Chương 1 MỞ ĐẦU

1.1 KHÁI NIỆM VÀ PHÂN LOẠI HỢP CHẤT THIÊN NHIÊN1.1.1 ĐỐI TƯỢNG VÀ LỊCH SỬ NGHIÊN CỨU

Hợp chất thiên nhiên là các sản phẩm hữu cơ của các

quá trình trao đổi chất trong cơ thể sống. Ngành hóa học

nghiên cứu tính chất và cấu trúc của các hợp chất thiên

nhiên được gọi là hóa học các hợp chất thiên nhiên

Lịch sử các hợp chất thiên nhiên có từ xa xưa. Ngành y

học cổ truyền của nhiều nước đã biết nhiều đến độc tính và

tác dụng chữa bệnh của của nhiều chất có nguồn gốc động

thực vật. Con người đã phát triển chưng cất tinh dầu từ

thế kỷ 16. Một số hợp chất cũng đã được phân lập rất sớm

như campho được chiết từ thế kỷ 17

Cuối thế kỷ 19, các nhà hóa học đã nghiên cứu tính chất

và cấu trúc của nhiều hợp chất thiên nhiên. Một trong những

công trình có giá trị là ‘’qui tắc isopren’’ về cấu tạo của

tecpenoit (Wallch, 1887)

Trong những năm của nửa đầu thế kỷ 20, các nhà hóa học

đã xác định được nhiều hợp chất thiên nhiên, như citral

(Tiemann, Semmler, Verley, 1890-1897), linalol (Tiemann,

Ruzicka, 1895-1919)…

Việc xác định các hợp chất thiên nhiên bằng các phương

pháp hóa học là việc rất khó khăn và phức tạp, có những1

trường hợp phải mất cả trăm năm. Ví dụ morphin tinh khiết

được phân lập từ cây thuốc phiện từ năm 1805, nhưng đến năm

1923 các nhà hóa học mới đưa ra dự đoán về cấu trúc và mãi

đến năm 1952 cấu trúc này mới được khẳng định bằng phương

pháp tổng hợp. Có nhiều hợp chất khác được xác định cấu trúc

cũng mất thời gian rất lâu như strychnin (1819-1954), quinin

(1820- 1944). Từ sau năm 1945, ngành hóa học các hợp chất

thiên nhiên phát triển mạnh mẽ nhờ sự hỗ trợ của các phương

pháp vật lý hiện đại, đặc biệt là các phương pháp phân tích

bằng quang phổ như: UV, IR, NMR, nhiễu xạ tia X

Ngày nay , song song với nghiên cứu hợp chất thiên

nhiên, người ta cũng nghiên cứu cấu trúc của hợp chất cao

phân tử, đặc biệt là các hợp chất cao phân tử trong cơ thể

động thực vật sống trong đại dương để tìm kiếm các hợp chất

có ích cho con người.

1.1.2 PHÂN LOẠI CÁC HỢP CHẤT THIÊN NHIÊN

Trong cơ thể động thực vật không chỉ có hợp chất hữu cơ

mà còn có nhiều hợp chất vô cơ như muối khoáng. Trong phần

này chúng ta chỉ đề cập đến các hợp chất hữu cơ có trong

động thực vật.

Hợp chất hữu cơ thiên nhiên rất đa dạng và phong phú.

Tùy thuộc vào cách phân loại người ta chia các hợp chất

thiên nhiên ra thành nhiều loại khác nhau

1.1.2.1 Dựa vào tính thiết yếu đối động thực vật: 2

người ta chia thành 2 nhóm

+ Chất trao đổi sơ cấp : Là những chất thiên nhiên cần

thiết cho sự sống gồm cacbonhidrat, protein, axit

nucleic, các lipit và dẫn xuất của chúng. Các hợp chất

này được sản sinh từ các cơ thể sống, không phụ thuộc

vào loài. Quá trình trong đó các chất trao đổi sơ cấp

được tạo thành được gọi là quá trình trao đổi thứ cấp

+ Chất trao đổi thứ cấp: Là những hợp chất thiên nhiên

không hẵn không cần thiết cho sự sống của động thực vật.

Tuy nhiên khác với chất trao đổi sơ cấp, các chất trao

đổi thứ cấp thường phụ thuộc nhiều vào loài. Các hợp

chất thứ cấp bao gồm : tecpenoit, steroit, flavonoit,

ankaloit….Chúng là sản phẩm của quá trình trao đổi thứ cấp.

Các chất trao đổi thứ cấp được nghiên cứu nhiều do

tác dụng dược lý và các hoạt tính sinh học của chúng.

Trong hợp chất thiên nhiên thường có các nhóm chức

cơ bản:

+ Hợp chất hidrocacbon chưa no

+ Ancol- phenol – ete

+Andehit- xeton

+ Axit hữu cơ và dẫn xuất

+ Amin

+ Dị vòng

+ Hợp chất tạp chức …3

1.1.2.2 Dựa vào bộ khung cacbon, các nhóm chức và

theo tính phổ biến của hợp chất:

Các hợp chất thiên nhiên thường được phân loại

thành:

+ Chất béo- lipit

+ Hidratcacbon- Gluxit ( monosacarit,

oligosacarit, polisacarit)

+ Axit amin- Protit

+ Tecpenoit (monotecpen, ditecpen, tritecpen…)

+ Steroit

+ Coumarin

+ Flavonoit

+ Ankaliot

+ Tanin

+ Chất kháng sinh

+ Vitamin…

1.2 PHƯƠNG PHÁP CHIẾT XUẤTCó nhiều phương pháp chiết xuất hợp chất thiên nhiên,

tùy thuộc vào hợp chất cụ thể và từng loại nguyên liệu

cụ thể mà người ta chọn phương pháp thích hợp. Muốn vậy

trước hết chúng ta phải biết những nguyên tác cơ bản

trong chiết xuất hợp chất thiên nhiên

1.2.1.NGUYÊN LIỆU 4

Để nghiên cứu thành phần hóa học của cây nào đó trong

điều kiện cho phép nên dùng nguyên liệu tươi. Nguyên

liệu thu hái xong nên ổn định bằng cách nhúng vào cồn

hay nước đun sôi trong vài phút, sau đó để ráo nước hay

làm khô tự nhiên trong không khí. Hết sức tránh dùng

nhiệt độ cao để làm khô nguyên liệu

Phải sơ bộ xử lý nguyên liệu ban đầu như: vứt bỏ

nguyên liệu có sâu bệnh,

Phải xác định đúng tên khoa học của cây, vì nếu không

xác định đúng tên của cây thì việc xác định không có ý

nghĩa về khoa học. Do đó thông thường khi thông báo khoa

học phải ghi địa chỉ người xác định, cơ quan…để người

đọc có thể liên hệ tham khảo khi cần thiết.

1.2.2 TÍNH PHÂN CỰC CÁC HỢP CHẤT THIÊN NHIÊN

Trong cây, các hợp chất hữu cơ tồn tại ở dạng hòa tan

trong nước, trong dầu béo hoặc tinh dầu

- Các hợp chất hòa tan trong nước (dịch tế bào) là

các hydratcacbon có phân tử lượng thấp (monosaccarit,

một số oligosaccarit như pectin, gôm…); các glycozit,

muối ankaloit của các axit hữu cơ; các aminoaxit, muối

của aminoaxit; các hợp chất phenol hòa tan dưới dạng

glycozit.

5

- Các hợp chất tan trong dầu béo hoặc tinh dầu là các

hidrocacbon, monotecpen, sesquitecpen, sterol,

carotenoit…

Nói chung các chất tan trong nước là các chất phân

cực còn các chất tan trong dầu béo và tinh dầu là các

chất ít phân cực. Tuy nhiên tính phân cực của chúng cũng

khác nhau tùy thuộc vào khối lượng nguyên tử và nhóm

chức có trong phân tử hợp chất

Thông thường các hợp chất có mạch cacbon dài kém phân

cực, các hợp chất có nguyên tử H liên kết trực tiếp với

nguyên tố âm điện như O, N, F, Cl…là những nhóm phân

cực, càng nhiều nhóm phân cực trong phân tử thì tính

phân cực càng lớn

1.2.3 DUNG MÔI

1.2.3. 1. Tính phân cực của dung môi

Dung môi dùng cho chiết xuất rất đa dạng và thay đổi

tùy theo tính chất của nguyên liệu. Cơ sở để lựa chọn

dung môi để chiết là độ phân cực của các hợp chất chứa

trong nguyên liệu và độ phân cực của dung môi.

Người ta phân biệt các dung môi theo độ phân cực

+ Dung môi phân cực mạnh: nước, các ancol thấp

(metanol, etanol….).

+ Các dung môi không phân cực: ete, êt-dầu hỏa,

benzen, toluen. hexan…6

+ Các dung môi phân cực yếu hoặc vừa etyl axetat,

cloroform, axeton,…

1.2.3.2. Chất tan trong nước và dung môi phân cực

+ Các chất điện ly như muối vô cơ tan trong nước và

dung môi phân cực

+ Các hợp chất hữu cơ nói chung không ion hóa, nhưng

nếu chúng có những nhóm tạo được liên kết hydro với nước

thì tan được trong nước. Càng nhiều nhóm phân cực thì

phân tử ấy càng dễ tan trong nước, nếu mạch cacbon càng

dài thì độ hòa tan càng giảm

Thực nghiệm cho thấy : 1 nhóm phân cực trong phân tử

có khả năng tạo thành liên kết hydro với nước thì làm

cho phân tử chất đó tan được trong nước nếu phân tử của

chất đó có mạch cacbon không quá 5 hoặc không quá 6 nếu

hợp chất có mạch nhánh. Nhưng nếu phân tử có nhiều nhóm

phân cực (từ 2 trở lên) thì tỉ lệ này giảm xuống: một

nhóm phân cực cho 3 hoặc 4 nguyên tử cacbon trong mạch

thì phân tử ấy tan được trong nước.

1.2.3.3. Chất tan trong ete và các dung môi không

phân cực

Các hợp chất hữu cơ không chứa nhóm phân cực được gọi

là các chất không phân cực. Nói chung các chất không

phân cực đều tan trong ete và các dung môi không phân

7

cực và ngược lại không tan trong nước và các dung môi

phân cực khác.

Các phân tử có một nhóm phân cực trong phân tử có thể

tan được trong ete.

Hầu hết các chất hữu cơ tan trong nước thì không tan

trong ete.

Nếu một chất vừa tan trong nước vừa tan trong ete thì

chất đó phải là chất không ion hóa, có số cacbon không

quá 5, có một nhóm phân cực tạo liên kết hydro nhưng

không phải là phân cực mạnh.

1.2.4 CÁC PHƯƠNG PHÁP CHIẾT XUẤT

Nói chung không thể có một phương pháp chung nào có

thể áp dụng được cho tất cả nguyên liệu. Trong phần này

chỉ nêu những phương pháp chiết xuất nhằm nghiên cứu sơ

bộ khi chưa biết rõ thành phần hóa học của nguyên liệu.

1.2.4.1 Phương pháp cổ điển: Dùng một dãy các dung

môi từ không phân cực đến phân cực mạnh để chiết phân

doạn các chất ra khỏi nguyên liệu. ví dụ dãy ete- dầu

hỏa, ete, cloroform, cồn và cuối cùng là nước.

Cách chiết thông dụng nhất là chiết nóng liên tục

trên máy soxhlet hoặc chiết hồi lưu. Sau mỗi lần chiết

với một loại dung môi, cần làm khô nguyên liệu rồi mới

tiếp tục chiết với dung môi tiếp theo. Mỗi phân đoạn

chiết, thu hồi dung môi và tiến hành phân tích riêng.8

Dựa vào tính phân cực của dung môi và có thể dự đoán

sự có mặt của các chất có mặt trong các dịch chiết.

+ Trong phân đoạn ete, ete dầu hỏa sẽ có hidrocacbon

béo hoặc thơm, các thành phần của tinh dầu như

monotecpen, các chất không phân cực như các chất béo

caroten, các sterol, các chất màu thực vật, clorofyl

+ Trong dịch chiết cloroform có sesquitecpen,

ditecpen, coumarin, quinon các aglycon do các glycozit

thủy phân tạo ra, một số ankaloit bazo yếu

+ Trong dịch chiết cồn sẽ có mặt glycozit, ankaloit,

flavonoit, các hợp chất phenol khác, nhựa, axit hữu cơ,

tanin

+ Trong dịch nước sẽ có sẽ có các hợp chất phân cự

như các glycozit, tanin, các đường, các hidratcacbon

phân tử vừa như pectin, các protein thực vật, các muối

vô cơ…

1.2.4.2 Khi cần chiết lấy toàn bộ thành phần trong

nguyên liệu, dung môi thích hợp nhất là cồn (metanol hay

etanol) 80% trong nước. Cồn, đặc biệt là metanol được

xem như dung môi vạn năng nó có thể hòa tan các chất

không phân cực cũng như các chất phân cực khác

Dịch chiết khi bay hơi dung môi được cao toàn phần

chứa hầu hết các hợp chất trong nguyên liệu

9

Sau đó cần tách phân đoạn các chất trong cao thì

chuẩn bị một dãy các chất không tan trong nước có độ

phân cực từ yếu đến mạnh như ví dụ dãy ete- dầu hỏa,

ete, cloroform, etyl axetat, butanol.

Hòa tan cao vào một lượng nước, cho vào bình chiết,

lần lượt chiết với các dung môi trên. Dịch chiết mỗi

phân đoạn sau khi thu hồi dung môi đem đi phân tích.

1.2.4.3 Cách chiết : có 2 cách chiết là chiết nóng

và chiết ở nhiệt độ thường

+ Chiết ở nhiệt độ thường : có 2 cách là ngấm kiệt và

ngấm phân đoạn. Ngấm kiệt là phương pháp tốt hơn vì nó

chiết được nhiều hợp chất hơn, ít tốn dung môi, nhất là

khi áp dụng phương pháp ngấm kiệt ngược dòng.

+ Chiết nóng: Nếu dung môi dễ bay hơi phải dùng

phương pháp chiết liên tục ( trong soxhlet) hoặc chiết

hồi lưu. Nếu chiết hồi lưu thì ít nhất phải chiết 2 lần.

1.2.4.4 Cách thu hồi dung môi: bằng cách chưng cất,

trong đó tốt nhất là dùng phương pháp chưng cất ở áp

suất thấp.

1.3 PHƯƠNG PHÁP TÁCH BIỆT CÁC HỢP CHẤT THIÊN NHIÊNPhương pháp tách biệt cơ bản nhất là các phương pháp

sắc ký

1.3.1. CÁC PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ

1.3.1. 1. Khái niệm về sắc ký10

Sắc ký là một phương pháp vật lý dùng để tách riêng

các thành phần ra khỏi hỗn hợp bằng cách phân bố chúng

ra 2 pha: một pha có bề mặt rộng gọi là pha cố định và

một pha kia là một chất lỏng hay chất khí gọi là pha di

động, di chuyển qua pha cố định.

Phân loại: Chia thành 2 loại: là sắc ký lỏng và sắc

ký khí

Sắc ký lỏng : là sắc ký có pha động là chất lỏng.

Trong sắc ký lỏng có các kỹ thuật:

+ Sắc ký giấy: pha tĩnh là giấy

+ Sắc ký lớp mỏng: pha tĩnh là lớp mỏng chất hấp phụ

được trải bằng trên tấm thủy tinh hoặc kim loại.

+ Sắc ký cột: Pha tĩnh là chất rắn được nhồi thành

cột. Trong sắc ký cột tùy thuộc vào bản chất của chất

rắn nhồi cột mà chia thành các loại:

-Cột cổ điển: cột đơn giản với chất hấp phụ là vô cơ

hay hữu cơ.

-Cột trao đổi ion: Cột là chất trao đổi ion âm hoặc

dương.

-Cột gel hay lọc gel: Pha tĩnh là một gel tổng hợp có

lỗ xốp xác định để lọc các chất có kích thước khác nhau.

+ Sắc ký lỏng cao áp: ( sắc ký lỏng hiệu năng cao)

Sắc ký khí là sắc ký có pha động là các chất khí.

Dựa vào pha cố định người ta còn chia ra:11

+ Sắc ký khí- rắn

+ Sắc ký khí – lỏng

1.3.1. 2 Sắc ký giấy

A. Các bước tiến hành

a) Chuẩn bị mẫu thử

Chất thử được pha trong lượng tối thiểu dung môi.

Dung môi thường dùng là các chất dễ bay hơi như axeton,

metanol, etanol

Trừ trường hợp nghiên cứu toàn diện về cây, thông

thường người ta phải loại tạp trước khi và cô đặc trước

khi chấm. Cách loại tạp thường dùng là tách bằng các

dung môi khác nhau, bằng cách tủa, ly tâm, đông lạnh…

b) Chấm mẫu thử: dùng ống mao quản có đường kính từ

0,5- 1mm. Thông thường nồng độ chất chấm từ 0,1-1%,

lượng chất chấm từ 1-1000g tùy thuộc vào độ nhạy để

phát hiện chúng.

Điều quan trọng trong kỹ thuật chấm vết là chấm vết

càng nhỏ càng tốt và các vết trên cùng một lần sắc ký

phải đồng đều nhau về kích thước và độ đậm đặc

c) Giấy: Nếu dùng sắc ký giấy để phát hiện chất thì

có thể dùng loại giấy mỏng, nhưng nếu dùng tách chất thì

có thể dùng giấy dày. Khi sử dụng cần triển khai đúng

12

chiều của giấy. Thông thường ở ngoài bó giấy có có mủi

tên chỉ chiều triển khai giấy.

d) Dung môi: Việc chọn dung môi thích hợp là yếu tố

chính quyết định kết quả thí nghiệm

+ Cách chọn dung môi:

Thứ tự độ phân cực của dung môi ( theo E. Berg, 1963)

Ete dầu hỏa < CCl4 < Xyclohexan< Cacbon disunfua <

dietylete < benzen < các este < Cloroform < dicloetan <

các ancol < nước < pyridin < các axit hữu cơ < các axit

vô cơ và bazo

Cũng có thể dùng dung môi nguyên chất hoặc hỗn hợp

dung môi với tỉ lệ thích hợp. Để lựa chọn hệ dung môi ta

có thể dùng chạy thử với chiều cao 10 cm là đủ.

+ Các loại hệ dung môi

- Hệ dung môi có pha cố định là nước

- Hệ dung môi có pha cố định là dung môi hữu cơ phân

cực ( ưa nước)

- Hệ dung môi có pha cố định là dung môi hữu cơ

không phân cực kỵ nước

e) Cách khai triển:

+ Triển khai trên xuống: Ưu điểm của phương pháp này

là tốc độ chảy tương đối ổn định và nhanh nhờ tác dụng

của trọng lực

13

+ Triển khai dưới lên ( triển khai ngược): Phương

pháp này có ưu điểm là triển khai đơn giản, nhanh chóng

nhưng có nhược điểm là khi dung môi chảy được độ 25 mm

thì dung môi sẽ chạy chậm lại, do đó người ta thường sử

dụng cách này để thử tìm hệ dung môi thích hợp và

thường cho chạy đến 25cm thì ngừng lại.

+ Triển khai ngang

+ Triển khai vòng

+ Triển khai nhiều lần và triển khai quá cở giấy

+ Sắc ký hai chiều

e) Phát hiện vết

+ Phương pháp hóa học: Dùng các chất hiện màu đặc

trưng cho từng loại hợp chất. Thuốc thử được pha có

nồng độ thích hợp cho tác dụng lên giấy . Có 2 cách:

- Nhúng giấy: Áp dụng cho các sắc đồ nhỏ,và thuốc

thử không hòa tan các vết

-Phun : Phương pháp này thường dụng hơn

+ Phương pháp vật lý:

Thường áp dụng với các hợp chất hấp thụ tia cực tím

trong khoảng từ 240-260 nm hình thành các vết tối trên

nền phát quang. Trong một số trường hợp có thể phun lên

giấy dung dịch Fluorescein (C20H18O2) với mục đích làm

tăng độ phát quang của nền để nhìn vết rõ hơn.

14

Một số chất có khả năng phát huỳnh quang khi chiếu

tia cực tím ở bước sóng khoảng 360nm

B Các yếu tố ảnh hưởng đến giái trị Rf

a) Trong sắc ký để biểu thị sự di chuyển của

các chất người ta dùng khái niệm Rf

Giá trị Rf không phải là một hằng số đặc trưng cho

sự di chuyển của một chất ở mọi điều kiện, do đó khi

ghi giá trị Rf phải ghi đầy đủ những điều kiện thí

nghiệm kèm theo (loại giấy, nống độ chất thử, lượng

chấm, hệ dung môi, lượng dung môi, chiều triển khai,

nhiệt độ tiến hành thí nghiệm)

b) Để làm tăng độ lặp lại trong sức ký giấy chúng ta

phải lưu ý

+ Giữ nhiệt độ không đổi trong khoảng nhiệt độ cho

phép 50C

+ Trộn đều dung môi và giử ở nhiệt độ thí nghiệm

trong 1-2 ngày.

+ Kiểm tra lại dung môi bằng cách chạy thử với chất

chuẩn đối chiếu

+ Giấy đã chấm chất thử được đưa vào trước 24 giờ để

tạo sự cân bằng giữa giấy và khí quyển trong bình

+ Đậy bình kín trong suốt quá trình triển khai

Chiều dài di chuyển của chất thử Chiều dài di chuyển của dung môi

Rf =

15

+ Đường di chuyển của dung môi phải từ 30-35 cm nếu

triển khai xuôi và 25 cm cho triển khai ngược

+ Dùng một loại giấy, tiến hành trong cùng một điều

kiện

C Hiện tượng vết dị thường

a. Vết lan rộng ( Không tập trung): Để khắc phục cần

phải

- Chấm vết càng nhỏ, tròn

- Thuốc hiện màu không quá đặc, pha vừa đủ để hiện

màu

- Chọn hệ dung môi thích hợp nhất là tốc độ chạy của

hệ dung môi.

Ngoài ra nếu hình dạng và kích thước lỗ xố của giấy

không đề vết cũng lan rộng

b.Vết có đuôi Vết có đuôi có thể do

+ Lượng chất chấm quá nhiều

+ Dung môi chảy quá nhanh

+ Sự biến dổi không thuận nghịch và thừ từ các thành

phần trong chất tan trong quá trình di chuyển

+ Sự hấp phụ quá mạnh của bề mặt chất hấp phụ

c. Hiện tượng hai đuôi

Hiện tượng này thường xãy ra đối với các chất màu

của dịch chiết, do các chất màu này không có khả năng

hấp phụ mạnh bằng các chất không có màu có mặt trong16

dịch chiết nên các chất không màu chiếm vị trí ngay ở

giữa còn các chất màu di chuyển ra rìa khi chấm. Vì vậy

khi triển khai thì có hai đuôi do các vết trên và dưới

chạy nhanh hơn ở 2 bên nên vế có 2 đuôi

d. Ngoài ra còn có các hiện tượng: vết bè ra hai bên

, lan rộng ra 2 bên, vết méo, vết không di chuyển, mất

vết hoặc một chất tạo nhiều vết

1.3.1.3. SẮC KÝ LỚP MỎNG (SKLM)

A. Nguyên lý:

Là phương pháp phân tích trong đó dung dịch chất

phân tích di chuyển trên một lớp mỏng chất hấp phụ mịn

vô cơ hay hữu cơ theo một chiều nhất định. Trong quá

trình di chuyển, mỗi chất chuyển dịch với tốc độ khác

nhau tùy thuộc vào bản chất của chúng và dừng lại ở

những vị trí khác nhau

B . Chất hấp phụ

Thường dùng là các oxit không tan, các oxit hidrat

hóa và các muối

Lực hấp phụ của các chất hấp phụ theo trật tự tăng

dần ( theo Strain) 1, Sacaroz

2, Magie xitrat

3, Tale ( đá tan, hoạt thạch)

4, Silicagel

5, Natri cacbonat17

6, Canxi cacbonat

7, Magie cacbonat

8, Magie oxit

9, Axit silixic hoạt hóa

10, Nhôm oxit hoạt hóa

11, Than động vật hoạt hóa

Trong phân tích nguyên liệu, chất được dùng thông dụng

nhất là silicagel

và oxit nhôm

C. Hoạt năng

Hoạt năng của chất hấp phụ phụ thuộc nhiều vào hàm

lượng nước trong nó vì nước hấp phụ sẽ chiếm vị trí hoạt

động trên bề mặt làm giảm khả năng hấp phụ của chất hấp

phụ, Vì vậy có thể điều chỉnh khả năng hấp phụ bằng cách

thêm nước. Tuy nhiên trong thực tế khi triển khai thông

thường ta phải sấy khô để khả năng hấp phụ của chất hấp

phụ tăng lên và sự hấp phụ ổn định.

D. Chất hấp phụ thông dụng

a. Silicagel: Dùng trong bản mỏng là loại bột mịn, vô

định hình có đường kính cở hạt từ 10- 40 m, nếu dùng

trong sắc ký cột thông thường thì đường kính cở hạt 63-

200 m (63-200 mesh)

Về mặt hóa học silicagel vô định hình là loại có các

nhóm siloxan O-Si-O và các nhóm silinol O-Si-OH.18

Vị trí hấp phụ trên bề mặt là các nhóm silinol, nó có

khả năng tạo liên kết cộng hóa trị với các hợp chất phân

tích.

Để tăng khả năng hấp phụ của silicagel người ta sấy ở

nhiệt độ 1100C-

120 0C để loại nước, nhưng không sấy cao hơn 150oC vì khi

đó các nhóm OH trong silicagel bị mất nước và giảm khả

năng hấp phụ và không hút nước.

Ngoài ra để tăng thêm khả năng hấp phụ, tùy theo bản

chất của chất cần tách người ta có thể thêm axit hay

bazo để sự hấp phụ có thể được tăng lên hay giảm xuống.

b. Alumina

Thành phần hóa học, chứa chủ yếu là -Al2O3.

