed translucent structures with an arlike shape that

became more abundant with time. By day 75 new structures resembling embryogenic

structures grew on the translucent structures. The first embryogenic structures observed

were globular embryogenic structures followed by the appearance of elongated

embryogenic structures, both of which became more abundant with time. By day 90 fully

developed embryogenic calluses were formed.

CHAPTER III

54

Figure 3.3Morphological changes occurring during the development of embryogenic callusinduced from embryogenic structures used as explants. These embryogenic structures wereisolated from embryogenic calluses originally obtained from coconut rachilla explants of a

Malayan Yellow Dwarf × Mexican Pacific Tall (MYD × MXPT) hybrid palm. Explants werecultured in vitro on medium II for the formation of embryogenic callus (T0–T90 culture timesfrom 0 to 90 d). Embryogenic calluses were subcultured on medium III for somatic embryo

induction (SEI T30-T60 culture times 30 and 60 d). TS translucent structure, TS+EStranslucent structure with embryogenic structure, GES globular embryogenic structure, EES

elongated embryogenic structures, SE Somatic embryo, SEI Somatic embryo induction.

CHAPTER III

55

The proportion of embryogenic structure explants forming fully developed embryogenic

callus increased with each subculture from 9.3% to 57.1% (explants originated from stage

−5 inflorescence) and 11.1% to 44.9% (explants originated from stage −6 inflorescence)

(Table 3.4 part A).

3.3.4 Histological analysis of embryogenic callus formation from embryogenicstructures

Histological analysis of isolated embryogenic structures (Fig. 3.4A) placed on medium II to

induce the formation of embryogenic callus showed that by day 30 of culture, translucent

structures with an ear-like shape had developed on compact callus. These translucent

structures consisted of meristematic cells with a densely stained cytoplasm (Fig. 3.4B).

Within the next 30 d the translucent structures became more abundant and larger, and by

day 60 histological sections showed arrays of small meristematic cells in their peripheral

tissues (Fig. 3.4C). Above these tissues, globular embryogenic structures formed by day

75 (Fig. 3.4D) followed by the appearance of elongated embryogenic structures, both of

which increased in size and number by day 90 (Fig. 3.4E). Histological sections also

showed that embryogenic structures apparently formed from meristematic cells

surrounded by a protoderm (Fig. 3.4E). The inner part of the callus was formed of xylem

and parenchyma cells (Fig. 3.4F, G). The cells of the embryogenic structures were densely

stained, the nuclei were not round, and the nucleoli were not visible (Fig. 3.4F, G).

CHAPTER III

56

Figure 3.4 Histological sections of embryogenic structures and callus from rachilla explantsof a Malayan Yellow Dwarf × Mexican Pacific Tall (MYD × MXPT) hybrid palm. (A) An

embryogenic structure at day 0. If used as an explant, this type of structure would produceembryogenic callus. (B–E) Callus obtained from an ES explant, forming embryogenic

structures after 30 d (B), 60 d (C), 75 d (D), and 90 d (E) of culture. (F, G) Magnification (40×)of embryogenic callus after 75 d (F) and 90 d (G). ES embryogenic structure, VT vascular

tissue, TS translucent structure, GES globular embryogenic structure, EES elongatedembryogenic structure.

CHAPTER III

57

3.3.5 Formation of somatic embryos and conversion into plantlets

Embryogenic calluses (originally from rachillae, stage −6, MYD × MXPT) produced after

subculture 3 (Table 3.4) were transferred to medium III to induce the formation of somatic

embryos (SE); 21.4% of these cultured calluses formed SE (Table 3.4, part B). These

somatic embryos (Fig. 3.3) were, in turn, used as explants to determine if the formation of

embryogenic calluses could be induced from them; of these, 18.1% formed embryogenic

calluses (Table 3.4 part C). As in the previous trials, embryogenic structures from these

calluses were used as explants on two subsequent occasions and in each case fully

embryogenic calluses were formed (Table 3.4 part C), such as the one depicted in Fig. 3.3

after 90 d of culture. These calluses formed SE after 30 d of culture on medium III. The

number of SE (globular stage) per callus after 30 d of culture was determined in three

batches of 10 calluses each; the results were 6.5 ± 4.5, 6.0 ± 3.8, and 5.6 ± 3.6. While still

on the calluses (Fig. 3.5A), globular embryos developed into torpedo-shaped embryos

(Fig. 3.5B).

CHAPTER III

58

Figure 3.5 (A) Calluses with somatic embryos (SE) and germinating somatic embryos (GSE).(B) Globular and torpedo-shape embryos, isolated from the callus for illustrative purposes.

(C) Germinating embryo, isolated from the callus for illustrative purposes. (D) Shootsdeveloping from GSE of a callus. (E) Batch of coconut plantlets in growth room. (F) A

coconut plantlet obtained through SE conversion. The embryogenic calluses producing thedevelopment stages shown here were obtained from embryogenic structure explants

isolated from embryogenic calluses originally induced from rachilla explants of a MalayanYellow Dwarf × Mexican Pacific Tall (MYD × MXPT) hybrid palm.

