ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ

УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ОБРАЗОВАНИЯ

КАЗАНСКИЙ НАЦИОНАЛЬНЫЙ ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ

ТЕХНОЛОГИЧЕСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ

На правах рукописи

ХАЛЕД ШАДИ МУНИР

СОСТАВ И СВОЙСТВА БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ ШРОТА

GLYCYRRHIZAE RADICES

14.04.02 – фармацевтическая химия, фармакогнозия

Диссертация на соискание ученой степени

кандидата химических наук

Научный руководитель:

доктор химических наук, доцент Сысоева М.А.

Казань 2017

2

ОГЛАВЛЕНИЕ

Стр

Список сокращений и условных обозначений…………………………..…....... 5

ВВЕДЕНИЕ………………………………………………………....................….. 6

ГЛАВА 1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР……………………………………..…..... 11

1.1 Общая характеристика сырья корня солодки……………….......... 11

1.1.1 Морфология корня солодки……………………………………....... 13

1.2 Способы извлечения глицирризиновой кислоты из корня

солодки……………………………………………..……………....... 13

1.3 Способы извлечения фенольных соединений из корня солодки... 17

1.4 Способы извлечения углеводов из корня солодки………..……... 19

1.5 Физико-химические характеристики биологически активных

веществ корня солодки…………………………………………..... 20

1.6 Анализ биологически активных веществ корня

солодки………………………………………………………………. 25

1.7 Биологические и фармакологические свойства веществ солодки 28

1.7.1 Биологическая активность глицирризиновой кислоты и её

производных ……………………………………………………....... 28

1.7.2 Биологическая активность фенольных соединений, выделенных

из корня солодки………………………………………………..….. 33

1.7.3 Биологическая активность полисахаридов, выделенных из корня

солодки………………………………………………………..…….. 37

1.7.4 Получение и применение лекарственных средств на основе

корня солодки……………………………………………………..... 38

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ…………………………………..…….. 43

2.1 Объекты исследования и материалы, использованные в работе… 43

2.1.1 Физико-химические свойства сырья и шрота корня солодки….... 43

2.1.2 Способ получения водно-аммиачного экстракта из сырья или

3

шрота корня солодки……………………………………...………... 44

2.1.3 Способ получения ацетонового экстракта из сырья или шрота

корня солодки…………………………………………………..…… 44

2.1.4 Способ получения этанольного экстракта из сырья или шрота

корня солодки……………………………………………………..... 45

2.1.5 Определение углеводов в шроте………………………………..…. 45

2.1.6 Разделение экстрактивных веществ этанольного экстракта из

шрота (фракции 2)…………………………………………..…….... 47

2.2 Общие методы анализа…………………………………………....... 48

2.2.1 Определение физико-химических показателей………………....... 48

2.2.2 Определение выхода экстрактивных веществ…………………..... 48

2.2.3 Определение суммы углеводов антроновым методом………..….. 48

2.2.4 Определение простых сахаров…………………………………....... 49

2.2.5 Определение пектина………………………………………..……… 50

2.2.6 Определение крахмала йодометрическим методом………...……. 50

2.2.7 Определение простых фенолов………………………………..…… 50

2.2.8 Определение белков по методу Флореса……………………..…… 51

2.2.9 Определение аминокислот нингидриновым методом………..….. 51

2.2.10 Определение лигнина…………………………………………..….. 52

2.2.11 Определение глицирризиновой кислоты………………………..... 53

2.2.12 Определение флавоноидов…………………………………….…… 53

2.2.13 ИК спектроскопия………………………………………………….. 55

2.2.14 Качественный анализ объектов исследования методом

инструментальной тонкослойной хроматографии…………….…. 55

2.2.15 Высокоэффективная жидкостная хроматография…………..……. 55

4

2.2.16 Хромато-масс-спектрометрический анализ………...…………….. 56

2.2.17 Микроскопический анализ………………………………..……....... 56

2.2.18 Определение антиоксидантной активности…………...………….. 57

2.2.19 Определение антимикробной активности объектов

исследования……………………………………………...……….... 57

2.2.20 Определение антимутагенной активности объектов

исследования………………………………………………………... 58

2.2.21 Статистическая обработка результатов………………………….... 59

ГЛАВА 3. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ………………………………….... 60

3.1 Физико-химические свойства сырья и шрота корня солодки….... 60

3.2 Состав углеводов шрота корня солодки…………………………... 61

3.3 Выбор растворителя для максимального извлечения

глицирризиновой кислоты и флавоноидных соединений……….. 67

3.4

Подбор условий экстракции шрота корня солодки этанолом для

максимального извлечения из него глицирризиновой кислоты и

флавоноидных соединений………………………………………....

73

3.5 Фракционирование экстракта, полученного из измельченного

шрота 80 % раствором этанолом…………………………………... 83

3.6 Биологическая активность фракций, полученных при

разделении этанольного экстракта шрота……………………….... 94

3.6.1 Исследование антимикробной активности объектов,

выделенных из шрота солодки…………………………………….. 94

3.6.2 Исследование антимутагенной активности объектов,

выделенных из шрота* солодки………………………………….... 97

ЗАКЛЮЧЕНИЕ…………………………………………………………………… 102

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ…………………………….. 104

ПРИЛОЖЕНИЯ…………………………………………………………………... 121

5

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ

ГК – глицирризиновая кислота

Гк – глицирретовая кислота

ТСХ – тонкослойная хроматография

ГФ – Государственная Фармакопея

БАВ – биологически активные вещества

БАД – биологически активная добавка

ЭВ – экстрактивные вещества

МСГК – моноаммонийная соль глицирризиновой кислоты

АОА – антиоксидантная активность

Тпл – температура плавления

λmax – длина волны максимальная

АЛТ – эндогенный фермент, аланинаминотрансфераза

АСТ – фермент белкового обмена, аспартатаминотрансфераза

ВЭЖХ – высокоэффективная жидкостная хроматография

ГХ/МС – газовая хроматография/ хромато-масс-спектрометрия

ИК – инфракрасная спектроскопия

n – количество данных, взятых для статистической обработки

(ДФПГ) DPPH – дифенилпикрилгидразил

IC50 – концентрация, необходимая для ингибирования 50 % ДФПГ радикала

6

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность работы. В настоящее время на основе извлечений из корня

солодки голой (Glycyrrhizae radices) фармацевтические предприятия выпускают

препараты, терапевтическая эффективность которых обусловлена содержанием в

них глицирризиновой кислоты и флавоноидных соединений, обладающих

широким спектром биологической активности. Несмотря на широкий спектр

исследований сырья корня солодки, остается не изученным шрот – отход

переработки корня солодки, который в условиях производства не находит

реализации. Поэтому исследование химического состава шрота корня солодки,

разработка способов его экстракции, исследование количественного и

качественного состава соединений, извлекаемых из него различными

растворителями, является актуальным для создания на основе экстрактов из

шрота новых эффективных лекарственных средств, которые будут обладать

высокой активностью и специфичностью действия.

Степень разработанности темы исследования. Основной вклад в

исследование биологически активных веществ корня солодки внесли работы

Толстикова Г.А., Толстиковой Т.Г., Аммосова А.С., Литвиненко В.И., Ипатовой

О.М., Денисовой С.Б. и др. Авторами изучен химический состав различных

видов солодки, определены биологические и фармакологические свойства

компонен-тов этого сырья, разработаны технологии различных лекарственных

форм на его основе К настоящему времени не имеется литературных данных по

комплексной переработке этого ценного лекарственного сырья, а также по

системному исследованию химического состава биологически активных веществ

шрота корня солодки – отхода фар-мацевтического производства. Известны

публикации, в которых из шрота корня солодки предлагалось получать:

экстракт, богатый слизистыми веществами, жиры и жироподобные вещества,

питательную среду для культивирования дрожжей, удобрения, кормовую муку

для животноводства, теплозвукоизоляционные плиты для строительства.

7

Цель работы. Исследование количественного содержания и

качественного состава экстрактивных веществ шрота корня – отхода

производства сиропа корня солодки, для определения перспектив его

дальнейшей переработки в лекарственные средства.

Для достижения цели поставлены следующие задачи:

1. Определить химический состав шрота корня солодки;

2. Разработать комплексный подход для определения количественного

содержания и качественного состава тритерпеноидных, флаво-ноидных и

сопутствующих им соединений в шроте корня солодки – отхода производства

сиропа корня солодки, который заключается в:

- подборе экстрагентов для увеличения выхода терпеноидных и

флавоноидных веществ из шрота корня солодки с наименьшим содержанием

сопутствующих соединений в полученных экстрактах;

- подборе оптимальных условий экстракции шрота корня солодки,

выбранным экстрагентом, для получения максимального выхода тер-пеноидных,

стероидных и флавоноидных соединений;

- установлении состава биологически активных веществ этанольно-го

экстракта шрота корня солодки, путем применения физических и химических

методов по их разделению.

3.Определить антиоксидантную, антимикробную и антимутагенную

активность фракций, полученных на основе этанольного экстракта из шрота

корня солодки для дальнейшего создания на их основе БАД и лекарственных

средств.

Научная новизна работы. Впервые исследован химический состав шрота

корня солодки, в нем установлено высокое содержание глицирризиновой

кислоты, фенольных и липофильных веществ, полисахаридов, в том числе

галактоглюканов, крахмала, клетчатки и белка.

Впервые применен комплексный подход к исследованию биологически

активных веществ шрота корня солодки, заключавшийся в оптимизации

экстракции шрота с получением этанольного экстракта, разработаны физические

8

и химические методы по разделению биологически активных веществ этого

экстракта, что позволило определить качественный состав и количественное

содержание глицирризиновой кислоты, флавоноидных и сопутствующих им

соединений в шроте корня солодки.

Впервые показано, что из шрота корня солодки могут быть выделены

фракции, которые обладают высокой антиоксидантной, антимикробной и

антимутагенной активностью.

Проведенное фракционирование этанольного экстракта из шрота

позволило увеличить антиоксидантные, антимикробные свойства полученных

фракций в 18,5, в 1,3 раз, по сравнению с исходным экстрактом.

Теоретическая и практическая значимость работы. Представлено

теоретическое обоснование усовершенствования методов по выделению,

фракционированию и идентификации биологически активных веществ,

извлекаемых из лекарственного растительного сырья на примере корня солодки.

Впервые показано, что шрот корня солодки можно использовать для

получения тритерпеноидных, стероидных, флавоноидных соединений,

галактоглюканов, пектинов, крахмала и клетчатки.

Впервые обоснована возможность применения этанольного экстракта,

полученного из шрота и выделенных из него фракций, для получения

субстанций и дальнейшей разработки на их основе лекарственных средств с

антиоксидантными, антимикробными и антимутагенными свойствами.

Методология и методы исследования. В работе использованы

современные методы физико-химического анализа: инструментальная

тонкослойная хроматография на лабораторном комплексе «CAMAG»,

высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ), хромато-масс-

спектрометрия, ИК-спектроскопия и метод динамического светорассеивания.

Статистическую обработку экспериментальных результатов проводили с

использованием программы «Statistica 6.0».

На защиту выносятся:

- результаты анализа химического состава шрота корня солодки;

9

- комплексный подход по определению количественного содержания и

качественного состава тритерпеноидных, флавоноидных и сопутствующих им

соединений в шроте корня солодки;

- антиоксидантная, антимикробная и антимутагенная активность фракции,

полученных на основе этанольного экстракта из шрота корня солодки и

практические рекомендации по использованию биологически активных веществ,

обнаруженных в шроте корня солодки.

Степень достоверности и апробация результатов. Достоверность

результатов работы обеспечена при применении современных методов анализа

использованием стандартов. Полученные экспериментальные данные

достоверны, обработаны с помощью программного обеспечения к

аналитическим приборам (PERKINELMER «TurboMass», CAMAG «WinCats»,

Shimadzu «Labsolutions»), а также с использованием программы «Statistica 6.0».

Результаты работы докладывались и обсуждались на XIII, XIV и XV

Международных конференциях молодых учёных «Пищевые технологии и

биотехнологии» (Казань, 2014г., 2015г., 2016 г.), XXV Всероссийской научно-

технической конференции «Окружающая среда и здоровье населения» (Казань,

2014г.), V Всероссийской молодежной научной конференции «Химия и

технология новых веществ и материалов» (Сыктывкар, 2012 г.).

Внедрение результатов исследования. Материалы, изложенные в

диссертационной работе Халед Ш.М. используются в лабораторных

практикумах бакалавров по направлению 19.03.02 «Продукты питания из

растительного сырья», профиль «Технология детского и функционального

питания» при изучении дисциплины – «Технология отрасли 2» («Технология

продуктов функционального питания») и по направлению 19.03.01

«Биотехнология», профиль «Пищевая биотехнология» при изучении дисциплин

– «Физико-химические методы анализа биологически активных веществ»,

«Химия биологически активных веществ»; магистров по направлению 19.04.01

«Биотехнология», профиль подготовки «Пищевая биотехнология» при изучении

дисциплины – «Биотехнология функциональных продуктов питания».

10

Объём и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, трёх

глав, выводов, библиографического списка, приложений. Работа изложена на

150 страницах машинописного текста, содержит 28 рисунков, 29 таблицы и 159

литературных источника.

11

ГЛАВА 1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

1.1 Общая характеристика сырья солодки

Glycyrrhiza относится к семейству бобовых Fabaceace. Корень солодки,

одно из самих древнейших лекарственных средств. В мире существует около 13

видов корня солодки. Наиболее распространены виды: солодка голая

(Glycyrrhiza glabra), солодка уральская, (Glycyrrhiza uralensis Fisch) и солодка

коржинского (Glycyrrhizaе Korshinskyi Grig) [1,2]. Солодка голая самая

популярная среди них, в её корнях содержится наибольшее количество

биологически активных веществ (БАВ) [1,2,3]. Большинство видов солодки

произрастают на территории Евразии.

Glycyrrhiza glabra L. – это многолетнее травянистое растение, с хорошо

развитой корневой системой. Стебель прямостоячий, негусто коротко и растет

до одного метра по высоты [4]. Пушистые листочки продолговато-яйцевидные,

около 2-4 см длиной и 1-2,5 см шириной, снизу (и редко сверху) кора продольно

морщинистая от коричневато-серой до темно-коричневой [5]. Соцветия –

довольно рыхлые, кисти по своей длине короче листьев или несколько длиннее.

Цветки – бобы плоские продолговатые до прямых длиной 1-3 см, шириной 6 мм,

довольно густо усеянные железистыми шипиками, многосемянные, или двух-

трехсемянные [4].

Как показано на рисунке 1.1, сырье в основном состоит из цилиндрических

отрезков корней, немного сужающихся, иногда продольно-расщепленных,

диаметром 1-5 см, длиной 15-40 см. Внешне, неочищенный корень фиолетово-

коричневый. Очищенный корень желтоватого цвета, с грубыми поперечными

бороздами, внутри с радиальным [4]. Корень имеет приторно сладкий вкус

благодаря главному компоненту глицирризиновой кислоте (ГК), которая в 50 раз

слаще, чем сахароза [5]. Запах тонкий, характерный.