Nó có 3 loại: trung tính, baz và axit

Alumin baz có chứa khoảng 0,1-0,5 % NaOH bám trên

mặt alumin ở dạng natrialuminat, có pH 10.Nó là chất

trao đổi ion trong nước

Alumin trung tính, có pH từ 6,5-7. Đây là loại dùng

tốt cho sắc ký cột vì không gây phản ứng với chất thử

Alumin axit được điều chế từ alumin với HCl loãng,

pH 4, có tác dụng như chất trao đổi ion.

Các chất thử có tính axit như các phenol, axit

cacboxylic sẽ bị giữ lại trên alumin baz hơn loại trung

tính và axit, ngược lại các chất có tính baz (amin,19

ankaloit...) sẽ bị giữ lại trên alumin axit hơn loại

trung tính và baz

Khác với silicagel, các alumin nếu sấy trên 2000C sẽ

hấp phụ lựa chọn đối với các chất phân cực và có thể làm

tăng độ hấp phụ khi đun nóng đến dưới 7000C và trên

7000C thì khả năng hấp phụ giảm.

E. Dung môi

a) Tốc độ di chuyển của chất phụ thuộc vào dung môi

Trật tự tăng dần lực phản hấp phụ dung môi như sau

( Theo Trappe)

Ete dầu hỏa < xyclohexan < CCl4 < tricloetylen <

toluen < benzen

< metylclorua < clorofoc < ete etylic < etyl

axetat < pyridin < axeton < n-propanol < etanol <

metanol < nước

Trong thực tế người ta thường dùng hỗn hợp dung môi

có độ phân cực với tỉ lệ phù hợp để tạo hệ các dung môi

mới

b) Phương pháp chọn dung môi

Nguyên tắc chung: Nếu chất thử có ái lực yếu đối với

chất hấp phụ thì chọn chất hấp phụ mạnh với hệ dung môi

có lực phản hấp phụ yếu. Ngược lại nếu chất thử ái lực

20

mạnh với chất hấp phụ thì chọn chất hấp phụ yếu và chọn

dung môi có lực phản hấp phụ mạnh.

c) Cấu tạo hóa học và ái lực hấp phụ

Các hidrocacbon no hầu như không hấp phụ

Sự có mặt của liên kết đôi tăng thêm lực hấp phụ,

càng nhiều nối đôi, lực hấp phụ càng tăng

Có thêm các nhóm chức càng làm tăng lực hấp phụ.

Bằng thực nghiệm, người ta thấy lực hấp phụ giảm dần

theo dãy sau:

+ Đối với hidrocacbon thơm:

- COOH > -CO-NH2 > -OH > -NH-CONH2 > -NH2 > -

OCO- CH3 > -CO-CH3 > - COCH3 > -N(CH3)3 > -

NO2 > -OCH3 > -H > -Cl

+ Đối với hidrocacbon mạch thẳng :

- COOH > -OH > -NH2 > -COOR(ankyl) > -CH3

21

+ Các hợp chất cacbonyl hấp phụ yếu hơn hợp chất có

OH và amin tương ứng

d) Kỹ thuật sắc ký

Tráng kính, hoạt hóa kính : hoạt hóa ở 1100C – 1 giờ

Bảo quản kính trong bình hút ẩm

Chấm mẫu phân tích

Triển khai bằng dung môi

Hiện vết

1.3.1.4 Sắc ký cộtA. Khái niệm

Có thể nói sắc ký cột là một dạng của sắc ký giấy

hoặc sắc ký lớp mỏng nhưng ở đây pha tĩnh được nhồi vào

cột, nhờ vậy có thể triển khai một cách liên tục với

nhiều hệ dung môi khác nhau từ phân cực yếu đến phân cực

mạnh

Tùy theo tính chất của chất dùng làm cột mà sự tách

có thể xãy ra chủ yếu theo cơ chế hấp phụ (cột hấp phụ)

ví dụ như silicagel, oxit nhôm hoặc cơ chế phân bố (cột

phân bố) ví dụ như xenlulo.

B. Dụng cụ - hóa chất

a)Cột

Kích thước cột và lượng chất hấp phụ: Thông thường

lượng chất hấp phụ gấp 25- 50 lần lượng chất cần tách và

độ cao của phần cột chất hấp phụ và của phần mẩu thử lớn22

hơn 8:1. Tuy nhiên với những chất khó tách thì cần cột

to và lượng chất hấp phụ phải lớn hơn.Bảng 1.1: Một số thông số của kỹ thuật sắc ký cột.

Mẫu sắc ký

(g)

Khối lượng

chất

hấp phụ

(gam)

Đường kính

cột

(mm)

Chiều cao

cột

(mm)

0,001

0,1

1,0

0,3

3

30

3,5

7,5

16

30

60

130

b) Hóa chất làm cột

Cột phân bố: xenlulo, kieselguhr (Cellite), gel của

axit silixic

Cột hấp phụ : oxit nhôm, silicagel, poliamit, CaCO3,

MgO, than hoạt

Một số hóa chất dùng cho sắc ký cột đã được tiêu

chuẩn hóa

+ Oxit nhôm trung tính (Merck), cở hạt 0,063-0,200 mm

(70- 230 mesh)

+ Oxit nhôm bazo, cở hạt 0,063-0,200 mm ( 70- 230

mesh)

+ Silicagel 60 Merck, cở hạt 0,063-0,200 mm

+ Poliamit: cở hạt < 0,07 mm

23

Khi cho chất hấp phụ vào dung dịch chứa chất hữu cơ,

thì các chất hữu cơ sẽ bám vào chất hấp phụ do nhiều

loại liên kết khác nhau. Trật tự các loại lực này thay

đổi như sau:

Sự tạo muối > liên kết phối trí > liên kết hidro > tương tác lưỡng

cực > lực Van-der-Valls

Dung môi: Các dung môi thường dùng cho sắc ký

cột là hexan, benzen, CHCl3, axeton, etanol, metanol,

butanol, nước.

Thứ tự độ phân cực tăng dần:

Ete dầu < hexan < xiclohexan < CCl4,< benzen < toluen

< diclometan < CHCl3 < ete etylic < etyl axetat < axeton

< pyridin < propanol < etanol < nước < axit axetic

Hứng các phân đoạn vào dụng cụ hứng và thu

hồi dung môi:

Thông thường các chất không phân cực ra trước sau đó

mới đến các chất phân cực yếu và cuối cùng là các chất

phân cực mạnh

Bảng 1.2 Thứ tự giải ly của các chất trong kỹ thuật sắc ký cột

Loại chất được giải

ly ra khỏi cột

Mức độ giải ly Thứ tự giải

ly

24

Ankan

Anken,

ankin

Xicloankan,

xicloanken

Aren

Xeton

Andehit

Este

Ancol, thiol

Amin

Phenol,axit

cacboxylic

Giải ly ra sớm

( với dung môi không

phân cực)

Giải ly ra chậm

(với dung môi phân cực)

C Kỹ thuật

a) Chuẩn bị cột: Yêu cầu là chất rắn làm cột phải

phân tán đồng đều ở mọi điểm trong cột thành một khối

đồng nhất.

Cột hấp phụ: Có 2 cách nhồi cột

+ Nhồi khô: Cột phải thật khô, lắp thẳng đứng vào

giá cố định vững chắc, đáy cột được lót một lớp cát mịn

và khô, dày từ 3-4mm. Đặt một phểu có cuống dài và lớn

ngay chính giữa cột, cho từ từ chất hấp phụ vào cột

liên tục, dùng ống cao su gỏ nhẹ và đều xung quanh cột

25

theo chiều từ dưới lên cho đến khi cột cao theo dự

định.

Tiếp đến cho dung môi vào cột một cách liên tục một

thời gian để ổn định cột. Từ lúc này trở đi không được

để khô dung môi trong cột.

Dung môi dùng để ổn định cột là dung môi đầu trong

hệ các dung môi để tách chất trong cột.

+ Vào cột bằng dung môi (Nhồi ướt): Cột được ổn định

vào giá. Lắc, trộn đều cột bằng dung môi thành một hỗn

hợp dịch. Rót vào cột cho chất hấp phụ lắng tự nhiên

xuống đáy cột . Khi dung môi chảy gần hết trong cột thì

tiếp tục rót hỗn hợp dịch vào. Chú ý là không được khô

dung môi trong cột. Tiếp tục cho dung môi hứng được rót

vào cột cho chảy tiếp tục một thời gian (từ 5-10 giờ)

để cho cột ổn định hoàn toàn

Cột phân bố: Cũng như sắc ký giấy, tách bằng

cột phân bố là thực hiện sự tách giữa 2 pha là pha cố

định và pha di động, do đó phải có giai đoạn xử lý pha

cố định.

Ví dụ tách glycozit bằng cột xenlulo với pha cố định

là nước và pha di động là butanol, ta làm như sau: trộn

bột xenlulo với nước, để yên 5-10 phút, sau đó lắc với

dung dịch butanol bảo hòa trong nước thành một hỗn dịch

26

rót vào cột. Sau đó nhồi tương tự như nhồi ướt của cột

hấp phụ.

Ngược lại nếu tách caroten bằng hợp chất ít phân

cực. Đầu tiên bột xenlulo tẩm đều với dầu parafin tan

trong ete dầu hỏa, để bốc hơi ete dầu. Sau đó cho bột

xenlulo vào cột bằng dung môi tương tự như trên.

b. Đưa chất thử vào cột:

Yêu cầu là phải phân tán chất thử thành một lớp mỏng

đồng đều trên một mặt phẳng. Có nhiều cách đưa chất thử

vào cột:

Phương pháp dùng đĩa giấy:

Dùng giấy lọc cắt thành đĩa tròn có đường kính nhỏ

hơn đường kính trong của cột khoảng 0,5 mm, dùng kim

khâu đâm thành những lỗ thủng nhỏ cách đều nhau khoảng

1,5 mm.

Cân chất thử hòa tan trong một lượng dung môi thích

hợp. Cho đĩa giấy thấm đều dung dịch thử, lấy ra cho

bay hơi dung môi, tiếp tục tẩm dung dịch cho đến hết.

Nếu tiến hành cột lớn có thể dùng 3-5 đĩa giấy.

Sau khi cột đã được ổn đinh bởi dung môi, mở đều cho

dung môi chảy cho đến khi mặt cột chất hấp phụ vừa khô

thì dừng lại. Đặt các đĩa giấy lên mặt cột, đĩa nào

nồng độ đậm nhất thì đặt ở dưới, đĩa nào nồng độ loãng

nhất đặt trên cùng. Dùng ống hút tẩm dung môi cho ướt27

đều. tiếp đến cho lớp cát dày độ 5mm lên các đĩa giấy

và bắt đầu cho dung môi chảy.

Phương pháp cho thẳng dung dịch thử lên cột:

Dùng lượng dung môi hòa tan mẫu càng ít càng tốt

nhưng phải hòa tan hết, cột sau khi đã ổn định cho dung

môi chảy cho đến khi trên bề mặt chất hấp phụ vừa se

khô thì đóng vòi lại. Dùng ống hút cho dung dịch mẩu

thử cho đều đặn trên mặt cột. có thể dùng lớp cát dày

5-7mm lên mặt cột sau khi đã cho dung dịch mẫu thử vào.

Phương pháp trộn đều chất hấp phụ với mẫu

chất thử

Trộn đều mẫu thử với chất hấp phụ và cho vào cột

thành một lớp đều. Nếu mẫu thử là cao đặc hoặc mềm thì

có thể hòa tan một ít vào dung môi, trộn đều chất hấp

phụ, sấy khô và tán thành bột

Trong 3 cách trên cho thẳng mẫu thử vào cột là nhanh

hơn cả, nhưng cần chú ý một số điểm sau:

- Chất thử hòa tan hoàn toàn

- Cho dung dịch chất thử lên mặt cột đều (bằng cách

ria đầu ống hút quanh thành cột, cách mặt cột khoảng 5

cm)

- Khi toàn bộ dung dịch thử ngấm hết vào cột mới cho

dung dịch mới

28

- Cho dung môi nhẹ nhàng không làm xáo động mặt cột.

Nếu chất thử ngấm vào cột với các lớp dày đều nhau

chứng tỏ kỹ thuật đảm bảo.

c. Rữa cột: có thể rữa cột trong các điều kiện

sau:

- Ở áp suất thường

- Ở áp suất cao

D Kỹ thuật sắc ký cột nhanh

a. Đặc điểm

Kỹ thuật sắc ký cột nhanh là kỹ thuật mà các thông

số tối ưu đã được xây dựng từ thực nghiệm với mục đích

làm cho việc ứng dụng được đơn giản, tiết kiệm, nhanh.

Để nghiên cứu kỹ thuật này, tác giả cố định một số

yếu tố và chỉ thay đổi một số yếu tố cần thiết.

Các yếu tố cố định là:

- Chất hấp phụ dùng cho mọi trường hợp là silicagel

60, cở hạt 40-60m.

- Chiều cao cột hấp phụ 15 cm.

- Tốc độ chảy: Mỗi phút chảy được 5 cm chiều cao

dung môi trong cột cho mọi cở cột với mọi chất thử.

Các yếu tố thay đổi được xây dựng bằng thực nghiệm

như sau:

Bảng 1.3: Một số thông số của kỹ thuật sắc ký cột

nhanh 29

Đường kính

cột (mm)

Thể tích

dung môi

rửa (ml)

Chất cần tách

(mg)

Thể tích mỗi

phân đoạn

(ml)Rf ≥

0,20

Rf ≥

0,1010

20

30

40

50

100

200

400

600

1000

100

400

900

1600

2500

40

160

360

600

1000

5

10

20

30

50

Ví dụ một hỗn hợp 2 chất Rf= 0,25 và 0,45 tức là

Rf = 0,20. Để tách 900mg hỗn hợp này phải dùng cột

đường kính 30mm rửa cột cần 400 ml dung môi và mỗi phân

đoạn tập hợp là 20 ml

Một đặc điểm của kỹ thuật là sử dụng áp suất không

khí nén vừa để làm tăng áp suất vừa điều chỉnh dòng

chảy.

Cột được dùng là các loại cột thủy tinh thông thường

nhưng có nối thêm bộ phận dẫn khí nén, có lắp một van

để điều chỉnh tốc độ chảy.

b. Các bước tiến hành

b1) Chọn dung môi: Dung môi dùng cho kỹ thuật sắc ký

nhanh là nên chọn dung môi có độ nhớt thấp như CHCl3,

etyl axetat, ete dầu hỏa, metanol. Dùng kính lớp mỏng

30

Silicagel 40-60m tiến hành với các chất thử để tìm hệ

dung môi thích hợp sao cho Rf trung bình là 0,35 (nếu

hệ chất thử có 3 chất). Nếu các chất tách nhau khá xa

thì điều chỉnh hệ dung môi sao cho có Rf thấp nhất bằng

0,35

Nếu hỗn hợp nhiều thành phần thì căn cứ vào Rf của

các thành phần này trên lớp mỏng để sử dụng các hệ có

độ phân cực tăng dần cho thích hợp

b2) Dựa vào Rf và Rf và lượng chất thử để chọn cột, thể tích dung môi

và ấn định số phân đoạn tập hợp theo bảng trên

b3) Chuẩn bị cột: nhồi chất hấp phụ vào cột theo đúng

yêu cầu:

Sau khi cố định cột, cho một ít bông đặt giữa đoạn

nối giữa đáy cột và vòi hứng, cho một lớp cát sạch độ

4mm phủ tràn lên đáy cột. Sau đó cho silicagel từng ít

một vào cột, vừa cho vừa gõ nhẹ vào thành cột chiều cao

của cột silicagel là 15cm. Mở vòi . Bột silicagel vào

xong, sau đó phủ lên một lớp cát độ 4mm, Tiếp đến rót

dung môi vào đầy cột, lắp nút vào miệng cột, buộc dây

và bắt đầu mở vòi tăng áp suất từ từ. Dung môi sẽ từ từ

đi vào cột silicagel và đẩy không khí thoát ra ngoài

theo vòi dưới cột. Lưu ý là phải duy trì áp suất liên

tục đến khi không khí thoát hết ra ngoài . Tiếp tục giử

áp suất cho dung môi chảy hết đến khi chỉ còn cách mặt31

silicagel độ 3mm thì dừng lại, nhanh chóng tháo nút ra.

Dung môi hứng được dùng lại để rửa sau khi cho mẫu thử

vào.

b4) Vào dung dịch thử: Chủ yếu bằng phương pháp cho

thẳng dung dịch thử vào cột. Sau khi cho mẫu thử vào

cột xong cần phải điều chỉnh áp suất sao cho mỗi phút

chảy được 5cm chiều cao của cột.

c) Ưu điểm của kỹ thuật sắc ký nhanh

- Tiết kiệm chất hấp phụ và dung môi, thời gian

nhanh hơn nhiều

- Nếu các chất có Rf từ 0,1-0,2 đều có thể tách

được bằng phương pháp này, nếu chọn được hệ dung môi

thích hợp.

- Đơn giản, dễ áp dụng nhờ các thông số đã được xây

dựng sẵn.

1.3.1.5. Sắc ký khí ( xem tài liệu)

1.3.2 PHƯƠNG PHÁP CHIẾT

1.3.2.1. Chiết rắn – lỏng

Chiết gián đoạn

Chiết liên tục: dụng cụ soxhlet

1.3.2.2. Chiết chất lỏng

32

Yêu cầu dung môi: dùng dung môi không trộn lẫn với

dung môi cũ và có khả năng tan tốt hợp chất hữu cơ hơn

dung môi cũ ( thường là nước)

Các dung môi thường dùng là ete etylic, ete dầu hỏa,

xăng, benzen, CHCl3...

1.4 PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH

1.4.1 PHÂN TÍCH ĐỊNH TÍNH

1. Phương pháp sắc ký

Sắc ký giấy

Sắc ký lớp mỏng

Sắc ký khí

2. Các phương pháp phổ( IR, UV, NMR, MS...)

3. Các phương pháp vật lý khác

Tnóng chảy , Tsôi

Chỉ số khúc xạ, góc quay cực

1.4.2 PHÂN TÍCH ĐỊNH LƯỢNG1. Phân tích khối lượng

2. Phân tích thể tích

33

CHƯƠNG 2:

PHENOL - AXIT PHENOL VÀ DẪN XUẤTPhenol là nhóm các hợp chất hữu cơ trong phân tử có

nhóm OH liên kết trực tiếp với nhân thơm.

Các hợp chất phenol nói chung dễ tan trong nước vì

trong thiên nhiên chúng thường tồn tại ở dạng glycozit.

Trong hàng ngàn hợp chất phenol trong thiên nhiên đã

biết rõ cấu tạo thì hợp chất flavonoit là nhóm hợp chất

quan trọng nhất. Ngoài hợp chất phenol đơn chức một

vòng, các phenylpropanoit và quinon cũng chiếm một tỉ

lệ đáng kể.

Về các poliphenol trong cây có lignin, melanin,

tanin.

Nhóm chức phenol còn tìm thấy trong một số protein

thực vật trong ankaloit và tecpenoit.

Khi chiết xuất nguyên liệu, các phenol rất dễ bị phá

hủy do tác dụng của enzim phenolaza vốn luôn có mặt

34

trong cây. Vì vậy sử dụng cồn nóng để chiết là cần

thiết vì cồn hạn chế sự phân hủy phenol bởi các enzim.

Để phát hiện phenol, người ta thường dùng dung dịch

FeCl31% trong nước hoặc cồn. Tùy thuộc vào bản chất của

phenol mà có thể có từ màu lục, tím xanh hoặc màu đen.

Nhiều hợp chất phenol có màu, có thể lợi dụng màu

sắc của nó để theo dõi quá trình chiết xuất

2.1 PHENOL VÀ AXIT PHENOLCác phenol và axit phenol thường được nghiên cứu

chung vì chúng thường song song tồn tại với nhau ở

trong cây.

Một số phenol có trong cây là: hydroquinon (1,4-

dihidroxibenzen), rezocxinol (1,3-dihidroxibenzen),

ocxinol (1,3-dihidroxi-5-metylbenzen), phlorogluxinol

(1,3,5-trihidroxibenzen), catechol (1,2-

dihidroxibenzen), pyrogalol. (1,2,3-

trihidroxibenzen),..

Các axit phenol thường gặp là: axit p-

hydroxibenzoic,

axit protocatechic (axit 3,4-dihidroxibenzoic),

axit vanilic (axit 4-hidroxi-3-metoxi benzoic),

axit syringic (axit 4-hidroxi-2,3-dimetoxi benzoic),

…35

2.1.1 SỰ PHÂN BỐ

Các axit phenol tồn tại ở dạng kết hợp với lignin

tạo thành este hoặc với các oza dưới dạng glycozit. Các

axit phenol thường gặp là: axit p-hydroxibenzoic, axit

pyrocatechic, axit vanilic, axit syringic, các axit ít

gặp là axit salixylic, axit o-protocatechic (axit 2,3-

dihydroxibenzoic),.

Ngược với axit phenolic, các phenol tự do rất hiếm

thấy trong cây. Hydroquinon là chất thường gặp hơn cả,

tiếp đến là catechol, ocxinol, phlorogluxinol,

pyrogalol.

2.1.2 PHÂN TÍCH PHENOL VÀ AXIT PHENOL

Việc tách phenol tốt nhất bằng SKLM. Thông thường

nguyên liệu tươi hoặc khô được nghiền nhỏ, thủy phân

với kiềm hoặc axit trong cồn loãng 600

Thủy phân axit: dùng axit HCl 2M trong 30 phút, sau

khi để nguội, lọc, chiết bằng ete. Gạn lớp ete, rửa

bằng nước vài lần, làm khan, bốc hơi đến khô. Hòa cắn

khô với metanol làm dung dịch chấm sắc ký

Nếu thủy phân bằng kiềm: NaOH 2M, thủy phân trong 4

giờ ở nhiệt độ thường. Dịch thủy phân đem axit hóa rồi

chiết bằng ete như trên.

36

Chất hấp phụ là silicagel G với các hệ dung môi có

độ phân cực trung bình. Các hệ dung môi thường được

dùng là :

A: Axit axetic : clorofoc (1 : 9)

(Chất hấp phụ là silicagel G)

B: Etyl axetat: Benzen (9:11)

( Chất hấp phụ là silicagel G)

C: Benzen: metanol: axit axetic (45: 8: 6

(Chất hấp phụ xenlulo MN 300)

D: Axit axetic : nước ( 6 : 94)

(Chất hấp phụ xenlulo MN 300)

Chất hiện màu : Vanilin + HCl

Kết quả phân tích được ghi ở bảng 2.1

Bảng 2.1: Kết quả phân tích bằngsắc ký lớp mỏng ( SKLM) của một số

phenol với 4 hệ dung môi thông dụng

Cácphenol

Rf x 100 với hệ dm Màu với

Vanilin+ HCl

UV (λmax)

A B C D Etanol Etanol+NaOH

Phenol đơn vòng

Ocxinol

4-

metylrezoxino

l

2-

19

25

40

17

62

63

64

59

46

59

58

48

67

65

73

74

Hồng xỉn

Đỏ gạch

Hồng xỉn

Đỏ

276,28

2

282

275,28

294

291

288

293

Phân37

metylrezoxino

l

Rezoxinol

Catechol

Hydroquinon

Pyrogalol

Phlorogluxino

l

Axit phenol

Axit galic

A.

protocatechic

A.p-

hidroxibenzoi

c

Axit syringic

Axit vanilic

Axit

salixylic

35

18

8

5

5

19

55

79

82

91

66

58

15

47

40

44

80

58

73

82

58

34

19

9

5

19

60

74

70

86

72

69

72

62

40

52

62

52

57

66

Không màu

Không màu

Không màu

Không màu

T.T Folin

Xanh

Xanh

Xanh sau khi

hơ NH3

Xanh sau khi

hơ NH3

Xanh sau khi hơ

NH3

Xanh sau khi

hơ NH3

0

276,28

3

279

295

269,27

3

272

260,29

5

265

271

260,29

0

235,30

5

hủy

Phân

hủy

350

Phân

hủy

240,

283

278

298

285,29

7

225,

297

2.2 PHENYL PROPANOIT38

Phenyl propanoit là nhóm hợp chất phenolic tự nhiên

gồm một mạch nhánh 3 nguyên tử cacbon gắn vào nhân thơm

Về mặt sinh tổng hợp chúng là dẫn xuất của axit amin

thơm phenylalanin

2.2.1 CÁC HỢP CHẤT THƯỜNG GẶP

Hợp chất phổ biến nhất là các axit hydroxyxinamic.

Trong đó có bốn axit phổ biến nhất là axit ferulic,

axit sinapic, axit cafeic và axit p-coumaric. Cả bốn

axit trên vì có khả năng phát quang màu xanh hoặc lục

dưới đèn tử ngoại, vì vậy dễ dàng phát hiện trên SKG

hoặc SKLM.

R= H: axit p-cumaric

R= H : axit ferulic

R= OH: axit cafeic

R= OCH3: axit sinapic

2.2.2. PHÂN BỐ

Các axit hidroxixynamic tồn tại trong cây chủ yếu ở

dạng este, dễ bị thủy phân bằng kiềm cho axit tự do.

Axit cafeic thường tồn tại ở dạng este với axit

quinic, gọi là axit clorogenic

2.2.3 CHIẾT XUẤT VÀ PHÂN TÍCH39

Axit hydroxixynamic thường được phân tích đồng thời

với các phenol và các axit phenol sau khi thủy phân

dịch chiết thực vật bằng kiềm và chiết láy phenol bằng

ete hoặc etyl axetat.

Cắn sau khi bốc hơi, hòa tan trong metanol, chấm

trên SKG hoặc SKLM xenlulozơ. Hiện vết bằng soi UV hoặc

UV + NH3.