When calluses were transferred to medium IV and grown under a 16-h photoperiod,

embryos germinated (Fig. 3.5A, C), and on medium V, still under a 16-h photoperiod,

developed into shoots (Fig. 3.5D) and converted to plantlets (Fig. 3.5E, F). This cycle

CHAPTER III

59

could be repeated, as shown in Fig. 3.6.

Figure 3.6. Subculture cycles for the formation of embryogenic callus. Each cycle consistedof three subcultures of embryogenic structure explants, corresponding embryogenic callusproduction, and a final step for the induction of somatic embryos, which in turn were finallyused as explants for the formation of additional embryogenic callus. Original explants werefrom rachillae of inflorescences from a Malayan Yellow Dwarf × Mexican Pacific Tall (MYD ×

MXPT) hybrid coconut palm. Tissues were cultured for 90 d on medium II. Bars represent SD.

3.3.6 Formation of embryogenic callus from selected coconut palms

At the end of the culture period, formation of calluses with necrotic tissue but associated

with pearly white tissue, similar to those obtained with explants from rachillae of MYD ×

MXPT hybrid palm (Fig. 3.1A, B), could be observed on explants of both palms. Most of

the explants responding with callus formation were from the younger inflorescences

tested: stages −8 (10 cm) and −9 (6 cm) from palm 1, and −9 (9.8 cm) and −10 (6 cm)

CHAPTER III

60

from palm 2.

Among treatments showing a response, the percentages of explants forming callus varied

from 0.9% to 44.4% for palm 1 and 0.9% to 35.5% for palm 2 (Table 3.5).

Table 3.5 Callus with embryogenic structures formed from different starting tissues originallyobtained from rachilla explants from inflorescences of two MRD × TAGT hybrid coconutpalms.

Medium

MRD x TAGT 1 MRD x TAGT 2Inflorescencecharacteristics

Explantsforming

embryogeniccallus (%)

Inflorescencecharacteristics

Explantsforming

embryogeniccallus (%)Position Size

(cm) Stage Position Size(cm) Stage

1

-6 39.4 I

0.0 a

-7 38.1 I

0.9 a2 0.9 a 0.0 a3 0.0 a 0.9 a

C.V. 49.5 68.41

-7 21.9 II

4.6 a

-8 20.0 II

5.5 a2 4.6 a 7.7 a3 4.6 a 6.6 a

C.V. 134.6 141.41

-8 10.3 III

21.1 b

-9 9.7 III

35.5 a2 37.7 a 25.5 ab3 44.4 a 20.0 b

C.V. 102.7 116.01

-9 5.9 IV

26.6 ab

-10 5.9 IV

13.3 a2 13.3 b 15.0 a3 33.3 a 13.3 a

C.V. 119.5 139.8Tissues were cultured for 90 d on three media, each prepared with medium I formulation andsupplemented with (1) 0.65 mM 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D), (2) 0.65 mM 2,4-D + 0.01mM 6-benzylaminopurine (BAP), or (3) 0.65 mM 2,4-D + 0.02 mM BAP. Data shown are averages ofvalues obtained from 60 to 105 repetitions. Values followed by the same letter within the samecolumn are not significantly different according to the Tukey test (P≤0.05). Significance andcoefficient of variation (C.V.) were determined using a (√ + 1) transformation.MRD × TAGT Malayan Red Dwarf × Tagnanan Tall.

The data showed numerical differences in callus formation between explants cultured on

different media (Table 3.5), but most of these were not statistically significant, while

differences due to developmental stage were statistically significant (Table 3.6) and the

best results were observed with inflorescences at developmental stage III (approximately

10 cm). The embryogenic structures obtained were used as explants, as in the case of

MYD × MXPT hybrid palm, and fully embryogenic calluses could be obtained. This was

CHAPTER III

61

successful for embryogenic structure explants originally from rachilla stages III and IV from

palm 1 and from stages II, III, and IV from palm 2 (data not shown). The calluses obtained

had several embryogenic structures and no necrotic or spongy tissues (not shown),

showing the same development pattern as described for MYD × MXPT hybrid palm in Fig.

3.3.

Table 3.6 Embryogenic callus formation from coconut rachilla explants frominflorescences at different developmental stages of the coconut hybrid MRD ×TAGT.

Variation sourceExplants forming

embryogenic callus(%)

C.V.

Culture medium

1 12.3 a

139.42 12.5 a

3 14.2 a

Inflorescencedevelopmental stagez

I 0.48 d

130.2II 5.65 c

III 30.74 a

IV 19.28 b

Tissues were cultured for 90 d on three media, each prepared with medium I formulationand supplemented with (1) 0.65 mM 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D), (2) 0.65 mM2,4-D + 0.01 mM 6-benzylaminopurine (BAP), or (3) 0.65 mM 2,4-D + 0.02 mM BAP.Data shown are averages of values from 60 to 105 repetitions. Values followed by thesame letter within the same column are not significantly different according to the Tukeypost hoc test (P≤0.05). Significance and coefficient of variation (C.V.) were determinedusing a (√ + 1) transformation.MRD × TAGT Malayan Red Dwarf × Tagnanan Tallz Stage as defined in Table 3.5.