12

Рисунок 1.1 – Внешний вид корней солодки

Корень солодки заготавливают в зависимости от природных условий с

марта по ноябрь [6] на третьем и последующих годах жизни растения. Сначала

сквашивают траву, затем плантажным плугом с тракторной тягой вспахивают

корневую систему растения вниз до 1 м. В маленьких зарослях корни

раскапывают ручным способом лопатами. При сборе урожая убирают только 50-

75 % общего запаса корней. Повторный сбор сырьевого материала на этом месте

можно будет осуществить через 6-8 лет. После очистки корни складируют в

копны на 24 часа на открытом пространстве [7]. При плохих погодных условиях

их высушивают под навесом при хорошем проветривании или на сушилках при

температуре не больше 50 °С. Подсушенный корень переправляют для

последующей обработки на предприятия.

Качество корня солодки нормируется Государственной Фармакопей (ГФ):

содержание экстрактивных веществ (ЭВ), извлекаемых 0,25 % раствором

гидроксида аммония, должно быть не менее 25 %, влаги не более 14 %, золы не

более 8 %, ГК – не ниже 6 % [8]. ГК является наиболее ценным извлекаемым

веществом, однако в корне солодки содержатся и другие БАВ: до 5,0 %

флавоноидов, углеводов до 34,0 %, белков – до 10,1 %, аминокислот до 12,71 %,

в том числе аспарагина до 4,0 %, жиров и жироподобных веществ до 4,7 %,

аскорбиновой кислоты до 3,1 % [3].

13

1.1.1 Морфология корня солодки

В поперечном срезе пробка корня солодки широкая, коричневая, состоит

из многих слоев [4]. Под пробкой первичная кора, широкая, желтого цвета с

длинными и сильно утолщенными волокнами, флоэма у очищенных корней

частично удалена вместе с пробкой [5]. У первичной коры волокна довольно

длинные, с небольшим отверстием и достаточно утолщенными стенками,

целлюлозными с внутренней стороны и немного одеревеневшими с внешней

стороны [4,8]. Вторичная кора широкая, желтого цвета, в ней хорошо видны

сердцевинные лучи, состоящие из радиальных групп волокон шириной от 1 до 8

клеток, чередуются с лубом [4, 5, 9]. Как показано на рисунке 1.2, простые,

округлые или яйцевидные зерна крахмала можно увидеть в паренхимных

сердцевинных лучах и клетках коры, размером 2-12 мкм, редко до 20 мкм [5].

Ксилема желтая, хорошо видна, расходится лучами [4].

Древесина имеет сосуды разных диаметров от узкого до очень широкого,

группы склеренхимных волокон с кристаллоносной паренхимой и обкладкой,

которая содержит крахмал. При окрашивании раствором йода, паренхима и

сердцевинные лучи, окрашиваются в синий цвет, сосуды желтые, луб остается

сероватым, древесина и группы волокон коры оранжевые. Сердцевина имеется

только в корневище, и она окрашивается в темно-желтый цвет [4, 5].

1.2 Способы извлечения глицирризиновой кислоты (ГК)

из корня солодки

Наиболее простым способом выделения ГК из корня солодки является

экстракция водой. В литературе описано несколько методов экстракции ГК

водой (экстракция с перемешиванием, кипячение) [10, 11], однако они не

получили широкого распространения. Это связано с тем, что, несмотря на то, что

выход ГК при использовании воды довольно высокий (4-6 %), проведение

14

Рисунок 1.2 – Микроскопия корней солодки голой [9]: 1 – многослойная пробка;

2 – запасающая паренхима; 3 – сердцевинные лучи; 4 – луб; 5 – лубяные

волокна; 6 – сосуды древесины; 7 – крахмальные зерна; 8 – камбий; 9 –

кристаллы в паренхиме

экстракции требует длительного времени и высоких энергозатрат на

поддержание необходимой температуры.

С целью увеличения выхода ГК, используются различные приёмы.

Согласно литературным данным, для извлечения ГК могут быть использованы

растворы гидроксида аммония, растворы щелочей, органические растворители и

растворы кислот [10,11, 12-15].

Классической технологией экстракции ГК из корня солодки является

использование водных растворов гидроксида аммония [12]. В работе [16]

Тихомирова с коллегами провели подбор условий экстракции ГК раствором

гидроксида аммония и показали, что экстракция корня солодки 1 % водным

раствором гидроксида аммония в течение 60 мин при температуре 120 °С

является оптимальной и позволяет извлечь ГК с выходом 7,3 %. Авторы

указывают, что применение раствора гидроксида аммония позволяет перевести

15

трудно растворимую в воде смесь глицирризина в легко растворимую в воде

моноаммонийную соль глицирризиновой кислоты МСГК, что, в частности, и

обеспечивает повышение выхода ГК.

В литературе также описаны способы экстракции БАВ из корня солодки с

использованием растворов щелочи (NаОН). Так, Денисова в [13] сообщает, что

2-кратная экстракция ГК из корня солодки с использованием 0,5 % (NаОН), при

продолжительности 1 час при 20-50 °С позволяет увеличить выход ГК до 17 %.

В работах [10, 14] была описана экстракция корня солодки с применением

органических растворителей. Гаврилин с коллегами [14] провели экстракцию ГК

из корня солодки 70 % водным раствором этилового спирта кипячением в

течение 2 ч. Выход ГК составил только 3,64-6,93 %.

В работе [17] проведен подбор условий выделения ГК из корня солодки

этанолом. Параметрами подбора условий являлись концентрация этанола и

размер частиц сырья. Шестиступенчатая экстракция методом реперколяции с

передвижкой извлечения через 1 ч была проведена при соотношении сырье:

экстрагент 1:10 при температуре 40-50 ºС. с использованием в качестве

экстрагента 40, 45, 50, 60, 75, 80 и 90 % этанола и различным размером частиц

сырья – 1-2, 2-3 и 3-5 мм. Максимальный выход ЭВ – 10,35±0,13 % от сырья и

ГК– 15,10±0,20 % от ЭВ наблюдался при использовании 50 % этанола и размера

частиц 3-5 мм.

Более широкий анализ влияния органических растворителей на выход ГК

осуществлён в [10]. В данной работе была проведена экстракция сырья

органическими растворителями: хлороформом, ацетонитрилом, метанолом и

этанолом. Показано, что ГК извлекается только при использовании метанола или

этанола. Содержание ГК в этанольном и метанольном экстрактах составляет 0,86

мг/г, что в 2,8 раз меньше, чем в водном экстракте, полученном при тех же

условиях. При подборе температуры, времени и концентрации спиртового

раствора для увеличения выхода ГК было установлено, что наилучшие

результаты достигаются при проведении экстракции сырья 30 % водным

раствором этанола при 50 °С в течение 60 мин. Однако содержание ГК в

16

полученным таким способом экстракте все равно не превышало его содержание

в водном экстракте.

Помимо выделения ГК органическими растворителями, в литературе также

описаны способы экстракции с применением растворов минеральных кислот в

органических растворителях. В работе [15] описана трёхстадийная экстракция

ГК из измельчённого корня солодки с применением 3 % ацетонового раствора

азотной кислоты с общей продолжительностью 3 ч. Выход ГК, выделенного

данным методом, составил 2,7 %.

Наряду с подбором экстрагента, перспективным способом увеличения

выхода ГК является использование физических способов для интенсификации

экстракции. В работе [18] проведено извлечение ГК из корня солодки двумя

способами: экстракцией в микроволновой печи и ультразвуковой экстракцией. В

обоих случаях в качестве экстрагента был использован 60 % раствор этанола с 1

% раствором гидроксида аммония. Перед проведением экстракции, сырьё

измельчали в блендере до получения мелкозернистого порошка. В качестве

контроля была выбрана реперколяция 80 % раствором этанола с

предварительным увлажнением сырья 10 % раствором гидроксида аммония

(выход ГК составил 6,36 %). Было установлено, что, извлечение ГК с

применением микроволновой печи позволяет сократить время экстракции с 72 ч

до 15 мин без уменьшения выхода ГК. В то же время, проведение

ультразвуковой экстракции позволяет не только сократить её

продолжительность до 10 мин, но и увеличить выход ГК на 34 %.

В работе [19] была проведена экстракция порошка корня солодки

различными растворителями, и дистиллированной водой, с применением

ультразвуковой ванны при частоте 50 кГц и температуре 45 °С с различным

временем выдержки 45, 60 и 120 мин. Экстракты обрабатывали 0,01 % аммиаком

с последующим концентрированием. После, провели обработку 70 % этанолом с

образованием осадка. Показано, что максимальное количество ГК получено при

экстракции корня солодки дистиллированной водой и метанолом при

температуре 45 °С в течение 45 мин 36,46 ± 1,29 и 35,80±1,18 % от ЭВ

17

соответственно. Экстракция этиловым спиртом позволила извлечь 15,62±1,45 %

от ЭВ ГК при тех же условиях.

В работе [20] было проведено получение МСГК «Глицирама» с наиболее

высокой чистотой 87 %. Это достигается использованием для экстракции сырья

0,5-1 % раствором аммиака и получении МСГК кислоты путем повторной

перекристаллизации 85 % этанолом. При этом выход ЭВ составил 7,50±1,18 % от

сырья, ГК после осаждения: концентрированной кислотой – 3,38±0,73 % от

сырья (44,92±3,88 % от ЭВ), триаммонийной соли 5,23±0,75 % от сырья,

технической МСГК 2,59±0,20 % от сырья, очищенной МСГК 1,25±0,18 % от

сырья.

1.3 Способы извлечения фенольных соединений из корня солодки

Для извлечения флавоноидов из корня солодки используют различные

способы экстракции. В работе [13] авторы описывают предварительную

обработку корня н-гексаном для того, чтобы удалить жиро-липидный комплекс

соединений. Экстракции подвергли, предварительно измельченные и

высушенные на лабораторной мельнице или на промышленной дробилке, корни

солодки. После экстракции гексаном, сырье экстрагировали этиловым спиртом и

ацетоном с перемешиванием при температуре 40-50 °С в течение 4 часов. Выход

агликонов флавоноидов в полученном экстракте составил 4 %, а гликозидов

флавоноидов 12-14 %.

В работе [21] была проведена экстракция измельчённого корня солодки

80% метанольным раствором путём перемешивания при температуре 25 °С, в

течение 1 часа. При этом выход флавоноидов составляет 17,00 ± 0,09 мг/г.

Экстракция измельченного корня солодки голой в работе [22] была

проведена водой и этанолом путём кипячения на водяной бане с обратным

холодильником в течение 1 часа, при температуре 50 °С. Содержание

фенольных, в том числе флавоноидных соединений в этанольном экстракте

составляет 9,2 и 6,8 % соответственно, а в водном экстракте – 4,8 и 2,3 %.

18

Авторами [23] была проведена экстракция порошка корня солодки водой в

аппарате Сосклета при соотношении сырье: экстрагент 1:10 в течение 8 ч. Выход

сухих веществ для водного экстракта составил 5,5 % от сырья, из которых на

долю фенольных соединений приходиться 6,50±2,21 мг/г в пересчете на

галловую кислоту, а на флавоноиды – 12,75±1,22 мг/г в пересчете на кверцетин.

При этом экстракция порошка корня солодки 96 % этанолом дает возможность

извлечь в 1,3 раза больше БАВ. Выход сухих веществ составил 7,3 %.

Количество фенольных соединений в этанольном экстракте составило 47,41±3,61

мг/г в пересчете на галловую кислоту, а флавоноидов 17,47±1,40 мг/г в пересчете

на кверцетин.

В работе [24, 25] при экстракции порошка корня солодки 96 % этанолом в

соотношении сырье: экстрагент 1:10 при комнатной температуре при

постоянном перемешивании в течение 48 ч. содержание фенольных соединений

составляет 4,05 мг/г сырья, из которых на долю флавоноидов приходиться 1,14

мг/г сырья. В полученном экстракте были идентифицированы: простые фенолы,

протокатеховая, бензойная, п-кумаровая, феруловая, коричная кислоты и

ванилин, флавонол, рутин, мирицетин, кверцетин и кемпферол, флавононовые

гликозиды – апигенин.

Авторами [26] была проведена экстракция корня солодки 96 % этанолом

(сырье: экстрагент 1:2, 2 ч, n=2) при кипячении с обратным холодильником с

последующей обработкой органическими растворителями и водой. Показано,

что экстракция гексаном позволяет выделить 134,79±5,89 мг/г в пересчете на

галловую кислоту фенольных соединений, 45 % которых являются флавоноиды

– 62,52±0,47 мг/г в пересчете на рутин. Последующая экстракция хлороформом

дает возможность извлечь 121,86±4,00 мг/г фенольных соединений в пересчете

на галловую кислоту, из которых 66,55±0,22 мг/г в пересчете на рутин

приходиться на флавоноиды. Экстракция корня солодки дополнительно н-

бутанолом позволяет получить 44,41±0,50 мг/г в пересчете на галловую кислоту

фенольных соединений, из которых 42 % это флавоноиды 18,77±0,10 мг/г в

пересчете на рутин. Дальнейшая обработка этилацетатом дает возможность

19

извлечь 163,50±5,31 мг/г фенольных соединений в пересчете на галловую

кислоту, из которых на долю флавоноидов приходиться 60,29±0,81 мг/г в

пересчете на рутин. Обработка водой позволяет выделить 8,91±0,43 мг/г в

пересчете на галловую кислоту фенольных соединений, 40 % которых являются

флавоноиды 3,60±0,09 мг/г в пересчете на рутин.

1.4 Способы извлечения углеводов из корня солодки

Из солодки голой в работе [13] были выделены моно- и олигосахариды

экстрагированием 82 % этанолом (выход 15,0 %). Так же был проведен гидролиз

корня солодки 2 н раствором H2SO4 в течение 8 часов на кипящей водяной бане и

определен моносахаридный состав полисахаридов корня (выход составил 3 %).

Авторами [27], проведен подбор условий экстракции полисахаридов 80 %

этанолом и показано, что экстракция измельчённого корня солодки с размером

частиц 0,25-0,5 мм, 80 % этанолом при соотношении (1:15) при комнатной

температуре в течение 1 часа с применение ультразвукового воздействия (20

мин) позволяет извлечь полисахариды с выходом 4,82 %.

Присутствие полисахаридов, а также декстринов и растворимых крахмалов

в корне солодки, авторы установили в работе [28]. Результаты, полученные при

исследовании химического состава подземных органов солодки, которая

произрастает в Таджикистане, показали высокое содержание суммы сахаров

11,80-23,30 %, в том числе сахарозы 7,0-16,70 %, редуцирующих сахаров 1,30-

8,50 %.

Авторами [29], изучен углеводный состав брикетированного корня

солодки. Количество легкогидролизуемых полисахаридов в нем составляет

18,60-21,70 %, труднорастворимых полисахаридов 21,90-26,50 %, пентозанов

13,60-14,80 %, минеральных элементов 11,50-14,70 %. Полисахариды далее были

гидролизованы с выходом сахаров до 75 %.

Ряд работ посвящен изучению полисахаридов различных видов солодки.

Три полисахарида, глицирризаны UA, UB и UC были выделены из корня

20

Glycyrrhiza uralensis, полисахариды глицирризан и глицирризан GA выделены из

столона Glycyrrhiza glabra var glandulifera [13].

Содержание трудногидролизуемых полисахаридов в сырье солодки

составляет 26,6 % от сухих веществ, а содержание легкогидролизуемых – в 1,43

раза, лигнина – в 1,24 раза меньше, то есть 18,6 и 21,4 % соответственно.

Количество гексозных сахаров, найденных в гидролизате шрота корня солодки –

64 % от суммы моносахаридов [30].