Dung môi: BAW: n-BuOH- HOAc - H2O (4: 1:5) lớp

trên

BN: n-BuOH -NH4OH 2M (1: 1) lớp

trên

BEW: n-BuOH – EtOH- H 2O (4:

1: 2,2)

Bảng 2.2 : Giá trị Rf và màu sắc của một số axit

hydroxyxinamic trên sắc ký giấy (SKG) với một số hệ

dung môi

Axit

hydroxixynamic

Rf x

100

UV UV+NH3

BAW BN BEW H2OAxit p- 92 16 88 42,8 - Màu hoa cà

40

coumaric

Axit cafeic

Axit ferulic

Axit sinapic

Axit o-

coumaric

Axit

isoferulic

79

83

84

93

89

4

12

4

21

12

79

82

88

86

67

26,6

33,6

62

82

37

Xanh

Xanh

Xanh

Vàng

Tối

Xanh sáng

Xanh sáng

Xanh lục

Vàng lục

vàng

2.2.4 CÁC POLYPHENOL

Có hai loại hợp chất thường gặp là lignin và lignan(

xem tài liệu)

a.Lignin

Lignin là các phenol polime khu trú ở các vách tế

bào thực vật có vai trò cùng với xenlulo làm cho than

cây và cành cây trở nên cứng cáp hơn và là chất đặc

trưng của các cây có gổ.

Lignin chiếm đến 30% trọng lượng các chất hữu cơ

trong cây.

Khi oxi hóa với nitrobenzen, lignin cho ra 3 andehit

phenolic tương ứng với ba axit phenol phổ biến trong

cây là axit p-hydroxybenzoic, axit vanilic và axit

syringic.

41

Lignin của cây hạt kín và cây hạt trần có sự khác

biệt. Trong cây hạt kín có chứa lignin thuộc nhóm

syringic nhưng trong cây hạt trần không có. Ngược lai,

axit phenol tự do trong thực vật hạt kín chỉ có axit p-

hydroxybenzoic và axit vanilic mà không có mặt axit

syringic, trong khi cây hạt trần có cả ba loại axit

trên.

Mối quan hệ giữa lignin và axit phenol tự do và sự

khác biệt của chúng với nhau trong thực vật hạt trần và

hạt kín có ý nghĩa trong việc phân tích, xác định về

phương diện hóa thực vật.

Để phân tích lignin, trước hết thủy phân trong axit

HCl loãng, sau đó phân tích xác định các axit phenol

từ dịch thủy phân.

Một đơn vị cấu trúc của lignin

b.Lignan

Lignan là các hợp chất phenol thiên nhiên có cấu

trúc C6-C3 hoặc các dẫn xuất polime của chúng. Hợp chất

lignan đóng vai trò chủ yếu tạo nên lignin là coniferin,

glycozit của coniferyl ancol.

42

Những nhựa phenolic thiên nhiên rất gần với lignin,

chúng là các dime của những đơn vị C6-C3 liên kết ở vị

trí cuatr C3. Dưới đây là một số dạng phổ biến

- Dạng axit guaiaretic, dẫn xuất của

- Các dẫn xuất tetrahydrofuran

Đa số các lignan thiên nhiên có nhóm 4-hydroxyl, 3-

metoxy phenol như thấy ở axit guaiaretic ,

lariciresinol

2.3 COUMARIN2.3.1 ĐẠI CƯƠNG

Coumarin là nhóm hợp chất thiên nhiên được xem là

dẫn xuất lăcton của axit orto-hydroxixynamic (I). Hầu

hết các coumarin đã biết hiện nay (khoảng 600 chất) tồn

tại chủ yếu dưới dạng tự do, một số ít tồn tại ở dạng

43

glycozit như các glycozit của psonolen (II). Coumarin

phổ biến nhất trong cây là chất umbeliferin (III)

Về cấu trúc có thể có các loại khung isopren như

suberosin (IV), colombianetin (V)

Về phân bố: Coumarin có trong nhiều họ thực vật:

Leguminosen, Umbeliferae, Ochidaceae, Rutaceae. Chúng

có mặt trong hầu hết các bộ phận của cây: rễ, lá, hoa,

quả.

Đặc tính vật lý Coumarin là chất phát quang mạnh và

rất nhạy với ánh sáng. Người ta lợi dụng tính chất này

để tách các hợp chất coumarin

Về tác dụng dược lý, coumarin và dicoumarin dùng làm

thuốc chống đông máu. Tính chất này có liên quan đến

nhóm OH ở vị trí C4 trong cấu trúc. Tính chất chống đông

máu biến mất hoặc giảm khi nhóm OH ở vị trí này bị biến

mất hoặc bị thay thế bởi nhóm khác.

44

Ngoài ra một số coumarin có tác dụng làm giản động

mạch vành và mạch ngoại vi, có tác dụng chống co thắt.

Một số coumarin có tác dụng làm tăng cholesterol trong

máu. Một số chất có tác dụng ức chế sinh trưởng thực

vật, tác dụng kháng khuẩn, diệt nấm và chống viêm.

2.3.2 CHIẾT XUẤT

Có thể dùng phương pháp chiết phân đoạn coumarin

bằng dãy các dung môi có độ phân cực tăng dần.

Nói chung các coumarin là phân cực yếu do đó đa số

tan trong ete dầu hỏa hoặc ete etylic. Nhiều trường hợp

có thể thu được coumarin tinh thể ngay trong dung dịch

ete hoặc ete dầu hỏa khi chiết soxhlet.

Do có mặt của nhóm lăcton, một số coumarin còn có

nhóm OH phenol nên chúng tan được trong kiềm nóng. Vì

vậy có thể chiết chúng bằng kiềm loãng nóng , dịch kiềm

đem axit hóa thu được kết tủa coumarin.

Các glycozit của coumarin có thể được chiết bằng

dung dịch metanol loãng hoặc etanol loãng (60-80%).

Nguyên liệu được loại tạp chất béo bằng ete dầu hoả sau

đó chiết bằng cồn. Dịch chiết cồn sau khi đã lọai tạp

có thể cho tinh thể coumarin khi làm bay hơi dung môi

Có thể loại tạp bằng dung dịch chì axetat. Các

glycozit coumarin có thể thủy phân bằng dung dịch axit

45

hoặc bằng enzym. Việc xác định phần đường có thể dùng

sắc ký giấy.

Để phân lập các coumarin có thể dùng sắc ký cột

polyamit, silicagel hoặc sắc ký lớp mỏng.

Có thể tinh chế coumarin bằng phương pháp thăng hoa

(nhưng chỉ áp dụng với các coumarin bền với nhiệt độ)

Nhờ đặc tính phát quang mạnh của coumarin dưới đèn

tử ngoại nên việc theo dõi, phát hiện chúng trong quá

trình chiết xuất được dễ dàng

2.3.3 PHÂN TÍCH COMARIN

2.3.3.1. Định tính

Hầu hết có tính phát quang mạnh dưới đèn tử ngoại.

Các coumarin có Oxi ở vị trí số 7 có thể phát quang ở

ánh sáng thường nhất là khi có axit sunfuric. Các

furocoumarin ( có cấu trúc kiểu (II) ) cho phát quang

màu lục.

Coumarin còn cho phản ứng màu với thuốc thử Emerson

( 0,5% Na2CO3, 0,9% 4-aminoantipyrin, 5,4 % feroxianua

trong nước).

Do có mặt nhóm lacton, coumarin tan được trong dung

dịch kiềm và làm dung dịch có màu vàng, màu này biến

mất khi thêm axit.

Có thể kiểm tra thêm coumarin bằng phản ứng đặc

trưng của vòng lacton. Để xác định vòng furan trong46

furanocoumarin bằng phản ứng Erhlich (dung dịch 0,5% p-

dimetylaminobenzandehit trong etanol, sau đó cho tác

dụng với khí HCl) tạo màu vàng cam.

2.3.3.2 Sắc ký giấy và sắc ký lớp mỏng

+ Sắc ký giấy:

Các hệ dung môi thường dùng là : Axit axetic: Nước

(98:2)

Di

metyl focmamit : Etanol (4:6)

Phát hiện vết bằng đèn UV, bằng dd KI + I2 hoặc bằng

các thuốc thử màu trên.

+ Sắc ký lớp mỏng:

Chất hấp phụ thường được dùng là silicagel, các hệ

dung môi thường được dùng là:

Ete dầu hỏa : etylaxetat (100: 3)

Toluen : etyl focmiat : axit focmic (5 :

4 :1)

CHCl3: CH3OH ( 9 : 1)

CHCl3 : etyl axetat (1 :1)

Hexan : etyl axetat (3:1)

Benzen : axeton (9:1)

Benzen : etyl axetat (9 : 1)

2.3.3.3 Phân tích quang phổ UV, IR, MS, NMR

47

Do có cấu trúc liên hợp nên phổ UV sử dụng khá hiệu

quả,nhờ có các băng đặc trưng. Các loại phổ IR, NMR

cũng được sử dụng để xác định cấu trúc rất hiệu quả

2.4 QUINONQuinon là những dixeton chưa no, khi khử chúng tạo

thành poliphenol. Các poliphenol này dễ bị oxi hóa tạo

lại quinon

Quinon là những hợp chất có màu , chúng góp phần tạo

màu sắc của cây và động vật. Nhiều hợp chất của quinon

như vitamin K...tham gia vào quá trình hô hấp, vào sự

vận chuyển electron trong các tổ chức thực vật

Về mặt phân bố, chúng có rải rác ở thực vật đơn bào,

ở nấm…, nhưng ít gặp trong cây một lá mầm

2.4.1 CẤU TRÚC- PHÂN LOẠI

Dựa vào sản phẩm khử hóa của quinon có thể chia

chúng thành các nhóm:

- Benzoquinon

- Naphtaquinon

- Antraquinon

- Phenantraquinon

Nếu 2 nhóm xeton cạnh nhau ta có octo quinon, còn

nếu nó cách nhau 1 nhóm vinyl ta có para quinon

48

2.4.1.1 Benzoquinon

Thường gặp loại này trong nhiều loại nấm và trong

thực vật bậc cao thường gặp chúng trong rễ của một số

loài họ cúc và một số loài khác . Ví dụ

2.4.1.2. Naphtoquinon

Các naphtoquinon có từ màu vàng đến đỏ. Chất quan trọng

nhất là vitamin K

2.4.1.3. Anthraquinon

Phần lớn các anthraquinon có nhóm OH ở C1 và C8 và tồn

tại ở dạng glycozit. Các glycozit này dễ bị thủy phân

trong quá trình chiết xuất.

49

Công thức của một số anthraquinon

Đôi khi các glycozit là các chất khử, kết hợp với một

oza hoặc hai quinon kết hợp với nhau qua nhóm xeton

2.4.1.4. Phenantraquinon

Nhóm này ít thấy ở trong tự nhiên, chỉ gặp một số hợp

chất . Ví dụ:

50

2.4.2 CHIẾT XUẤT

Do benzoquinon và naphtaquinon là những chất không

phân cực nên rất dễ tan trong dầu béo và các dung môi

không phân cực (ete , benzen…). Một số benzoquinon không

có OH ở C1 và naphtaquinon có thể cất kéo hơi nước. Do đó

benzoquinon và naphtaquinon có thể chiết bằng ete dầu hỏa

hoặc benzen nóng. Một số trường hợp chúng có thể kết tinh

ngay trong bình khi bốc hơi dung môi.

Các anthraquinon do có nhiều nhóm OH nên nói chung là

những nhóm phân cực mạnh, chúng tan được trong nước nóng,

trong cồn và các dung dịch kiềm và dung dịch cacbonat

kiềm. Các anthraquinon có thể chiết bằng cồn. Dịch chiết

cồn đem bốc hơi cồn và kết tinh lại trong hỗn hợp axeton-

nước sẽ thu được glycozit anthranon toàn phần.

Để thủy phân các glycozit có thể dùng axit axetic

hoặc HCl 5% trong cồn ở 700C trong 1 giờ. Các aglycon sau

khi thủy phân được chiết bằng benzen. Bốc hơi benzen và

tinh chế lại thu được anthranon tinh khiết.

51

Để tách hỗn hợp các quinon có thể bằng sắc ký cột với

chất hấp phụ là polyamit, silicagel, MgO hoặc canxi

photphat.

2.4.3 PHẨN ỨNG ĐỊNH TÍNH

- Dùng chất khử để khử chúng thành polyphenol (mất

màu) và oxi hóa chúng trở lại hợp chất ban đầu (có màu).

Chất khử thường dùng là bohidrua và oxi hóa bằng cách để

ngoài không khí.

- Một số p-benzoquinon và p-naphtaquinon cho màu xanh

hoặc tím với thuốc thử xiano axetat etyl và amonoac hoặc

với dung dịch 0,2% p-nitrophenyl axetonitrin với natri

hydroxit 0,1N.

- Dung dịch 1,4-naphtaquinon trong benzen có màu vàng

chuyển sang màu đỏ khi cho thêm kiềm. Các 1,2-

naphtaquinon có màu đỏ, khi cho thêm kiềm chuyển sang màu

tím xanh.

- Các hydroxianthraquinon cho màu sắc khác nhau khi

đun nóng với dung dich magie axetat 0,5% trong metanol.

- Phản ứng Bortrager: Dùng để phát hiện anthraquinon

và naphtaquinon.

Trong ống nghiệm, cho vài mg chất thử được hòa tan

trong 1 ml dung dịch 2-5% KOH. Đun nóng 10 phút, để

nguội. Axit hóa dung dịch và chiết bằng benzen. Tách lớp52

benzen qua ống nghiệm khác. Cho vào ống chứa benzen 1 ml

dung dịch KOH, lắc. Nếu lớp benzen mất màu và lớp kiềm có

màu đỏ là phản ứng dương tính.

Nếu có dẫn xuất anthron thì lớp kiềm vẫn giữ màu vàng

với huỳnh quang lục, nhưng sẽ chuyển sang màu đỏ nếu thêm

vào đó 2 giọt dung dịch H2O2 3-6%.

2.4.4. SẮC KÝ GIẤY VÀ SẮC KÝ BẢN MỎNG

Sắc ký giấy được sử dụng nhiều khi phân tích quinon.

Giấy được tẩm với dung dịch 5 dầu váelin trong ete-dầu

hỏa. Dùng hỗn hợp đimetylfocmamit-H2O (97:3) làm pha di

động. Các quinon cho vết phát quang màu lục hoặc tím

dưới đèn tử ngoại

Đối với các hydroxiantraquinon dung hệ dung môi ete

dầu hỏa bão hòa trong metanol 97%. Để hiện vết dùng dung

dịch 0,5% mage axetat trong methanol và hơ nóng giấy 900C

trong 5 phút. Các anthraquinon có OH ở meta cho màu da

cam,, Nếu OH ở vị trí para cho màu mận chin và nếu OH ở

vị trí octo cho màu tím.

Sắc ký lớp mỏng: chất hấp phụ thường dung là polyamit

và silicagel. Nếu dung silicagel tráng trên kính thì có

thể dung các hệ dung môi sau:53

-Benzoquinon: n-hexan – etylaxetat (17:3)

: benzene- axit axetic (9:1)

: clorofom-axit axtic (9:1)

-Naphtaquinon: Ete dầu hỏa-etyl axetat (7:3)

: benzene-ete dầu hỏa (7:3)

-Antraquinon: n-hexan – etylaxetat (85:15)

: benzene- axit axetic

(10:2)

Hiện màu: Phun dung dịch KOH 10% trong methanol các

vết màu vàng nguyên thủy của ảntaquinon sẽ chuyển thành

màu đỏ, tím hoặc lục. Cũng có thểhiện vết bằng cách hơ

kính lên lọ ammoniac và soi phát quang ở UV

2.4.5 PHÂN TÍCH QUANG PHỔ

Chương 3 FLAVONOIT3.1 ĐẠI CƯƠNG

54

3.1.1 ĐỊNH NGHĨA : Flavonoit là những chất màu thực

vật có cấu trúc cơ bản như sau:

Tại các vòng có liên kết với hay một vài nhóm

hydroxyl tự do hay đã thay thế một phần. Vì vậy về bản

chất chúng là những poliphenol có tính axit. Các

poliphenol có thể phản ứng với nhau qua các nhóm OH để

tạo thành phân tử phức tạp hơn hoặc có thể liên kết với

các hợp chất khác trong cây như các đường hoặc protein

3.1.2 PHÂN LOẠI

Dựa vào sự oxy hóa của vòng pyran trung tâm, người ta

phân flavonoit thành các loại khác nhau

3.1.2.1 Flavon : Có cấu trúc chung

Thường gặp là

55

3.1.2.2. Flavanon : khác flavon là không có liên kết

đôi ở C2-C3

Chúng đều có OH ở vòng A hay vòng B. Trong tự nhiên

nó thường có mặt đồng thời với flavon tương ứng. Các

chất thường gặp là naringin, prunnin và hesperidin

3.1.2.3. Flavonol : khác với Flavonon là có nhóm OH ở

C3

Nó là loại hợp chất phổ biến trong tự nhiên, đặc biệt

là trong cây hạt kín có chứa nhiều chất sau: kaempferol,

quecxetin và mirixetin

56

3.1.2.4. Dihydroflavonol : tương tự như flavonol

nhưng không có nối đôi C2-C3

Chất phổ biến nhất là 7-hydroxidihydroflavonol

3.1.2.5.Chalcon

Là loại flavonoit vòng mở, hai nhân thơm liên kết với

nhau qua mạch ba cacbon α, β không no. Phổ biến nhất là

butein

3.1.2.6. Isoflavon:

là nhóm isoflavonoit phổ biến nhất có nhiều tác dụng

chữa bệnh

Ví dụ daidzein có trong cát căn, hoặc fomonometin có

trong cam thảo

57

Ngoài ra còn có nhiều loại khác như auron,

antoxyanidin, leucoantoxifanidin, rotenoit,

neoflavonoit, biflavonoit.

3.1.3 PHÂN BỐ

Nó là loại hợp chất phân bổ rộng nhất ở trong thiên

nhiên ( lớn hơn 2000 chất) Nói chung nó không có mặt

trong tảo và nấm. còn các loại thực vật bậc cao đều có

mặt flavonoit, và nó có mặt liên kết các bộ phận của cây

: thân, lá, rể, gỗ… và khu trú ở thành tế bào. Flavonoit

tham gia vào sự tạo thành màu sắc của cây (đặc biệt là

hoa) đó là một trong những chức năng cơ bản của

flavonoit đối với cây.

3.1.4 VAI TRÒ CỦA FLAVONOIT TRONG CÂY

3.1.4.1 Các phản ứng sinh hóa:

- Các nhóm OH phenol của flavonit có vai trò trong sự

hòa tan các chất và di chuyển dể dàng qua các màng sinh

lý

58

- Một số flavonoit có tác dụng như là chất chống oxi

hóat, bảo vệ axit ascorbic trong cây

- Một số có tác dụng ức chế các enjym và các chất

độc của cây

3.1.4.2 Vai trò ức chế và kích thích sinh trưởng

của cây :

Nhóm hydroxi có mặt trong cấu tạo của flavonoit đóng

vai trò ức chế và kích thích sinh trưởng của cây

Ví dụ trong cây ổi các flavonoit có các nhóm OH ở vị

trí 4’ làm tăng cường hoạt tính của enzim làm kích thích

sinh trưởng, còn khi OH ở vị trí 3’và 4’ lại ức

chế...Flavonoit còn tham gia vào quá trình hô hấp quang

hợp

3.1.4.3 Vai trò tạo màu sắc

Tạo ra sức hấp dẫn để dụ ong bướm đến thụ phấn góp

phần cho cây tồn tại & phát triển.

Trong việc tạo màu các flanon, flavonol,chalcon cho

màu vàng trong khi các autõyanin cho các màu hồng , đỏ,

tím hoặc xanh thẩm

3.1.4.4 Vai trò bảo vệ cây:

Tạo vị đắng để động vật ăn cỏ không thích ăn cây

3.1.5 VAI TRÒ CỦA FLAVONOIT TRONG Y HỌC

Nhiều flavonoit Có tác dụng ức chế hô hấp và sự tái

sinh sản đối với nhiều chủng vi khuẩn59

Nhiều flavonoit có tác dụng đối với một số dạng

ung thư (ung thư vòm họng…)

Nhiều flavonoit có tác dụng nâng cao tính bền của

thành mạch máu đặc biệt là các flavonoit có nhóm OH ở

các vị trí 3’, 4’. Rutin là chất tiêu biểu của tác dụng

này

Tác dụng estrogen: Một số flavonoit có tác dụng

gây sẩy thai ở động vật

Nhiều flavonoit có tác dụng chống dị ứng, chống co

giật, giảm đau

3.2 CHIẾT XUẤTĐộ hòa tan của các flavonoit tùy thuộc vào số nhiều

axit có trong phân tử. Do số nhóm và vị trí của các nhóm

này rất khác nhau vì vậy không có phương pháp chung về

chiết xuất. Tuy nhiên có thể nêu nguyên tắc chung như

sau :

- Do flavonoit có hầu hết các bộ phận của cây (rễ,

gổ, lá, hoa, quả, hạt, sáp), trường hợp chiết lớp sáp ở

ngoài lá thì phải dùng ete… để rửa lấy sáp, các bộ phận

khác nói chung sấy khô, tán bột để chiết.

- Nói chung các glycofit của flavonoit có độ phân

cực mạnh hơn aglicon tương ứng. Đối với aglicon mà có ít

nhóm OH , chúng có độ phân cực yếu thì dùng các dung môi60

phân cực yếu như bonzen, cloroform, etyl axetat… để

chiết.

- Các flavonoit có nhiều nhóm OH như flavonol, các

glycozit.. là những chất phân cực mạnh, nên có thể chiết

chúng bằng cồn, nước hoặc là hỗn hợp của chúng

- Dung môi có thể áp dụng cho hầu hết flavonoit là

cồn 80%, 60% (có thể là C2H5OH,CH3OH 60%,80%)

- Chiết các glycozit : có thể dùng nước nóng

- Do có OH phenol nên có thể dùng dung dịch kiềm

loãng

3.3 TÁCH RIÊNG – TINH CHẾ3.3.1.TÁCH SƠ BỘ : Nhằm mục đích loại tạp và tách

phân đoạn đối với hỗn hợp các flavonoit : có thể áp dụng

các cách sau :

1. Có thể dung hỗn hợp các dung môi có độ phân cực

khác nhau, không tan với nhau để phân đoạn :

Ví dụ : hỗn hợp aglycon và glycozit : CHCl3-H2O, H2O

– etyl axetat , Butanol-ete dầu hỏa

2. Phương pháp cổ điển : Dùng Pb( CH3COO)2 để tủa

flavonoit (phenol nói chung)

Hòa tan cao hỗn hợp vào cồn loãng,cho dung dịch chì

axetat vào để tủa flavonoit. Lọc lại cho tủa này tan

trong cồn loãng khấy đều thành dung dịch đồng nhất. Sau

đó cho 1 trong các dung dịch sau đây : Na3PO4; Na2S để kết61

tủa chì. (Dùng photphat hoặc sunfat tốt hơn sunfua vì

các tủa này hấp phụ flavonoit ít hơn sunfua chì )

3. Dùng than hoạt tính cho vào dung dịch cao để hấp

phụ flavonoit sau đó dùng dung môi rửa than để lấy lại

flavonoit

Khi rửa dung môi từ không phân cực => phân cực ít =>

phân cực mạnh

Ví dụ : ete => methanol => nước nóng

4. Tách phân đoạn bằng các dung dịch có độ kiềm khác

nhau

ví dụ : đầu tiên dùng dung môi hữu cơ CHCl3, etyl

axetat; sau đó lần lượt chiết dung dịch trên với dung

dịch natriborat Na3BO3, NaHCO3 và Na2CO3 10%.

Axit hóa các dung dịch kiềm, flavonoit sẽ kết tủa,

lọc thu kết tủa hoặc chiết lấy flavonoit bằng dung môi

hữu cơ (CHCl3,etyl axetat )

3.3.2.SẮC KÝ CỘT

- Là phương pháp tốt nhất để tách riêng flavonoit.

Các chất hấp thụ thường dùng là poliamit, silicagel,

xenluloza

- Dung môi dùng rửa là : ete dầu, Benzen, CHCl3, ete,

etyl axetat, axeton, rượu etylic, rượu metylic, H2O, áp

dụng cho hầu hết Flavonoit

62

3.3.3 TINH CHẾ: phương pháp tốt nhất là lọc qua cột

chất hấp thụ ( poliamit, silicagel, bột xenlulo), hạn

chế dùng than hoạt vì than hoạt hấp thụ rất mạnh

flavonoit

Kết tinh flavonoit trong etanol , metanol hoặc cồn –

axeton, cồn-etyt axetat.

3.3.4 THỦY PHÂN GLYCOZIT FLAVONOIT Có thể dùng axit

hay enzym

Đối với enzym thường dùng là -glycosidaza vì hầu

hết cac glycozit flavonoit là -glycosit

Cách thủy phân bằng axit: Có thể dùng các loại axit

khác nhau (HCl, HCOOH, CH3COOH…) với nồng độ thích hợp,

thêm một ít cồn để hòa tan glycozit, đun sôi cách thủy

từ vài phút đến 1 giờ hoặc có thể lâu hơn tùy theo từng

loại hợp chất và điều kiện tiến hành phản ứng. Để nguội.

Chiết dung dịch thu được bằng ete để láy phần aglycon.