Following the same procedures as for the previous three palms, 10 more palms were

CHAPTER III

62

sampled: another five MRD × TAGT and five MRD × VTT hybrid palms (batch three). In

these cases, sampling was also destructive, and inflorescences were selected according

to size rather than position. Rachilla explants, about 1,500 for each palm, are currently in

culture, and calluses showing the occurrence of embryogenic structures are already

forming.

3.3.7 Histological analysis of rachillae used for the study

Histological analyses of rachillae at different stages of development of two hybrids are

presented in Fig. 7. Transverse sections of development stage −4 to −6 of inflorescence of

MYD × MXPT palm (Fig. 3.7A–C) showed a tissue that consisted of floral meristems

covered by bracts. Fig. 3.7C is representative of the immature stage (−6) that presented

the best response for this palm.

The transverse sections of rachillae from immature inflorescences of stages −8, −9, and

−10 of MRD × TAGT palm 2 are presented in Fig. 3.7D, E, and F, respectively. Fig. 3.7E is

representative of the immature stage (−9) that presented the best response for this palm.

A closer view of the floral meristem (Fig. 3.7G, H) showed the meristematic dome formed

by a group of meristematic cells with visible nuclei of irregular shape and with nucleoli not

clearly defined. The cells also revealed densely stained cytoplasm, indicative of high

metabolic activity. Fig. 3.7I shows a part of Fig. 3.7E highlighting the vascular strands at

the center of the rachilla transverse section.

CHAPTER III

63

Figure 3.7 Histological sections of rachilla explants obtained from immature inflorescencesof different developmental stages, excised from two coconut hybrids. (A–C) Malayan YellowDwarf × Mexican Pacific Tall (MYD × MXPT) hybrid, developmental stages −4 (A), −5 (B), and

−6 (C). (D–F) Malayan Red Dwarf × Tagnanan Tall (MRD × TAGT) hybrid, developmentalstages −8 (D), −9 (E), and −10 (F). (G, H) Magnification [40×] of floral meristems

corresponding to box in (C) and box at right in (E), respectively. (I) Magnification [40×] ofcenter of rachilla corresponding to center box in (E). Fp floral primordia, S sepal.

3.4 DISCUSSION

In order to satisfy the growing demand for elite coconut plants, a process is needed for

mass propagation such as the one for plumule explants reported by Pérez-Núñez et al.

(2006) based on the production of embryogenic calluses and their multiplication, but that

CHAPTER III

64

instead uses explant tissues from adult palms that are already bearing fruit and have

known measured performance. Thus, the purpose of the present study was to determine

whether rachilla explants from immature inflorescences could be used to obtain

embryogenic calluses, could be multiplied, and could form somatic embryos that can

convert into plantlets.

Hybrid coconut palms were chosen as the source of explants because there is interest in

Mexico in hybrid palms, in particular the MRD × TAGT and MRD × VTT hybrids. These

hybrids were introduced into Mexico for testing over 10 years ago, and they are very

valuable since they were found resistant to LY in a trial in Tabasco, Mexico (Castillo et al.

2012) and only a limited number of these palms exist in Mexican territory. From previous

attempts to collect immature inflorescences (unpublished data), it was found that the

process could be destructive for the palms, and considering the scarcity of the highvalue

hybrids discussed above, the initial tests described here were carried out with explants

from a more readily available hybrid, MYD × MXPT, that is currently produced in Mexico.

In the first trial, the efficacy of 25 different treatments (different combinations of 2,4-D and

BAP concentrations) to induce the formation of callus with embryogenic structures (as

defined by Pérez-Núñez et al. 2006 and Sáenz et al. 2006) was evaluated on explants

from immature inflorescences of this hybrid at three developmental stages. After 90 d of

culture, calluses could be obtained consisting of spongy or necrotic tissue with one or two

pearly white structures. These calluses were similar to those reported by Verdeil et al.

(1994) and Hornung and Verdeil (1999). Histological analysis of these pearly white

structures revealed the presence of peripheral meristematic tissue, which has previously

been associated with callus growth in explants of different species, for example, coconut

inflorescences (Verdeil et al. 1994; Verdeil et al. 2001), Elaeis guineensis zygotic embryos

(Schwendiman et al. 1990), and Coffea canephora leaves (Berthouly and Michaux-Ferriere

1996).

Considering all of the explants evaluated, the response percentage of callus formation was

below 20%, not reaching the yields obtained from plumule explants, which had responses

of 40% or higher (Pérez-Núñez et al. 2006). Additionally, although the calluses obtained

had pearly white structures, these were scarce and were associated with spongy or

CHAPTER III

65

necrotic tissue, contrasting with the calluses covered with white pearly embryogenic

structures reported for plumule (Pérez-Núñez et al. 2006; Sáenz et al. 2006). These initial

results could be considered disappointing; however, the obtained pearly white structures

resembling embryogenic tissue could be responsive explants once isolated from the rest of

the callus tissues, as reported by Pérez-Núñez et al. (2006) for plumule-derived tissues. In

the present study calluses were obtained from the isolated pearly white structures that,

with successive subcultures, increased in the percentage of calluses forming pearly white

structures, without spongy or necrotic tissues, and with tissues resembling fully

embryogenic callus (as defined by Pérez-Núñez et al. 2006).