1.5 Физико-химические характеристики биологически активных веществ

корня солодки

Основными действующими веществами корня солодки являются

глицирризиновая кислота, фенольные соединения и углеводы.

Глицирризиновая кислота: ГК обнаружена более чем в 10 разновидностях

солодки, и находится в виде смешанных калиево-кальциево-магниевых солей

[13,14]. Содержание ГК в корнях солодки варьируется в интервале 2-24% [13,17].

ГК представляет собой кристаллическое, бесцветное вещество, которое хорошо

растворимо в этаноле и горячей воде, и практически не растворимо в холодной

[5, 31, 32]. Температура плавления (Тпл) – ГК (220 °C). УФ-спектр

глицирризиновой кислоты показывает, что максимальный пик ее поглощения

находиться в области 254 нм. [33, 34]. Агликоном ГК является одноосновная

глицирретиновая кислота с характерной для нее кетогруппой, которая находится

в 11 положении. Ее сахаристая часть представляет собой 2 молекулы

глюкуроновой кислоты [33]. (рисунок 1.3).

21

Рисунок 1.3 – Агликон и гликозидный остаток глицирризиновой кислоты

Фенольные вещества извлекаемые из корня солодки.

Простые фенольные соединения. В настоящее время из корня солодки

выделены и идентифицированы следующие фенольные соединения: простые

фенолы (фенол, резорцин, пирогаллол), фенолкарбоновые кислоты

(протокатеховая, хлорогеновая, бензойная, галловая, салициловая, ванилиновая и

кофейная), оксикоричные кислоты (феруловая кислота, коричная кислота,

синаповая кислота) [23]. Простые фенольные соединения (фенол, резорцин,

пирогаллол) это кристаллические, бесцветные, иногда слегка окрашенные

вещества, со специфическим запахом, с температурой плавления (Тпл) 40,9-110

°С, обадают оптической активностью. В растениях они чаще встречаются в виде

гликозидов, которые в свою очередь, хорошо растворимы в спирте, воде,

ацетоне, но нерастворимы в хлороформе и эфире. Агликоны хорошо растворимы

в бензоле, эфире, хлороформе и этилацетате, но слабо растворимы в воде.

Простые фенолы имеют характерные спектры поглощения в УФ областях

спектра. Фенолкарбоновые кислоты (хлорогеновая, бензойная кислота и другие)

представляют собой кристаллические вещества, растворимые в эфире,

22

этилацетате, спирте, водных растворах ацетата и гидрокарбоната натрия. Они

представляют собой кристаллические вещества, с характерным запахом,

малорастворимые в воде, хорошо растворяются в органических растворителях

(этанол, ацетон, эфир), с Тпл 122,4-240 °С.

Свободные оксикоричные кислоты представляют собой чаще бесцветные

кристаллические вещества, хорошо растворимые в этиловом и метиловом

спиртах, этилацетате, метилированные производные растворяются в эфире и

хлороформе. Для обнаружения в растениях используют их свойство

флюоресцировать в УФ-свете и реакции, характерные для фенольных

соединений. Тпл варьируется между 134-170 °С.

Фенольные соединения из корня солодки (фенол, резорцин, пирогаллол),

выделенные из водного экстракта, эфиром при рН 7,0-7,5 представляют собой

простые фенольные соединения, не содержащие карбоксильной группы

("нейтральные"). При подкислении водного экстракта корня солодки до рН 3,0-

3,5 тем же растворителем извлекают "кислые" фенольные соединения,

представленные фенолкарбоновыми кислотами (протокатеховой, салициловой,

кофейной, хлорогеновой, бензойной, галловой и ванилиновой) [13].

Флавоноиды, извлекаемые из корня солодки. В настоящее время из корня

солодки выделены и идентифицированы свыше 50 различных флавоноидов, а

также охарактеризованы основные группы флавоноидных агликонов (флавоны,

халконы, флавононы, изофлавоны, флавонолы) и их гликозиды [35, 13]. В

чистом виде флавоноиды представляют собой кристаллические соединения,

желтые (флавоны, флавонолы, халконы, ауроны) и бесцветные (изофлавоны,

катехины, лейкоантоцианидины, флаванонолы, флавононы) без запаха, с

горьковатым вкусом. (Тпл агликонов до 300 °С, у гликозидов 100-180 °С).

Катехины, гликозиды и лейкоантоцианидины хорошо растворимы в этаноле,

воде и метаноле различной концентрации, но нерастворимы в органических

полярных растворителях. Агликоны, за исключением лейкоантоцианидинов и

катехинов растворяются в этиловом эфире, ацетоне, спиртах, этилацетате, и

плохо растворимы в воде. Флавоноидные гликозиды способны к

23

ферментативному и кислотному гидролизу, а также обладают оптической

активностью.

Содержание флавоноидов в корнях солодки 3-6 %. Ниже представлены

основные флавоноиды корня солодки (рисунок 1.4) и их характеристика.

Ликвиритигенин С15Н12О4 (флаванон) белое кристаллическое вещество, Тпл

193-195 ⁰С, λmax – 275, 310 нм, растворим в этаноле [36].

Ликвиритин С21Н21О9 (флаванон), белое кристаллическое вещество, Тпл

209-211 ⁰С, λmax – 275, 313 нм, растворим в этаноле, метаноле, и их водных

растворах [37].

Изоликвиритигенин С15Н12О4 (халкон), оранжевое кристаллическое

вещество, λmax – 255, 370 нм, растворим в этаноле [5].

Рисунок 1.4 – Основные флавоноиды корня солодки

Ликуразид С26Н30О13 (халкон), желтое кристаллическое вещество, Тпл 150-

151 ⁰С, λmax – 245, 370 нм, растворим в этаноле, метаноле, и их водных растворах

[38].

Ононин С22Н22О9 (изофлавон), белое кристаллическое вещество, Тпл 215-

217 ⁰С, λmax – 260, 300 нм, растворим в этаноле [39].

24

Формононетин С16Н12О3 (изофлавон), белое кристаллическое вещество,

растворим в этаноле [36].

Углеводы извлекаемые из корня солодки: В работе [13] установлено, что в

корне солодки голой содержание углеводов достигает до 40 %. По мономерному

составу охарактеризованы и выделены следующие классы углеводов: простые

сахара, пектиновые вещества, спирто- и водорастворимые полисахариды,

гемицеллюлозы и клетчатка. В корне солодки содержится до 16 %

моносахаридов [40], поэтому при обработке его водными растворами спиртов и

водой экстракты содержат значительное количество сахаров. Три полисахарида,

глицирризаны UA, UB и UC были выделены из корня Glycyrrhizae uralensis, и

полисахариды глицирризан GU и глицирризан GA выделены из столона

(вытянутый боковой побег растения) Glycyrrhizae glabra var glandulifera [13].

Основой структуры глицирризана GA [13] являются β-1,3-связанные остатки

галактозы. Основная структурная единица глицирризана – α-арабино-β-3,6-

галактан (L-арабиноза, D-галактоза, L-рамноза, D-галактуроновая и D-

глюкуроновая кислоты в соотношении 22:10:1:2:1). Глицирризан UA состоит из

L-арабинозы, D-галактуроновой кислоты, D-галактозы, L-рамнозы, в молярном

соотношении 20:3:1:14. Структурная единица глицирризана UA [13] это β-1,3-

связанная галактоза, все остатки которой в боковой цепи содержат α-1,5-

связанную L-арабинозу в положении 6. Глицирризан состоит из L-арабинозы, L-

рамнозы D-галактозы, D-глюкозы, в молярном соотношении 12:20:1:10:10.

Также содержится небольшое количество О-ацетильных группы и около 10 %

глицирризан UA и 35 % глицирризан UВ остатков, пептидных остатков и D-

галактуроновой кислоты в виде метиловых эфиров [13]. Нейтральный

полисахарид глицирризан UC состоит из L-арабинозы, D-галактозы, L-рамнозы,

D-глюкозы, в молярном соотношении 10:30:1:27 и его можно определить как

арабино-3,6-галакто-глюкан [13]. В гидролизате полисахаридов определены

галактоза, ксилоза, арабиноза, глюкоза, манноза. В [13] приведены работы, по

которым были выделены около 15 % моно- и олигосахаридов путем экстракции

25

корня солодки 82 % этанолом. Галактоза, глюкоза, манноза, сахароза и

глюкофруктан обнаружены в их составе.

1.6 Анализ биологически активных веществ корня солодки

Определение содержания глицирризиновой кислоты. По стандартной

методике фармакопейной статьи [41] точную навеску измельченного сырья

помещают в колбу, прибавляют 20 мл 96 % этилового спирта. В колбу вносят 3

% ацетонового раствора кислоты азотной и нагревают на водяной бане в течение

30 минут. После этого фильтруют и прибавляют по каплям раствор аммиака

концентрированного до появления обильного осадка (рН от 8,3-9). Растворяют в

воде и образуется раствор А и Б Оптическую плотность раствора Б измеряют на

спектрофотометре при длине волны 258 нм, в качестве раствора сравнения

используют воду. Параллельно измеряют оптическую плотность раствора Б СО

глицирама. Содержание глицирризиновой кислоты в пересчете на глицирам

должно быт не менее 6 %.

Для определения количественного содержания ГК в корне солодки в

работе [5] был исследован ряд образцов корней солодки голой и ее препаратов

(сухой, густой экстракт) методом прямой спектрофотометрии на

спектрофотометре СФ-4А (заводской № 700322 проверен по нейтральным

светофильтрам фирмы ЛОМО) и СФ-26. Оптическую плотность растворов

измеряли на спектрофотометре при длине волны 258 нм, в кювете с толщиной

слоя 10 мм, используя в качестве раствора сравнения воду. Для достоверного

определения ГК предложено использовать стандарт глицирам. Содержание

глицирризиновой кислоты согласно ФС в сырье солодки находится в интервале

от 10,51 % до 15,23 %, в экстракте густом от 15,50 %до 17,25 %, в экстракте

сухом от 18,35 % до 21,80 %, в экстракте жидком от 7 ,08 % до 13,91%, в сиропе

от 0, 25% до 0 ,73%.

26

Методом тонкослойной хроматографии (ТСХ) проводилось изучение

образцов солодки голой (Glycyrrhiza glabra L.) и солодки уральской (Glycyrrhiz

auralensis Fisch.) [5].

Установлено, что при использовании пластинки "Силуфол УФ-254",

"Сорбфил-ПТСХ-П-А-УФ", и системы растворителей хлороформ: метанол: вода

(26:14:3) для хроматографического анализа, ГК обнаруживается в виде

фиолетового флуоресцирующего пятна (254 нм) с величиной Rf около 0,3 (на

уровне ГСО глицирама).

Стандартная методика для определения ГК с использованием методом

ТСХ (лабораторный комплекс «СAMAG») проводится на пластинах ПТСХ-АФ-

А-УФ «Sorbfil» в системе растворителей этилацетат: муравьиная кислота:

уксусная кислота: вода (15:1:1:2). В качестве проявителя применяли 10 %

раствор H2SO4 в метаноле. Денсиметрическую обработку хроматограммы

осуществляли при длине волны 254 нм до и после проявления. Количественное

определение глицирризиновой кислоты осуществляли по площади пятна на

хроматограмме с применением градуировочного графика, построенного по

растворам стандарта глицирризиновой кислоты [5].

В работе [14] были использованы три способа определения содержания ГК

в сырье. Методом ВЭЖХ – на жидкостном хроматографе «Стайер» фирмы

Аквилон (Россия-США-Чехия), снабженном колонкой Luna С-18 4,6×150 мм

(Phenomenex, США), с содержанием углерода около 16 %. В качестве подвижной

фазы использовали смесь ацетонитрила и раствора муравьиной кислоты (20 г/л)

в соотношении 40:60, при расходе элюента 1 мл/мин. Детектирование

осуществляли при 257 нм. Выход ГК составил 3,72±0,13 %. Для подтверждения

полученных результатов анализ сырья проводили спектрофотометрическим

методом и с помощью капиллярного электрофореза. Последний проводили с

использованием системы для капиллярного электрофореза Капель 103 Р (НПФ

Люмэкс, Санкт-Петербург) с кварцевым капилляром диаметром 50 мкм, общей

длиной 75 см и эффективной длиной 65 cм. Детектирование осуществляли

спектрофотометрически при 254 нм в катодной области капилляра. Работу

27

проводили при комнатной температуре. В качестве ведущего электролита

использовали раствор натрия тетрабората десятиводного, применение которого

для анализа слабых кислот можно считать оптимальным. Выход ГК составил

3,64 ±0,25 %. А спектрофотометрический метод показал 6,93±0,45 % (n=5), что

соответствует требованиям ГФ Х, и существенно превышает результаты,

полученные методами ВЭЖХ и капиллярного электрофореза.

Определение содержания фенольных и флавоноидных соединений.

Изучение образцов солодки уральской (Glycyrrhiza uralensis Fisch.) и солодки

голой (Glycyrrhiza glabra L.) проводилось методом тонкослойной хроматографии

(ТСХ) [5]. При использовании пластинки "Силуфол УФ-254", "Сорбфил-ПТСХ-

П-А-УФ", системы растворителей хлороформ: метанол: вода (26:14:3) для

хроматографического анализа, ликуразид на хроматограмме обнаруживается в

виде доминирующего желтовато-оранжевого или желтого пятна с величиной Rf

около 0,5 [5].

Стандартная методика для определения флавоноидов с использованием

ТСХ (лабораторный комплекс «СAMAG») проводится на пластинах ПТСХ-АФ-

А-УФ «Sorbfil» в системе растворителей хлороформ: трет-бутилметиловый эфир:

муравьиная кислота (15:3:0,2). В качестве проявителя применяли 10 % раствор

H2SO4 в метаноле. Денсиметрическую обработку хроматограммы осуществляли

при длине волны 254 нм до и после проявления [5].

В работе [22] для определения общего содержания фенольных соединений

корня солодки был использован колориметрический метод Фолина-Чекальтеу.

Поглощение регистрировали при 760 нм с помощью спектрофотометра UV/VIS

Spectroscan 80 D. Общее содержание фенольных соединений в водных и

этанольных экстрактах составило соответственно 4,8 и 9,2 мг/100 мг сухого

экстракта. А для определения общего содержания флавоноидов был использован

спектрофотометрический метод с хлоридом железа согласно (Zhisben и др,

1999). при 510 нм. В качестве стандарта использовали катехин. Общее

содержание флавоноидов в обоих экстрактах составило 2,3 и 6,8 мг/ 100 мг

сухого экстракта соответственно. В работе [23] так же показано, что содержание

28

фенольных и флавоноидных соединений корня солодки, измеряемое

колориметрическим методом, составляет 40,5 % и 11,4 % от сухого веса,

соответственно.

В работе [21] для определения суммы фенольных соединении применялся

спектрофотометрический метод, основанный на их окислении в щелочной среде

реактивом Фолина-Чекальтеу. Содержание суммы фенольных соединений

составило 11.03 ± 0.16% от сухой массы сырья.

1.7 Биологические и фармакологические свойства веществ солодки

Биологическое и терапевтическое действие растительного сырья солодки

можно достигнуть путем получения либо суммарных экстрактов, либо

индивидуальных соединений – ГК, глицирритовой кислоты или их производных,

флавоноидных соединений или их препаратов, и высокомолекулярных

соединений (полисахаридов, пектинов). БАВ корня солодки обладают

минералокортикоидными, противовоспалительными; противоязвенными,

антиаллергическими, гепатопротекторными, антимикробными, антивирусными и

антидотными, противоопухолевыми и иммунотропными, гиполипидемическими,

антиоксидантными и другими свойствами [42, 43, 44, 45].