Phần dịch nước chứa các đường, có thể phân tích hỗn hợp

này bằng sắc ký giấy

3.4. PHÂN TÍCH FLAVONOIT3. 4.1 PHÂN TÍCH ĐỊNH TÍNH

3. 4.1 .1 Các phản ứng màu flavonoit

63

a/ Amoniac ( NH3) : Khi có mặt của hơi NH3, nhiều

flavonoit thay đổi màu, có thể quan sát sự thay đổi màu

bằng mắt thường hoặc dưới đèn tử ngoại

+ Cánh hoa màu trắng + hơi NH3 cho màu vàng là flavon

hoặc flavonol

+ Cánh hoa màu vàng + NH3 cho màu vàng cam hoặc hồng

là Chalcon, auron

+ Cánh hoa màu bất kỳ ( vàng , đỏ, tím…) +NH3 cho màu

đỏ thẩm là autoxyanidin

b/ Phản ứng xianidin của Wilstater

-Benzopyron trong đa số flavonoit có phản ứng với

HCl +Mg bột

Trong 3 ống nghiệm, cho vào mỗi ống 1-2 ml dung dịch

thuốc thử

+ Ống 1: làm đối chứng

+ Ống 2: thêm 0,5 ml HCl đặc + 3-5 hạt Mg. Quan sát,

nếu sau 10’ nó từ màu vàng, đỏ, đến xanh là có

flavonoit. Có thể nhận định thêm

- Vàng cam-đỏ là flavon

- Đỏ thẩm là flavonol, flavanon

- Màu đỏ ngay sau khi cho HCl là chalcon, auron

+ Ống 3: Thêm 0,5 ml HCl đặc đun cách thủy 5 phút,

nếu có màu đỏ tím là leucoantoxyanidin

64

c/ Thuốc thử FeCl3 trong cồn hoặc nước => cho màu

của phenol và flavon

d/ Thuốc thử SbCl5 1% trong tetraclorua cacbon => có

tủa màu đỏ hoặc tím là của Chalcon, màu vàng hay da cam

=> flavon ( phản ứng Marini – Bettolo )

e/ Thuốc thử axit boric trong anhydrit axetic

Các hợp chất 5- hydroxi flavonon cho màu cam hay đỏ

g/ H2SO4

Hòa tan một ít cao của dịch chiết flavon vào axit

sunfuric đặc, nếu cho màu: vàng tươi : flavon,

flavonol

màu cam : flavonon

đỏ hoạc tím : chalcon, auron

h/ Kiềm : Dịch chiết flavonoit, nếu trong dung dịch

kiềm. Nếu có:

Màu vàng :flavon, flavonol,

Màu cam, đỏ: flavon, isoflavonon

Màu tím : Chalcon

Màu cà phê: flavonol

Màu xanh: autoxyanin …

3. 4.1.2 Sắc ký giấy và sắc ký lớp mỏng

Nếu dùng hệ dung môi thích hợp ta có thể tách

được các flavonoit khác nhau có Rf khác nhau

3.4.2 PHÂN TÍCH CẤU TRÚC BẮNG PHƯƠNG PHÁP QUANG PHỔ65

Chương 4

TINH DẦU- HỢP CHẤT LACTON

TECPENOIT4.1 ĐẠI CƯƠNG VỀ TINH DẦU

Tinh dầu (còn có tên khác là chất thơm, hương thơm,

tinh du…) là hỗn hợp của nhiều chất bay hơi, có mùi đặc

biệt có nguồn gốc chủ yếu từ thực vật thu được bằng cách

chưng cất hoặc chiết bằng dung môi hữu cơ

Nó ít tan trong nước, dể tan trong ete, dầu béo, dể

bay hơi,

66

Về phân bố: Cây chứa tinh dầu phân bổ khá rộng trong

nhiều họ thực vật. Trong cây, tinh dầu có thể khu trú

tại lá, hoa, quả , rể, vỏ, thân gỗ… Thành phần tinh dầu

của mỗi bộ phận của cây có thể giống hoặc khác nhau

( ví dụ : thành phần tinh dầu hoa cam và vỏ cam rất khác

nhau). Vì vậy thường để sử dụng người ta không khai thác

tất cả các bộ phận của cây ma chỉ khai thác những bộ

phận nào có hàm lượng cao và phẩm chất tinh dầu tốt

nhất.

4.2 THÀNH PHẦN HÓA HỌCNó là hỗn hợp của nhiều hợp chất khác nhau: các

hydrocacbon béo hoặc thơm, các dẫn xuất của chúng như

ancol, andehit, xeton, este , ete… nhưng chung qui lại

chúng có hai nhóm chính là tecpenoit và các dẫn xuất của

phenol. Nhóm tecpenoit chủ yếu là monotecpen, và

sesquitecpen.

4.2.1 TECPENOIT

4.2.1. 1. Monotecpen (C10) : Dựa vào đặc điểm cấu

trúc, có thể chia thành 3 nhóm chính là: loại không vòng

(như geraniol), có 1 vòng (như limonen) và 2 vòng (như

pinen). Trong mỗi nhóm có thể là loại không có nhóm chức

hoặc có thể có nhóm chức (ancol, andehit, xeton.. )

Ví dụ :

Hợp chất không vòng 67

Hợp chất 1 vòng

Hợp chất hai vòng

4.2.1.2 Sesquitecpen (C15):

Sesquitecpen luôn có mặt cùng với monotecpen trong

tinh dầu. Sesquitepen trong tinh dầu do có nhiệt độ sôi

trên 200oC, do đó khi chưng cất thì chúng có hàm lượng

không cao.

Một số sesquitecpen có trong tinh dầu là :

68

Đặc điểm cấu tạo của tecpenoit

Người ta coi tecpenoit là sản phẩm của sự kết hợp các

phân tử isopren với nhau. Đó là ‘’qui tắc isopren ’’ của

tecpenoit

Cách xác định cấu trúc của tecpen. Dựa vào các phản

ứng đặc trưng và qui tắc isopren

Những phản ứng đặc trưng thường dùng :

+ Xác định liên kết đôi: phản ứng với dung dịch brom,

cộng hydro ( Ni xúc tác)

+ Xác định H linh động: Tác dụng với CH3MgX hoặc với

natri

+ Xác định nhóm -CHO: Dùng thuốc thử Fehling, Tollens

hay axit fucsinsunfurơ

+ Xác định vị trí của liên kết đôi: Phản ứng ozon

phân : Cho hỗn hợp các hợp chất chứa nhóm cacbonyl, phản

ứng oxi hóa cắt mạch… phối hợp với ”quy tắc isopen” ta

có thế xác định được cấu tạo của tecpen

4.2.2 DẪN XUẤT PHENOL

Nhóm này là thành phần chủ yếu của tinh dầu của một

số cây trong họ Umbeliferae tiêu hồi, mùi, thìa lá …

69

Đa số hợp chất của nhóm này là loại phenyl propanoit

có cấu trúc C6-C3 có một hay nhiều nhóm OH tự do hay bị

thay thế H của OH. Vì vậy về bản chất chúng là hợp chất

phenol

Một số hợp chất thường gặp

Đặc điểm của các phenol này khác với phần lớn các hợp

chất phenol khác là chúng có thể tan được trong dầu béo.

Thành phần của tinh dầu tuy khác nhau nhưng thường có

nguồn gốc sinh tổng hợp từ một số tiền chất nhất định.

Vì vậy mỗi loại tinh dầu đều có một thành phần chủ yếu

và một số thành phần phụ có cấu trúc tương tự.

Ví dụ tinh dầu bạc hà có 50-70% mentol, ngoài ra có

menton, limonene, -pinen, cadinen…. Tinh dầu tiểu hồi

70

có70-90% anetol, ngoài ra có các thành phần khác tương

tự

4.3 CHIẾT XUẤT. Tinh dầu khu trú trong nhiều bộ phân khác nhau của cây:

lá, hoa , thân, vỏ thân, rễ, quả…Nguyên liệu chiết tinh

dầu có thể khô hoặc tươi, nhưng nếu có điều kiện thì dùng

tươi tốt hơn vì thành phần không bị hao hụt và phân hủy

trong quá trình làm khô.

Tùy thuộc vào các dạng tinh dầu có trong nguyên liệu

trạng thái tự do, hay hết hợp glycozit mà người ta dùng

các phương pháp khác nhau để tách chúng.

Nhìn chung các phương pháp được dùng để tách tinh dầu

phải đạt yêu cầu cơ bản như sau :

- Giữ cho sản phẩm tinh dầu có mùi tự nhiên như

nguyên liệu

- Qui trình kỹ thuật khai thác phù hợp, thuận tiện,

nhanh chóng

- Phương pháp tách tinh dầu tương đối triệt để khai

thác hết tinh dầu trong nguyên liệu mà có đầu tư ít tốn

nhất

Trong thực tế người ta thường sử dụng các phương pháp

sau:

4.3.1 PHƯƠNG PHÁP CƠ HỌC: ( thường là ép )71

Phương pháp này thường dùng để tách tinh dầu nằm ở vỏ

(quýt, cam, bưởi), khi tác dụng một lực lên các tế bào

chứa tinh dầu vở, tinh dầu chảy ra. Phương pháp này có

ưu điểm nhanh, tinh dầu giữ được mùi tự nhiên. Tuy nhiên

phương pháp này không sử dụng được cho nhiều nguyên liệu

chứa tinh dầu hoặc hàm lượng tinh dầu trong nguyên liệu

thấp

4.3.2 PHƯƠNG PHÁP CHƯNG CẤT :

Đây là thường dùng nhất vì thiết bị không phức tạp

lắm mà có khả năng lấy kiệt được tinh dầu trong nguyên

liệu và dựa vào nhiệt độ sôi các chất khác nhau có thể

lấy được các phân đoạn với thành phần chủ yếu là một số

chất nào đó. Tuy nhiên có những nhược điểm là : Các tinh

dầu có thành phần khó bay hơi, hay một số tinh dầu có

thành phần không bền vững dễ thay đổi ở nhiệt độ cao thì

không áp dụng được

4.3.3 PHƯƠNG PHÁP TRÍCH LY (ngâm chiết)

Phương pháp này áp dụng cho các nguyên liệu tinh dầu

mà thành phần hóa học của nó không bền dễ thay đổi thành

phần và mùi vị ở nhiệt độ cao. Ngoài ra các nguyên liệu

có hàm lượng tinh dầu quá ít cũng không dùng phương pháp

chưng cất được mà phải dùng phương pháp trích ly.

Phương pháp trích ly người ta thường dùng các dung

môi hữu cơ dễ bay hơi như ete dầu hỏa, ete, ancol,72

axeton hoặc các dung môi khó bay hơi như mỡ động vật,

vazơlin. Gần đây người ta dùng CO2 lỏng để trích lý tinh

dầu.

4.3.4 PHƯƠNG PHÁP HẤP PHỤ

Đối với một số nguyên liệu, nhất là các loại hoa, có

thể kéo dài thêm thời gian tạo hương sau khi hái rời

khỏi cây, trước đây người ta dùng mở động vật để hấp

thụ. Nhưng phương pháp này mất nhiều thời gian, thao tác

thủ công, không áp dụng ở qui mô công nghiệp được, giá

thành đắt.

Hiện nay người ta dùng than hoạt tính làm chất hấp

phụ, bằng cách cho luồng khí ẩm đi qua lớp hoa tươi,

nhằm kéo dài thời gian sống của hoa. Luồng khí ẩm khi đó

cho qua lớp hoa tươi lôi cuốn theo chất thơm đi vào

thiết bị hấp phụ Chất hấp phụ than hoạt sẽ giữ các

chất thơm => sau đó trích ly => thu tinh dầu.

Lớp hoa sau khi hấp phụ, đen trích ly hoặc chưng cất

để thu phần tinh dầu không bay hơi còn lại.

4.3.5 PHƯƠNG PHÁP LÊN MEN:

Phương pháp này dùng cho các loại tinh dầu ở dạng quả

và các dạng mà tinh dầu không ở trạng thái tự do mà các

dạng kết hợp khác (ở dạng glycozit là chủ yếu). Trước

khi đưa sử dụng phương pháp tách tinh dầu thông thường,

73

người ta phải dùng men, enzym xử lý sơ bộ trước để tạo

tinh dầu ở dạng tự do

4.4 TÍNH CHẤT CỦA TINH DẦU4.4.1 TÍNH CHẤT VẬT LÝ:

Ở nhiệt độ thường , tinh dầu chủ yếu ở thể lỏng, trừ

một số trường hợp đặc biêt

Tinh dầu có tính dễ bay hơi, có thể cất kéo bằng hơi

nước rất ít tan trong nước, tan trong cồn, các dung môi

hữu cơ,các dầu mỡ.

Tùy theo thành phần, tinh dầu tan trong cồn với nồng

độ khác nhau, có thể tan một phần trong dung dịch kiềm

(phenol), dung dịch NaHSO3 (andehyt)….

Tinh dầu không có màu hay có màu hơi vàng, có loại

tinh dầu có màu xanh (tinh dầu dương kỳ thảo) hay màu

đỏ(tinh dầu thymus), màu nâu thẩm (tinh dầu quế)

Tình dầu có vị hơi cay và hắc.

Tỷ trọng : nằm trong khoảng 0,850- 0,950. Một số nặng

hơn nước (tinh dầu quế, đỉnh hương ). Tỉ trọng của tinh

dầu phụ thuộc vào thành phần của tinh dầu

Nếu tỷ lệ các hidrocacbon tecpenoit cao thì tỷ trọng

thấp (<0.9). Nếu tỷ trọng cao hơn 0,9 thì thường chứa

nhiều hợp chất chứa oxi ( este, ancol, andehit, xeton).

74

Nếu tỉ trọng lớn hơn 1 thường chứa nhiều thành phần

chứa nhân thơm (eugenol, andehit xinamic…)

Nó thường có năng suất quay cực : có thể quay phải

(+) như tinh dầu long não hay trái quay trái (-) như

tinh dầu bạc hà

Chỉ số khúc xạ 1,450-1,560: chỉ số khúc xạ của tinh

dầu phụ thuộc vào thành phần hóa học của tinh dầu. Nếu

tinh dầu có chứa nhiều nhân thơm hoặc vòng có nhiều nhóm

chứa oxi thì tỷ trọng và chỉ số khúc xạ đều cao.

Điểm sôi : tinh dầu có đặc điểm sôi cao 150-180oC nếu

thành phần là các tecpen 250-280oC nếu là sesquitecpen;

và trên 300 oC nếu thành phần là là politecpen . Một số

tinh dầu có thể phát quang dưới đèn tử ngoại ( eugenol,

andehyt ximamic)

4.4.2. TÍNH CHẤT HÓA HỌC

Dưới tác dụng của nhiệt độ, ánh sáng, không khí,

nước…. tinh dầu dễ bị oxi hóa và một phần biến thành

nhựa.

Khi bị oxi hóa, thành phần của tinh dầu bị thay đổi:

ancol chuyển thành andehit, axit , andehit chuyển thành

axit…

Các hợp chất có dãy nối đôi dể bị oxit như sau :

75

Nhiều thành phần có nhóm chức khác nhau (ancol, andehit,

phenol…) các nhóm này giúp cho việc kiểm nghiệm, chiết

xuất tinh dầu

4.5 PHÂN TÍCH TINH DẦU4.5.1 PHÂN TÍCH SƠ BỘ

Dựa vào tỉ trọng và chỉ số khúc xạ của tinh dầu người

ta có thể sơ bộ phán đoán được thành phần chủ yếu của

tinh dầu.

+ Nếu tỉ trọng dưới 0,9 và chỉ số khúc xạ dưới 1,47

thì tinh dầu có tỉ lệ cao hidrocacbon tecpen hoặc mạch thẳng

+ Nếu tỉ trọng cao hơn 0,9 và chỉ số khúc xạ dưới

1,47 thì tinh dầu có nhiều hợp chất mạch thẳng có nhiều nhóm

chức chứa oxi

+ Nếu tỉ trọng nhỏ hơn 0,9 và chỉ số khúc xạ lớn hơn

1,47 thì tinh dầu có nhiều hợp chất thơm

+ Nếu tinh dầu có nhiều hợp chất thơm hoặc vòng

có nhiều nhóm chức có oxi thì tỉ trọng và chỉ số khúc xạ

đều cao

Độ hòa tan của tinh dầu trong hỗn hợp cồn-nước tùy

thuộc vào tỉ lệ của các chất có chứa oxi

76

Nếu tinh dầu tan nhiều trong dung dịch KOH chứng tỏ

chúng có nhiều hợp chất chứa OH phenol

Hỗn hợp tinh dầu với cacbon disunfua với lượng bằng

nhau, nếu đục là tinh dầu có lẫn nước.

4.5.2 PHẢN ỨNG MÀU

- Phát hiện ancol trong tinh dầu: Cho 1 giọt tinh

dầu, 0,3ml CS2, 100mg KOH đã nghiền nhỏ. Lắc trong 5

phút. Nếu có xuất hiện màu vàng hay tủa vàng là có

ancol. Nếu không có phản ứng, thêm 1-2 giọt amoni

molipdat 1%, sau đó axit hóa từ từ bằng axit sunfuric,

làm lạnh hỗn hợp và thêm 3-4 giọt CHCl3. Lắc mạnh hỗn hợp

và giữ yên, nếu lớp CHCl3 có màu tím là phản ứng dương

tính

- Phát hiện andhit – xeton : Hòa tan 1 giọt tinh dầu

vào 2-3 giọt etanol tuyệt đối + 1 giọt thuốc thử 2,4-

dinitro phenyl hydrazin ( hòa nóng 5 gam 2,4-dinitro

phenyl hydrazin trong 60ml axit photphoric 85% được pha

bằng 39,5 ml etanol).

Nếu có kết tủa đỏ là có nhóm cacbonyl thơm

Nếu có màu vàng cam là có nối đôi ở vị trí α,β,

Nếu có màu vàng là có cacbonyl bảo hòa. Thêm 1 giọt

KOH 2N trong etanol màu sẽ chuyển sang màu đỏ thẩm, màu

mận chín hoặc màu xanh

77

Ngoài ra có thể phát hiện andehyt bằng thuốc thử

Schiff (axit fucsinsunfuro), Tollens.

-Phát hiện phenol : dùng FeCl3

- Phát hiện hợp chất chưa bảo hòa: cộng Br2/CCl4, nếu

có hợp chất không bão hòa thì màu của brom biến mất sau

1 phút

Các phenol và một số hợp chất thơm có nhóm metylen

cũng có phản ứng dương tính. Để phân biệt nên làm thêm

phản ứng Baeyer:

Hai giọt tinh dầu hòa trong 1-2 ml axeton . Cho từng

giọt dung dịch KMnO4 1%. Lắc . Nếu có tủa màu café do

KMnO4 bị khử chứng tỏ có hydrocacbon chưa no và các

chất khử khác như andehyt. Các hợp chất hydrocacbon thơm

và một số phenol còn cho phản ứng với hỗn hợp H2SO4-

focmandehyt. Dẫn xuất benzene cho màu màu hồng hoặc vàng

cam ngay sau khi cho thuốc thử, còn dẫn xuất phaphtalen

cho màu lục hoặc ve.

Ngoài ra có thể dùng sắc ký bản mỏng, sắc ký giấy để

nhận biết các chất trong tinh dầu

4.6 TÁCH CÁC THÀNH PHẦN TRONG TINH DẦU . - Đối với chất rắn ở nhiệt độ thường: để lạnh, lọc ly

tâm (mentol của bạc hà)

78

- Tách axit tự do ra khỏi tinh dầu: nếu không có

phenol hay nhóm cacbonyl thì lắc với kiềm loãng, rửa

tinh dầu bằng nước, làm khô bằng Na2SO4

- Phương pháp tách cổ điển là chưng cất phân đoạn ở

áp suất thường hay thấp.

Với dụng cụ có nhiều đĩa, các chất có nhiệt độ sôi

thấp ra trước, sau đó monotecpen chứa oxy tiếp đến là

hợp chất thơm và cuối cùng là sesquitecpen. Phần còn lại

trong bình là các sản phẩm polime, đitecpen và hợp chất

azulen

Nếu tinh dầu thu được bằng cách chiết với dung môi

hoặc ép thì trong cặn có chứa sáp

- Sắc ký cột: có thể dùng cột silicagel để tách các

các hidrocacbon ra khỏi hợp chất có chứa oxi, rữa bằng

ete dầu hỏa, sau đó dùng etyl axetat để tách hợp chất có

oxi ra khỏi cột.

Để tách từng chất trong phần có chứa oxi, có thể

dùng cột oxit nhôm trung tính, rửa cột bằng các dung môi

phân cực tăng dần lần lượt vớ n-pentan; pentan-benzen

(9:1); benzene; benzene-ete (9:1); ete; ete-clorofom

(9:1); clorofom; và clorofom-etanol (9:1);

Các phân đọan thu được có thể tiếp tục tách hoặc tinh

chế bằng sắc ký .

4.7 HỢP CHẤT LACTON TECPENOIT79

- Các hợp chất lacton của tecpenoit có nhiều ứng dụng

quan trọng trong y học và nông nghiệp. Đặc điểm là

sesquitecpen lacton, chúng có tác dụng được tế bào,

kháng ung thư, kháng vi trùng, diệt côn trùng, diệt nấm

mốc…

- Đa số các lacton tecpenoit đều có vị đắng , một số

chất có mùi vị khó chịu làm cho động vật ăn cỏ và sâu bọ

không thích. Đặc tính đó có thể là một trong các chức

năng của lacton là bảo vệ thực vật.

Vòng laton không no trong cấu trúc có quan hệ đến vị

đắng và các tác dụng độc và kháng trùng. Các liên kết

không no trong vòng lacton dễ dàng tác dụng với nhóm OH,

SH, NH2 của các axit amin và protein trong vi khuẩn, biến

thành chất độc và làm rối loạn các quá trình sống của vi

khuẩn.

- Theo Kupchan, tác dụng kháng ung thư của các hợp

chất tecpenoit đều liên quan đến sự liên hợp của nối đôi

với nhóm C=O của vòng lacton.

4.7.1 SESQUITECPEN LACTON

4.7.1 .1.ĐẠI CƯƠNG

80

Sesqui tecpen lacton có bộ khung cơ bản 15C ( C15) :Về

lý thuyết chúng gồm ba đơn vị isopren, một phần của bộ

khung là một metyl butenoit

Sesquitecpen lawcton phân bố chủ yếu ở dạng cây thảo

và cây bụi. Đặc biệt tập trung nhiều trong họ cúc

(Asteraceae). Trong cây cây chúng tập trung chủ yếu

trong lá, hoa và nói chung là các bộ phận trên mặt đất.

Về phân loại : Sesquitecpen lacton được sắp sếp theo

cầu trúc của bộ khung cơ bản của sesquitecpen. Chúng có

khoảng 20 dạng cấu trúc của sesquitecpen lacton khác

nhau: các dạng thường gặp nhất là : eudesmanolit (I),

guianolit (II), pseudoguianolit (III), germacranolit

(IV), eremophilanolit (V) . hay Santonin (VI) thuộc loại

eudesmanolit

Đặc biệt artemisinin (VII) là một loại sesquitecpen

81

lacton có mặt trong cây thanh cao hoa vàng (Artemisia annua

L. ) mọc ở nhiều nơi ở miền Bắc Việt Nam và nhiều nước

trên thế giới có tác dụng chống vi trùng sốt rét .

4.7.1 .2 CHIẾT XUẤT

Nói chung sesquitecpen lacton là chất phân cực trung

bình, nó rất ít tan trong dung môi không phân cực như

ete dầu và trong nước, tan nhiều trong CHCl3, ete etylic,

ít tan trong metanol và etanol ở nguội, nhưng tan nhiều

khi nóng.

Có thể chiết sesquitepen lacton theo các cách sau

đây sau :

a. Chiết bằng CHCl3Bột nguyên liệu có thể loại chất béo bằng ete dầu,

sau đó chiết CHCl3 từ 6-12 giờ. Cất thu hồi CHCl3. Cắn

hòa tan vào C2H5OH nóng. Sau đó cho thêm 1 lượng tương

đương Pb(CH3COO)2 5% và vài giọt HCl ( để dung dịch có

môi trường axit yếu).

82

Để yên 1 ngày, lọc bỏ kết tủa. Thu hồi cồn (còn lại

nước), chiết nước này bằng CHCl3. Lấy lớp CHCl3 , rửa

bằng nước, làm khan dịch CHCl3 bằng Na2SO4. Cất thu hồi

dung môi thu được cắn sesquitecpen. Tinh chế bằng sắc ký

cột oxit nhôm

b. Chiết cồn (metanol hoặc etanol)

Bột nguyên liệu được chiết bằng cồn nóng. Thu hồi cồn

còn lại ¼ thể tích. Thêm lượng tương đương nước. Dùng

ete dầu để chiết loại chất béo. Sau đó chiết

sesquitecpen lacton bằng CHCl3. Dịch chiết CHCl3 rữa

nhiều lần bằng nước, làm khan bằng Na2SO4 . Thu hồi CHCl3

. Tinh chế như trên thu được sản phẩm

c. Chiết bằng cồn - nước.

Chiết nguyên liệu bằng cồn ( ngâm kiệt ) . Bã còn lại

cho vào nước đun sôi 1-2 giờ. Dịch chiết cồn thu hồi

cồn. Cắn còn lại hòa vào dịch chiết nước

Dịch nước được chiết bằng CHCl3 hoặc butanol, thu

hồi dung môi thu được cắn. Đun cặn này với benzen, lọc

nóng, sau đó để lạnh, sesquitecpen sẽ kết tủa. Lọc lấy

tủa. Tinh chế bằng cột oxit nhôm

d. Chiết bằng dung dịch kiềm nóng

Vòng lăcton trong môi trường kiềm đun nóng sẽ mở ra

tạo thành muối tan được trong nước. Dung dịch này nếu

83

trong dung dịch axit sẽ đóng vòng trở lại và và kết tủa

trong nước.

4.7.1.3. PHẢN ỨNG ĐỊNH TÍNH

Phản ứng định tính của sesquitecpen lacton dựa vào sự

có mặt của nhóm lacton. Ngoài ra có thể áp dụng các phản

ứng của tecpenoit.

- Phản ứng với hidroxymat feric: cho vài giọt thuốc

thử trong etanol hay ete, thêm 1 giọt dung dịch

hydroxylamin clohidrat 1N, 1 giọt KOH 2N trong metanol.