These apparently embryogenic calluses were subcultured on medium III for induction of

SE formation. The SE developed from globular to torpedo-shaped structures that were

able to germinate and convert into plantlets, thus showing the embryogenic nature of the

calluses obtained from rachilla explants. Therefore, these calluses were considered

equivalent to those obtained from plumule explants, which had already been demonstrated

to be embryogenic (Sáenz et al. 2006).

Somatic embryos were also tested as explants on medium II, and formation of fully

embryogenic calluses could be achieved as well. Furthermore, when embryogenic

structures from these calluses were used as explants and cultured on medium II, fully

embryogenic callus formed again.

This phenomenon, referred to as secondary somatic embryogenesis, has been reported

previously for different species (Vasic et al. 2001; Maximova et al. 2002) including coconut

(Pérez-Núñez et al. 2006). Secondary somatic embryogenesis has also been reported to

help retain embryogenic competence during prolonged culture times, for as long as 10

years in different species (Baker and Wetzstein 1995; Schavemaker and Jacobsen 1995;

Martinelli et al. 2001).

Developmentally, the formation of embryogenic callus, either from embryogenic structures

or somatic embryo explants, was very similar to the process described previously in which

embryogenic callus formed from plumular explants (Sáenz et al. 2006). During the first

month, a callus formed that started showing ear-shaped structures (referred to as

CHAPTER III

66

translucent structures by Sáenz et al. 2006). During the second month, these translucent

structures increased in number and histologically they showed the occurrence of

peripheral meristematic tissue. During the following days of culture, globular structures

appeared on the surface of the translucent structures. Later, elongated structures were

visible, and at day 90 the translucent structures were covered partially by globular

structures but mostly by elongated structures. Histologically these structures also showed

the presence of peripheral meristematic tissue. According to the morphological

development and histological observations, both globular and elongated structures can be

considered as embryogenic structures, as described by Sáenz et al. (2006). At the end of

this 90-d period the obtained callus appeared as fully embryogenic callus, which

developed SE on the surface of the embryogenic structures when the callus was

transferred to medium III.

Taken together, these findings show that the process of obtaining plantlets derived from

rachilla explants is developmentally and functionally comparable to that reported for

plumular explants (Pérez-Núñez et al. 2006; Sáenz et al. 2006), as both involve the

formation of embryogenic callus, SE, conversion of these to plantlets, and, most

importantly, the fact that in both cases embryogenic callus can be multiplied consistently

by using embryogenic structures or SE as explants.

This new knowledge was then applied to generate embryogenic calluses from rachilla

explants obtained from two palms of the more valuable MRD × TAGT hybrid and results

were positive, obtaining calluses with a few pearly white structures that after isolation and

subsequent subcultures of these structures, fully embryogenic calluses were obtained as

in the case of the first hybrid palm (MYD × MXPT).

Next, the number of fruit-bearing palms tested was extended with five more MRD × TAGT

hybrid palms and five MRD × VTT hybrid palms. Once again, calluses with pearly white

structures were formed from explants from these palms. These structures were isolated

and cultured new calluses are currently under development.

It is interesting that, for these two palms as well as for the MYD × MXPT palm, the younger

inflorescences were more responsive than the more mature explant sources. This has also

CHAPTER III

67

been observed for other species such as Triticum aestivum (Benkirane et al. 2000),

Euterpe edulis (Guerra y Handro 1998), and palms Areca catechu (Karun et al. 2004) and

Bactris gasipaes (Steinmacher et al. 2007). In the present study it was also noticed that

most of the explants responding with callus formation were from inflorescences about 10

cm long, irrespectively of their relative position in the palm but with similar morphological

and histological development. This suggests that size, together with morphological

development, is probably a more convenient reference for sampling than inflorescence

position in the plant, the usual parameter considered. Accordingly, for the last batches of

palms sampled, size (about 10 cm long) was used as a reference to select the

inflorescence for obtaining explants, and the results support this decision.

3.5 CONCLUSIONS

The results presented here show that fully embryogenic callus can be obtained from

rachilla explants, through a stepwise process of subculturing the white pearly structures,

scarce at the beginning and becoming more abundant in the new calluses formed, to

finally obtain fully embryogenic calluses. Results also indicate that embryos can be

obtained from these calluses, that embryos themselves can be used as explants to

produce new embryogenic callus, and that this sequential process can be carried out

repeatedly and reproducibly. Furthermore, embryos obtained through this process were

able to germinate and convert to plantlets.

These results could be the basis for further studies to develop a protocol for massive

propagation of coconut using rachilla explants from immature inflorescences, therefore

allowing the cloning of fruit-bearing palms of known traits and measured performance. As

shown, the present protocol is already being used to produce and multiply embryogenic

calluses from the very valuable MRD × TAGT and MRD × VTT hybrid palms.

CAPÍTULO IV

69

CAPÍTULO IV

RELACIÓN ENTRE EL TAMAÑO DE LA INFLORESCENCIA COMO FUENTEDE EXPLANTE Y LA RESPUESTA EMBRIOGÉNICA.