1.7.1 Биологическая активность глицирризиновой кислоты и её

производных

Агликон Гк проявляет минералокортикоидную, кортикостероидную,

противовоспалительную, и противоязвенную активность благодаря схожести со

структурой глюкокортикоидных гормонов коры надпочечников [46].

ГК является гепатопротектором [23]. Увеличение содержания гликогена

печени связано с механизмом антициррозного действия ГК [13].

Согласно [47, 48] ГК и её агликон являются мощными

гепатопротекторами. В ходе исследовании на печени крыс, установлено, что ГК

29

и глицирретовая кислота снижают АЛТ и АСТ в сыворотке крови, а также

снижают перекисное окисление печеночных липидов, вызванное

провоцирующим агентом.

В работе [49] определена АОА МСГК, показано, что концентрация,

необходимая для ингибирования 50 % ДФПГ-радикала, составила 2,18 мкг

(1822,34 мкг/мл), а глицирретовой кислоты 0,38 мм. В работе [50] при 500

мкг/мл концентрация, и степень ингибирования 50 % ДФПГ-радикала,

составляет 67,22 %, при значении концентрации, необходимой для

ингибирования 50 % ДФПГ радикала (IC50) 359,45 мкг /мл.

Проведённые исследования в работе [51] показали, что, ГК дозозависимо

снижает образование активных форм кислорода нейтрофилами при активации их

как форбол 12-миристат 13-ацетатом (ФМА). Методом флуоресценции

дихлордигидрофлуросцеина (DFC) показано, что непосредственное добавление

ГК в культуру нейронов приводит к снижению скорости образования свободных

радикалов и к повышению уровня, восстановленного глутатиона.

Биологические свойства экстрактов корня солодки, исследованы в работе

[52]. Автором было показано, что водный экстракт солодки проявляет

антибактериальную активность в отношении как грамположительных (St. aureus

и B. subtilis), так и грамотрицательных бактерий (E. coli). Причём подсчёт

общего микробного числа (ОМЧ) показал, что экстракт подавляет рост

грамотрицательных бактерий более чем на 90 %, а грамположительных бактерий

на 100 %. Автор связывает биологические свойства исследуемого экстракта

именно с содержанием в нём ГК.

Полученные Астафьевой [53] результаты подтверждены в [13, 54]. Они

показали, что глицирретинат натрия (содержащийся в солодке) и спиртовый

экстракт солодки проявляет антибактериальную активность в отношении

Salmonella typhimurium [54], Staphylococcus aureus, Mycobacterium tuberculosis,

Escherichia coli, Entamoeba histolytica Trichomonas vaqinalis [55], S. Mutans [56].

Как и Астафьева [52], Денисова [13] связывает антибактериальную активность

30

экстрактов солодки с содержащимися в них ГК, а также изофлавоноидами

(вероятно глабрану) [57] и ретрохалконами [58].

В работах [59, 60, 61] противомикробную активность комплекса ГК с

левомицетином, а также самой ГК и левомицетина исследовали in vivo на белых

мышах на влияние на золотистый стафилококк (Staphylococcus aureus),

кишечную палочку (Eschericichia coli), протей (Рroteus vulgaris) и синегнойную

палочку (Рseudomonasae ruginosa). Экстракт Glycyrrhiza glabra показал

различную антибактериальную активность (9-14 мм/20 мкл, зоны

ингибирования) против тестируемых бактериальных организмов. Использование

данного комплекса в отношении золотистого стафилококка, синегнойной

палочки, протея и кишечной палочки оказалось в 1,3-2,9 раз эффективнее, чем

сумма эффектов от применения ГК и левомицетина в отдельности. Таким

образом, комплекс ГК с левомицетином повышает резистентность мышей к

инфекциям, вызванным золотистый стафилококком, кишечной палочкой,

протеем и синегнойной палочкой, эффективнее левомицетина и ГК по

отдельности, а также стимулирует гуморальный и клеточный иммунитет.

Применение ГК в качестве транспортной молекулы позволит в разы

уменьшить терапевтические дозы антибиотиков, и тем самым уменьшить

побочные эффекты от их использования.

Интересно отметить, что антимикробная активность экстрактов корня

солодки выше активности экстрактов таких лекарственных растений, как

тысячелистника мелкоцветкового (соцветия) и цмина песчаного (соцветия) [62].

В меньшей степени исследованы фунгицидные свойства экстрактов

солодки и ГК. В работе [63] установлено, что соли ГК на 100 % ингибируют рост

Alternaria alternata, Aspergillus niger, Botritis cinerea, Fusarium oxysporum,

Monilia sp., Penicillum lividum и Trichoderma viridae при концентрации

100 мкг/мл.

Также ряд работ посвящён исследованию противовирусной активности ГК

и других компонентов экстрактов корня солодки. В работе [64] установлена

противовирусная активность глицирризина и глицирретовой кислоты по

31

отношению к вирусу ВИЧ. ГК и ее производные ингибируют размножение

вирусов Vaccinia, stomatitus [65], Herpes simplex [66], ветряной оспы [63],

гепатита А и В [64]. Лабораторные и клинические исследования показали, что

ГК и ее соли ингибируют вирус иммунодефицита человека, а так же проявляет

противовирусное действие на РНК и ДНК разных типов вирусов in vivo и in vitro

(Varicella Zoster; вирус простого герпеса типа 1 и 2; цитомегаловирус, различные

типы вируса папилломы человека, в том числе онкогенные), путём прерывания

репликации вирусов на ранних стадиях, что вызывает выход вириона из капсида,

тем самым, не допуская его проникновение в клетки и инактивирует указанные

вирусы в нетоксичных для нормально функционирующих клеток концентраций

мутантные штаммы вирусов [67-70, 44].

В работе [71] исследовали иммунную систему у мышей, OVA-индуцируя

аллергический ринит, показали, что глицирризин дозой (30 мг/кг) значительно

модулирует общий иммунитет у мышей.

Противовоспалительная активность [72] глицирризиновой кислоты

сочетается со стимулирующим влиянием на гуморальные и клеточные факторы

иммунитета плюс, что существенно тормозит синтез простагландинов клетками

соединительной ткани в зоне воспаления и выброс кинино. Регенерирующее

действие обусловлено улучшением репарации слизистых и кожи [73].

Ряд авторов [13, 48, 74] считают, что одним из основных свойств в

реализации противовоспалительного эффекта глицирризиновой кислоты

является угнетение продукции простагландина Е2 и лейкотриенов. А другие

считают, что противовоспалительное действие глицирризиновой и

глицирретовой кислот связано с их кортизолообразным эффектом, который

проявляется ингибированием фосфолипазы А2. Этот фермент расщепляет

липиды в клеточных мембранах, тем самым, начиная процесс накопления

провоспалительных простагландинов и лейкотриенов.

Противоязвенный механизм глицирризина [48] из экстракта солодки и

ряда ее производных (деглицирризиновая кислота) отличается от известных

антацидов (тагамет, зантак) тем, что вместо ингибирования выброса кислоты

32

препарат стимулирует нормальные защитные механизмы, которые

предотвращают образование язвы желудка и двенадцатиперстной кишки. Кроме

того, деглицирризиновая кислота улучшает как качество, так и количество

защитных веществ, которые оконтуривают желудочно-кишечный тракт,

увеличивают жизненный цикл кишечной клетки и улучшают кровоснабжение

слизистой кишечника [48].

Механизм отхаркивающего и противокашлевого действия препаратов

солодки связан с ее положительным влиянием на активность реснитчатого

эпителия трахеи и бронхов, усилением секреторной функции слизистого

эпителия верхних дыхательных путей и со способностью ее составных частей

вступать в реакцию омыления [5, 75, 76]. Известно, что ГК является

антагонистом гистамина и ацетилхолина, и этот эффект обусловливает ведущее

положение солодки среди средств антиаллергического действия [75, 77].

Некоторые производные ГК и Гк проявили свойства антагонистов Н1-

гистаминовых рецепторов, в связи с чем, они оказались эффективными при

лечении псориаза, экземы, крапивницы, бронхиальной астмы, аллергических

дерматозов [17, 42, 78].

В работе [77] показано, что Глицирам (глицирризинат аммония) в

эксперименте на животных повышает противоопухолевый и

противометастатический эффекты циклофосфана, снижая при этом его

токсическое действие на гемопоэтическую ткань. На моделях цитостатической

миелосупрессии, вызванных 5-фторурацилом или циклофосфаном, показано, что

глицирам при пероральном введении стимулирует восстановление

граноломоноцитарного и эритроцитарного ростков гемопоэза. Авторы

предлагают, что глицирам, имея в своей структуре две молекулы глюкуроновой

кислоты, обладает протекторным эффектом в отношении

гемопоэзиндуцирующего микроокружения, важным компонентом матрикса,

которого являются гликозаминогликаны, содержащие глюкуроновую кислоту

[77].

33

ГК и Гк, и их производные стимулируют выработку антител, которые

делают возможным их использования в качестве стимуляторов

неспецифического иммунитета [76].

1.7.2 Биологическая активность фенольных соединений, выделенных из

корня солодки

В работе [79], показано, что метанольный экстракт корня солодки голой,

содержащий сумму фенольных соединении и флавоноидов (протокатеховая

кислота, ванилиновая кислота, бензойная кислота, кверцетин, рутин,

нарингенин, ликвиритин, феруловая кислота, кумаровая кислота, коричная

кислота, мирицетин, кемпферол, апигенин, ликвиритигинин) обладает

противогрибковой активностью, сильно ингибируя рост Trichoderma и умеренно

ингибируя активность в отношении Fusarium.

Для АОА метанольного экстракта, значение IC50 = 64 мкг / мл, тогда, когда

для витамина С IC50= 17 мкг / мл. [79].

Содержащийся в солодке ликохалкон А проявляет активность против

паразитов, вызывающих инфекционную малярию [80] и лейшманиоз [81,82].

Обнаружена активность против СПИДа у ряда флавоноидных соединений:

ликохалкона А, изоликофлавонола, глицикумарина, ликопиранокумарина и др.

соединений [83]. Согласно [84] предложены лекарственные препараты,

содержащие флавоноиды и соли бария и висмута, соединения титана и циркония

для профилактики и лечения вирусных болезней, передаваемых половым путем

(СПИД, генитальный герпес, вирусная папиломма).

В работах [37, 85, 86], метанольный экстракт солодки, содержащий

glabrene, licoisoflavone, isolicoflavonol, gancaonin, подвергали скринингу против

12 тестируемых бактерий. Большинство организмов были признаны

чувствительными к экстракту. Показали значительную антимикробную

активность в отношении стафилококка с зоной торможения роста.

34

В работе [22] на основе проведённого опыта установлено, что

полифенолы сумма фенольных соединений, в том числе и флавоноиды корня

солодки делают ее мощным антиоксидантом. Поскольку их больше в

этанольном чем в водном экстракте, этанольный экстракт корня солодки был

признан более эффективным антиоксидантным средством.

В работе [87], было проведена оценка антибактериальных эффектов

фенольных соединении солодки, на Enterococcus faecium FN-1 устойчивых к

ванкомицину, предварительно культивированных на среде Мюллера-Хинтона

при 37 °С в аэробных условиях. В качестве стандартов использовали

антибактериальные препараты – эритромицин, норфлоксацин, ванкомицин,

линезолид, имипенем, тетрациклин, оксациллин и гентамицин. Исследование

показало, что фенольные соединения корня солодки являются сильным

антибактериальным средством против тестируемых штаммов E. faecium (MIC

8 мкг/мл) и E. faecalis (MIC 16 мкг/мл).

Флавоноиды корня солодки способны ингибировать процессы окисления

веществ липидной природы и проявляют антиокислительные свойства.

Антиоксидантные свойства флавоноидов образовывают комплексы с Fе+3 -

активаторами реакции свободно радикального окисления липидов и связаны со

способностью ингибировать липоксигеназу [13, 88].

Огромный интерес представляет АОА фенольных соединений корня

солодки. В работе [89], проведено определение АОА флавоноидов корня

солодки с применением DPPH-реактива. Показано, что концентрация

флавоноидов, необходимая для ингибирования 50 % ДФПГ-радикала, составила

100 мкг/мл.

Этанольный экстракт солодки (Glycyrrhiza glabra L) обладает мощной

антиоксидантной активностью благодаря высокому содержанию фенольного

компонента [90]. Антиоксидантная активность флавоноидов лакрицы более чем

в 100 раз выше, чем антиоксидантная активность витамина Е. Доза 2,58 мг / мл

флавоноидов лакрицы может эффективней очистить от свободных радикалов

(поглощение 20,6 %), чем 258 мг/мл витамина Е (поглощение 11,2 %). Таким

35

образом, экстракт лакрицы может быть использован для разработки

косметических продуктов для защиты кожи и волос от окислительного

повреждения [90].

В работе [91] показано, что наличие фенольных соединений в метанольном

экстракте солодки голой обеспечивает его антиоксидантную способность. С

помощью DPPH анализа установлено, что он является мощным

антиоксидантным агентом при концентрации фенольных соединений в нем

500 мкг/мл. Так IC50 для метанольного экстракта солодки голой составляет

359,45 мкг/мл, а для стандартного раствора аскорбиновой кислоты составляет

14,70 мкг/мл.

Флавоноиды корня солодки, обладают спазмолитическим действием,

действуя на гладкую мускулатуру, уменьшают ломкость капилляров путём

уменьшения их проницаемости.

Изучено антибактериальное действие флавоноидов, выделяемых из

экстракта солодки [92, 93]. Получен и изучен интересный комплекс кверцетина,

выделяемого из солодки, с фосфатидил-холином [94]. Сообщается о защитной

активности флавоноидов солодки при гепатотоксичности 4-х хлористого

углерода у мышей [95]. Нарингенин, который также выделяют из солодки,

является ингибитором диметилнитрозамина – индуктора повреждения печени у

крыс [95]. Глабрен, глаброзид и ликвиритин, входящие в состав корня солодки,

можно использовать для лечения меланизации кожи, а кемпферол, выделяемый

из надземной части солодки, предложен в качестве антимутагенного средства

для предотвращения мутаций, вызываемых при употреблении в пищу ряда

продуктов, содержащих циклические амины [96].

Изоликвиритигенин и его глюкозид in vitro обладают ингибирующим

эффектом на 12-О-тетрадеканоилфорбол-13-ацетат (ТРА) стимулятор 32Рi-

включения введенного фосфолипида НеLa клеток [95]. Есть данные об

ингибирующем эффекте изоликвиритигенина в сравнении с пироксикамом на

образование и карциногенез крипатофокуса кишечника мышей,

индуцированного азоксиметаном [95].

36

Изофлавоноиды и флаваноны, в том числе и из солодки обладают

выраженными гиполипидемическими свойствами [95].

Сообщается о различной ингибирующей активности invitro ряда

флавоноидов, солодки: нарингенина, рутина, кверцетина и др. по отношению

ротавирусной инфекции [73].

Влияние флавоноидов корня солодки на пролиферацию активированных

мононуклеарных клеток исследовалось в работе [97] in vitro. В диапазоне

концентраций 1-20 мкг/мл экстракты дозозависимо подавляли пролиферацию

мышиных спленоцитов, индуцированную Кон А in vitro. Следует отметить, что при

этом не наблюдалось зависимости антипролиферативного эффекта от

принадлежности [97].