Đun cách thủy 1-2 phút. Để nguội, axit hóa dung dịch với

1-2 giọt HCl, thêm 1 giọt FeCl3 1%. Nếu có màu mận chín

là phản ứng dương tính. Nếu không có màu thì pha loãng

ít nước rồi quan sát lại ( Phản ứng chung của hợp chất

lacton)

- Các hợp chất có vòng lacton α,β không no cho phản

ứng với các thuốc thử:

+ Legan (natri nitroprusinat = natri nitroxianua):

màu hồng

+ Baljet (axit picric): Màu vàng da cam

84

+ Kedde ( axit 3,5-dinitrobenzoic trong metanol): màu

hồng

- Các hợp chất lacton không no (α,β và β,) đều khử

dung dịch Tollen, trong đó các hợp chất lacton β, cho

phản ứng mạnh hơn do đó có thể khử dung dịch AgNO3 trong

môi trường trung tính. Người ta có thể dùng phản ứng với

thuốc thử Tollen để phân biệt lacton no và không no

- Ngoài ra sesquitecpen lacton cho phản ứng dương

tính với thuốc thử Libermann Burchat (1 ml anhidrit

axetic + 1mlCHCl3 + 1 giọt H2SO4)dung dịch SbCl3, Vanilin

photphoric.

4.7.2. IRIDOIT

4.7.2.1. ĐẠI CƯƠNG

Iridoit là nhóm hợp chất thiên nhiên có cấu trúc

monotecpen với một vòng xiclopentan và một vòng δ-lacton

( hoặc dẫn xuất) thường là không no

Trong thực vật đã tìm thấy iridoit trong hàng chục

loài thuộc hàng chục họ thực vật. Một số iridoit trong

cây có tác dụng xua đuổi sâu bọ

85

Trong cây, iridoit tồn tại chủ yếu ở dạng glycozit

trong đó nhóm xeton trong vòng lacton biến thành liên

kết axetal gắn qua OH của đường ( chủ yếu là glucozơ),

nhưng trong động vật chân đốt thì chỉ tồn tại ở dạng

iridoit aglycon.

4.7.2.2.CHIẾT XUẤT

Có thể chiết glycozit iridoit bằng cồn họặc bằng nước

nóng. Dịch chiết cho bay hơi dung môi, cặn thu được hòa

tan vào ít nước, để lắng, lọc bỏ cắn. Dịch lọc loại tạp

bằng cách lắc vài lần bằng benzen hoặc etyl axetat

( hoặc có thể loại tạp bằng chì axetat như đối với

sesquitecpen lacton)

4.7.2.3 PHẢN ỨNG ĐỊNH TÍNH VÀ PHÂN TÍCH HỢP CHẤT

IRIDOIT

a. Phản ứng định tính

Phản ứng đặc trưng là phản ứng Trim-Hill

Thuốc thử Trim Hill được điều chế: 10 ml CH3COOH+

10ml dung dịch CuSO4 0,2% và 0,5 ml HCl đặc. Cho 1ml dung

dịch thử và 1-2 giọt thuốc thử Trim Hill, đun nhẹ, nếu

có iridoit thì sẽ xuất hiện màu xanh

Ngoài ra iridoit có các phản ứng màu với một số

thuốc thử tecpenoit (Liebermann Burchat; SbCl3 trong

CHCl3) và với dung dịch anisandedit trong H2SO4

b. Phân tích86

Có thể phân tích bằng sắc kí giấy, lớp mỏng

- Sắc kí lớp mỏng với chất hấp phụ là silicagel G với

các hệ dung môi là

+ CHCl3 : CH3OH : H2O (6 :4 :1)

+ Xiclohexan : etyl axetat (3: 7)

+ n-butanol : axit axetic : nước ( 4: 1: 5)

- Sắc ký giấy với hệ dung môi là n-butanol

: axit axetic : nước hoặc isopropanol bảo hòa trong

nước. Chất hiện màu anisandehit trong axit sunfuric hoặc

SbCl3 trong CHCl3 hoặc có thể dùng thuốc thử Trim Hill

87

Chương 5 STEROIT

Steroit là những hợp chất dẫn xuất của

xiclopentenophenantren. Chúng gồm nhiều hợp chất thiên

nhiên trong đó có sterol, axit mật, hocmon giới tính,

vitamin D

Nhiều steroit có nhiều tính chất quan trọng được dùng

trong điều trị bệnh (điều hòa hệ thống nội tiết, chữa

viêm khớp…). Hiện nay steroit còn dùng điều chế thuốc

tránh thai. Nhiều ứng dụng của steroit trong chăn nuôi

và nông nghiệp ngày càng được công nhận.

88

5.1 CẤU TRÚC VÀ CÁCH GỌI TÊN5.1.1 CẤU TRÚC

Steroit là những chất do

hidro một phần hay hoàn toàn

1,2- xiclopentenophenantren.

Để thuận lợi, các vòng của hệ

thống người ta đánh số theo

thứ tự chữ số latinh A, B, C,

D. Trong các chất này R’ và

R’’ là những nhóm metyl hay

dẫn xuất oxi hóa của chúng,

cũng có khi các nhóm đó không

tồn tại. Còn nhóm R là những

gốc ankyl khác nhau. Còn nhóm

R là những gốc ankyl khác

nhau5.1.2.CÁCH GỌI TÊN

89

Tên của steroit được dựa

vào một số cấu trúc cơ bản

thường là tên của các

hidrocacbon tương ứng (hidrua

nền).sau đó thêm tiếp đầu ngữ

và tiếp vị ngữ chỉ rõ bản chất

của nhóm thế. Vị trí của nhóm

thế được chỉ định bỡi chỉ số

của nguyên tử cacbon mà nó

liên kết. Việc đánh khung sườn

cacbon của steroit như sau

5.1.2.1 Cấu hình α và β

Sự định hướng trong không gian của các nhóm thế được

kỳ hiệu bằng chữ α và β. Trong đó các nhóm thế C18 và C19

được ký hiệu bằng β. Tất cả các nhóm thế β là những nhóm

thế nằm trên mặt phẳng chung của hệ thống (được biểu

diễn bằng vạch đậm), ngược lại các nhóm thế α là các

nhóm thế nằm dưới mặt phẳng chung của hệ thống vòng

(được biểu diễn bằng nét đứt đoạn). Còn các nhóm thế

chưa xác định được cấu hình α hay β thì dùng ký hiệu là

ξ (xi) và biểu diễn bằng vạch ngoằn ngòeo

Dưới đây là một số hidrua nền quan trọng

90

5.1.2.2 Đồng phân lập thể:

Luôn chỉ định đồng phân

lập thể ở C5 bởi tiếp đầu ngữ

5α và 5β, trừ phi nó là liên kết

đôi. Nếu một nguyên tử cacbon

chung cho 2 vòng khác với C5 và

có cấu hình bất thường sẽ được

chỉ định bởi tiếp đầu ngữ thích

hợp. Ví dụ

3β, 5α-pregnan

91

Các ancol của steroit có tên chung là sterol.

5.2 STEROL Sterol là dẫn xuất monohydroxysteroit có 27, 28hoặc 29 nguyên tử cacbon. Chúng là những chất kết tinh và

là các thành phần có trong dầu mỡ động thực vật. Sterol

có mặt ở dạng tự do hoặc dạng este của các axit béo cao.

5.2.1 CẤU TẠO

Ngoài cholesterol, các sterol thường gặp là

phytosterol (ví dụ : stigmaterol, β-sitosterol,) và

ergosterol

Stigmaterol(C29H48O) có thể thu được từ phần không xà

phòng hóa của dầu đậu nành, còn sitosterol (C29H50O) là

một trong sáu srerol có trong mầm lúa mì

92

Ergosterol lầ đầu tiên thu được từ lúa mạch, nhưng có

thể thu được khá dễ từ nấm men. Khi chiếu tia tử ngoại

vào Ergosterol sẽ biến thành tiền vi tamin D2, và khi đun

nóng chất này thành vitamin D2

5.2.2 .PHẢN ỨNG MÀU CỦA STEROL

Không có phản ứng màu riêng cho sterol, chỉ có phản

ứng màu chung cho steroit. Những phản ứng thường sử dụng

là

5.2.2.1. PHẢN ỨNG LIEBERMANN BURCHARD

(anhidrit axetic 1ml + cloroform 1ml (để lạnh)+ 1

giọt axit sunfuric đặc)

Cho 1 giọt dung dịch thuốc thử vào dung dịch thuốc

thử. Nếu có sterol xuất hiện màu xanh nhạt, lục,93

hồng,cam, đỏ…Màu này bền dần trong một thời gian. Đây là

phương pháp để thử cholesterol trong máu.

5.2.2.2 PHẢN ỨNG ROSENHEIM

Dung dịch thử trong CHCl3 + dung dịch axit

tricloaxetic 90%. Nếu có sterol với nhân dien sẽ cho màu

tím. Màu này chuyển sang xanh lơ sau 20 phút

5.2.2.3 PHẢN ỨNG SALKOWSKI ( H2SO4/CHCl3)

Cho thuốc thử vào dung dịch thử, nếu có màu đỏ thì có

cholesterol và các sterol khác

5.2.2.4 PHẢN ỨNG TORTELLI - JAFFE

Hòa tan 0,5 mg chất thử bằng 0,2 ml axit axetic và

0,2 ml CHCl3. Cho dọc thành ống 1,2 giọt dung dịch nước

brom trong CHCl3. Nếu có sterol có liên kết đôi sẽ có màu

vàng lục giữa hai lớp

5.2.3 PHÂN BỐ

Sterol phân bố rộng, nó thường có mặt cùng với

ankaloit hoặc saponin steroit. Chúng có mặt trong tất cả

các bộ phận của cây, nhưng chủ yếu là các hạt có dầu ở

dạng tự do hoặc este, một số ở dạng glycozit.

5.2.4 CHIẾT XUẤT

Do sterol là hợp chất hầu như không phân cực, rất

ít tan trong nước , tan nhiều trong dung môi kém phân

cực hoặc không phân cực, nên dùng các dung môi này (ete

94

dầu, ete, benzen, CHCl3…) để chiết xuất. Muốn chiết xuất

dạng glycozit có thể dùng cồn.

Sản phẩm chiết thông thường là hỗn hợp các este của

sterol với lipit, caroten…nên phải xà phòng hóa sau đó

mới chiết sterol bằng các dung môi hữu cơ. Tinh chế bằng

kết tinh phân đoạn

5.2.5 PHÂN TÍCH STEROL

5.2.5 1. SẮC KÝ LỚP MỎNG

Thông thường dùng sắc ký lớp mỏng với chất hấp phụ là

silicagol G háy oxit nhôm. Các hệ dung môi thường dùng

là

+ Benzen : etyl axetat ( 4:1)

+ Benzen : cloroform (9 :1)

Hiện màu bằng dung dịch SbCl3 trong CHCl3, H2SO4 20%

trong cồn hoặc H2SO4 –nước (1:1) và hơ nóng

Một số sterol có thể phát hiện vết bằng cách soi

trên đèn tử ngoại

5.2.5 2. SẮC KÝ KHÍ

Thường được sử dụng rộng rãi để phân tích

sterol nói riêng và steroit nói chung

5.2.5.3 XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC

Thường dùng các phổ UV, IR,NMR. MS để xác định cấu

trúc

5.3 CÁC STEROIT KHÁC ( xem tài liệu)95

Chương 6 SAPONIN6.1 KHÁI NIỆM

96

Saponin là thuật ngữ để chỉ một nhóm glucozit có đặc

điểm chung là khi hoà tan trong nước sẽ có tác dụng giảm

sức căng bề mặt của dung dịch và tạo nhiều bọt.

Dưới tác dụng của enzym thực vật , vi khuẩn hay axit

loãng saponin bị thuỷ phân tạo thành genin (gọi là

sapogenin) và phần đường. Phần đường có thể gồm một hay

một số phân tử monosaccarit:

-Về phần đường: phổ biến nhất là D-Glucoga,D-

Galactoga, L-Arabioga, L-Rammoga…

-Về phần sapogenin có thể có cấu trúc cholan như

saponin steroit hoặc tritecpen dạng β-amyrin (axit

oleanelic), dạng α-amyrin…

* Dựa vào cấu trúc của sapogenin người ta chia thành

2 nhóm lớn là Sapogenin tritecpen và sapogenin steroit.

*Về phân bố: Saponin phân bố rất rộng, đà tìm thấy ở

trên 80 họ thực vật. Saponin steroit tập trung chủ yếu ở

cây một lá mầm trong khi saponin tritecpen có nhiều ở

cây hai lá mầm.

6.2 SAPONIN TRITECPENCấu trúc của Saponin tritecpen rất đa dạng, dựa vào

cấu trúc của genin người ta chia thành 4 nhóm chính:

-Dẫn xuất β-amyrin

- Dẫn xuất α- amyrin

- Dẫn xuất lupeol và tritecpen 4 vòng.97

Nhóm sapogenin tritecpen 4 vòng chiếm số lượng không

nhiều trong tự nhiên, nhưng đều là những sapogenin quan

trọng. Đáng chú ý là dạng đamaran có chứa nhiều trong họ

nhân sâm.

Ngoài ra trong họ nhân sâm còn có loại saponin

tritecpen 5 vòng

Dưới đây là một số khung cơ bản

6.3 SAPONIN STEROIT

98

6.3.1 CẤU TRÚC

6.3.1.1. ĐẶC ĐIỂM CẤU TRÚC

Trừ hợp chất Criptogenin (có cấu trúc 4 vòng) tất cả

các saponin steroit đều có đặc điểm chung về cấu trúc là

hệ thống vòng spiroxetal (vòng E và F) nối nhau qua C22.

Các hợp chất này chỉ khác nhau 3 điểm:

-Ở C5 vòng A/B:Hidro có thể có cấu hình α và β hoặc

dây nối đôi giữa C5- C6

-Tuỳ theo cấu trúc của R1 và R2 (thường là H hoặc CH3)

mà chúng có thể là đồng phân iso(cấu hình C25 là R) hoặc

đồng phân neo (C25 có cấu hình S).

-Về số nhóm thế: tất cả các saponin streroit đều có

nhóm OH ở C3;một số ít còn có OH ở C2 hay C6 (hoặc cả

hai).Vài sapogenin còn có thêm C=O ở C12.

6.3.1.2 CẤU TRÚC CỦA MỘT SỐ SAPOGENIN STEROIT

99

Trong hàng trăm hợp chất saponin streroit đã được

biết cho đến nay chỉ khoảng 10 chất có ý nghĩa kinh tế

lớn vì:100

-Có nguồn nguyên liệu dồi dào hoặc trồng dễ cho năng

suất cao.

-Hệ thống sproxetal trong cấu trúc dễ dàng bị phá vở

để cho hợp chất trung gian là đehydropregnenolon axetat

(D.P.A) là khung cơ bản để tổng hợp các thuốc steroit.

Trong đó diosgenin được sử dụng nhiều nhất.

6.3.2 SƠ ĐỒ THOÁI BIẾN DIOSGENIN THÀNH DEHDRO

PREGNENOLON AXETAT (D.P.A)

6.4 PHÂN BỐ- ỨNG DỤNG CỦA SAPONIN 6.4.1 PHÂN BỐ

Saponin tritecpen phân bố chủ yêu ở cây hai lá mầm,

đáng chú ý nhất là tập trung ở họ nhân sâm.

Saponin steroit tập trung chủ yếu ở cây một lá mầm

trong nhiều họ khác nhau.

101

6.4.2 ỨNG DỤNG

- Tác dụng bồi bổ, tăng cường sinh lực (nhân sâm)

- Tác dụng long đờm, dịu ho (cam thảo, cam thảo đất…)

- Giảm đau khớp xương (ngưu tất, cỏ xước)

- Hạ cholesterol trong máu (ngưu tất, cỏ xước)

Riêng nhóm saponin steroit là nguồn nguyên liệu

quan trọng bán tổng hợp các thuốc cocticoit và thuốc hạn

chế sinh đẻ

6.5 CHIẾT XUẤT SAPONINDo saponin phân cực mạnh → tan tốt trong nước hoặc

trong ancol thấp, ít tan trong dung môi hữu cơ ít phân

cực hay không phân cực (ete, axeton ,benzen…)

Nếu nguyên liệu có nhiều chất béo, sơ bộ loại chúng

bằng ete dầu hay benzen, các sapogenin do không còn phần

đường gắn vào nên nói chung là phân cực yếu , nên ít tan

trong nước, tan nhiều trong dung môi hữu cơ (ete dầu, n-

hexan, ete, benzen , axeton ,cồn)

Tuỳ thuộc vào yêu cầu nghiên cứu và sản xuất, cần

chiết chúng ở dạng saponin hay sapogenin mà chọn cách

chiết và dung môi thích hợp.

6.5.1 CHIẾT SAPONIN

Có thể dùng nước hay ancol thấp để chiết:

6.5.1.1 CHIẾT BẰNG NƯỚC

102

Nguyên liệu tươi , xay bột ngâm với nước một thời

gian (6-12 giờ). Ép, dùng nước để rửa bả. Dịch ép thu

được lắc với benzen vài lần để loại chất béo. Dịch nước

loại béo xong, chiết saponin bằng n-butanol bão hòa

nước. Dịch chiết butanol đem cất thu hồi dung môi. Cắn

thu được hòa tan trong một lượng nhỏ etanol. Cho vào

dung dịch này một lượng gấp 3-4 lần thể tích dung dịch

saponin một hỗn hợp gồm ete-axeton (1:4). Saponin sẽ kết

tủa. Để lắng, lọc, thu lấy kết tủa. Dịch lọc cho thêm

một lượng ete-axeton khác để tủa hết saponin.

Saponin thô thu được đem tinh chế và kết tinh trong

cồn + axeton

Nếu nguyên liệu khô thì làm bột thô, chiết nước nóng

và chiết lấy saponin như trên.

Nguyên liệu (xay nhỏ)

Dịch nước

dịch chiết nước dịch butanol

cắn

dịch etanol Saponin Saponin khô

Saponin.

103

1) H2O (6-12h)

Benzen (loại

Butanol2)

Chưng Etanol

Ete : axeton(1:4)

lắng,lọc

Tinh chế (trongcồn+etanol)

6.5.1.2 CHIẾT BẰNG CỒN

Bột nguyên liệu khô chiết nóng hay ngâm kiệt với

etanol hay metanol 80%. Dịch chiết cất thu hồi cồn còn

nước;lắc hỗn hợp này với bengen để loại chất béo. Sau đó

chiết saponin bằng butanol bảo hoà nước. Cất thu hồi

butanol. Cắn thu được hoà tan vào một ít etanol và kết

tủa dung dịch bằng hỗn hợp ete: axeton (1:4). Sau đó

tinh chế cho ta saponin theo cách ở trên.

Trong nghiên cứu, có thể kết tủa saponin từ dung dịch

nước bằng cholesterol hoặc stearin. Phức hợp tủa được

lọc riêng ( thường áp dụng để định lượng saponin)

Các saponin axit có thể kết tủa dưới dạng muối amoni

hoặc natri. Có thể áp dụng tách saponin bằng cột trao

đổi ion: Dịch chiết saponincho chảy qua cột anion, sau

đó đẩy saponin ra khỏi cột bằng dung dịch anion (Ví dụ :

dung dịch HCl, axit axetic), cuối cùng rữa lất saponin

bằng cồn.

6.5.2 CHIẾT SAPOGENIN

Để chiết sapogenin đầu tiên phải có giai đoạn thuỷ

phân saponin thành đường và sapogenin.

Nguyên liệu xay nhỏ, ngâm trong nước nóng 35-400C

(nếu cần có thể cho thêm enzym thuỷ phân) trong vài104

ngày. Thời gian thủy phân tùy thuộc vào từng loại

saponin, thường là 48-72 giờ.

Nếu thuỷ phân trong axit (HCl, H2SO4) cho pH=1-2

(thường từ 5-10%) đun sôi 3- 6giờ tùy thuộc từng loại

saponin., Để nguội, lọc cả bã dược liệu đem sấy khô. Sau

đó bã được chiết bằng dung môi hữu cơ nóng (hồi lưu,

trong thiết bị soxhlet). Dung môi có thể dùng là n-hexan

, ete dầu, benzen hoặc cồn. Trong công nghiệp có thể

dùng xăng công nghiệp đã tinh chế lại để chiết xuất.

Có thể kết hợp cả hai cách trong việc thủy phân

saponin; thuỷ phân bằng enzym trước, sau đó thủy phân

bằng axit.

Trong nghiên cứu, trước khi tiến hành thủy phân một

lượng lớn bao giờ chúng ta cũng cần phải làm thí nghiệm

thăm dò. Bắt đầu với nồng độ axit thấp với thời gian

thủy phân ngắn và nâng dần đến khi đạt được các thông số

tối ưu cho một phản ứng thủy phân.

6.6 PHÂN TÍCH SAPONIN6.6.1 TÁC DỤNG PHÁ HUYẾT:

Khi cho saponin vào máu sẽ làm huỷ vách hồng cầu, làm

cho hemoglobin khuyếch tán ra. Lợi dụng tính chất này để

định tính saponin

6.6.2 PHẢN ỨNG TẠO BỌT.

105

Đối với dịch chiết saponin trong nước hoặc cồn có khả

năng tạo bọt, nhưng độ bền vững của bọt tùy thuộc vào

bản chất của saponin.Trong 2 ống nghiệm , ống thứ nhất

cho khoảng 5ml dung dịch NaOH 0,1N (pH=13), ống thứ 2

cho 5ml dung dịch HCl 0,1N (pH=1). Cho vào mỗi ống 5ml

dung dịch saponin. Lắc mạnh 2 ống. Nếu có bọt nhiều và

bền vững ở ống đựng NaOH ( ống 1) là saponin steroit,

còn nếu bọt nhiều và bền vững trong môi trường axit là

saponin tritecpen

6.6.3 PHẢN ỨNG TẠO MÀU.

- Phản ứng Libermann-Burchard: Hỗn hợp 1ml anhidrrit

axetic + 1ml CHCl3 đã làm lạnh ở 00C, sau đó thêm 1 giọt

H2SO4. Chất thử được hòa tan bằng cloroformvaf cho vào

hỗn hợp trên. Nếu xuất hiện màu xanh da trời, lục, hồng,

cam, đỏ và bền vững trong một thời gian là có phản ứng

trung tính

- Phản ứng Resenhein: Cho 1-2 giọt axit tricloaxetic

90% vào 1ml dung dịch thưtrong CHCl3 . Các saponin

tritecpen cho màu tím, chuyển sang màu xanh lơ sau 20

phút.

-Phản ứng Salkowski: 1-2 mg chất thử hòa trong 1ml

CHCl3. thêm 1ml H2SO4, có màu vàng đến hồng là có saponin

106

-Phản ứng Carr-Price: 1ml dung dịch thử + 1-2 giọt

dung dịch SbCl3 20% trong CHCl3. Nếu có saponin steroit

sẽ cho màu hồng hoặc đỏ ( phản ứng chung của steroi)

- Phản ứng Rosenthaler: 1 mml dung dịch thử + 1-2

giọt dung dịch vanilin 1% trong etanol, thêm 1 giọt HCl

đặc. Nếu có saponin tritecpen hoăc steroit thì sẽ có màu

lục đến tím.

- Phản ứng Molish: Các saponin do có phần đường nên

có phản ứng với thuốc thử Molish

1-2 mg saponin +1-2 giọt dung dịch -naphtol trong

etanol. Nhỏ dọc thành ống nghiệm 1 giọt H2SO4 đặc. Nếu

xuất hiện một vòng màu tím là phản ứng dương tính.

- Phản ứng Tortelii-Jafe: ( phát hiện liên kết đôi

steroit): cho 0,5mg chất thử cho hòa tan trong

0,2mlCHCl3. Cho nhẹ nhàng không hòa lẫn 0,1 ml dung dịch

brom 0,2% trong CHCl3. Nếu có steroit có liên kết đôi sẽ

có một vòng lục giữ 2 lớp.

6.6.4 PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ GIẤy, LỚP MỎNG VÀ QUANG PHỔ

( xem tài liệu)

Chương 7

107

GLYCOZIT TIM VÀ GLYCOZIT XIANOGEN7.1 GLYCOZIT TIM

7.1.1 ĐẠI CƯƠNG

Glycozit tim là nhóm glycozit có cấu trúc steroit, có

tác dụng đặc hiệu đối với tim. Nhưng ở liều cao chúng

trở nên gây độc, dẫn đến chết người.

Trong cây glycozit tim tồn tại ở dạng glycozit hòa

tan trong dung dịch tế bào. Dưới tác dụng của men hoặc

axit loãng, các glycozit bị thủy phân tạo thành genin và

các đường. Là glycozit nên chúng dễ tan trong nước và

cồn loãng, rất ít tan trong các dung môi không phân cực

hoặc phân cực yếu như ete, ete dầu hỏa, benzen...Trong

dung dịch nước các glycozit tim làm giảm sức căng bề mặt

của dung dịch và tạo bọt khi lắc mạnh.

Glycozit tim tồn tại trong khoảng 10 họ thực vật, đặc

biệt là họ Apocynaceae và họ Asclepiadaceae

7.1.2 CẤU TRÚC HÓA HỌC

7.1.2.1. PHẦN GENIN

Phần genin của glycozit tim có cấu trúc 5 vòng A, B,

C, D, F. Vòng F là một vòng lacton γ hoặc δ gắn với C17.

Dựa vào vòng lacton người ta chia thành hai nhóm chính:

- Cacdenolit (I), genin có vòng γ lacton α, β không

no ( còn gọi là butenolit)

108

- Butadienolit (II), genin có vòng δ lacton không no

với 2 nối đôi (còn gọi là pentenolit)

Cáu trúc các genin của glycozit tim có thể khác nhau

ở 3 điểm:

+ Cấu hình ở C3, C5 hoặc C17 (α hoặc β)

+ Có thể thêm nhóm chức chứa oxi, chủ yếu là nhóm OH

Tại C1, C2, C5, C11 ,C12 , C15 , C16 , và C19

+ Có thể có các liên kết đôi ở trong khung, thường là

ở vòng B

7.1.2.2. PHẦN ĐƯỜNG

Phần đường của glycozit tim khá phức tạp. Có 3 loại

đường

- Đường thông thường ( ví dụ Glucozo, Rhamnozo,

Xylozo)

109

- Đường 2-deoxy: là đường không có oxi ở vị trí số 2.