4.1 INTRODUCCIÓN

La obtención de un sistema de propagación masiva de plantas que permita clonar

individuos maduros en producción, es de gran importancia en el caso del cocotero. Si bien

todas las etapas del proceso son importantes, la elección del explante inicial para inducir

la formación de tejido embriogénico es determinante para el establecimiento de un

protocolo de micropropagación vía embriogénesis somática.

Históricamente, en los trabajos realizados para inducir la formación de callo embriogénico

a partir de explantes de tejido floral de cocotero siempre usan la posición relativa de la

inflorescencia en la palma como parámetro de selección (Verdeil et al. 1993; Verdeil et al.

1994; Verdeil et al. 2001; Perera et al. 2007; Perera et al. 2009b). Inclusive, en el trabajo

de caracterización de inflorescencias de cocotero realizado por Perera y colaboradores

(2010) asignan una etapa de desarrollo de inflorescencia específico con la posición de

dicha inflorescencia en la palma, sin embargo, en el capítulo III del presente trabajo, se

demostró histológicamente que inflorescencias localizadas en distintas posiciones en la

palma pueden tener un estado de desarrollo similar o inversamente que inflorescencias

localizadas en la misma posición en la palma pueden tener un estado de desarrollo

distinto.

Tomando en cuenta lo anterior, en este capítulo se presenta un estudio cuyo propósito fue

determinar si hay una relación más adecuada entre la longitud de la inflorescencia (y los

explantes correspondientes) y respuesta embriogénica, en comparación con la relación

entre la posición de la inflorescencia en la palma y respuesta embriogénica.

CAPÍTULO IV

70

4.2 MATERIALES Y MÉTODOS

4.2.1 Muestreo y caracterización de inflorescencias

Las metodologías que se siguieron para colectar y caracterizar morfológicamente las

inflorescencias fueron las mismas que se describen en el capítulo II, incluyendo

mediciones de las inflorescencias.

4.2.2 Establecimiento de explantes iniciales e inducción de formación deestructuras embriogénicas.

Las metodologías que se siguieron para inducir la formación de estructuras embriogénicas

fueron las mismas que se describen en el capítulo III, incluyendo concentraciones de

reguladores de crecimiento y el diseño experimental de ambos experimentos.

4.3 RESULTADOS

Se realizó una comparación entre todas las inflorescencias usadas como fuente de

explante (Figura 4.1A) y se puede observar que las inflorescencias del mismo tamaño

eran morfológicamente similares a pesar de no encontrarse en la misma posición en su

respectiva palma. Estos resultados son complementados por la caracterización histológica

mostrada en el capítulo III, en el cual se observa que las inflorescencias que generaron

mayor inducción de formación de estructuras embriogénicas presentaron las mismas

estructuras histológicas.

Al observar la figura 4.1B, se nota que las inflorescencias con tamaño de alrededor de 12

cm o menos fueron aquellas que generaron mayor respuesta embriogénica. En el caso

del híbrido MYD x MXPT la inflorescencia de la cual se obtuvieron los explantes más

responsivos fue la inflorescencia -6 (12.3 cm). Estos resultados coinciden con los que se

obtuvieron con las inflorescencias provenientes del híbrido MRD x TAGT, ya que también

fueron las inflorescencias más jóvenes probadas las que obtuvieron mayor respuesta

embriogénica -8 (10.3 cm) y -9 (5.9 cm) en caso de la palma 1 y -9 (9.7 cm) y -10 (5.9 cm)

en el caso de la palma 2.

CAPÍTULO IV

71

Figura 4.1 Inflorescencias usadas como fuente de explantes de raquilla en el presentetrabajo, estas se encontraban en diferentes etapas de desarrollo como se muestra en (A).Las mejores respuestas en porcentaje de explantes que formaron callo embriogénico y la

longitud de la respectiva inflorescencia usada como fuente de explantes se muestra en (B).Las palmas usadas para el presente estudio fueron una planta híbrida MYD x MXPT y dos

plantas híbridas MRD x TAGT.

CAPÍTULO IV

72

4.4 DISCUSIÓN

La eficiente selección de fuente de explante es uno de los puntos cruciales durante el

desarrollo de un protocolo de micropropagación.

Existen diferentes reportes en cultivos como banano (Youssef et al. 2010), aguacate

(Zulfiqar et al. 2009), sorgo (Indra y Krishnaveni 2009) y gladiola (Tan Nhut et al. 2004) en

los cuales se concluye la gran relevancia de la selección de la fuente de explante, así

como la etapa de desarrollo en la que se encuentra dicha fuente de explante sobre la

respuesta que se obtendrá durante la etapa de inducción del proceso de

micropropagación.