Флавоноиды корня солодки угнетают функцию клеток-эффекторов

контактной чувствительности к 2,4-динитрофторбензолу, что опосредуется

регуляторными CD4+ лимфоцитами, а также повышением секреции

интерлейкинов 2-профиля (IL-4, IL-6, IL-10). Это позволяет свидетельствовать о

том, что иммуносупрессивый механизм действия флавоноидов корня солодки

основан на отрицательной регуляции иммунного ответа без цитотоксического

влияния на клетки-эффекторы [13,98].

В работе [99, 100] рассмотрено как флавоноиды корня солодки

(изофлавоны, халконы) (isoliquiritigenin) и (халкон А), дозозависимо угнетают

пролиферацию опухолевых клеток in vitro. При этом отмечено, что

антипролиферативный противоопухолевый эффект не имеет значимой видовой

(мышь/человек) или гистологической специфичности (раки /лейкозы/саркомы).

Флавоноиды вызывают апоптоз опухолевых клеток, не обладая прямой

цитотоксичностью, поэтому могут рассматриваться как перспективное решение

для профилактики развития раковых заболеваний [100]. Индукция апоптоза

может быть связана с остановкой опухолевых клеток в Сг/М-фазе клеточного

цикла. Комбинации флавоноидов корня солодки умеренно подавляют

пролиферацию резистентной к доксорубицину клеточной линии K-562/DOX,

также приводят к усилению противоопухолевого эффекта in vitro.

37

В работе [101] показано, что флавоноиды корня солодки – группа

ретрохалконы (ликохалкон A) (LCA) выделенные из корней китайского

лакричника, ингибируют in vitro рост штаммов Plasmodium falciparum у человека

(Dd2) в (3H) восприимчивых к хлорохину (3D7) и стойких к хлорохину. В

условиях эксперимента мышам, инфицированным P. yoelii, вводили ликохалкон

A перорально или внутрибрюшинной и в течение 3-6 дней он защищал мышей

от инфекции P. yoelii. Чтобы исследовать активность ликохалкона A на

различных стадиях развития малярии в крови, последний был внесен в культуры,

содержащие трофозоиты и шизонты. При этом было установлено, что

ликохалкон A являлся ингибитором на всех стадиях развития культур. Эти

результаты исследования свидетельствуют, что ликохалкон A, обладая мощной

противомалярийной активностью, может быть использован для создания

эффективного противомалярийного препарата.

1.7.3 Биологическая активность полисахаридов, выделенных из корня

солодки

Большой интерес из других БАВ солодки представляют

высокомолекулярные углеводородные соединения полисахариды и пектины,

которые выделяют из корней и травы.

Японские ученые из корней солодки уральской и солодки голой выделили

ряд фракций полисахаридов с противоопухолевой активностью. Затем у

полисахаридов солодки были обнаружены и иммуностимулирующие свойства

[96]. В работе [95] была установлена структура основного полисахарида корней

солодки уральской, который ответственнен за иммунологическую активность.

Он назван глицирризаном UA. Интересно сообщение об изучении

биологического эффекта неочищенных фракций полисахаридов, полученных из

корневых волосков и побегов солодки голой и уральской на активацию

макрофагов [95]. В сообщении [95] представляют основную структуру

38

глицирризана GA- полисахарида, выделяемого из столонов солодки голой и

показана его антикомплементарная и алкалинфосфатазная активность.

В работах [81,82] приводится биохимическая характеристика двух

выделенных полисахаридов, обладающих активностью по отношению к

ретикулоэндотелиальной системе, а также нового нейтрального полисахарида из

корней солодки уральской.

Сообщается о пектиновом полисахариде корней солодки уральской

рамногалактуронане II и о его вероятном вкладе в проявление митогенной и

антикомплементароной активности корней солодки [95].

В работе [102] показано, что водный экстракт (1 мг/мл) солодки

значительно ингибирует адгезию Helicobacter Pylori к ткани желудка человека.

Этот эффект связывают с действием именно полисахаридов корня солодки,

выделенных из экстракта.

В работе [103] был выделен и охарактеризован водорастворимый

полисахарид (GIP1) из корней солодки Inflata. Исследовалось

противоопухолевое влияние этого полисахарида на клеточной линии рака

полости рта SCC-25, а также изучен возможный механизм его действия.

Результат эксперимента показал, что этот водорастворимый полисахарид (50,

100, и 200 мкг / мл), снижает жизнеспособность SCC-25 клеток с помощью

индукции апоптоза.

В работе [104] с помощью гель-фильтрации и ВЭЖХ выделены из корней

солодки полисахаридные фракции (GR-2IIa и GR-2IIb), которые показали

наиболее сильную антикомплементарную активность.

1.7.4 Получение и применение лекарственных средств на основе корня

солодки

На основе корня солодки получают широкий ассортимент

фармацевтических препаратов, таких как экстракты солодки густой и сухой,

солодки сироп, элекасол, глицирам, ликвиритон, лавалон, флакарбин и другие.

39

Наши отечественные заводы выпускают фармацевтический препарат

сироп корня солодки и «Глицирам». Эти препараты используются для

профилактики и лечения многих заболеваний в качестве отхаркивающих,

противокашлевых, гепатопротекторных, противоязвенных,

капилляроукрепляющих и других средств.

Технология «Глицирама» была разработана сотрудниками пятигорского

фармацевтического института под руководством профессора И.А. Муравьева

[105]. Она заключается в экстракции корня солодки 0,25 % аммиаком.

Полученный экстракт высушивают и перерастворяют в воде (70-80 ºС) с

последующим осаждением глицирризиновой кислоты при добавлении

концентрированной серной кислоты (рН 1,0-1,5). После обработки этого осадка

ацетоном и добавления 25 % раствора аммиака получается триаммонийная соль

глицирризиновой кислоты, затем после обработки её ледяной уксусной кислотой

получается МСГК. Фармакопейный глицирам получают обработкой осадка

МСГК активированным углем. В конце его промывают этиловым спиртом и

сушат на вакуум-сушилке. Общий выход глицирама составляет 36,5 % от сухого

экстракта. Технология получения сиропа корня солодки на ОАО

«Татхимфармпрепараты» [106] заключается в процессе бисмацирации 0,25 %

водным раствором аммиака с модулем 1:5 в течение 48 ч, второй раз – с

троекратным количеством в течение 24 ч. Аммиак необходимо использовать для

того, чтобы перевести свободную глицирризиновую кислоту (плохо

растворимую в воде) имеющейся в корне, в легкорастворимую аммонийную

соль.

В экстрактах из солодкового корня Glycyrrhiza eglabra L., солодки

экстракте густом (Glycyrrhiza eextractum spissum) и солодки экстракте сухом

(Glycyrrhiza eextractum siccum) основными действующими веществами являются

ГК и фенольные соединения, эти суммарные препараты корней солодки имеют

высокую противовоспалительную, противоязвенную, гепатопротекторную

активность и антиаллергическое действие. На их основе готовят такие препараты

как глицирам, эликсир лакричника, сироп корня солодки.

40

В сиропе солодки (Glycyrrhizae sirupi), так же основными действующими

веществами являются ГК и фенольные соединения.

Сироп солодки состоит из (4 г) густого экстракта солодкового корня, (86 г)

сахарного сиропа, (10 г) спирта. Получается смесь желто-бурого цвета, с

приторно сладким вкусом и своеобразным запахом. Используют его в

педиатрии, в качестве отхаркивающего, для облегчения выделения мокроты при

острых и хронических воспалительных процессах, и как противовоспалительное

средство [5].

В эликсире грудном (Elixir pectoralis) основными действующими

веществами являются ГК и фенольные соединения. Состав препарата: экстракта

солодкового корня 60 частей, анисового масла 1 часть, раствора аммиака 10

частей, спирта этилового 49 частей, воды дистиллированной 180 частей. Он

представляет собой сладковатую на вкус жидкость бурого цвета, с запахом

анисового масла и аммиака. Применяют как отхаркивающее средство по 20-40

капель на прием [5].

Глицирам (Glycyramum). Основным действующим веществом является

аммониевая соль глицирризиновой кислоты, полученная из корней солодки,

умеренно стимулирует кору надпочечников, тем самим оказывает

противовоспалительное и антиаллергическое действие. Его назначают для

лечения аллергических дерматитах, экземе, и бронхиальной астме, у детей в

меньших дозах 0,2-0,6 г/сутки улучшаются функциональные показатели

проходимости дыхательных путей. Выпускается в упаковках по 50 штук,

таблетки массой по 0,05 г. Способ применения внутрь 2-4 раза в день, по 0,05-0,1

г за 30 мин до еды. Побочных явлений при применении препаратов солодки не

выявлено [107-109].

В Стронгер Нео-Минофаген С (Strongerneo-minophagen С) основным

действующим веществом является ГК в сочетании с глицином и L-цистином,

применяется в Японии, для лечения заболеваний печени, в виде внутривенных

инъекций [13].

41

Фосфоглив (Phosphogliv) – отечественный гепатопротекторный препарат,

который состоит из соли ГК и полиненасыщенного фосфатидилхолина, не

уступающий известному препарату «Эссенциале» по эффективному

воздействию. Основным действующим веществом является ГК. [110, 111].

Рувимин (Ruvemine) – содержит 80 % ГК, который по некоторым

показаниям превышает гепатопротекторное действие эсенциале [112, 113].

Флакарбин (Flacarbinum) в качестве основных действующих веществ

содержит флавоноиды. Это препарат на основе флавоноидов корня солодки,

содержит в 100 г 2 г кверцетина и ликуразида, 76 г глюкозы, 10 г пектина и

натрий карбоксиметилцеллюлозы [114]. Назначают его для больных язвенной

болезнью двенадцатиперстной кишки и желудка, а также как

капилляроукрепляющее, противовоспалительное и спазмолитическое средство.

Принимается 3 раза в день, во внутрь по 1/2 чайной ложки гранул перед едой.

Форма выпуска, гранулы во флаконах зеленовато-желтого цвета.

Ликвиритон (Liquiritonum) – содержит сумму флавоноидов из корней

солодки голой. Основными действующими веществами являются флавоноиды.

Его принимают, при обострении и для профилактики язвенной болезни желудка

и двенадцатиперстной кишки, хронических гастритах и как регенератор

слизистой оболочки желудка. В качестве спазмолитического,

противовоспалительного и антисекреторного. Препарат хорошо переносится

больным. Выпускают в таблетках по 0,1 г, назначают внутрь 3-4 раза в день, по

0,1-0,2 г за 20-30 мин до еды в течение 4-5 недель [115]. Выпускают в таблетках

по 0,1 в упаковке по 25 штук [115-117].

Лавалон (Lavalonum) – представляет собой комплексный препарат, в

состав которого входит смесь халконовых гликозидов из корней солодки голой и

эфирное масло лаванды. Основными действующими веществами являются

флавоноиды. Назначают для лечения язвы желудка и 12-и перстной кишки, а

также для лечения воспаления печени и желчевыводящих путей. Лавалон

выпускался в мягких капсулах и таблетках, но был снят с производства [23].

42

Глидеринина-мазь (Unguentum Glyderinini) – 1 % и 2 % глидеринин (18-

дегидроглицирретовая кислота, выделенная из экстракта корней солодки) в

качестве основного действующего вещества содержит ГК. Применяют как

противовоспалительное и антиаллергическое средство. Используют при

нейродермитах, аллергических дерматитах, экземах [23].

Проведеный анализ литературных данных по изучению сырья и шрота

корня солодки показал, что корень солодки очень широко исследован, однако,

данных по химическому составу шрота корня солодки – отхода

фармацевтического производства – и методов извлечения из него конкретных

веществ в литературе не обнаружено. Богатый химический состав этого

растительного сырья, высокая биологическая активность и терапевтическая

эфективность его компонентов, показанные в литературном обзоре, делают

перспективным проведение исследования химического состава шрота корня

солодки, разработку способов извлечения его активных компанентов и

выделение из него фракции, обладающей биологической активностью [118]

43

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1 Объекты исследования и материалы, использованные в работе

Объектами исследования в работе являются:

1. Корень солодки, измельчённый. Производитель ОАО

«Красногорсклексредства», 04.2016, серия 151115, г. Красногорск, мкр. Опалиха,

ул. Мира, 25.

2. Корень солодки, измельчённый, производитель ОАО

«Красногорсклексредства», 09.2014, серия 90914, г. Красногорск, мкр. Опалиха,

ул. Мира, 25.

3. Шрот корня солодки – отход производства лекарственного средства

«Сироп корня солодки» на ОАО «Татхимфармпрепараты». Дата выработки шрота

18.12.2012 г. Шрот высушен в соответствии с инструкцией по заготовке и сушке

[119]. Шрот также измельчали с получением двух различающихся по морфологии

фракций: 1 – преимущественно тонкие волокна, 2 – тонкодисперсный порошок с

размером частиц менее 1 мм. Микроскопический анализ шрота и его фракций

провели по методике, описанной в п. 2.2.17. Полученные результаты

представлены на рисунке 3.5.

2.1.1 Физико-химические свойства сырья и шрота корня солодки

Определение влажности, зольности, содержания сырого протеина, сырой

клетчатки и сырого жира в сырье, шроте и его фракциях проводили по методикам,

описанных в п. 2.2.1. Протоколы анализа представлены в приложении А на

рисунках А1, А2 и А3. Полученные данные приведены в таблице 3.1.

44

2.1.2 Способ получения водно-аммиачного экстракта из сырья или шрота

корня солодки

Сырье или шрот корня солодки с размером частиц менее 2 мм

экстрагировали 0,25 % водным раствором гидроксида аммония [119] в

соотношении сырье:экстрагент 1:50 в течение 2 ч. В экстрактах определяли

содержание ЭВ, содержание ГК, углеводов, простых фенолов, белков по

стандартным методикам, описанным в п. 2.2.2, 2.2.11, 2.2.3, 2.2.7, 2.2.8

соответственно. Полученные результаты приведены в таблице 3.5. Анализ

качественного состава водоаммиачного экстракта, в том числе количественное

определение в них ГК, провели методом инструментальной ТСХ на лабораторном

комплексе «СAMAG» по методике, описанной в п. 2.2.14. Полученные

хроматограммы экстрактов представлены на рисунке 3.2, результаты их

обработки сведены в таблицах 3.5 и 3.6. Протоколы анализа приведены в

приложении Б на рисунке Б1.

2.1.3 Способ получения ацетонового экстракта из сырья или шрота корня

солодки

Сырье или шрот корня солодки с размером частиц менее 2 мм

экстрагировали ацетоном, подкисленным азотной кислотой [119] в соотношении

1:50 кипячением в течение 2 ч. Кратность экстракции 3 стадии,

продолжительность стадии – 0,5 ч. В полученных экстрактах определяли

содержание ЭВ, ГК, сумму углеводов, простых фенолов, простых сахаров, по

стандартным методикам, описанным в п. 2.2.2, 2.2.11, 2.2.3 2.2.7, 2.2.4

соответственно. Полученные результаты приведены в таблице 3.5. Анализ

качественного состава экстракта, в том числе количественное определение в нём

ГК, провели методом инструментальной ТСХ на лабораторном комплексе

«СAMAG» по методике, описанной в п. 2.2.14, Полученные хроматограммы

45

экстрактов представлены на рисунке 3.2, результаты их обработки сведены в

таблицы 3.5 и 3.6. Протоколы анализа приведены в приложении Б на рисунке Б1.