Loại này khá phổ biến trong glycozit tim ( ví dụ

Digitosozo, Oleandrozo)

- Đường đặc biệt

Dây nối ozơ chủ yếu gắn qua OH ở C3 của genin, nhưng

cũng có một số glycozit có thêm dây nối qua OH ở C2 hoặc

C1.

Trật tự liên kết của glycozit tim như sau: Genin gắn

trực tiếp với vài phân tử đường 2-deoxy hoặc đường đặc

biệt, tiếp đến là một vài phân tử đường thông thường,

nhất là glucozo gắn vào cuối mạch

Genin – (đường 2-deoxy hay đường đặc biệt)n- (glucozo)n

Trong quá trình chiết xuất nếu không khống chế được

men thủy phân trong nguyên liệu thì ta chỉ thu được

glycozit thứ sinh, chỉ còn lại một phần đường thường là

đường đặc biệt hoặc đường 2-deoxy. Đó là sản phẩm sự

thủy phân không hoàn toàn từ các glycozit nguyên sinh.

Tác dụng chủ yếu của glycozit tim chủ yếu do genin,

nhưng phần đường có ảnh hưởng đến độ tan, sự phân bố đặc

trưng của thuốc trong cơ thể, sự tích lũy và sự thải trừ

thuốc và độc tính. Vì vậy cần phải chọn phương pháp

chiết xuất thích hợp làm sao cho đủ lượng đường cần

thiết để đạt tới tác dụng thuốc mong muốn.

7.1.2.3. CẤU TRÚC CỦA MỘT SỐ AGLYCON CỦA GLYCOZIT TIM110

111

7.1.2.4.CÔNG THỨC MỘT SỐ ĐƯỜNG CỦA GLYCOZIT TIM

7.1.3. CHIẾT XUẤT

112

Phương pháp chiết xuất dựa theo nguyên tắc chung về

chiết glycozit, nhưng tùy theo yêu cầu của sản phẩm mà

có cách xử lý riêng.

Nói chung các sản phẩm có ứng dụng trong điều trị là

các glycozit có chứa từ 1 đến 4 phân tử đường. Điều mấu

chốt trong kỹ thuật là việc khống chế hoặc dùng men

thủy phân với mức độ cần thiết để đạt được sản phẩm

mong muốn.

Nếu muốn thu được glycozit nguyên sinh phải diệt men

thủy phân trong nguyên liệu bằng cách đun sôi nguyên

liệu với cồn 50-90% trong vài phút

Nếu cần lấy glycozit thứ sinh thì dùng men thủy phân

trong nguyên liệu hoặc cho men khác thêm vào

Nếu cần lấy aglycon ( để nghiên cứu) thì thủy phân

bằng axit loãng hoặc thủy phân men và thủy phân axit

Nguyên liệu, đặc biệt là hạt phải tiến hành loại chất

béo bằng ete dầu trước khi chiết

Tính phân cực của các glycozit phụ thuộc chủ yếu của

bản chất và số lượng của các đường trong hợp chất. Nói

chung nếu càng nhiều phân tử đường thì độ phân cực càng

mạnh.

Dung môi thích hợp để chiết glycozit tim là cồn 50-

90%. Để loại tạp ( chủ yếu là các hợp chất phenol và

tanin) có thể dùng chì axetat và cho chảy qua cột hấp113

phụ. Để tách phân đoạn các glycozit có thể dùng các hệ

dung môi có độ phân cực khác nhau.

7.1.3.1 CHIẾT AGLYCON (để nghiên cứu)

Nguyên liệu được loại tạp sơ bộ bằng ete dầu hỏa. Lấy

bã nguyên liệu chiết bằng cồn với nồng độ thích hợp bằng

soxhlet hoặc chiết hồ lưu 2-3 lần. Dung dịch thu được,

để nguội, cho dung dịch chì axetat vào để loại hợp chất

phenol (tủa). Axit hóa dịch bằng axit sunfuric đến pH=

5-6. Làm bay hơi bớt dung môi và sau đó chiết bằng dung

dịch CHCl3-etanol (2:1) cho đến khi hết glycozit. Cho bay

hơi dung môi, hòa tan cặn bằng cồn và thêm một ít axit

sunfuric và thủy phân khoảng nửa giờ ở khoảng 500C. Để

nguội, chiết bằng CHCl3, rửa dịch CHCl3 bằng NaHCO3, rửa

lại bằng nước , làm khan bằng Na2SO4, cất thu hồi dung

môi thu được cắn. Tách bằng sắc ký cột thu được aglycon.

7.1.3.2. CHIẾT GLYCOZIT

Nguyên liệu được chiết bằng dung dịch cồn từ 50-900,

sau đó cất loại dung môi ở áp suất thấp và tách riêng

theo như phương pháp chung nêu ở trên.

7.1.4 PHÂN TÍCH

7.1.4.1. CÁC PHẢN ỨNG MÀU

Các phản ứng màu của glycozit tim chủ yếu dựa vào

vòng lacton không no, cũng có thể dùng các phản ứng đặc

114

trưng của đường ( đường deoxy) như phản ứng Keller-

Kiliani hay Xanthidrol

- Phản ứng Baljet: 1 mg chất thử thêm 3-4 giọt thuốc

thử ( hỗn hợp thể tích tương đương axit picric 1% trong

cồn và dung dịch 10% NaOH trong nước). nếu có màu vàng

cam hoặc hồng xỉn là phản ứng dương tính

- Phản ứng Kedde: thuốc thử là hỗn hợp đẳng tích của

2 dung dịch:

Dung dịch A: axit 3,5-dinitrobenzoic 2% trong cồn

Dung dịch B: KOH 5,7% trong nước.

Cho 12 giọt thuốc thử vào 1mg chất thử, nếu có màu

hồng tím là dương tính. Màu này biến đi sau 1.2 giờ

- Phản ứng Raymond: cho 1-2 giọt dung dịch m-

dinitrobenzen 1% trong cồn và 2 giọt dung dịch NaOH 20%

trong nước vào 1mg chất thử. Nếu có màu tím hoặc xanh

là phản ứng dương tính ( các nhóm metylen hoạt động cũng

cho phản ứng này)

- Phản ứng Tollens: Ống nghiệm chứa 2-3 mg glycozit

và 5 giọt pyridin, thêm 4 giọt thuốc thử Tollens, nếu

dung dịch có tủa bạc là có mặt của đường khử trong

glycozit.

- Phản ứng Keller- Kaliani: (Phản ứng đặc trưng cho

đường 2-deoxy) . Trong ống nghiệm chứa 0,1-0,2 mg chất

thử, thêm 1ml dung dịch thuốc thử mới pha gồm 1ml feric115

sunfat Fe2(SO4)3 5% và 99 ml axit axetic băng. Sau đó cho

thêm 1-2 giọt axit sunfuric. Nếu có màu xanh xuất hiện

trong 1-2 phút là phản ứng dương tính

- Phản ứng Xanthidrol:Lấy 1-2 mg chất thử , thêm 3-5

giọt dung dịch xanthidrol 0,125% trong axit axetic băng

có thêm 1% HCl đặc. Nếu có màu đỏ chứng tỏ có đường 2-

deoxy

7.1.4.2. SẮC KÝ GIẤY VÀ SẮC KÝ LỚP MỎNG

a) Sắc ký giấy: Pha di động dùng cho sắc ký giấy là

hệ các dung môi phân cực như: n-butanol bảo hòa hơi nước

hoặc etanol-pyridin- nước (5:1:4)

b)Sắc ký lớp mỏng: Chất hấp phụ là silicagel G hoặc

oxit nhôm trung tính, với các hệ dung môi phân cực,

các hệ dung môi thường dùng là:

- etyl axetat – Xiclohexan (4:1)

- etyl axetat – axeton (9:1)

- metyl etyl xeton- CHCl3- focmamit (5:2:1)

Hiện màu trên giấy hoặc trên sắc ký lớp mỏng bằng các

dung dịch sau:

- m-dinitrobenzen 10% trong cồn, tiếp đến phun dung

dịch NaOH 10% trong metanol- nước, các glycozit xuất

hiện màu tím hoặc xanh

- Dung dịch axit tricloaxetic 25% trong CHCl3, hơ

nóng 1100C, xem màu qua UV116

- Dung dịch anisandehit trong axit axetic-H2SO4 hơ

nóng 1100C

7.1.4.3. QUANG PHỔ: UV, IR, MS, NMR

7.2 GLYCOZIT XIANOGEN7.2.1.CẤU TRÚC

Cấu trúc chung của hợp chất này như sau:

Khi bị thủy phân bởi men chúng giải phóng HCN ( axit

prussic, hidro xyanogen)

7.2.2 PHÂN BỐ

Đã phát hiện sự có mặt của xyanogen glycozit trong

khoảng 750 loài của 250 chi họ thực vật. Các glycozit

xyanogen phổ biến nhất là linamarin và lotaustralin và

hai loại này thường có mặt đồng thời với nhau. Chúng có

trong một số loài sắn.

Ngoài ra còn có một số loại khác.117

7.2.3 PHÂN TÍCH

-Phát hiện HCN: Dùng giấy picrat

Giấy picrat được điều chế bằng cách dùng axit picric

0,05M trong nước được trung hòa bằng NaHCO3 và lọc, cắt

giấy lọc thành từng giải nhỏ, nhúng vào dung dịch

picrat, làm khô, bảo quản kín.

Để thử ta dùng 1 gam nguyên liệu tươi, thái nhỏ, cho

vào ống nghiệm, thêm 1 giọt nước, 2 giọt toluen nghiền

nhanh bằng đủa thủy tinh. Dùng nút bấc đậy kín miệng ống

nghiệm, trong ống có đặt lơ lửng 1 tờ giấy picrat. Giử

ấm ống nghiệm ở 400 trong 2 giờ. Nếu có HCN hiair phóng

thì giấy picrat chuyển từ màu vàng sang màu đỏ. Màu càng

đậm thì HCN giải phóng càng nhiều.

Nếu phản ứng âm tính có thể giử nguyên ống nghiệm 24-

48 giờ ở nhiệt độ phòng sau đó làm lại như trên.

Ngoài ra còng có thể dùng phương pháp sắc ký giấy

hoặc lớp mỏng để phân tích xyanogen glycozit.

Chương VIII

ANKALOIT VÀ CAROTENOIT8.1 ANKALOIT

118

8.1.1 KHÁI NIỆM

Ankaloit là những hợp chất có chứa dị vòng nitơ, có

tính bazơ, thường gặp trong nhiều loại thực vật, đôi khi

còn tìm thấy trong một vài động vật. Ngoài hợp chất dị

vòng, người ta còn thấy một số ít ankaloit có nguyên tử

nitơ nằm ở ngoài vòng (như colchixin, hordenin…)

Ankaloit có tính chất hoạt động sinh lý cao đối với

cơ thể người và động vật, nhất là đối với hệ thần kinh.

Với một lượng nhỏ có thể là loại thuốc đặc hiệu, nhưng

lượng tương đối lớn nó là chất độc gây chết người.

8.1.2 PHÂN LOẠI

Về cấu tạo, ankaloit có đến 250 dạng cấu trúc khác

nhau với gần 6000 chất tự nhiên (>5500).Vì vậy, người ta

phân loại dựa vào cấu trúc của ankaloit thành gần 20

nhóm, nhưng ngày nay, người ta còn đề nghị chia thành

các nhóm nhỏ hơn.

- Ankaloit thường có cấu tạo khác nhau, nhưng chung

quy lại nó có chứa một số dị vòng nitơ như:

Ví dụ Nicotin có dị vòng pyrolidin.

Quinin có dị vòng quinolin

119

- Các ankaloit có trong cùng một cây hoặc cùng một

họ thực vật thường có cấu trúc gần giống nhau

- Các ankaloit trong cây thường kết hợp với axit

( như axit oxalic, tactric, lactic…) để tạo muối

- Thành phần các ankaloit trong cây phụ thuộc nhiều

vào khí hậu, mùa trong năm

8.1.3 PHÂN BỐ

- Có rất nhiều họ, loài thực vật chứa ankaloit trong

đó đại đa số là cây 2 lá mầm. Để giới hạn với ý nghĩa

thực tiễn, một cây được coi là có ankaloit phải chứa ít

nhất 0,05% ankaloit so với nguyên liệu khô. Điều đáng

lưu ý: Cây có chứa ankaloit đều vắng mặt tinh dầu và

ngược lại.Có ý kiến cho rằng chức năng của 2 nhóm này

đối với cỏ cây là như nhau.

- Sự phân bố trong tổ chức cây:

Trong cây ankaloit tập trung chủ yếu vào nhưng cơ

quan tổ chức hoạt động nhất :nội bì và ngoại bì,các túi

nhựa.Nơi sản sinh ra ankaloit không hẳn là nơi tập trung

nhiều ankaloit (ví dụ thuốc lá: sản sinh ở rể nhưng

tập trung ở lá…)120

- Điều đáng lưu ý là sự thay đổi có chu kỳ của một

số loài có chứa ankaloit, chu kỳ có thể là vài tuần…Hàm

lượng của ankaloit trong cây biến đổi rất lớn,vì vậy cần

phải xác định đúng thời điểm thu hái nguyên liệu.

8.1.4 SINH TỔNG HỢP ANKALOIT

Cho đến nay người ta thừa nhận rằng: đại đa số

ankaloit là dẫn xuất của aminoaxit. Người cho rằng: đầu

tiên aminoaxit có nhóm cacbonyl bị khử thành một amin,

sau đó có sự oxy hoá thành andehit bởi men oxizada amin.

Sau đó andehit ngưng tụ với nhóm amin tạo vòng đặc trưng

đối với ankaloit.

8.1.5 TÍNH CHẤT

8.1.5.1.TRẠNG THÁI

Các ankaloit có chứa oxi thường ở trạng thái rắn còn

không chứa oxi thường tồn tạo ở trạng thái lỏng.

8.1.5.2.TÍNH TAN

Hầu hết ankaloit không tan trong nước (trừ một số

ít như nicotin, conin tan được trong nước), nhưng tan

trong dung môi hữu cơ như ete, CHCl3, các ancol thấp

(metanol, etanol, propanol, butanol)

Một số ankaloit có nhóm phân cực nên tan một phần

trong nước hay kiềm loãng (như morphin, cephalin có OH

phenol). Ngược lại với các bazơ (ankaloit), các muối của 121

ankaloit nói chung tan được trong nước và hầu như không

tan trong dung môi hữu cơ (CHCl3, ete…)

Một số hợp chất ankaloit (có hợp chất ngoại lệ) như

Ephindrin, colchixin các bazơ của chúng tan được trong

nước đồng thời cũng khá tan trong dung môi hữu cơ và các

muối của chúng thì ngược lại.

8.1.5.3.TÍNH BAZO

Ankaloit do có mặt nitơ nên có tính bazơ, nhưng lực

bazơ của chúng không giống nhau, tuỳ thuộc bản chất của

các nhóm thế và các nhóm chức trong phân tử.

- Hầu hết có tính bazơ mạnh do đó làm xanh quỳ tím.

- Tạo muối với axit.

- Một số tạo tủa Al(OH)3, Fe(OH)3 trong dung dịch của

muối kim loại này.

Do tính bazơ khác nhau, nên ở môi trường axit yếu, một

số bazơ mạnh có thể chuyển thành muối, nhưng bazơ yếu thì

một số ankaloit tồn tại trong dung dịch dưới dạng bazơ

(không tác dụng với axit yếu).

Dựa vào đặc tính này, người ta áp dụng để tách các nhóm

ankaloit có pKa khác nhau ra khỏi hỗn hợp của chúng.

8.1.5.4.TÁC DỤNG CỦA ÁNH SÁNG

Một số ankaloit không bền ở ánh sang mặt trời, tia tử

ngoại.

8.1.5.5.HOẠT TÍNH SINH LÝ 122

Tác dụng lên hệ thần kinh mạnh, có thể dùng lượng nhỏ

chữa bệnh, nhưng dùng nhiều gây chết, gây nghiện…

8.1.6 CHIẾT XUẤT- TÁCH RIÊNG ANKALOT

Ngoài tính chất của ankaloit đã nêu ở trên, một số

điểm khác nhau về đặc tính có liên quan đến quá trình

chiết xuất cần lưu ý:

-Trong cây, ankaloit tồn tại ở dạng muối với các axit

hữu cơ, nhưng một số kết hợp với tannin (nhất là những cây

có nhiều tannin). Vì vậy đối với nguyên liệu có nhiều

tanin thì cần dùng môi có độ phân cực mạnh hơn hoặc chiết

nóng để tách ankaloit ra khỏi tanin và hoà tan vào dung

môi.

-Một số ankaloit tồn tại ở dạng este như Atropin,

Cocain, Heliotrin có thể bị thuỷ phân trong quá trình

chiết xuất nên hạn chế dùng nhiệt độ cao. Ngược lại một số

ankaloit tồn tại ở dạng glycozit (glycoankaloit) như

solasonin, solamacgin trong các loài Solanum. Để chiết

các ankaloit này cần giai đoạn thuỷ phân.

- Nói chung các ankaloit tương đối bền vững so với

nhiều hợp chất thiên nhiên khác, tuy nhiên một số ankaloit

chứa nhân indol ít bền vững với ánh sang và các tác nhân

oxi hoá- khử do đó nên chú ý các yếu tố có thể làm hỏng

ankaloit vì vậy tốt nhất chiết trong khí quyển nitơ123

- Đại đa số ankaloit là những chất kết tinh không màu,

có nhiệt độ nóng chảy xác định. Chỉ có một số ít hợp chất

ankaloit có màu vàng (Becberin, Palmatin…) có thể dùng

tính chất này để theo dõi chúng trong quá trình chiết

xuất.

8.1.6.1.NGUYÊN TẮC CHUNG CHIẾT XUẤT

Nói chung ankaloit có thể chiết từ nguyên liệu khô tán

bột. Để hạn chế bớt khó khăn trong quá trình chiết tách ,

đối với nguyên liệu nhiều chất béo , chất màu nên loại tạp

trước khi chiết xuất. Có hai cách loại tạp:

- Ngâm bột nguyên liệu với ete-đầu hỏa trong vài giờ đến

1 ngày

- Chiết liên tục bằng soxhlet hoặc hồi lưu với ete dầu

trong 1-2 giờ.

Bột loại tạp xong, cho khô tự nhiên

Có hai phương pháp chính để chiết ankaloit: là chiết

bằng dung môi hữu cơ và chiết bằng dung dịch nước axit

hoặc cồn

a. Phương pháp chiết bằng dung môi hữu cơ:

Trước hết bột nguyên liệu được tẩm kiềm để chuyển

ankaloit muối trong nguyên liệu thành dạng bazo. Kiềm

thường được dùng là Ca(OH)2, NaOH, NH4OH.

Dung môi dung để chiết có thể là clorofoc, ete,

benzene, etyl clorua, Clorofoc là dung môi thích hợp nhất124

cho hầu hết ankaloit bazơ (trừ ankaloit N bậc 4, N-oxit có

cách xử lý riêng).

Các bước tiến hành:

-a1) Bột nguyên liệu tẩm dung dịch NH3 10% ( hoặc nước

vôi, NaOH) để yên 1-2 giờ

- a2)Cho bột nguyên liệu đã tẩm kiềm vào soxhlet, cho

CHCl3 ngập bột nguyên liệu từ 1-2h.

- a3)Tiến hành chiết nóng (lượng bé 3-6 giờ); lượng lớn

hơn 1000g từ 6-10 giờ ( lần 1); từ 2-4 giờ ( lần 2) để lấy

kiệt ankaloit

-a4) Cất thu hồi dung môi CHCl3, còn lại 1/3 hoặc 1/2.

Sau đó lắc với dung dịch axit hữu cơ hoặc vô cơ (1-2%).

Các axit có thể dung là axit tactric, HCl ,H2SO4.Cần chú ý

pKa của ankaloit định chiết để cho đủ lượng axit cần thiết

để chuyển ankaloit dạng bazơ trong CHCl3 thành dạng muối

tan trong nước (Nếu không đủ lượng axit thì ankaloit sẽ

còn lại trong lớp CHCl3); thu lấy dung dịch axit. Lượng

axit trong mỗi lần chiết không cần nhiều nhưng cần phải

chiết nhiều lần. Với 100ml dung dịch CHCl3, thì lần đầu cần

20-30 ml dung dịch axit và các lần sau( 5-7 lần) mỗi lần

cần khoảng 15ml. Theo dõi quá trình chiết bằng thuốc thử

ankaloit.

-a5)Dịch chiết này thường chứa nhiều tạp chất , nên cần

phải loại tạp.Để loại tạp chất Clorophlyl,chất màu, nhựa125

trong dung dịch axit: lắc dung dịch axit của ankaloit với

dung môi hữu cơ như ete, ete dầu, CHCl3 một vài lần.

-a6) Cho dung dịch axit ankaloit vào bình chiết, rót

vào đó một lượng CHCl3 hoặc ete, sau đó cho từ từ dung dịch

NH4OH 10% đến pH đã chọn trước tùy theo yêu cầu nhất định

Cụ thể:

+ Nếu trong dung dịch axit có chứa nhiều nhóm ankaloit

cần sơ bộ tách phân đoạn thì đầu tiên cho dung dịch pH=2-3

để chiết lấy ankaloit yếu. sau khi chiết ankaloit yếu xong

nâng pH của dung dịch lên 6-7 để chiết lấy ankaloit bazo

trung bình. Sau cùng nâng dung dịch lên 10-12 để chiết lấy

ankaloit bazơ mạnh

Cách chiết trên gọi là chiết phân đoạn ở môi trường pH

khác nhau

+ Nếu chỉ cần chiết lấy ankaloit toàn phần thì kiềm hóa

dung dịch axit đến pH từ 10-12 và chiết clorofoc như trên.

-a7) Dịch chiết CHCl3 tách ra riêng, làm khan bằng

Na2SO4 khan ( thường dùng 1-2 gam cho 60ml CHCl3 hoặc cho 50

ml ete và lắc trong 15 phút). Lọc, cất thu hồi dung môi

thì thu được ankaloit.

Như vậy nguyên tắc chung để chiết bằng dung môi hữu

cơ như sau: chuyển ankaloit ở dạng muối thành dạng

ankaloit bằng cách tác dụng với kiềm, sau đó chiết

ankaloit bằng dung môi hữu cơ CHCl3, ete, benzene.126

b.Phương pháp thứ 2: Chiết bằng dung dịch axit vô cơ

hay hữu cơ.

Dùng axit vô cơ hoặc hữu cơ để chiết ankaloit ở dạng

muối hòa tan. Các axit thường được dùng là: axetic,

tactric, sunfuric, nitric, photphoric, tùy theo loại

ankaloit . Cách chọn axit là dựa vào độ hòa tan của các

muối ankaloit trong nước.

Ví dụ

Stricnin bazo có độ hòa tan trong nước ở 250C là 0,016%

Stricnin sunfat có độ hòa tan trong nước ở 250C là 3,2%

Stricnin nitrat có độ hòa tan trong nước ở 250C là

2,3%. Như vậy muốn chiết stricnin trong mã tiền nên dùng

axit sunfuric, nồng độ axit thường là 0,5-1%

. Dùng dung môi là dung dịch nước của axit là dung môi rẽ

tiền nhất và thích hợp nhất để chiết ankaloit hiện nay.

Nhưng khó khăn là nước khó bay hơi, do đó cần phải thực

hiện cô đặc dung dịch dưới áp suất giảm

Vì vậy nếu điều kiện cho phép thì thay dung dịch nước

axit bằng dung dịch cồn axit (metanol, etanol…).

Cồn axit có ưu điểm là có khả năng hòa tan ankaloit

mạnh hơn nước, đồng thời ít hòa tan tạp chất hơn

( protein, gluxit…), chúng dễ được cô cạn để kết tủa triệt

để ankaloit nên hiệu suất chiết xuất cao hơn

127

Dịch chiết thu được qua các quá trình tiếp theo như

sau:

-b1) Nếu dịch chiết nước: để yên 1-3 ngày (có điều kiện

nên để lạnh) để lắng tạp. Sau đó gạn hoặc lọc. Nếu hàm

lượng ankaloit trong dung dịch quá thấp, cần cô đặc thì

chuyển pH sang 7-8 trước khi cô, vì ở môi trường axit

akaloit dễ bị hỏng bởi nhiệt độ hơn trong môi trường trung

tính hoặc kiềm

Nếu dịch chiết cồn-axit trung hòa axit pH=7 rồi cất thu

hồi cồn. Sau đó hòa tan cặn vào dung dịch axit 1%. Để yên

1-3 ngày như trên.

Cách loại tạp (nhựa clorofyl, protein, cacbon hydrat…)

đơn giản nhưng cần nhiều thời gian. Để dung dịch axit lạnh

1 đêm, sau đó đưa ra nhiệt độ thường 1 ngày, lại để lạnh 1

đêm…lặp lại như vậy sau đó lọc hoặc gạn lấy dịch trong.

-b2) Dịch lọc xong tiến hành như a4, a6, a7 của phương

pháp chiết bằng dung môi hữu cơ.

Trong sản xuất hiện nay do chưa có đủ điều kiện dung

môi hữu cơ để chiết ankaloit bazo thì phương pháp thích

hợp nhất là tủa dung dịch chiết bằng kiềm. Lọc lấy tủa

hòa tan ankaloit kiềm vào dung dịch axit, lại tủa bằng

kiềm. lặp đi lặp lại như vậy thu được ankaloit thô, cuối

cùng tinh chế và kết tinh trong cồn.

128

Một kỹ thuật cần lưu ý là để tủa tốt hơn và dễ dàng nên

tủa ở nhiệt độ 60-700C. Kết tủa xong không lọc ngay mà nên

để yên 1-2 ngày. Ankaloit sẽ tủa trong thời gian này

Lọc lấy tủa , dung dung dịch NH3 hoặc kiềm loãng để rữa

tủa và cuối cùng rữa lại bằng nước.

Hiện nay ở nhiều nước người ta sử dụng nhựa trao đổi

ion để tách ankaloit ra khỏi dung dịch.