En el caso de cocotero, el presente trabajo de investigación es el primero en establecer la

relación directa entre longitud de inflorescencia, etapa de desarrollo y respuesta

embriogénica. Si bien, en los trabajos de Verdeil y colaboradores (Verdeil et al. 1993;

Verdeil et al. 1994) establecen un rango de tamaño de inflorescencias usadas de entre 10

y 40 cm, estableciendo que las mejores respuestas de inducción se dan con las

inflorescencias de entre 10 y 25 cm, al tener un rango tan amplio de tamaño de

inflorescencia, esto no permite la elección eficiente de las inflorescencias como fuente de

explante. En el presente trabajo la relación entre tamaño de inflorescencia, etapa de

desarrollo y respuesta embriogénica fue establecida comparando morfológica e

histológicamente las inflorescencias cuyos explantes presentaron mayor respuesta

embriogénica y dichos resultados demuestran que las inflorescencias con tamaños

similares (aproximadamente 10-12 cm) contaban con estructuras histológicas similares

que las agruparon en una misma etapa de desarrollo. Es fácil seleccionar con base a este

criterio pues las inflorescencias menos desarrolladas y la más desarrolladas tiene rangos

de longitud claramente diferentes, 18 cm para más desarrollo y 6 para menos

desarrollada.

Estos resultados son de gran importancia ya que al obtener una selección más precisa y

por lo tanto más efectiva de la fuente de explante, se puede eficientar el proceso de

micropropagación que parte de estos. Tomando en cuenta lo anterior, la precisa y efectiva

selección de la fuente de explante inicial brinda al proceso de micropropagación a partir

CAPÍTULO IV

73

de raquillas de cocotero un gran potencial para rescatar palmas pertenecientes genotipos

e híbridos de gran interés agronómico y fitosanitario.

CAPÍTULO V

75

CAPÍTULO V

DISCUSIÓN GENERAL

En el presente trabajo de tesis se obtuvieron resultados importantes con respecto a la

obtención de un protocolo reproducible de micropropagación de plantas de cocotero a

partir de rachilla de inflorescencia inmadura, desde la elección adecuada de fuente de

explante hasta la obtención de plántulas.

Las inflorescencias de diferentes palmas han sido descritas histo-morfológicamente como

es el caso de palma datilera y cocotero (De Mason y Stolte 1982; Perera et al. 2010); sin

embargo, ninguno de estos trabajos fueron usados para generar marcadores morfológicos

de selección de inflorescencias como fuente de explante para inducción de embriogénesis

somática, a pesar de ser usadas para este fin (Eeuwens 1976; Eeuwens y Blake 1977;

Branton y Blake 1983; Verdeil et al. 1993; Verdeil et al. 1994; Perera et al. 2007; Perera

et al. 2009a; Perera et al. 2009b).

En el caso específico de cocotero, Perera y colaboradores en 2010 caracterizaron histo-

morfológicamente las inflorescencias de cocotero y describen un estado de desarrollo de

inflorescencia específica dependiendo de la posición de esta en la palma. En contraste;

los resultados presentados en el capítulo II, observamos que no existe una relación

directa entre la posición de la inflorescencia en la palma con su estado de desarrollo, ya

que las inflorescencias que se encontraban en la misma posición en las respectivas

palmas no tenían las mismas dimensiones. Estos resultados son corroborados con la

información histológica obtenida en el capítulo III, lo que confirma n que las

inflorescencias de aproximadamente la misma longitud tienen el mismo estado de

desarrollo. Además, las inflorescencias -6 del híbrido MYD x MXPT, -8 de la palma 1 y -8

de la palma 2 del híbrido MRD x TAGT de aproximadamente 10 cm de longitud fueron las

más responsivas en la etapa de inducción de formación de callo embriogénico a pesar de

haber estado en posiciones diferentes en la palma. Asimismo inflorescencias con una

longitud mayor fueron menos responsivas.

Por lo tanto los resultados obtenidos en los capítulos II, III y IV muestran que el grado de

CAPÍTULO V

76

desarrollo tanto en tamaño, anatomía e histología de las inflorescencias usadas como

fuente de explante, coincide con presencia de una respuesta embriogénica que fue mayor

para el rango especifico de alrededor de 10-12 cm de longitud. Por lo tanto podemos

concluir, con base a lo anterior, que se pudo identificar a la longitud la inflorescencia

inmadura como un marcador confiable de su etapa de desarrollo, en lugar del uso de

rangos de tamaño de inflorescencia demasiado amplios para ser considerados

marcadores certeros del estado de desarrollo de la inflorescencia (Verdeil et al. 1993;

Verdeil et al. 1994; Verdeil et al. 2001) o la posición relativa de la inflorescencia en la

palma (Perera et al. 2010).

Un gran beneficio de contar con un parámetro de selección como el tamaño, que permite

identificar donde están los tejidos en donde se puede inducir la formación de callos

embriogénicos es que permite enfocar la colecta a aquellas inflorescencias que serán

altamente responsivas. Igualmente, el trabajo de establecimiento in vitro de explantes se

enfoca en aquellos provenientes de una sola inflorescencia, en lugar de tener que

establecer cultivos con explantes de 3 o 4 inflorescencias y evaluar cuál tiene mejor

respuesta, lo cual es un gran ahorro de tiempo e insumos.

Aunque la selección eficaz de las inflorescencias para ser usadas como fuente de

explante es muy ventajosa, el método es destructivo, lo cual es una desventaja, sobre

todo cuando se trata de palmas pertenecientes a genotipos de alta importancia por sus

características agronómicas deseables y resistencia a plagas y enfermedades y de los

cuales se tienen pocos individuos. Sin embargo, el protocolo establecido en el presente

trabajo permite la clonación y multiplicación de los genotipos de las plantas que se

pueden estar perdiendo al hacer el muestreo, como es el caso de los híbridos usados

para la presente tesis. Tomando en cuenta lo anterior, la destrucción de una planta con

características de gran importancia agronómica para obtener explantes iniciales de

inflorescencia permite el rescate del genotipo al que pertenece y potencialmente la

obtención de miles de plantas idénticas a la planta madre aunque se destruya.