2.1.4 Способ получения этанольного экстракта из сырья или шрота корня

солодки

Способ 1. Сырье и шрот корня солодки с размером частиц 2-7 мм

экстрагировали 40 %, 70 %, 80 % и 96 % раствором этанола, при кипячении в

соотношении 1:40 в течение 2 ч. Кратность экстракции – 1, 3 стадии. В

полученных экстрактах определяли содержание ЭВ, ГК, углеводов и

флавоноидов, по стандартным методикам, описанным в п. 2.2.2, 2.2.11, 2.2.3 и

2.2.12 соответственно. Полученные результаты приведены в таблицах 3.7.

Способ 2. Шрот корня солодки с размером частиц менее 2 мм (фракция 2)

экстрагировали 80 % раствором этанола кипячением в течение 1, 2 ч. Кратность

экстракции – 1, 3 стадий. Использовали соотношения шрот: экстрагент – 1:40,

1:50, 1:60, 1:80, 1:100. В полученных экстрактах определяли содержание ЭВ по

стандартным методикам, описанных в п. 2.2.2. Полученные результаты

приведены в таблице 3.9.

Анализ качественного состава экстрактов, полученных способом 1 и 2, в том

числе количественное определение в них ГК, провели методом инструментальной

ТСХ на лабораторном комплексе «СAMAG» по методике, описанной в п. 2.2.14, с

использованием системы растворителей № 1, проявителя № 1. Полученные

хроматограммы экстрактов представлены на рисунке 3.3 и 3.6. Протоколы

анализа приведены в приложении Б на рисунках Б2 и Б3, результаты их обработки

сведены в таблицы 3.8 и 3.12.

2.1.5 Определение углеводов в шроте

Навеску измельченного шрота массой 5 г переносили в круглодонную

колбу, приливали 200 мл 80 % раствора этанола. Колбу соединяли с обратным

46

холодильником и нагревали на водяной бане в течение 30 мин. Далее содержимое

колбы охлаждали и фильтровали. В полученном экстракте (проба 1) определяли

содержание ЭВ, сумму углеводов, простых сахаров, и проводили анализа состава

углеводов методом ВЭЖХ по методикам согласно п. 2.2.2, 2.2.3, 2.2.4, 2.2.15

соответственно. Данные приведены в таблице 3.2 и 3.3, и (в приложении В) на

рисунках В1, В2 и В3.

Остаток шрота после спиртовой экстракции возвращали в колбу, приливали

50 мл дистиллированной воды. Колбу соединяли с обратным холодильником и

нагревали на водяной бане при температуре 45 ºС в течение 1 ч. Далее

содержимое колбы охлаждали и фильтровали. Полученный водный экстракт

доводили до объема 100 мл дистиллированной водой (проба 2) и определяли в

нем содержание ЭВ, сумму углеводов, простых сахаров, водорастворимого

пектина и крахмала по методикам согласно п. 2.2.2, 2.2.3, 2.2.4, 2.2.5, 2.2.6

соответственно. Данные приведены в таблице 3.2.

Остаток шрота после отделения водного экстракта снова возвращали в

круглодонную колбу, приливали 50 мл 0,05 н раствора соляной кислоты. Колбу

соединяли с обратным холодильником и нагревали при 80 ºС в течение 30 мин.

Далее содержимое колбы охлаждали и фильтровали. Остаток шрота возвращали в

круглодонную колбу, наливали 30 мл 1 % раствора лимоннокислого аммония.

Колбу соединяли с обратным холодильником и нагревали на водяной бане в

течение 1 ч. Далее содержимое колбы охлаждали и фильтровали. Полученные

экстракты объединяли – проба 3. Определяли в ней содержание ЭВ, сумму

углеводов, простых сахаров, пектина и крахмала по методикам согласно п. 2.2.2,

2.2.3, 2.2.4, 2.2.5 и 2.2.6 соответственно. Полученные результаты представлены в

таблице 3.2.

При хранении пробы 3 в течение суток наблюдали выпадение осадка. Его

отделяли путем фильтрования. Проведена качественная реакция осадка с

раствором йода. Осадок исследован с помощью ИК-спектроскопии по методике,

описанной в п. 2.2.13. ИК-спектр приведен на рисунке 3.1.

47

2.1.6 Разделение экстрактивных веществ этанольного экстракта

из шрота (фракции 2)

20 г шрота (фракция 2 с размером частиц менее 2 мм), экстрагировали 80 %

этанолом при кипячении в течение 2 ч., соотношение фракция 2: экстрагент 1:40.

Полученный этанольный экстракт концентрировали на роторном испарителе

«IKA» до объёма 200 мл, с последующим центрифугированием, в течение 10 мин

при 3000 об/мин. В результате получили фракцию Ι (супернантант 1,5478 г) и

фракцию ΙΙ (осадок 0,7971 г). Разделение полученных фракций проводили по

схеме, представленной на рисунке 3.7.

Проведен качественный анализ полученных фракций при помощи

инструментального метода тонкослойной хроматографии на лабораторном

комплексе «CAMAG» (Щвейцария) по методике, описанной в п. 2.2.14. Для

фракций VII, XI XIX, XIII и XXI использовали систему растворителей – 2, а для

фракций XV, XXIII и VIII систему растворителей – 3. Для дериватизации

использовали проявители – 1, 2, 3. Полученные хроматограммы фракций

представлены на рисунках 3.9 и 3.10. Протоколы анализа приведены на рисунке

Б4 (Приложение Б), а результаты их обработки сведены в таблицах Б5-Б12

(Приложение Б).

Оценку антиоксидантной активности исходного этанольного экстракта и

фракций, полученных после их разделения, шрота (фракция 2) проводили с

помощью реактива – 0,2 мМ раствором ДФПГ (2,2-дифенил-1-

пикрилгидразилом), по методике, описанной в п. 2.2.18. Полученные результаты

представлены в таблице 3.16 и в (приложении Г, таблица Г1 и рисунок Г1).

Состав веществ фракции VII анализировали методом хромато-масс-

спектрометрии (ГХ/МС), по методике, описанной в п. 2.2.16. Полученные данные

представлены в таблице 3.17 и на рисунке Д1 (Приложение Д).

Проведено определение антимикробной активности этанольного экстракта

шрота, фракций VII иVIII по отношению к тест-культуре Staphylococcus aureus по

48

методике, описанной в п. 2.2.19. Полученные результаты представлены в таблице

3.18 и на рисунке 3.11.

Проведено определение антимутагенной активности по тесту Эймса в

отношении Salmonella typhimurium ТА 100 и Salmonella typhimurium ТА 98

фракций VIII и XXI по методике, описанной в п. 2.2.20. Полученные результаты

представлены в таблице 3.19.

2.2 Общие методы анализа

2.2.1 Определение физико-химических показателей

Определение влажности, зольности, сырого протеина, сырой клетчатки и

сырого жира (веществ, экстрагируемых петролейным эфиром) в объектах

исследования проводили по [119, 120-124].

2.2.2 Определение экстрактивных веществ

Определение экстрактивных веществ в объекте исследования проводили по

стандартной методике [119].

2.2.3 Определение суммы углеводов антроновым методом

Количественное определение углеводов в объекте исследования проводили

антроновым методом [125].

Объект исследования разбавляли дистиллированной водой в соотношениях

1:30 и к 1 мл этого раствора добавляли 3 мл антронового реактива. Содержимое

пробирок перемешивали и ставили на кипящую водяную баню с температурой 95-

100 °С на 7 мин. Затем пробирки охлаждали до 20 °С и определяли оптическую

плотность на спектрофотометре «UNICO UV/VIS 2800» при длине волны равной

49

590 нм против контрольной пробы. Калибровочную кривую строили по растворам

глюкозы (10-100 мкг/мл).

Содержание суммы углеводов в объектах исследования рассчитывали по

уравнению

Y=0,0051X,

где Y – оптическая плотность,

X – концентрация суммы углеводов, мкг/мл.

2.2.4 Определение простых сахаров

Количественное определение простых сахаров в объекте исследования

проводили йодометрическим методом [125].

По результатам титрования 0,01 н раствором тиосульфата натрия

рассчитывали количество простых сахаров Х, %, по формуле

X = (A× [248 – (a – b)])/(v×n×10000),

где Х – количество восстанавливающих сахаров, %;

А – общий объем исследуемого раствора, мл;

v – объем исследуемого раствора, взятого для анализа, мл;

а – объем 0,01 н раствора тиосульфата натрия, затраченного при титровании

контрольного раствора, мл;

b – объем 0,001 н раствора тиосульфата натрия, затраченного при

титровании исследуемого раствора, мл;

n – навеска исследуемого шрота, г;

[248 – (a – b)] – количество инвертного сахара, соответствующее 1 мл 0,001

н раствора тиосульфата натрия, мкг;

50

10000 – коэффициент для перевода микрограммов в граммы и пересчета

результата в проценты.

2.2.5 Определение пектина

Количественное определение пектина в объектах исследования проводили

титриметрическом методом [126].

2.2.6 Определение крахмала йодометрическим методом

Количественное определение крахмала в объектах исследования

осуществляли йодометрическим методом [125]. Объект исследования разбавляли

дистиллированной водой в соотношениях 1:20 и к 10 мл этого раствора добавляли

1 мл раствора йода. Содержимое пробирок перемешивали и измеряли оптическую

плотность на спектрофотометре «UNICO VV/VIS 2000» при длине волны 450 нм

против контрольной пробы. Калибровочную кривую строили по растворам

крахмала (10-50 мкг/мл). Содержание крахмала в объектах исследования

рассчитывают по уравнению калибровочной кривой

Y=2,405Х+0,0175,

где Y – оптическая плотность,

X – концентрация крахмала, мкг/мл.

2.2.7 Определение простых фенолов

Количественное определение простых фенолов в объекте исследования

проводили фотометрическим методом с применением 4-аминоантипирина [127].

Объект исследования разбавляли дистиллированной водой в соотношении

1:10 и к 2,5 мл этого раствора прибавляли 2 мл 0,066 М раствора

51

гидроортофосфата натрия, одну каплю 2 % раствора 4-аминоантипирина и 0,5 мл

1 % раствора гексоцианоферрата (III) калия. Через 5 мин измеряли оптическую

плотность на спектрофотометре «UNICO UV/VIS 2800» при длине волны 500 нм

против контрольной пробы. Калибровочную кривую строили по растворам

фенола (1-10 мкг/мл). Содержание простых фенолов в объектах исследования

рассчитывали по уравнению

Y=0,0598Х+0,0009,

где Y – оптическая плотность,

X – концентрация простых фенолов, мкг/мл.

2.2.8 Определение белка по методу Флореса

Объект исследования разбавляли дистиллированной водой в соотношении

1:10. К 1 мл исследуемого раствора прибавляли 9 мл раствора бромфенолового

синего [128], выдерживали при комнатной температуре 30 мин. Оптическую

плотность измеряли на спектрофотометре «UNICO UV/VIS 2800» при длине

волны 610 нм против контрольной пробы. Калибровочную кривую строили по

растворам альбумина (0,01-0,08 мг/мл). Количественное определение содержания

белков в объектах исследования рассчитывали по формуле

Y = 0,445X,

где Y – оптическая плотность,

X – концентрация белка, мг/мл.

2.2.9 Определение аминокислот нингидриновым методом

Метод основан на образовании окрашенного раствора в сине-фиолетовый

цвет комплекса аминокислот с нингидрином [128]. В пробирку с 0,5 мл объекта

52

анализа (или контроля) приливают 0,5 мл ацетатного буфера (4 М, рН=5,5) и 1 мл

4 % раствора нингидрина в метилцеллюлозе. Тщательно перемешивали и

помещали на 20 мин в кипящую водяную баню для развития окраски. Затем

добавляли 5 мл 50 % раствора изопропанола, снова тщательно перемешивали.

Оптическую плотность измеряли на спектрофотометре при длине волны 540 нм

против контроля. Калибровочный график строили по растворам глицина

(1-10 мкг/мл).

2.2.10 Определение лигнина

Определение содержания лигнина в объекте иследования проводили по

[125]. Навеску измельченного сырья массой 0,5 г тщательно смешивали с 6 мл 37

% раствора формалина в стакане на 100 мл, прибавляли 6 мл 72 % раствора

серной кислоты, затем 8 мл концентрированной серной кислоты и оставляли на 24

ч при периодическом помешивании. После этого к раствору добавляли 35 мл

смеси ледяной уксусной кислоты и хлороформа в соотношении 6:1 и после

взбалтывания содержимое стакана медленно переливали в стакан на 600 мл, в

котором было 400 мл воды. Хлороформ удаляли, нагревая на водяной бане 20

мин, и давали отстояться осадку в течении 24 ч. Лигнин собирали во взвешенный

набитый стеклянной ватой стеклянный фильтр № 2. Далее, после промывки

лигнина 5 % раствором соляной кислоты и водой, стеклянные тигли высушивали

до постоянного веса при 105 ºС и после охлаждения взвешивали. Содержание

лигнина х, %, определяли по формуле

х=((в1-в) *100)/н,

где в – вес сухого (без осадка) тигля, г;

в1 – вес тигля с сухим осадком, г;

н – навеска, г.

53

2.2.11 Определение глицирризиновой кислоты

Количественное определение ГК в объектах исследования проводили

гравиметрическим методом в сочетании с титрованием по ФС 42-2614-96 [118], а

также методом инструментальной тонкослойной хроматографии на лабораторном

комплексе «СAMAG» по следующей методике. На линию старта пластинки

«Sorbfil» ПТСХ-АФ-А-УФ аппликатор автоматически наносит заданный объем

объекта исследования и затем рядом 0,01 % раствора стандарта ГК (С30Н46О4,

«ACROS ORGANICS», CAS 53956-04-0). Пластинку с нанесенными пробами

помещают в автоматическую камеру для элюирования хроматограммы в системах

растворителей: этилацетат – муравьиная кислота – уксусная кислота – вода

(15:1:1:2). В качестве проявителя применяли 10 % раствор H2SO4 в метаноле.

Денсиметрическую обработку хроматограммы осуществляли при длине волны

254 нм до и после проявления. Содержание ГК рассчитывали по площади пятна

на хроматограмме с применением градуировочного графика, построенного

площади пятен, соответсвующих 0,05-0,10 мкг стандарта ГК.

2.2.12 Определение флавоноидов

Определение содержания флавоноидов в объектах исследования проводили

спектрофотометрическим методом согласно [129]. Для этого готовили следующие

растворы:

- раствор сравнения – 1 мл экстракт вносили в мерную колбу вместимостью

25 мл и доводили объем 96 % этиловым спиртом до метки;

- опытный раствор – 1 мл экстракта вносили в мерную колбу вместимостью

25 мл, прибавляли 2 мл 2 % спиртового раствора хлорида алюминия и доводили

объем раствора до метки объем 96 % этиловым спиртом;

- раствор ликвиритигенина – 0,005 г (точная навеска) ликвиритигенина

растворяли в мерной колбе вместимостью 10 мл в 2 мл 95 % спирта. Доводили

объем раствора до метки 95 % спиртом и перемешивали (раствор А).