8.1.6.2 TÁCH RIÊNG

Kỹ thuật tách riêng ankaloit tùy thuộc vào thành phần

của ankaloit trong hỗn hợp để quyết định

Nếu hỗn hợp ankaloit toàn phần chỉ chứa vài ba

ankaloit, trong đó chỉ có một ankaloit chính thì việc tách

không khó khăn

Phương pháp tách thông dụng nhất trong sản xuất và

nghiên cứu là là tách bằng phân bố giữa hai pha dung môi

có độ phân cực khác nhau và không hòa lẫn vào nhau. Mỗi

phân đoạn tách riêng tiếp tục tinh chế bằng kết tinh phân

đoạn.

Ví dụ: Lợi dụng độ hòa tan khác nhau của bruxin và

stricnin trong cồn loãng 25% để tách riêng chúng ra khỏi

nhau.

Hạt mã tiền tán bột trrọn với sữa vôi, sấy khô làm bột.

Chiết nóng với CHCl3. Dịch chiết lắc với dung dịch H2SO4 1%.

Dịch chiết axit được kiềm hóa bằng dung dịch NH3 thu được129

tủa ankaloit toàn phần. Chiết tủa này với dung dịch cồn

25% sẽ lấy được bruxin, còn lại là stricnin.

Dịch chiết cồn được cô cạn bớt, sau đó tủa bruxin bằng

dung dịch axit oxalic. Lọc lấy tủa. Rữa tủa này bằng cồn.

Bốc hơi cồn sẽ thu được bruxin thô, tinh chế lại và kết

tinh trong axeton thu được bruxin

Cặn không tan trong cồn 25% ở trên được đem hòa tan

trong cồn 950, tinh chế lại thu được stricnin.

Nhưng việc tách riêng sẽ khó khăn đối với trường hợp

có nhiều ankaloit có cấu tạo tương tự nhau và đây cũng là

đặc điểm của nguyên liệu chứa ankaloit. Trong trường hợp

này phải phối hợp nhiều loại phương pháp khác nhau. Chẳng

hạn đầu tiên tách phân đoạn bằng dung môi có độ phân cực

khác nhau. Sau đó mỗi phân đoạn lại tách rêng bằng dung

môi có pH khác nhau. Cuối cùng, đối với các phân đoạn còn

lại là hỗn hợp 3,4 chất thì tách riêng hỗn hợp các

ankaloit bằng phương pháp sắc ký cột hoặc sắc ký tách lớp.

8.1.7 PHÂN TÍCH ANKALOIT

8.1.7.1 THUỐC THỬ ANKALOIT

Có rất nhiều thuốc thử cho phản ứng màu hoặc kết tử

với ankaloit. Sau đây là một số thuốc thử thường dùng

- Thuốc thử Dragendorff: Hòa tan 8,0 gam bitmut

nitrat kiềm trong 20 ml HNO3. Hòa tan 27,2 gam KI trong

130

50ml H2O. Hỗn hợp hai dung dịch trên cho thêm nước cho vừa

đủ 100 ml. Phản ứng cho tủa màu vàng cam.

Ngoài ankaloit, thuốc thử Dragendorff còn cho phản

ứng với một số hợp chất hữu cơ bazơ khác như cholin và

một số chất không phải là bazo hữu cơ như pỷol,

Xinamandehyt, ninhydrrin. Ngược lại thuốc thử

Dragendorff không cho phản ứng với bất kỳ một amino axit

nào:

- Thuốc thử Mayer: Hòa tan 1,36 gam HgCl2 trong

60 ml nước. Hòa tan 5 gam KI trong 50 ml nước . Hỗ hợp

hai dung dịch thêm nước vào vừa đủ 100 ml

- Thuốc thử Wagner: Hòa tan 1,27 gam Iot và 1 gam

KI trong 20 ml nước. Thêm nước vừa đủ 100ml. Phản ứng cho

kết tử nâu

- Axit silicotungstic 5% , axit photphomolipdic

8.1.7.2 QUANG PHỔ HẤP THỤ CỦA ANKALOIT

-UV

-IR

-NMR

8.2 CAROTENOIT8.2.1 ĐẠI CƯƠNG

Carotenoit là những chất màu vàng,da cam, đỏ...có nhiều

trong nhiều loại động thực vật.

131

Người ta còn gọi nó là chất màu lipỏcomic ( màu trong

chất lipit) vì chúng tan trong dầu béo

Trong cơ thể động vật, carotenoit được hòa tan trong mỡ

hoặc hóa hợp với protein ở pha nước

Chúng là những chất màu chính trong một số hoa màu

vàng, da cam, đỏ của nhiều loại vi sinh vật.

8.2.2. PHÂN LOẠI VÀ TÍNH CHẤT

Các carotenoit gồm hai loại chímh

-Nhóm hydrocacbon: tan trong ete dầu

-Nhóm xanthophyl là các dẫn xuất oxi trong caroten.

Chúng bao gồm andehyt, xeton, axit…chúng tan trong etanol

8.2.2.1 NHÓM CAROTEN HYDROCACBON:

Phổ biến là caroten có nhiều trong cà rốt

8.2.2.2 NHÓM XANTOPHIN :

có thể xếp nhiều loại khác nhau. Ví dụ

132

-Nhóm carotenoit có nhóm OH (hoặc este hoá nhóm OH)

-Nhóm carotenoit metoxyl hoá (có nhóm CH3O-). Ví dụ

như Rhodovibrin

-Nhóm carotenoit oxi hoá (oxicarotenoit)

-Nhóm epoxi carotenoit: có nhóm epoxi

-Nhóm cacboxi carotenoit:có nhóm –COOH. Ví dụ bixin:

chất màu đỏ có trong hạt điều Bixa orellana

Hầu hết các carotenoit trong tự nhiên đều là

tetratecpenoit gồm 8 đơn vị isoprene (C40)

Hầu hết các nối đôi đều có cấu hình trans, liên kết

giữa vòng cuối và mạch trung tâm là liên kết đơn. Tuy

nhiên khi dehydro hoá có thể chuyển nối đơn thành nối

đôi trong trường hợp đó người ta gọi là “retro”

Để xác định cấu trúc của carotenoit người ta có thể

dung các phương pháp:

133

- Hydro hoá

-Cộng halogen: để xác định nối đôi

-Oxi hoá với axit cromic để biến CH3 mạch nhánh thành

hợp chất cacboxyl

-Cắt đứt liên kết đôi bằng KMnO4 hay ozon phân.

Phương pháp sắc ký (cột, giấy, lớp mỏng) là phương

pháp chủ yếu để phân lập và xác định cấu trúc của

carotenoit

8.2.3 TỔNG HỢP CAROTENOIT

Thông thường người ta tổng hợp bằng cách ghép: một

hợp chất gồm 2 nhóm chức có khả năng phản ứng với 2 hợp

chất khác nằm ở hai tận cùng có 2 kiểu

1) Kiểu cộng hợp C19+C2+ C19

Ví dụ: Điều chế β-caroten

2) Hoá hợp các đợn vị C16+C8+C16

Ví dụ:

3) Hoá hợp C14+C12+C14

134

Chương 9

GLUXIT-AMINOAXIT-PRROTEIN9.1 GLUXIT

135

Gluxit (cacbohydrat ) là nhóm các hợp chất hữu cơ phổ

biến trong tự nhiên, đặc biệt trong thực vật ( chiếm

trên 80% khối lượng khô)

Gluxit được chia thành các nhóm chính dựa vào số đơn

vị oza tạo nên

- Monosaccarit (monozơ): là gluxit không có khả năng

thủy phân thành các gluxit đơn giản hơn. Công thức tổng

quát là CnH2nOn. Thí dụ glucozơ, fructozơ, manozơ,

galactozơ...

-Oligosaccarit (oligozơ) là những gluxit khi thủy

phân cho ta từ 2-10 monosaccarit. Thuộc dãy này có

đisaccarit, trisaccarit, ...Những disaccarit phổ biến là

saccarozơ, mantozơ, lactozơ...đều có công thức là C12H22O11

-Polisaccarit (poliozơ) gồm trên 10 đơn vị

monosaccarit tạo nên. Loại này gồm 2 loại:

homopolisaccatrit và hetoropolisaccarit

Homopolisaccatrit: khi thủy phân cho trên 10

monosaccarit cùng loại. Ví dụ như tinh bột, xen lulô

Hetoropolisaccarit: khi thủy phân cho các

monosaccarit khác loại.Ví dụ như hemixenlulozow, aga-

aga....

9.1.1 MONOSACCARIT ( Gluxit đơn giản, đường đơn)

9.1.1.1 CẤU TRÚC: có 2 dạng cấu trúc là mạch hở và

mạch vòng 136

a) Cấu trúc mạch hở: Cấu tạo mạch hở của

monosaccarit, thí dụ như gluco đã được thực nghiệm xác

nhận:

- Khi cho glucozo tác dụng với thuốc thử Tollens, cho

phản ứng tráng gương , điều đó chứng tỏ trong phân tử

gluco có nhóm andehyt

-Cho glucozo tác dụng với anhydrit axetic, cho ta sản

phẩm là pentaaxetyl glucozo điều đó chứng tỏ có 5 nhóm

OH

- Khi cho glucozo tác dụng với HI (dư) cho sản phẩm

là n- hexan chứng tỏ glucozo có mach không phân nhánh.

-Khi cho glucozo tác dụng với HCN, sau đó thủy phân

và khử bằng HI dư thu được axit CH3-(CH2)5-COOH. Chứng tỏ

glucozo có cacbon mạch thẳng và nhóm CH=O đầu mạch…Do đó

glucozo có công thức cấu tạo là:

CH2OH-CHOH-CHOH-CHOH-CHOH-CH=O

+ Đối với Fructozo người ta làm những ví dụ tương tự

cũng thấy có nhóm C=O và 5 nhóm OH, để xác định vị trí

nhóm OH người ta cho tác dụng với HCN, sau đó thủy phân

và cuối cùng khử bằng HI dư cho axit 2-metyl caproic:

CH3(-CH2)3-CH(CH3)-COOH vậy công thức cấu tạo của fructozo

là

CH2OH-CHOH-CHOH-CHOH-CO-CH2OH

137

Như vậy xét về cấu tạo nó thuộc loại

polihydroxicacbonyl. Tùy thuộc vào bản chất của nhóm

cacbonyl mà chúng được chia thành 2 loại:

andozơ ( nhóm andehyt –CH=O) và xetozơ ( nhóm xeto –

CO-)

b) Cấu hình của monosaccarit. Đồng phân quang học

b1) Andozơ

Các andozơ tự nhiên là các hợp chất polihydroxi bất

đối mà cấu hình đơn giản nhất là D- glyxerandehyt và L-

Glyxerandehyt được Fischer đề nghị

-Dãy D và L:Nếu nhóm OH của monosaccarit có cấu

hình của nguyên tử C xa nhóm C=O nhất nămf bên phải

trong cong thức Fischer ở phía phải thuộc dẫy D, còn ở

phía trái thuộc dãy L

- Đồng phân epimer: hai monosaccarit có cấu hình chỉ

khác nhau ở 1 nguyên tử C thì đó là đồng phân epimer. Ví

dụ D- glucozo và D- mannozo là hai đồng phân epime

- Đồng phân quang học thường. Trong các đồng phân

quang học của D- Glucozo chỉ có đồng phân L-gluccozơ là

đồng phân đối quang, các đồng phân còn lại là đồng phân

quang học thường của D- glucozo.

Hai đồng phân đối quang có cấu hình hoàn toàn trái

ngược nhau, có năng suất quay cực bằng nhau nhưng trái

138

nhau về dấu, còn các đồng phân quang học thường có năng

suất quay cực khác nhau.

139

Dưới đây là một số andozơ thuộc dãy D

140

b2) Xetozơ: Có nhóm C=O ở cacbon số 2. Ví dụ hợp

chất dãy D

c-Cấu trúc dạng vòng của monosaccarit. Đồng phân

anomer

sự có măt đồng thời nhóm C=O và OH trong phân tử , do

đó có khả năng tác dụng của nhóm HO với C=O tạo hợp chất

141

dạng vòng khi đó có nhóm OH hemi-axetal. Ví dụ đối với

D- Glucozơ

- Đồng phân anomer: Hai monosaccarit có cấu trúc vòng là

đồng phân anomer của nhau khi cấu hình của chúng chỉ

khác nhau ở nguyên tử C chứa nhóm OH hemiaxetal. Ví dụ

và β- D- glucopiranozo là hai đồng phân anomer, chúng

chỉ khác nhau về cấu hình của cacbon số 1 (có nhóm OH-

hemiaxetal).

Đối với glucozo, cấu trúc chủ yếu là dạng vòng

( chiếm hơn 99,9%), trong đó đồng phân β- D-

gluccopiranozo là chủ yếu vì có cấu dạng bền vững hơn

( vì các nhóm OH ở vị trí biên nhiều hơn ở đồng phân )

9.1.1.1 TÍNH CHẤT

a) TÍNH CHẤT VẬT LÝ142

Các monosaccarit đều ở trạng thái rắn, không màu, dễ

tan trong nước, ít tan trong ancol, hầu như không tan

trong các dung môi hữu cơ thông thường (

benzen, ete...)

Các đồng phân anomer của monosaccarit có nhiệt độ

nóng chảy khác nhau và góc quay cực riêng khác nhau. Thí

dụ

Monosacca

rit

Nhiệt độ nóng

chảy

[]D

β β ⇋βD-

glucozo

146 150 +1120 +18,70 +52,70

D-

mannozo

133 132 +29,30 -170 +140

D-

galactozo

167 167 +150,70 +54,4 +810

Các monosaccarit đều có vị ngọt,độ ngọt cũng khác

nhau: fructozo ngọt hơn glucozo khoảng 2,4 lần và ngọt

hơn galactozo khoảng 5,5 lần.

b)TÍNH CHẤT HÓA HỌC

b1) Phản ứng của nhóm OH

-Phản ứng với Cu(OH)2 tạo hợp chất phức

143

-Phản ứng tạo este: khi tác dụng với clorua axit,

anhydrit axit

- Phản ứng tạo thành glicozit:

+ Tác dụng với CH3OH có HCl khan chỉ thế OH ở

hemiaxetal tạo thành glucozit bền trong kiềm, do

không còn khả năng mở vòng nên không có tính khử,

nhưng dễ thủy phân trong axit hoặc enzim tạo hợp chất

đầu:

- Phản ứng tạo thành ete:

144

Trong điều kiện xt HCl chỉ có –OH hemiaxetal phản ứng

tạo glicozit, để chuyển các nhóm OH khác thành ete cho

glicozit phản ứng với dimetyl sunfat trong kiềm

- Phản ứng tạo thành axetal vòng và xetal vòng

b2) Phản ứng của nhóm cacbonyl

) Phản ứng oxi hóa

- Phản ứng oxi hóa giử nguyên mạch cacbon:

+ Phản ứng với thuốc thử Tollen ( tráng bạc): vì phản ứng xãy

ra trong OH- nên cả xetozo cũng phản ứng vì trong

kiềm xãy ra quá trình đồng phân hóa ando ⇋ xeto qua

giai doạn trung gian là enol

145

+Phản ứng với dung dịch brôm: tạo axit andonic, trong môi

trường axit , các andonic dễ dàng chuyển thành vòng

lacton

+Phản ứng với axit HNO3:

Tạo axit saccaric (axit polihidroxidicacboxylic), sau

đó chuyển thành dilacton

- Phản ứng oxi hóa cắt mạch cacbon:

+Tác dụng với HIO4

Các metyl glicozit cũng bị oxi hóa bởi HIO4 nhưng chỉ

xãy ra ở liên kết –CHOH-CHOH-

146

)- Phản ứng khử: bằng H2/Ni, t0, hoặc NaBH4 tạo

poliancol

)- Phản ứng tạo phenylosazon : tác dụng với phenyl

hydrazine trong môi trường axit axetic , đầu tiên tạo

phenyl hydrazon sau đó tiếp tục phản ứng cho sản phẩm

cuối cùng là osazon

147

- Phản ứng nối dài và rút ngắn mạch cacbon ( xem

tài liệu)

Chất tiêu biểu: Glucozo, mannozo, galactozo ( xem tài

liệu)

9.1.2 OLIGOSACCARIT (OLIGOZO)

Oligosaccarit thường gặp nhất là đisaccarit và

trisaccarit. Những đisaccarit quan trọng là saccarozo,

mantozo và lactozo.Các oligosaccatrit thường gặp dưới

dạng kết hợp trong glycozit ( nhất là flavonoit) là

rutinozo (6--ramnosylglucozo), Neohesperidozo (2--

ramnosylglucozo)... Đại diện cho trisaccarit là rafinozo

9.1.2.1 CẤU TRÚC PHÂN TỬ

Cấu trúc và tên gọi hệ thống của saccarozo và manto:

Một số đisaccarit khác

148

9.1.2.2 TÍNH CHẤT VẬT LÝ

Các oligosaccarit đều ở trạng thái rắn, có nhiệt độ

nóng chảy và năng suất quay cực khác nhau.

Oligosaccarit Nhiệt độ nóng

chảy ( 0C)

[]D ( trong

nước) hoặc β ⇋ β

Saccarozo 184-185( bị phân

hủy)

+ 66,5o

-

mantozo(monohydra

t)

102-103 + 1120

β - mantozo 108( bị phân

hủy)

+ 1730

-

lactozo(monohydra

t)

200 + 860

149

+1370

+ 550

β - lactozo 252 + 350

Saccaro có góc quay cực riêng là + 66,50 (quay phải).

Khi thủy phân hoàn toàn ( nhờ axit hoăc enzim) thu được

hỗn hợp đẳng phân tử D- Glucozo và D-fructozo có năng

suất quay cực là -200(quay trái). Hỗn hợp sản phẩm thủy

phân của saccarozo được gọi là đường nghịch đảo vì làm

đổi góc quay từ phải sang trái.

9.1.2.3 TÍNH CHẤT HÓA HỌC

a) Phản ứng thủy phân: có xúc tác axit hoặc enzim tạo

thành monosaccarit. Ví dụ:

+Saccarozobị thủy phân cho D- glucozo và D- Fructozo

+ Mantozo cho D- glucozo

+ Lactozo thủy phân (nhờ men β –Galactoziada) cho D-

galactozo và D- glucozo

b) Phản ứng của nhóm OH:

150

Tương tự như monosaccarit chúng có khả năng tạo phức

với Cu(OH)2, cũng có khả năng tạo ete, este...tương tự

tính chất của OH trong monosaccarit

c) Phản ứng của nhóm cacbonyl:

Các oligosaccarit còn nhóm hemiaxetal như mantozo,

lactozo...đều có khả năng mở vòng tạo ra nhóm andehyt,

vì vậy chúng có thể có các phản ứng sau:

+ Phản ứng oxi hóa: như phản ứng tráng gương, với

Cu(OH)2 tạo Cu2O, với dung dịch nước brom...

+

Phản ứng tạo thành osazon

151

9.1.2.4 PHÂN TÍCH OLIGOSACCARIT

Sắc ký giấy có thể dùng để phân tích oligosaccarit

nhưng tốc độ di chuyển chậm hơn

Các hệ dung môi có thể dùng là

BAW: Butanol: axit axetic: nước ( 4: 5 : 1) lớp trên

BEW: n- butanol: etanol: nước ( 4 : 1: 2,2)

BBPW: n-butanol: benzen:piridin: nước (5 : 1 : 3 : 3)

Hiện màu các vết bằng dung dịch anilin phtalat

9.1.3 POLISACCARIT (poliozo)

Phân tử do trên 10 đơn vị monosaccarit kết hợp với

nhau nhờ các liên kết glycozit, tạo nên mạch nhánh

hoặc không phân nhánh

Các homopolisaccarit tiêu biểu là tinh bột,

xenlulozo, glicogen

152

Các heteropolisaccarit tiêu biểu là hemixenlulozo,

aga-aga...

9.1.3.1 TINH BỘT

Tinh bột là polisacarit dự trử ở thực vật, chúng được

tích lũy chủ yếu ở củ khoai, sắn...) hat ( gạo, ngô...).

Gạo chứa nhiều tinh bột nhất (khoảng 80%) mì khoảng

70%, các loại củ quả khác ít hơn.

a)CẤU TRÚC

Tinh bột là hỗn hợp của 2 loại polisaccarit: amilozo

và amilopectin. Cả hai loại này đều do các gốc -D-

Glucopiranozo kết hợp với nhau tạo nên.

Phân tử amilozo có cấu tạo không phân nhánh gồm các

gốc -D-Glucopiranozo kết hợp với nhau nhờ liên kết -

1,4-glycozit

153

Hoặc viết gọn lại là:

Phân tử của amilopectin có cấu trúc phân

nhánh, gồm một số mạch amilozo liên kết với nhâu nhờ

liên kết -1,6-glycozit

Phân tử khối của amilopectin có thể đạt tới 1 triệu

đv.C, còn amilozo chỉ khoảng 200.000 đv.C

Tinh bột chứa khoảng 10-20% amilozo và 80-90%

amilopectin, tồn tại ở dạng hạt, amilopectin được phân

bố bên ngoài, phía trong hạt là amilozo.

b)TÍNH CHẤT VẬT LÝ

Tinh bột tồn tại ở trạng thái rắn, không tan trong

nước lạnh, tan trong nước nóng. Khi đun nóng cấu trúc

của amilopectin có nhiều thay đổi và gây ra hiện tượng

hồ hóa tinh bột.

Tinh bột có góc quay cực riêng []D từ + 180 đến +

2100

c)TÍNH CHẤT HÓA HOC

Tinh bột không tham gia phản ứng tráng bạc và với

thuốc thử Fehling vì phân tử chứa một khối lượng rất lớn154

gốc -glucozo nhưng chỉ rất ít gốc ở cuối mạch có -OH

hemiaxetal. Tinh bột có tính chất hóa học chủ yếu sau:

c1) Phản ứng thủy phân

Có thể thủy phân hoàn toàn tinh bột nhờ xúc tác axit,

tạo sản phẩm cuối cùng là D- glucozo:

Các sản phẩm trung gian (-C6H10O5-)x (x< n), có khối

lượng nhỏ hơn tinh bột gọi là dextrin hay là tinh bột

tan.

Trong cơ thể người và động vật, tinh bột bị thủy phân

nhờ xúc tác enzim khác nhau, ví dụ amilaza trong nước

bọt, mantaza trong ruột:

c2)

Phản ứng với Iot

Ở nhiệt độ phòng, tinh bột tác dụng với dung dịch iot

cho màu xanh tím. Màu của dung dịch chủ yếu là màu của “

155

hợp chất bọc” được tạo thành bởi phân tử amilozơ ở dạng

vòng xoắn với các phân tử iot nằm ở phía trong ống xoắn.

Khi đun nóng màu xanh mất đi do các liên kết hydro

giữa các vòng xoắn bị đứt, mạch amilo tạm thời bị duổi

thẳng nên phân tử iot tách khỏi phân tử amilozo. Để

nguội màu xanh lại xuất hiện

Phản ứng màu của iot, người ta dùng để nhận biết tinh

bột; ngược lại từ dung dịch hồ tinh bột người ta cũng

dùng để nhận biết iot.

9.1.3.2 XENLULOZOXenlulozo là thành phần chính của thành tế bào thực

vật. Xenlulozo có nhiều trong sợi bông ( trên 95%

xenlulozo), trong sợi đay, gai…trong gổ (có khoảng 40-

50%) và trong thân tre nứa…

a)CẤU TRÚC

Phân từ xenlulozo có cấu trúc không phân nhánh, gồm

các gốc β-D-glucopiranozo liên kết với nhau bằng các

liên kết β-1,4- glycozit:

β-D-1,4-glucopiranozo trong phân tử xenlulozo nằm ở

cấu dạng ghế:

156

Giữa nguyên tử O trong vòng của gốc β-D-

glucopiranozo này với nhóm OH của nguyên tử C3 của gốc β-

D-glucozo kề bên tạo liên kết hydro nội phân tử. các

nhóm OH còn lại đều tạo liên kết Hydro giữa các phân tử

với các phân tử xenlulozo bên cạnh

b)TÍNH CHẤT VẬT LÝ

Xenlulozo ở trạng thái rắn, màu trắng , tồn tại ở

dạng sợi với độ dài khác nhau. Xenlulozo không tan trong

nước và trong các dung môi hữu cơ thong thường , tan

được trong phức đồng(II)-amoniac, đồng (II)-

etylendiamin, dung dịch tetrametylamoni hydroxit…

c)TÍNH CHẤT HÓA HỌC

Tương tự tinh bột, xenlulozo không có khả năng tham

gia phản ứng tráng bạc và khử Fehling. Những phản ứng

xãy ra đối với xenlulozo chủ yếu là ở liên kết β-1,4-

glycozit hoặc ở các nhóm –OH

c1) Phản ứng thủy phân: có xúc tác axit hoặc enzim

xenlulaza cho sản phẩm cuối cùng là D- Glucozo

157

c2) Phản ứng của các nhóm hydroxyl

- Phản ứng với axit nitric:

Xenlulozo tác dụng với HNO3 đặc nóng nhờ xúc tác H2SO4

tạo hỗn hợp xenlulozo trinitrat và xenlulozo đinitrat. Tỉ

lệ của các sản phẩm này phụ thuộc vào tỉ lệ HNO3: H2SO4

và thời gian phản ứng

Các xenlulozo nirat tan được trong axeton và một số

este

-Phản ứng với anhydrite axetic: cho ta xenlulozo

triaxetat (còn gọi là triaxetyl xenlulozo) là polime

nhân tạo để điều chế tơ axetat, phim ảnh, màng cách

điện…

158

Xenlulozo diaxetat được điều chế bằng cách thủy phân

không hoàn toàn xenlulozo triaxetat trong dung dịch nước

–axit axetic

Các xenlulozo nitrat đều không brền với tác dụng của

kiềm, axit, dễ tan trong axeton, hoặc hỗn hợp etylaxetat

–etanol

- Phản ứng với dung dịch NaOH và CS2

Xenlulozo tác dụng với dung dịch NaOH đặc cho

‘xenlulozo kiềm”.