Después de seleccionar la fuente de explante adecuada, se realizó el ensayo de barrido

de concentraciones de 2,4-D, que nos permitió identificar 0.65 mM como la concentración

adecuada para inducir la formación de estructuras blancas aperladas similares a las

CAPÍTULO V

77

estructuras de tipo embriogénico. Dichas estructuras mostraron histológicamente que

tenían potencial para ser usadas como explante que permitiera la formación de un callo

que tuviera las características de un callo embriogénico como el descrito por Sáenz y

colaboradores (2006) el cual está formado por un cúmulo de estructuras embriogénicas

en la superficie del callo y no presenta tejido esponjoso o necrótico, a este tipo de callo se

le puede llamar “callo embriogénico completo”. Después de dos resiembras de las

estructuras blancas aperladas obtenidas a partir de explantes de raquilla, se logró obtener

callo embriogénico, cuyas características coincidían con las de un “callo embriogénico

completo“.

En diversos trabajos reportados en la literatura se ha evaluado la inducción de formación

de estructuras embriogénicas en presencia de 2,4-D en diversas concentraciones como

0.362 mM (Verdeil et al. 1993), 0.25 mM (Verdeil et al. 1994; Verdeil et al. 2001) y 0.1 mM

(Perera et al. 2009a; Perera et al. 2009b). En todos estos trabajos han reportado la

obtención de callo identificado como “callo embriogénico”, sin embargo, este callo era más

parecido al obtenido en el presente trabajo directamente de explantes de raquilla, ya que

contaban con escasas estructuras blancas aperladas en la superficie del callo y

presentaban tejido esponjoso o necrótico por lo que, a diferencia del callo obtenido en el

presente trabajo, no puede ser considerado verdadero callo embriogénico o “callo

embriogénico completo” como el descrito por Sáenz y colaboradores (2006).

En el presente trabajo, además de realizarse la caracterización morfológica del callo

embriogénico completo obtenido a partir de raquillas de cocotero y su desarrollo, también

se caracterizó histológicamente y tal como se observa en los resultados del capítulo III, el

desarrollo del callo embriogénico obtenido a partir de raquillas presenta estructuras

características de un callo embriogénico completo similares a las reportadas por Sáenz y

colaboradores en el 2006. Después de realizar la caracterización del callo obtenido a

partir de raquillas de cocotero, se observa que tiene las mismas características morfo-

histológicas que el callo embriogénico completo obtenido a partir de plúmulas, por lo cual

se espera que al ser altamente similares, se comporten de la misma manera bajo

condiciones de cultivo in vitro. Lo anterior se corroboró al obtenerse embriones somáticos,

que después de germinar se completó el ciclo de regeneración de plantas híbridas de

cocotero incorporando el callo embriogénico obtenido a partir de raquillas al protocolo de

CAPÍTULO V

78

micropropagación de plantas partiendo de plúmulas basado en los trabajos de Chan y

colaboradores (1998) y Pérez-Núñez y colaboradores (2006).

Desde el punto de vista histórico, en relación al caso de plúmula, es importante señalar,

que el éxito que se ha obtenido resultó de una búsqueda racional y sistemática, para

identificar a la plúmula como una fuente de tejido altamente responsivo para la inducción

de embriogénesis somática a través de la formación de callo embriogénico.

Una vez obtenido el callo embriogénico a partir de plúmula, se realizaron diversos

estudios para caracterizarlo morfológica, histológica, molecular y bioquímicamente. Estos

estudios generaron el conocimiento necesario para establecer las características definidas

con las que debe contar el callo embriogénico de cocotero, lo cual permitió establecer un

sistema de estudio para generar conocimiento y desarrollar protocolos de

micropropagación de cocotero eficientes y reproducibles y partir de ellos desarrollar un

proceso de propagación masiva mediante la multiplicación de callo embriogénico y la

embriogénesis somática secundaria (Pérez-Núñez et al., 2006).

Estos estudios con plúmula han sido una base muy importante para enfocar el trabajo con

explantes de inflorescencia. Por lo que el poder inducir la formación de callo embriogénico

completo a partir de raquilla ha sido muy importante, para poder tratar de logar lo mismo

que con plúmula. En el presente trabajo, se demostró que el callo embriogénico obtenido

a partir de raquillas pudo multiplicarse mediante el uso de sus estructuras embriogénicas

como explante para generar nuevo callo embriogénico. Además, los embriones somáticos

también pudieron usarse como explante inicial para generar nuevo callo embriogénico lo

cual permitió llevar a cabo la embriogénesis somática secundaria.

El contar con un proceso que permite la multiplicación de callo embriogénico y la

embriogénesis somática secundaria sienta las bases para poder establecer en un futuro

próximo un proceso de propagación masiva como el reportado en plúmula (Chan et al.