54

В мерную колбу емкостью 25 мл помещали 1 мл раствора А, добавляли 2 мл

2 % раствора алюминия хлорида и перемешивали (раствор Б). Параллельно

готовили раствор сравнения без добавления алюминия хлорида. Срок годности

растворов 1 месяц

Далее измеряли оптическую плотность растворов на спектрофотометре при

длине волны 420 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм против раствора сравнения.

Параллельно измеряли оптическую плотность раствора Б ликвиритигенина на

фоне раствора Б данного стандарта.

Таблица 2.1 – Данные оптической плотности раствора ликвиритигенина Объект Разведение D Dср

Раствор ливиритигенина 1:25

0,030

0,025 0,020

0,025

Содержание флавоноидов в пересчете на ликвиритигенин рассчитывали по

формуле

где Х – содержание флавоноидов в пересчете на ликвиритигенин, %;

D – оптическая плотность исследуемого раствора (Б) при длине волны 420

нм;

Do – оптическая плотность раствора ликвиритигенина (Б) при длине волны

420 нм;

m – масса сырья, г;

mo – масса ликвиритигенина г;

V – объем экстракта исследуемого объекта, мл;

Vo – объем раствора ликвиритигенина, мл;

V1 – объем экстракта объекта исследования, взятого на анализ, мл;

V2 – объем раствора ликвиритигенина, взятого на анализ, мл;

55

2.2.13 ИК спектроскопия

ИК-спектры образцов снимали в таблетках с KBr на спектрофотометре

«IRPrestigе - 21» с Фурье преобразованием фирмы «Shimadzu» в области 4000-400

см-1.

2.2.14 Качественный анализ объектов исследования методом

инструментальной тонкослойной хроматографии

Качественного анализ объектов исследования проводили методом

инструментальной тонкослойной хроматографии (лабораторный комплекс

«СAMAG») на пластинах «Sorbfil» ПТСХ-АФ-А-УФ в следующих системах

растворителей: 1 – этилацетат : муравьиная кислота : уксусная кислота : вода

(15:1: 1: 2); 2 – гексан : ацетон (6:4); 3 – хлороформ : метанол : вода (26:14:3).

Применяли следующий проявители: 1 – 10 % раствор серной кислоты в

метаноле; 2 – 3 % раствор хлорида алюминия в этаноле; 3 – 5 % раствор

карбоната натрия. В качестве стандартов использовали растворы ГК и

ликвиритигенина. Денсиметрическую обработку хроматограммы осуществляли

при длине волны 254 нм, 354 нм и при видимом свете до и после проявления

[130].

2.2.15 Высокоэффективная жидкостная хроматография

Исследование ВЭЖХ углеводов в этанольном экстракте, осуществляли на

ВЭЖХ-хроматографе серии LC-20 prominence «Shimadzu, Япония», колонка

Zorbax «Agilent Technologies», длина 250 мм, диаметр 4,6 мм, с зернением 5 мкм;

подвижная фаза: смесь ацетонитрил - вода в соотношении 85:15, скорость потока

1,8 мл/мин, температура колонки 35 ºС. Рабочая длина волны 190 нм. В качестве

стандартов использовались растворы рамнозы, ксилозы, арабинозы, фруктозы,

маннозы, глюкозы, галактозы, сахарозы и мальтозы.

56

2.2.16 Хромато-масс-спектрометрический анализ

ГХ/МC-исследование проводилось на приборе «PEClarus 680 SQ-8».

Температурная программа термостата. Начальная температура 100 °С – изотерма

5 минут. Нагрев со 100 °С до 280 °С со скоростью 4 °С/мин. Изотерма на 280 °С –

10 минут. Температура инжектора – 280°С. Колонка ELITE-5MS: длина – 30 м;

диаметр – 0,25 мм; толщина фазы – 0,25 мкм. Поток 1 мл/мин, деление потока 10

мл/мин, режим вакуумной компенсации. Параметры детектора: Температура

источника 290 °С, температура трансферной линии 280 °С. Ионизация

электронным ударом 70 эВ. Параметры детектирования: с 0 по 3 минуту

выключенный источник. С 3 по 60 минуту включенный источник в режиме

общего тока с 50 m/z по 500 m/z. Идентификацию компонентов проводили с

использованием библиотеки масс-спектров NIST-11 [131].

2.2.17 Микроскопический анализ

Подготовку объектов осуществляли путем холодного размачивания [9].

Объекты выдерживали для набухания в воде в течение 1 ч, затем переносили в

смесь глицерина со спиртом в соотношении 1:1 и настаивали в течение 5 сут.

Размоченные объекты выравнивали скальпелем для придания соответствующего

направления и затем приготавливали срезы при помощи бритвы. Сначала срезали

более толстые, но цельные ломтики, затем делали срезы тонкие и более мелкие.

Полученные срезы помещали на предметное стекло. Измельченные объекты

после размачивания сразу наносили на предметные стекла и исследовали на

видеомикроскопе «MC 100 (LDC)» при увеличениях 4х, 10х.

Для изучения химического состава объекта проводили качественные

реакции с применением специфических реактивов [9]:

- раствор Люголя – крахмал окрашивается в синий цвет, а целлюлоза в

желтый;

57

- 80 % раствор серной кислоты – клетки и ткани, содержащие ГК,

окрашиваются в оранжево-красный цвет;

- 1 % раствор хлорида железа – клетки, ткани, содержащие флавоноиды,

окрашиваются в черно-синий или черно-зеленый цвет.

2.2.18 Определение антиоксидантной активности

Определение антиоксидантной активности проводили с применением

реактива 0,2 мМ раствором ДФПГ на многорежимном ридере «TECAN infinite M

200 Pro» микропланшетным методом [132,133].

Опытный раствор готовили, приливая к 100 мкл исследуемого раствора

различных концентраций 100 мкл метанола и 100 мкл реактива ДФПГ.

Контрольный образец содержал 100 мл метанола и 100 мкл реактива ДФПГ. Для

вычета окраски самого исследуемого раствора готовили холостую пробу, которая

состояла из 100 мкл исследуемого раствора различных концентраций и 100 мкл

метанола. После проводили измерение оптической плотности при 517 нм во всех

лунках микропланшета.

Процент ингибирования I (%) определяли по формуле

I = ((Ак - Ао)/Ак) × 100,

где Ак – разность между оптической плотности контрольного образца и

оптической плотности метанола;

Ао – разность между оптической плотности опытного образца и оптической

плотности холостой пробы

2.2.19 Определение антимикробной активности объектов исследования

Исследование проводили методом диффузии в агар с использованием

дисков по отношению к тест-культуре Staphylococcus aureus ATCC® 29213™.

58

Активацию культуры осуществляли согласно инструкции, указанной в её

паспорте (приложение Е) [134]. На поверхность агаризованной среды Мюллера-

Хинтона делали посев микробной культуры штрихом, укладывали стерильные

бумажные диски, на которые наносили испытуемые растворы. Также, для

сравнения полученных результатов использовали диски со стандартным образцом

гентамицина. Чашки помещали в термостат и через 18 ч осматривали, отмечая

зоны задержки роста микробной культуры.

2.2.20 Определение антимутагенной активности объектов исследования.

Исследование антимутагенной активности проводили методом Эймса на

тестерных культурах Salmonella typhimurium ТА 100 и Salmonella typhimurium ТА

98 согласно [135].

Перед проведением анализа тестерную культуру активировали. Для этого её

переносили в 5 мл LB-бульона, содержащего ампициллин в концентрации

25 мкг/мл, и инкубировали при 37 ºС в течение 12-15 ч. Затем 5 мл полученной

культуры переносили в 20 мл свежего LВ-бульона с ампициллином (25 мкг/мл) и

инкубировали с принудительной аэрацией при 37 ºС в течение 2-2,5 ч.

Полученную культуру центрифугировали, осадок ресуспендировали и

использовали при проведении анализа.

Перед проведением анализа готовили растворы исследуемых препаратов в

стерильной дистиллированной воде или диметилсульфоксиде.

Для проведения анализа в стерильные чашки Петри вносили агар с

микродобавками биотина и гистидина, добавляли 0,1 мл бактериальной суспензии

и 0,1 мл раствора исследуемого соединения. Чашки термостатировали при 37 ºС.

Учет результатов проводили по индукции обратных мутаций к гистидиновой

прототрофности через 48 ч. инкубации. Сравнивали число колоний-ревертантов,

выросших при действии исследуемого соединения и в негативном контроле по

формулам:

59

Выживаемость = (число колоний в опыте/ число колоний в контроле) ×100 %

Мутагенный потенциал = число His+ ревертантов в опытном вариатне / число

His+ ревертантов в негативном контроле

Антимутагенный эффект (%) = [1 – (Т – К)/(М – К)] ×100 %,

где М – число His+ ревертантов в положительном контроле;

Т – число His+ ревертантов в опытном варианте (в присутствии

объекта исследования и мутагена);

К – число колоний His+ ревертантов в негативном контроле.

2.2.21 Статистическая обработка результатов

Обработку экспериментальных данных проводили с использованием

программного обеспечения «Statistica 6.0».

60

ГЛАВА 3. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

3.1 Физико-химические свойства сырья и шрота корня солодки

Сырье корня солодки экстрагируют водно-аммиачным раствором на ОАО

«Татхимфармпрепараты» при получении сиропа корня солодки. Шрот,

получаемый в ходе технологической переработки корня солодки, имеет высокую

влажность, что ограничивает его дальнейшее использование. В связи с этим всю

партию шрота корня солодки, полученную на ОАО «Татхимфармпрепараты»,

подвергали сушке при температуре (40±5) ºС [136]. После высушивания для

анализа была сформирована средняя проба шрота согласно требованиям [119].

Проведено определение БАВ в шроте в сравнении с исходным сырьем.

Полученные результаты анализа приведены в таблице 3.1.

Таблица 3.1 – Химический состав сырья и шрота корня солодки (n=3-5, P=0,95)

Массовая доля веществ Содержание, % в

Сырье Шроте

Глицирризиновой кислоты 6,80* 2,76±0,14

Веществ, экстрагируемых петролейным эфиром 1,40±0,02 1,66±0,11

Веществ, экстрагируемых диэтиловым эфиром 8,34±0,01 5,17±0,02

Веществ, экстрагируемых водно-аммиачным

раствором 35,6* 22,9±0,40

Сырого протеина 12,33±0,95 12,36±0,94

Сырой клетчатки 24,56±0,12 31,69±0,08

Лигнина 21,4 [118] 11,64±0,73

Минеральных веществ 6,86* 3,49±0,02

Влаги 3,75±0,20 5,30±0,10

* - данные из протокола испытания корня солодки на ОАО

«Татхимфармпрепараты» (приложение А)

Таким образом, установлено, что из шрота можно извлечь еще около 41 %

глицирризиновой кислоты. Он богат веществами, экстрагируемыми

61

петролейным и диэтиловым эфиром, которые в основном представлены

липофильными и простыми фенольными соединениями. Как из сырья, так и из

шрота 0,25 % раствором аммиака извлекается в три раза больше веществ, чем

органическими растворителями. Сырье и шрот богаты клетчаткой, лигнином и

белками. Как видно из табличных данных, влажность и зольность шрота не

превышают требований, установленных фармакопейной статьей на исходное

лекарственное сырье [41].

Проведенные исследования показали, что классическая промышленная

технология по переработке этого сырья не позволяет максимально извлекать из

корня солодки экстрактивные вещества, в том числе глицирризиновую кислоту

[136]. Показана возможность дополнительного извлечения из шрота

биологически активных веществ для исследования его состава и

количественного содержания, что позволит расширить спектр БАД и

лекарственных средств на основе корня солодки.

3.2 Состав углеводов шрота корня солодки

Известно, что наибольшее количество биологически активных веществ

корня солодки представлено углеводами. После экстракции сырья водно-

аммиачным раствором в шроте должна увеличиваться доля углеводов, что

продемонстрировано на примере клетчатки (таблица3.1).

Для извлечения углеводов шрот корня солодки последовательно

обрабатывали: 80 % этанолом; дистиллированной водой; 0,05 н раствором

соляной кислоты и 1 % раствором лимоннокислого аммония [125]. Во всех

полученных экстрактах определяли сумму углеводов, в том числе их отдельных

групп. Результаты приведены в таблице 3.2.

62

Таблица 3.2 – Состав углеводов, извлекаемых последовательно из шрота корня

солодки различными экстрагентами (n = 5, P = 0,95)

Состав углеводов Содержание, % от шрота

Углеводы, извлекаемые 80 % этанолом:

- сумма углеводов 1,19±0,01

- простые углеводы 0,32±0,02

Углеводы, извлекаемые дистиллированной водой:

- сумма углеводов 2,76±0,15

- водорастворимый пектин 0,81±0,09

- крахмал 2,22±0,14

Углеводы, извлекаемые 0,05 н раствором соляной кислоты и

1 % раствором лимоннокислого аммония:

- сумма углеводов 8,55±1,12

- протопектин 0,82±0,01

- крахмал 8,05±0,01

Углеводы, извлекаемые 80 % этанолом. При экстракции шрота корня

солодки 80 % этанолом в экстракт будут переходить главным образом простые

углеводы [125]. Установлено, что сумма углеводов в этанольном экстракте

составляет 1,19 % от шрота. При этом только 27 % от суммы обнаруженных

углеводов приходится на долю простых углеводов. Их содержание в шроте

почти в 50 раз меньше, чем в исходном сырье (16 % [28]). Остальные 73 %

углеводов, извлекаемых из шрота 80 % этанолом, могут быть представлены,

например, спирторастворимыми полисахаридами, которые ранее были

обнаружены в корне солодки [137].

Известно, что сумма углеводов, полученная из этанольного экстракта

корня солодки, обладает биологической активностью, проявляя выраженные

противоязвенные и спазмолитические свойства [13]. Поэтому особый интерес

представляло исследование качественного состава суммы углеводов,

извлекаемых этанолом из шрота корня солодки. Для решения этой задачи был

применен метод ВЭЖХ. Поскольку анализируемый экстракт содержит наряду с

простыми сахарами и полисахариды, исследовали как исходный этанольный

экстракт, так и гидролизат, полученный при его кипячении с 10 % раствором

63

соляной кислоты в течение 10 мин. В таблице 3.3 приведены результаты

обработки их хроматограмм.

Таблица 3.3 – Результаты обработки хроматограмм этанольного экстракта из

шрота корня и его гидролизата

Объект

исследования Пик

Время

удерживания,

мин

Площадь

пика, % Отнесение

Этанольный

экстракт из

шрота корня

солодки

1 5,484 1,1 - 2 5,867 0,3 фруктоза 3 6,516 0,5 глюкоза 4 10,277 45,8 - 5 11,558 11,3 сахароза 6 15,836 3,3 - 7 17,575 34,5 - 8 19,314 3,2 -

Гидролизат

этанольного

экстракта из

шрота корня

солодки

1 4,839 0,1 арабиноза

2 5,652 2,8 фруктоза

3 7,393* 43,9 глюкоза + галактоза

4 8,114 15,3 -

5 11,292 37,9 -

Примечание: *на хроматограмме глюкоза и галактоза выходят одним

уширенным пиком, захватывая времена удерживания 6,5 мин и 7,4 мин.