Chế

hóa ‘xenlulozo kiềm”với cacbon điunfua thu được

xenlulozo angtogenat

Khác với xenlulozo, xenlulozo xangtogenat tan được

trong dung dịch NaOH loãng tạo thành dung dịch rất nhớt

159

có tên gọi là “visco”. Thủy phân xenlulozo xangtogenat

bằng dung dịch H2SO4 thu được xenlulozo hydrat

Công nghiệp dệt xenlulozo hydrat để sản xuất tơ hóa

học gọi là tơ visco

9.2AMINO AXIT – PEPTIT- PROTIT 9.2.1 AMINO AXIT 9.2.1.1 KHÁI NIỆM

Axit amino cacboxylic còn gọi tắt là axit amin hay

aminoaxit, hay axit amin là những hợp chất hữu cơ trong

phân tử có đồng thời nhóm amono NH2 và nhóm cacboxyl

COOH, chúng là đơn vị cấu tạo nên protein, enzym. Một số

axit amin mà cơ thể động vật không thể tổng hợp được

phải cung cấp từ thực phẩm ( gọi là các aminoaxit không

thể thay thế). Các aminoaxit tham gia cấu tạo protit đều

là α-aminoaxit và có cấu hình L160

a) Phân loại

+ Tùy thuộc vào vị trí tương đối của nhóm amino và

nhóm cacboxyl mà có các loại α-aminoaxit, β-aminoaxit,

γ-aminoaxit...

α β

γR-CH(NH2 )-COOH, R-CH(NH2)-CH2-COOH , R-CH(NH2)-CH2-

CH2-COOH

α-aminoaxit β-aminoaxit

γ-aminoaxit...

+ Tùy theo tỉ lệ nhóm COOH và NH2 ở trong phân tử mà

người ta chia thành: Các aminoaxit có tính axit khi số

nhóm COOH nhiều hơn NH2

Các aminoaxit có tính bazo khi số nhóm COOH ít hơn

NH2

+ Tùy thuộc vào đặc điểm cấu tạo của gốc hidrocacbon

trong phân tử mà có các loại aminoaxit mạch thẳng và

aminoaxit mạch vòng.

b) Cách gọi tên.

Tên thông thường.

Hầu hết các amino axit gọi bằng tên thông thường.

Ngoài ra người ta còn dùng ba chữ đầu tiên của tên

aminoaxit, hoặc một mẫu tự theo qui ước quốc tế. Ví dụ

như glyxin, leuxin…

161

Tên quốc tế IUPAC. tương đối ít dù ng hơn

tên thường

Tên gọi theo dẫn xuất của axit cacboxylic tương

ứng.,nguyên tử cacbon của nhóm COOH được đánh số là số1,

vị trí của nhóm amino được đánh số bằng số tự nhiên

2,3,4…

H2N CH CCH 3

OHO

CH 3 CHOH

CHNH 2

COO H3 2 1

Axit -aminopropanoic Axit 3-

hydroxy-2-aminobutanoic

Ngoài ra người ta có thể gọi theo danh pháp hợp lý:

gọi theo dẫn xuất của axit. Vị trí của các nhóm thế được

đánh số bằng chữ Hylap α,β,γ,δ...

Một số amino axit thường gặp và quan trọng. Trong đó

caca các hợp chất được đánh dấu (*) là các axit amin

không thể thay thế

Công thức cấu tạo Tên

thường Chữ viết tắt

162

Công thức cấu tạo Tên thường

Chữ viết tắt

9.2.1.2 ĐIỀU CHẾ

163

a) Điều chế các α-amino axit

+ Từ axit -monohalocacboxylic. Cho axit -

monohalocacboxylic tác dụng với amoniac. Ví dụ :R CH

BrCOOH NH 3 R CH

NH 2

COOH

+ Tổng hợp Strecker.

Cộng HCN và NH3 vào andehyt cho -

aminonitrin. Thuỷ phân có xt axit cho -amino axit.Ví

dụ :

CH 3 CHO + HCN + NH3 CH 3 CHNH 2

CNH3O CH 3 CH

NH 2

COOH

+ Tổng hợp Gabriel.

Cho phtalimit tác dụng với -haloeste để tạo sản phẩm

trung gian phtalimidoaxetatetyl. Thuỷ phân hợp chất này

cho glyxin và axit phtalic.

b) Điều chế các β-amino axit ( xem tài liệu)

+ Từ axit không no

CH2=CH-COOH + NH3 → NH2 - CH2-CH2-COOH

+ Từ andehyt và axit malonic ( Phương pháp Rodionov)164

Cho andehit tác dụng với axit malonic có mặt của

amoniac trong rượu

CH3CHO + HOOC-CH2-COOH + NH3 →

C

H3CH(NH2)-CH2-COOH + CO2+ H2O

9.2.1.3 TÍNH CHẤT VẬT LÝ

Các aminoaxit là những chất rắn kết tinh không

bay hơi. Khi đun nóng mạnh nó nóng chảy đồng thời bị

phân hủy. Có tính chất đó là do trong phân tử có nhóm

COOH và NH2 nên chúng tồn tại chủ yếu ở dạng ion lưỡng

cực NH3+-R-COO-

Trừ Glyxin không có cacbon bất đối, còn các

aminoaxit khác đều có tính quang hoạt và các aminoaxit

tham gia cấu tạo protit trong tự nhiên đều có cấu hình L

(nhóm NH2 gần nhóm COOH nhất ở phía trái trong công thức

Fischer)

COOHH2N H

CH 3

COOHH NH 2

CH 3

L(+)-Alanin D(-)-Alanin

9.2.1.4 TÍNH CHẤT HÓA HỌC

a) Tính axit- bazơ. Điểm đẳng điện của aminoaxit

Axit amin là một hợp chất lưỡng tính.

165

Có thể tạo muối với axit và bazơ vô cơ, do đó các

axit amin có thể viết dưới 4 dạng, tuỳ theo pH của môi

trường mà tồn tại ở dạng nào đó.

Ví dụ :

NH 3 CH 2 COOHH

NH 3 CH 2 COO

NH 2 CH 2 COOH

OH NH 2 CH 2 COOAcid lieân hôïp Ion löôõng cöïc Baz lieân hôïp

Điểm đẳng điện: là giá trị pH của môi trường mà ở đó

trong phân tử aminoaxit tổng số điện tích dương bằng điện

tích âm , nghĩa là phân tử trung hòa về điện, tức là tổng

điện tích của phân tử bằng o. Như vậy tại điểm đẳng điện

phân tử tồn tại ở dạng ion lưỡng cực ( chủ yếu) hoặc phân

tử trung hòa (rất it). Điểm đẳng điện thường được ký hiệu

là pI

Tại điểm đẳng điện, nếu dung dịch có đặt dòng điện 1

chiều thì các phân tử aminoaxit không di chuyển về phía

điện cực nào.

Điểm đẳng điện của các aminoaxit có số nhóm amino

bằng số nhóm cacboxyl nằm khoảng 6,0-6,3

Điểm đẳng điện của các aminoaxit có số nhóm amino lớn

hơn cacboxyl nằm khoảng 7,6-10,8

Điểm đẳng điện của các aminoaxit có số nhóm amino

nhỏ hơn cacboxyl nằm khoảng 2,8-3,3

166

Có thể tính được điểm đẳng điện của aminoaxit nếu

biết được pKa của aminoaxit

Đối với hợp chất có 1 nhóm NH2 và 1 nhóm COOH thì

pI= (pK1 + pK2)/2

Ví dụ: Glyxin H2N-CH2-COOH ; pK1= 2,35; pK2= 9,78;

pI= (2,35+9,78)/2 =

6,06

b) Phản ứng của nhóm –COOH.

Aminoaxit có các tính chất của nhóm cacboxyl như tạo

các dẫn xuất của axit...

+ Tạo ester.

+ Tạo clorua axit.

NH 2 CHR

COOH NH 2 CHR

COClPCl5

+ Decacboxyl hóa ( tách CO2)

NH 2 CH

R

COOH NH 2 CH 2 RBa(OH)2

c) Phản ứng của nhóm amino.

Nhóm amino của aminoait cho phản ứng như một nhóm

amin thông thường.

+ Phản ứng ankyl hoá.

NH 2CHR

COOH NH CHR

COOHH 3CCH 3I

167

+ .Axyl hóa: Tạo Amit.

Tác dụng với axit nitro. Tạo hidroxy axit và giảiphóng nito

Ví dụ :NH 2 CH

RCOOH HO CH

RCOOH + N2HONO

d) Phản ứng chung của nhóm cacboxyl và nhómamino.Nhiều phản ứng có sự tham gia đồng thời của cả hainhóm chức amino và cacboxyl. Ví dụ

+ Tách nước.

Ví dụ :đối với α- aminoaxit dưới tác dụng của nhiệt ,

hai phân tử tác dụng với nhau, tách nước tạo hợp chất

vòng đixetopiperazin

R CHCOOH

NH 2

H 2NCH R

HOOCR CH

C

NH

ONH

CH RCO

+

+ Tạo phức với một số kim loại nặng.

Nhóm cacboxyl và amino của aminoaxit, có khả năng tạo

phức với các cation kim loại chuyển tiếp như

Ví dụ :

d)Các phản ứng màu của aminoaxit

+ Phản ứng với ninhydrin.168

Aminoaxit cho phản ứng màu với ninhydrin, xanh đến

tím , phản ứng này dùng để phát hiện các aminoaxit

trong phép sắc ký giấy, sắc ký bản mỏng….

+ Phản ứng xantoproteic

+ Phản ứng milon, tạo sunfua chì…xem tài liệu

9.2.1.5 PHÂN TÍCH AMINO AXIT

Để phân tích amino axit có thể dùng sắc ký giấy hoặc

sắc ký lớp mỏng.

-Chiết: Để chiết lấy amino axit tự do từ hạt: nghiền

hạt với ít nước nóng, sau đó cho cồn 750 vào ngâm trong

12 giờ. Ép, lọc hoặc ly tâm. Bốc hơi cồn. Dung dịch cô

đặc dùng để chạy sắc ký giấy hoặc lớp mỏng

-Sắc ký giấy: chạy 2 chiều, chiều chạy 45-50cm

Dung môi: Chiều 1: butanol- axit axetic-nước (BAW)

(4:1:1)

Chiều 2: Phenol- nước ( 3:1)

169

-Sắc ký lớp mỏng: Với những hỗn hợp nhiều axit amin

nên chạy sắc ký 2 chiều với hệ dung môi như đối với sắc

ký giấy

Thuốc thử hiện màu là dung dịch ninhiđrin 0,1% trong

axeton, hơ nóng kính ở 1050C trong 10 phút

Nếu dùng thuốc thử là dung dịch axetat cadimi 1%,

trong nước + 2ml axit axetic + 100ml axeto-hòa tan vào

đó 0,1 gam ninhidrin thì không cần hơ nóng thì vết axit

amin vẫn hiện màu

Bảng : Rf và màu của một số amino axit trên kính silícagel

G với 2 hệ dung môi (B:A:W) và Phenol: nước

Aminoaxit

Rf x 100

Màu với

ninhidrin

BAW Phenol: nước

Glyxin

Alanin

Serin

Cystein

Threonin

Valin

Leuxin

Isoleuxxin

Methionin

Axit

18

22

18

10

20

32

44

43

35

17

24

29

20

4

26

40

48

49

44

6

Tím đỏ

Tím

”

”

”

”

”

”

”

Tìm xanh

170

aspartic

Axit

glutamic

Aspagin

Glutamin

Arginin

Lysin

Prolin

Phenylalanin

Tyrosin

Triptophan

24

14

15

6

3

14

43

41

47

10

-

-

19

9

50

55

47

63

Tìm

Vàng nâu

Tím

”

”

Vàng

Nâu tím

’’

’’

Hệ dung môi :butanol- axit axetic-nước (BAW) (4:1:1)

: Phenol- nước ( 3:1)

9.2.1.5 ĐỊNH LƯỢNG AMINO AXIT

Trước đây người ta thường định lượng bằng cách sau:

Có thể định lượng bằng cách phối hợp sắc ký giấy

hoặc lớp mỏng với đo mật độ quang .Dịch chiết với một

lượng xác định được tách bằng sắc ký giấy hoặc lớp

mỏng . Hiện vết bằng dung dịch ninhidrin. Cắt các vết

riêng ra chiết với cồn 500. Các dịch chiết tạo màu với

ninhidrin và đo độ hấp thụ trên quang phổ kế. Các kết

quả đo được so sánh với đường cong chuẩn đã được lập sẵn

với các amino axit chuẩn171

Có thể dùng phương pháp chuyển thành dẫn xuất

đinitrophenyl bằng cách cho dịch chiết có chứa aminoaxit

với dung dịch 2,4-đinitroflorobenzen trong nước và

axeton. Đem dẫn xuất này tách bằng sắc ký lớp mỏng

( hoặc giấy) sau đó tiến hành định lượng như trên. Nhưng

trong cách này do sản phẩm đinitrophenyl có màu vàng nên

không cần phải chất hiện màu ninhidrin

Phân tích bằng phương pháp sắc ký điện di

Trong dung dịch nước, các aminoaxit có thể tồn tại 3

dạng: anion, cation và ion lưỡng cực

Tùy theo pH của môi trường mà một trong các dạng đó

chiếm ưu thế

Do đặc điểm trên có thể phân tích amino axit bằng sắc

ký điện di

Trong dung dịch đệm môi trường axit, dưới tác dụng

của điện trường các phân tử amino axit ở dạng cation sẽ

chuyển về cực âm và ngược lại nếu phân tích ở môi trường

172

kiềm thì các aminoaxit trở thành anion và chuyển về cực

dương.

Vì mỗi amino axit có điểm đẳng điện khác nhau và

trong quá trình phân tích nếu có sự thay đổi có kiểm

soát pH của dung dịch điện ly thì có thể tách chúng ra

khỏi nhau vì mỗi chất có một đương lượng điện tích khác

nhau di chuyển với mức độ khác nhau.

9.2.2. PEPTIT

Peptit là những polime aminoaxit chứa từ 2 đến khoảng

50 gốc aminoaxit trong phân tử. Peptit có trong cơ thể

động thực vật, một số nấm hoặc do con người điều chế ra

9.2.2.1 CẤU TRÚC VÀ DANH PHÁP

a)Cấu trúc: gồm 2 hoặc nhiều gốc aminoaxit kết hợp

nhờ liên kết peptit

Nhóm peptit –CO-NH- có cấu trúc phẳng, nguyên tử H

của nhóm NH nằm ở vị trí anti đối với nguyên tử O của

nhóm cacbonyl và liên kết N-C mang một phần đặc điểm của

liên kết đôi C=N do sự liên hợp của cặp e tự do của N

về phía nhón cacbonyl

173

Do đó liên kết peptit khó quay tự do xung quanh trục

của nó trong khi đó khả năng quay tự do của liên kết C

- CO- là rất lớn. Đó là nguyên nhân cấu trúc xoắn của

phân tử protein

Các peptit thiên nhiên đều cấu tạo từ các -

aminoaxit, nếu phân tử có 2 ,3,…n gốc aminoaxit được gọi

là đipeptit, tripeptit….polipeptit

Trong phân tử peptit, đầu mạch chứa gốc NH2( hoặc

NH3+) được gọi là “đầu N”, còn đầu kia chứa nhóm COOH

(hoặc COO-) gọi là “đuôi C”.

Khi viết công thức cấu tạo của peptit “đầu N” được

quy ước viết ở phía bên trái trong công thức phân tử còn

“đuôi C” được quy ước viết về bên phải của công thức

b) Cách gọi tên: Gọi tên bằng cách ghép tên gốc axyl

của aminoaxit tạo nên từ phân tử peptit theo trình tự

sắp xếp của chúng từ đầu N sang phía đuôi C, riêng

aminoaxit đuôi C được giử nguyên tên: Ví dụ

174

9.2.2.2 TÍNH CHẤT VẬT LÝ

Các peptit có khối lượng phân tử nhỏ là chất kết tinh

tan tốt trong nước , Cac peptit có phân tử khối lớn là

chất rắn không định hình, tạo được dung dịch keo với

nước.

9.2.2.3 TÍNH CHẤT HÓA HỌC

a) Tính axit- bazo: có tính lưỡng tính tương tự như

amino axit

b) Phản ứng thủy phân:

- Thủy phân hoàn toàn: trong axit nóng hoặc kiềm nóng

cho sản phẩm cuối cùng là aminoaxit hoặc muối của nó.

Thường thủy phân trong khoảng 24-72 giờ ở nhiệt độ 1100C,

xúc tác HCl 2N

-Thủy phân không hoàn toàn: tạo các peptit nhỏ hơn

nhờ các enzim đặc hiệu

c-Phản ứng với 2,4-đinitrofluorobenzen: tương tự như

aminoaxit , đầu N sẽ phản ứng tạo thành dẫn xuất 2,4-

dinitrophenyl màu vàng.

d-Phản ứng màu biure:các peptit có từ 2 nhóm peptit

trở lên phản ứng với dung dịch CuSO4 loãng trong kiềm cho

phản ứng tạo thành dung dịch hợp chất phức có màu tím

hoặc màu tím đỏ

9.2.2.4 TỔNG HỢP PEPTIT

175

Để tổng hợp peptit theo một trật tự xác định bằng

phản ứng trùng ngưng các amino axit, chúng ta cần phải

“bảo vệ” nhóm amino hay cacboxyl nào đó khi chúng ta

không cần chúng tham gia phản ứng tạo liên kết peptit.

Các bước tổng hợp cơ bản như sau:

a) Bảo vệ nhóm amino: Thường dùng nhóm

benzyloxicacbonyl C6H5-CH2-O-CO- ( còn gọi là nhóm

cacbobenzoxi- viết tắt Cbz) bằng cách cho aminoaxit tác

dụng với benzylclorofomiat C6H5-CH2-O-CO-Cl trong môi

trường kiềm.

Thí dụ:

b)Bảo vệ nhóm amino: chuyển thành dẫn xuất benzyl hay

metyl hoặc etyleste

176

c) Ngưng tụ các dẫn xuất của aminoaxit: quá trình này

nhờ có chất xúc tác là DDC (dixiclohexyl cacbođiimit-

C6H11-N=C=N-C6H11). Thí dụ

d) Hydro phân dẫn xuất của peptit:

9.2.2.5 XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC PEPTIT

a) Xác định thành phần các amino axit trong phân tử

peptit

Để xác định các aminoaxit trong cấu trúc của peptit,

người ta thủy phân hoàn toàn peptit thành aminoaxit

(thường thủy phân bằng HCL 6N ở 1100C trong 24-72 giờ),

sau đó nhận biết các aminoaxit bằng phương pháp sắc ký.

Ngày nay bằng phép phân tích tự động có thể xá định

chúng trong khoảng 2 giờ.

177

b) Xác định trật tự sắp xếp các amino axit trong phân

tử peptit

Về nguyên tác phải qua các bước cơ bản sau:

- Xác định aminoaxit đầu N: có 2 phương pháp chính:

+ Phương pháp Sanger: cho peptit tác dụng với 2,4-

đinitrroflurobenzen, tạo thành dẫn xuất 2,4-

dinitrophenyl của peptit. Thủy phân dẫn xuất này trong

dung dịch axit thu được dẫn xuất 2,4-đinitrophenyl của

aminoaxit đầu N và các aminoaxit. Nhận biết dẫn xuất

2,4-đinitrophenyl của aminoaxit đầu N bằng phương pháp

sắc ký.

+ Phương pháp Edman: ( xem tài liệu)

- Xác định aminoaxit đuối C.

Thủy phân peptit nhờ enzim cacboxipeptiđaza,

aminoaxit xuất hiện đầu tiên trong dung dịch ( nhận biết

bằng phương pháp sắc ký chính là aminoaxit đuôi C

- Thủy phân từng phần mạch peptit (nhờ enzim thì nó

chỉ cắt các liên kết peptit ở những vị trí xác định).

9.2.3. PROTEIN

Protein là những polime thiên nhiên được cấu tạo bởi

các chuổi polipeptit. Protein có trong mọi cơ thể sống

(động, thực vật), enzim

9.2.3.1 PHÂN LOẠI VÀ CẤU TRÚC

a) Phân loại178

a1) Dựa vào thành phần hóa học: chia thành 2 nhóm:

- Protein đơn giản: khi thủy phân hoàn toàn chỉ cho

hỗn hợp các aminoaxit

-Protein phức tạp: khi thủy phân hoàn toàn, ngoài sản

phẩm là các aminoaxit còn có các hợp chất khác không

chứa aminoaxit gọi là nhóm prrothetic ( nhóm ghép). Dựa

vào thành phần của phi protein mà người ta chia thành

những nhóm nhỏ hơn.

a2) Dựa vào hình dạng phân tử: chia thành 2 nhóm:

-Protein hình cầu: phân tử có dạng hình cầu , tan

trong nước( anbumin, globulin...

- protein hình sợi: Phân tử có dạng hình sợi, không

tan trong nước . Ví dun như keratin của tóc, fibroin của

tơ tằm...

b) Cấu trúc

-Cấu trúc cấp 1 (bậc 1): là trật tự sắp xếp của các gốc

aminoaxit trong phân tử. Cấu trúc này tồn tại được là

nhờ liên kết peptit

-Cấu trúc bậc 2: là cấu dạng của protein: Phân tử có thể

tồn tại một trong hai dạng chủ yếu là dạng xoắn ( còn

gọi là -keratin) và cấu dạng gấp khúc β ( còn gọi là

dạng β-keratin) Các cấu dạng này được duy trì nhờ liên

kết hydro N-H---O=C< giữa các nhóm peptit với nhau

179

-Cấu trúc bậc 3: là hình dạng của mạch polipeptit cuộn

lại trong không gian 3 chiều, các nhóm kị nước nằm ở

phía trong còn các nhóm ưa nước nằm ở trên bề mặt phân

tử. Cấu trúc bậc 3 duy trì được nhờ tương tác Van der

Vall, tương tác tác tĩnh điện, liêen kết đi sufua –S-S-,

và nhóm este

-Cấu trúc bậc 4: là một tổ hợp 2 hoặc nhiều đại phân tử

polipeptit kết hợp với nhau nhờ lực hút Van der Vall và

liên kết H giữa các nhóm nguyên tử phân bố trên bề mặt

các đại phân tử protein.

9.2.3.2 TÍNH CHẤT

a) Tính lưỡng tính: cũng có tính lưỡng tính, điểm

đẳng điện tương tự như aminoaxit và peptit

b) Tính tan: Tính tan của chúng phụ thuộc nhiều vào

cấu tạo phân tử, bản chất dung môi, pH của dung dịch,

nhiệt độ...Các protein hình sợi ( long, tóc, sừng...)

không tan, còn cấu trúc hình cầu ( như anbumin...) tan

được trong nước hoặc dung dịch muối loãng trung tính tạo

dung dịch keo. Ở điểm đẳng điện độ tan thấp nhất.

c) Sự kết tủa và sự biến tính:

Khi thay đổi các yếu tố như nồng độ, nhiệt độ ...thì

các dung dịch keo của protein bị kết tủa. Có hai loại

kết tủa:

180

-Kết tủa thuận nghịch: sau khi protein bị kết tủa, nếu ta

loại bỏ những nguyên nhân tạo tủa mà tủa sẽ tan trở lại

tạo dung dịch keo, gọi là kết tủa thuận nghịch. Ví dụ

ta cho thêm muối (NH4)2SO4 vào dung dịch lòng trắng trứng

thì có kết tủa, nhưng loại muối ra hoặc pha loãng thì

kết tủa lại tan.

- Kết tủa không thuận nghich: Tủa tạo thành không thể tan

trở lại thành dung dịch keo. Thông thường tác dụng của

axit mạnh, muối kim loại nặng, nhiệt độ ...thì kết tủa

của protein không thuận nghịch

-Sự biến tính:Trong trường hợp kết tủa không thuận

nghịch, tính chất của protein khác đi nhiều so với chất

ban đầu nên gọi là sự biến tính của protein.

d) Phản ứng thủy phân:

Khi đun nóng dung dịch protein nhờ xúc tác axit,

bazơ, hoặc nhờ men, phân tử protein bị thủy phân tạo

thành sản phẩm cuối cùng là các L--aminoaxit.

e) Một số phản ứng định tính và định lượng protein:

-Phản ứng định tính:

+ Phản ứng biure: phản ứng với Cu(OH)2 trong kiềm cho

phức màu xanh tím

+ Phản ứng xangtoproteic: phản ứng với HNO3 đặc cho kết tủa

màu vàng

181

-Phản ứng định lượng: (Phản ứng với thuốc thử Folin-

Xiocanto)

Đầu tiên thực hiện phản ứng biure, sau đó cho thêm

thuốc thử Folin-Xiocanto ( hỗn hợp của axit

photphomolipdic và axit photphovonphramic) để tạo ra hợp

chất phức màu xanh da trời có bước sóng hấp thụ cực đại

ở 750nm. Dựa vào cường độ màu của dung dịch để tính hàm

lượng protein

182

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Nguyễn Văn Đàn, Nguyễn Viết Tựu: Phương pháp nghiên

cứu hóa học cấy thuốc (1985). Nhà xuất bản Y học

2. Lê Văn Đăng. Chuyên đề một số hợp chất thiên nhiên

(2005),. Nhà xuất bản Đại học Quốc gia TP HCM

3. Đỗ Tất Lợi. Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam (2000),

Nhà xuất bản Y học

4. Nguyễn Năng Vinh. Kỹ thuật khai thác và sơ chế tinh dầu

(1977). Nhà xuất bản Nông nghiệp

5. John D.Roberts and C.Caserio. Hóa học hữu cơ hiện

đại. Tập 3 (1984)-Nguyễn Đức Chung dịch, Nhà xuất

bản KH& KT Hà Nội

6. Raphael Ikan. Natural products. A Laboratory guide

Second edition. Academic press, INC (1991)

183