1998; Pérez-Núñez et al. 2006).

En general, se puede decir que en el presente trabajo se hicieron avances importantes en

cuanto a la micropropagación de palmas de cocotero, ya que durante más de cuatro

décadas, diversos grupos de trabajo alrededor del mundo han realizado trabajos de

CAPÍTULO V

79

investigación enfocados al establecimiento de un proceso reproducible de clonación de

plantas maduras de cocotero en producción sin tener éxito. Menos aún para fines de

propagación masiva, como ocurre en el presente caso.

Actualmente, el protocolo de micropropagación basado en plúmula de cocotero está

siendo escalado en instalaciones en el Parque Científico (Sierra Papacal, Yucatán)

conocidas como la “Biofabrica” en donde se trabaja para propagar masivamente plantas

de cocotero.

Si quisiéramos trabajar con callo embriogénico de rachilla en la “Biofábrica”, podríamos

preguntarnos si sería necesario realizar de nuevo todos los estudios y pruebas que se han

hecho para establecer la propagación masiva para plúmula. Afortunadamente la

respuesta es no, porque ese proceso que ya está operando usa como “materia prima”

callo embriogénico completo, puesto que para rachilla ya se cuenta con esta “materia

prima”, entonces sólo se necesita trabajar con ella en la “Biofábrica” y comenzar a hacer

ajustes para su propagación masiva.

Podemos concluir entonces, que el protocolo generado en el presente trabajo tiene el

potencial de ser escalado para propagar masivamente plantas de cocotero que pueden

ser usadas para la reforestación de plantaciones viejas y así poder cumplir con la

demanda actual de productos derivados de cocotero. Debido a la importancia y gran

demanda de estos productos, la reforestación con plantas que cuentan con características

agronómicas deseables así como resistencia a plagas y enfermedades tendrá un impacto

positivo en la economía tanto nacional como internacional.

CAPÍTULO VI

81

CAPÍTULO VI

CONCLUSIONES Y PERSPECTIVAS

6.1 CONCLUSIONES GENERALES

Después de analizar los resultados obtenidos en el presente trabajo, se llegó a las

siguientes conclusiones generales:

Se identificó al tamaño de inflorescencia como un marcador morfológico preciso y

confiable del estado de desarrollo adecuado para que dicha inflorescencia pueda

poderse usar como fuente de explante para lograr la formación de callo

embriogénico.

A partir de explantes de raquilla se logró inducir la formación de callo con

estructuras blancas aperladas y con base a la resiembra sucesiva de estas

estructuras blancas aperladas en dos ocasiones, se logro obtener callo

embriogénico completo.

Las estructures embriogénicas en los callos embriogénicos pudieron ser utilizadas

exitosamente como explantes para generar nuevo callo embriogénico, iniciándose

el proceso de multiplicación.

Los mejores resultados de inducción de la formación de callo embriogénico, así

como de la multiplicación del mismo, se dieron usando explantes de raquilla

provenientes de inflorescencias de aproximadamente 10 cm de longitud

sembrados en medio de cultivo adicionado con 0.65 mM de 2,4-D.

A partir del callo embriogénico obtenido de raquillas, se pudo inducir la formación

de embriones somáticos, los cuales germinaron para formar brotes que se

desarrollaron hasta convertirse en plántulas. Además, tanto el callo embriogénico

como los embriones somáticos obtenidos fueron usados como explante para

generar nuevo callo embriogénico.

CAPÍTULO VI

82

El callo embriogénico obtenido a partir de explantes de raquilla muestra gran

similitud con el callo embriogénico obtenido a partir de plúmula desde el punto de

vista morfológico e histológico, por lo cual se espera que las plantas obtenidas a

partir de explantes de raquilla sean fisiológicamente iguales a las obtenidas a partir

de plúmulas.

El que se cuente con la formación de callo embriogénico a partir de raquilla, de su

multiplicación, del uso de embriones somáticos para realizar embriogénesis

somática secundaria, refleja el mismo tipo de respuestas que son la base de la

propagación masiva desarrollada con explantes de plúmula, por lo que

potencialmente esto también se puede lograr con explantes de raquilla.

6.2 PERSPECTIVAS

La gran similitud morfológica e histológica entre el callo embriogénico obtenido a partir de

raquillas y el callo obtenido a partir de plúmulas permite extrapolar el protocolo de

propagación masiva altamente eficiente basado en el callo embriogénico de plúmula y

usar en su lugar callo embriogénico obtenido de raquillas. Lo anterior nos permitirá no

sólo la micropropagación de plantas maduras en producción a partir de raquilla, sino que

también el escalamiento este protocolo para la producción masiva de plantas de cocotero

tal como se está haciendo en la “Biofabrica” del CICY partir de explantes de plúmula.

Además, con este protocolo se podrán establecer nuevas líneas de callo embriogénico a

partir de palmas de cocotero de interés por sus características agronómicas y de

resistencia a plagas y enfermedades que sean identificadas en ensayos ya establecidos

como con los que se cuenta en México con variedades introducidas de Costa de Marfil por

INIFAP y CICY, así como las que puedan identificarse en un futuro con nuevas

introducciones o en otros países mediante colaboraciones internacionales.

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