Всего на хроматограмме этанольного экстракта из шрота корня солодки

обнаружено 8 пиков. Из них 3 были отнесены к фруктозе, глюкозе и сахарозе,

имеющих содержание 0,3 %, 0,5 % и 11,3 % от суммы обнаруженных углеводов

соответственно. Известно, что эти углеводы являются основными в корне

солодки, и содержание сахарозы всегда значительно выше составляющих ее

моносахаридов [28]. В отличие от этанольного экстракта из сырья корня

солодки, в котором преобладающим углеводом является сахароза (46 %) [13], в

экстракте из шрота основными являются два неидентифицированных углевода с

содержанием 45,8 % и 34,5 % соответственно. Первый пик с временем

удерживания 10,277 мин можно отнести к дисахаридам, а второй, с временем

удерживания 17,575 мин – к олигосахаридам.

64

На хроматограмме кислотного гидролизата этанольного экстракта из

шрота по сравнению с исходным экстрактом исчезают пики с большими

значениями времени удерживания (15,836, 17,575 и 19,314). При этом в

гидролизате накапливается галактоза в сочетании с глюкозой до 43,9 %,

фруктоза с 0,3 % до 2,8 %. Дополнительно в следовом количестве

обнаруживается арабиноза. Также появляются два неидентифицированных

углевода с временами удерживания 8,114 мин и 11,292 мин, суммарно

занимающих около 53 % от суммы обнаруженных углеводов. Пик с временем

удерживания 11,292 мин можно отнести к ди- или олигосахаридам, которые по-

видимому образуются при гидролизе спирторастворимых полисахаридов или

отделение гликозидных остатков флавоноидов и глицирризиновой кислоты,

извлекаемых из шрота.

Результаты ВЭЖХ анализа этанольного экстракта из шрота подтверждают

предположение, сделанное ранее по данным количественного определения в нем

углеводов, что 80 % этанолом из шрота извлекаются преимущественно

полисахариды. Главным образом они представлены галактоглюканами,

поскольку в гидролизате значительно увеличивается количество галактозы и

глюкозы. Также в анализируемом экстракте может содержаться олигосахарид –

глюкофруктан, который ранее был обнаружен в корне солодки [138]. Например,

полисахарид глицирризан UC, выделенный из корней солодки уральской,

структурной единицей которого является арабино-3,6-галакто-глюкан проявляет

выраженное иммуномодулирующее действие на уровне с препаратом «Зимозан»

[139]. Глюкофруктан из Arctium lappa также обладает иммуномодулирующим и

противокашлевым действием [139].

Следовательно, этанольный экстракт из шрота представляет значительный

практический интерес для исследования его биологической активности.

Углеводы, извлекаемые дистиллированной водой. Показано, что сумма

углеводов, извлекаемых водой из шрота корня солодки, составляет 2,76 %

(таблица 3.2). В составе обнаруженных углеводов основную часть занимает

крахмал – 80,4 %, а остальные 19,6 % приходятся на водорастворимый пектин.

65

Определена степень этерификации выделенного пектина и показано, что она

составляет 2,32±0,41 %. Очень низкая степень этерификации пектина,

выделенного из шрота корня солодки, обуславливает его фармакологическую

ценность в качестве высокоэффективного сорбента.

Углеводы, извлекаемые 0,05 н раствором соляной кислоты и 1 %

раствором лимоннокислого аммония. Наибольшее количество углеводов – 8,55

% извлекается из шрота корня солодки с применением 0,05 н раствора соляной

кислоты и 1 % раствора лимоннокислого аммония (таблица 3.2). Также, как и в

водном экстракте в их составе преобладает крахмал – 94,1 % от суммы

обнаруженных углеводов. При этом стоит отметить, что выход крахмала при

последовательной обработке шрота 0,05 н раствором соляной кислоты и 1 %

раствором лимоннокислого аммония в 4 раза выше, чем при экстракции шрота

водой [140]. По-видимому, это связано с особенностями анатомического

строения корня солодки. Известно, что крахмал локализован в виде крахмальных

зерен округлой или яйцевидной формы величиной 2-20 мкм во вторичной коре в

сердцевинных лучах и паренхимных клетках, которые чередуются с лубом [5]. В

процессе обработки шрота 0,05 н раствором соляной кислоты и 1 % раствором

лимоннокислого аммония происходит частичный гидролиз основного

связывающего гликана луба –целлюлозы, что и обуславливает увеличение

выхода крахмала.

Выход протопектина одинаков с выходом водорастворимого пектина, при

этом степень его этерификации еще ниже – 0,86±0,05 % (таблица 3.2).

При осаждении протопектина этанолом, выпавший осадок не полностью

растворялся в воде. Его отделили фильтрованием и высушили. Выход осадка

составил 2,28 % от шрота. Положительная качественная реакция с йодом

указывает, что полученный осадок представляет собой крахмал.

В ИК-спектре осадка присутствуют все характерные для крахмала полосы

поглощения: 3400 см-1 (валентные колебания связанных ОН-групп), 2800-3000

см-1 (валентные колебания СН-групп), 1400-1450 см-1(деформационные

колебания СН-групп), 1000-1100 см-1(колебания скелета молекулы) [141].

66

(рисунок 3.1). Однако, наличие полосы поглощения 1629 см-1 (валентные

колебания -С=О группы) указывают на наличие в анализируемом объекте наряду

с крахмалом пектиновых веществ.

Рисунок 3.1 – ИК-спектр осадка из экстракта шрота, полученного с

применением 0,05 н раствора соляной кислоты и 1 % раствора лимоннокислого

аммония

Таким образом, показано, что фракция углеводов, извлекаемая из шрота

корня солодки последовательной обработкой 0,05 н раствором соляной кислоты

и 1 % раствором лимоннокислого аммония, за счет содержания в ней как

пектина, так и крахмала, обладает практической ценностью и может быть

использована, например, в качестве эффективного сорбента или

вспомогательных веществ в фармации.

Содержание структурных полисахаридов – гемицеллюлоз, целлюлозы и

лигнина проведено по стандартной методике определения сырой клетчатки в

растительных кормах. Показано, что общее содержание структурных

полисахаридов в шроте корня солодки составляет 31,69±0,04 % (таблица 3.1).

Эта группа углеводов может быть использована в качестве сорбентов и

67

источника пищевых волокон при разработке биологически активных добавок и

лечебно-профилактического питания [142].

Установлено, что шрот корня солодки содержит: простые углеводы – 0,3

%, спирторастворимые полисахариды в виде галактоглюканов – около 0,8 %,

пектиновые вещества – 1,6 %, крахмал – 10,3 %, структурные полисахариды –

31,7 %.

На основе проведенных исследований предлагается использовать:

пектиновые вещества, при разработке иммуномодуляторов, а также в качестве

высокоэффективного сорбента, крахмал в фармацевтическом производстве в

качестве наполнителя, структурные полисахариды, как высокоэффективный

сорбент, в качестве источника пищевых волокон и для разработки новых

биологически активных добавок.

3.3 Выбор растворителя для максимального извлечения

глицирризиновой кислоты и флавоноидных соединений

В настоящее время фармацевтическая промышленность различных стран

на основе глицирризиновой кислоты выпускает лекарственные средства

«Глицирам» и «Фосфоглив» (Россия), «Туссилинар» (Польша), «StrongerNeo-

MinophagenC» и «Glycyron» (Япония), «Compound Glycyrrhizin Capsule» (Китай)

и др. На основе фракции флавоноидов разработаны лекарственные средства –

«Флакарбин» и «Ликвиритон». Выход этих веществ при экстракции сырья корня

солодки сильно изменяется в зависимости от используемого экстрагента. Кроме

того, различается и состав сопутствующих соединений, извлекаемых наряду с

целевыми компонентами. Исходя из анализа литературных данных [1, 13, 143], в

работе были выбраны три наиболее часто используемых для экстракции корня

солодки экстрагента и применены условия проведения этого процесса (таблица

3.4).

68

Таблица 3.4 – Условия экстракции различными экстрагентами сырья и шрота

корня солодки

Экстрагент Условия экстракции

0,25 % раствор

гидроксида аммония

Соотношение сырье/шрот:экстрагент – 1:50,

замачивание в течение 1 ч с последующим

кипячением в течение 2 ч, кратность экстракции – 1

стадия [41]

Ацетон, подкисленный

3 % раствором азотной

кислоты

Соотношение сырье/шрот:экстрагент – 1:50;

кипячение в течение 0,5 ч, кратность экстракции – 3

стадии [144]

80 % этанол

Соотношение сырье/шрот:экстрагент – 1:40;

кипячение в течение 2 ч, кратность экстракции – 1

стадии [125]

В полученных экстрактах определили содержание экстрактивных веществ,

в том числе отдельных классов биологически активных веществ [145].

Наибольший выход экстрактивных веществ, как из сырья, так и шрота

корня солодки наблюдается при их экстракции ацетоном, подкисленным 3 %

раствором азотной кислоты (таблица 3.5). При этом в анализируемых экстрактах

содержится максимальное количество глицирризиновой кислоты. Согласно

литературным данным [13], подкисленный ацетон используют для увеличения

выхода глицирризиновой кислоты при экстракции корня солодки. Содержание

глицирризиновой кислоты в экстракте из шрота в 4,5 раза ниже по сравнению с

экстрактом из сырья (таблица 3.5), поскольку основная её часть уже была

извлечена в ходе промышленной переработки корня солодки [145].

Наряду с глицирризиновой кислотой в ацетоновых экстрактах из сырья и

шрота преобладают простые фенолы и углеводы (таблица 3.5). Стоит отметить,

что простые углеводы, выделенные из корня солодки, обладают

противоязвенным и спазмолитическим действием [13], а простые фенолы

69

проявляют выраженную антимикробную активность [146]. В связи с этим

ацетоновый экстракт из шрота корня солодки представляет наибольший

практический интерес, т.к. в его экстракте содержание простых фенолов и

углеводов практически не уступает их содержанию в экстракте из исходного

сырья.

При экстрагировании 0,25 % раствором гидроксида аммония и 80 %

этанолом извлекается из сырья и шрота корня солодки практически одинаковое

количество экстрактивных веществ, в том числе основных биологически

активных компонентов – глицирризиновой кислоты и флавоноидов (таблица

3.5). Применены разные методы анализа углеводов в этих экстрактах. Показано,

что содержание в них простых углеводов невелико. Использование же

антронового метода позволило установить, что суммарное содержание углеводов

в исследуемых экстрактах составляет 65-70 % от экстрактивных веществ. Это

хорошо согласуется с ранее полученными результатами, описанными в

предыдущей подглаве, что обнаруженные углеводы экстрактов представлены в

основном полисахаридами.

В корнях солодки содержится до 30 % крахмала [13, 1], и он может

извлекаться при водно-аммиачной экстракции. Поэтому было проведено

определение крахмала в водно-аммиачных экстрактах из сырья и шрота корня

солодки, и показано, что его содержание составляет 4,23 и 2,88 %

соответственно. Также в анализируемых экстрактах из сырья и шрота показано

наличие белков в количестве 0,34 и 0,15 % соответственно (таблица 3.5).

Обнаруженные полимерные вещества являются балластными и затрудняют

дальнейшую обработку полученных водно-аммиачных экстрактов. В связи с

этим более перспективно для экстракции шрота в качестве экстрагента

использовать 80 % этанол, т.к. полученные экстракты содержат меньшее

количество сопутствующих соединений.

Для уточнения качественного состава экстрактивных веществ в экстрактах,

полученных из сырья и шрота корня солодки с применением различных

экстрагентов, была применена тонкослойная хроматография [145]. Исследование

70

проводили на лабораторном комплексе «CAMAG» (Швейцария).

Хроматограммы анализируемых экстрактов, полученных из сырья и шрота, в

сравнении со стандартами – глицирризиновой кислотой (трек 1) и

ликвиритигенином (трек 2), а также этанольным экстрактом из сырья корня

солодки (трек 9) [130] приведены на рисунке 3.2.

Рисунок 3.2 – Хроматограмма экстрактов из сырья и шрота корня солодки,

полученных с применением: 0,25 % раствора гидроксида аммония (трек 1 и 2);

ацетона, подкисленный 3 % раствором азотной кислоты (трек 3 и 4);

80 % этанола (трек 5 и 6), в видимом свете после дериватизации.

71

Таблица 3.5 – Количественный и качественный состав экстрактивных веществ, извлекаемых из сырья и шрота корня

солодки различными экстрагентами (n = 3-5, P = 0,95)

Объект

исследования

Содержание, % сырья*/шрота

экстрактивные

вещества

глицирризиновая

кислота***

простые

фенолы флавоноиды простые

углеводы крахмал сумма

углеводов

сумма

белков

Экстрагент – 0,25 % раствор гидроксида аммония

Экстракт

из сырья 21,70±1,81 7,14 0,04±0,01 3,37±0,13 0,18±0,02 4,23±0,22 14,59±0,38 0,34±0,02

Экстракт

из шрота 10,11±1,84 0,82 0,01±0,01 0,43±0,04 0,10±0,01 2,88±0,22 6,83±0,59 0,15±0,04

Экстрагент – ацетон, подкисленный 3 % раствором азотной кислоты

Экстракт

из сырья 24,32±2,02 10,02 0,51±0,01 1,29±0,50 0,66±0,11 - -** -

Экстракт

из шрота 21,51±1,77 2,22 0,43±0,08 0,22±0,03 0,51±0,03 - -** -

Экстрагент – 80 % этанол

Экстракт

из сырья 26,74±1,99 8,07 0,32±0,01 3,83±0,06 0,13±0,01 - 17,87±0,60 26,74±1,99

Экстракт

из шрота 9,13±0,64 1,03 0,24±0,03 0,45±0,03 0,10±0,01 - 6,47±0,46 9,13±0,64

* партия сырья 151115, производитель ОАО «Красногорсклексредства»

**- метод не может быть применим, т.к. дает завышенный результат вследствие побочной реакции между глицирризиновой кислотой и

серной кислотой, входящей в состав антронового реактива

*** - количественное определение проведено инструментальной тонкослойной хроматографией

72

Согласно полученным данным, самое большое содержание фенольных

соединений – ликвиритигенина, а также пятен с Rf = 0,84 и выше наблюдается у

спиртовых экстрактов из сырья и шрота (треки 5, 6). Анализ литературных

данных по исследованию флавоноидов корня солодки (трек 9) [5], а также

использование специфического окрашивающего реактива (раствор H2SO4 в

метаноле) [147], позволяет отнести пятна с Rf = 0,84 и выше к изофлавонам, в том

числе к формононетину. На хроматограммах экстрактов, полученных с другими

экстрагентами (треки 1-4), изофлавоны не обнаруживаются. Это может быть

связано либо с плохой экстрагирующей способностью растворителей, либо с

разрушением сложно организованных фенольных соединений.

Проведена денситометрическая обработка хроматограмм и ее результаты

приведены в таблице 3.6.

Экстракты из шрота содержат меньшее количество соединений по

сравнению с экстрактами из сырья. Наиболее богатый качественный состав

фенольных соединений имеет этанольный экстракт из шрота. Всего в нем

обнаружено 8 пиков, из них четыре отнесены к флавоноидам [145].

Проведенный качественный и количественный анализ фенольных

соединений в экстрактах, полученных с применением наиболее часто

используемых для экстракции корня солодки экстрагентов, подтверждает

сделанный ранее вывод о том, что 80 % этанол является наиболее эффективным

экстрагентом для извлечения флавоноидных соединений из шрота корня

солодки.

Установлено, что для переработки шрота корня солодки перспективно

использовать 80 % этанол. В полученном экстракте наблюдается высокое

содержание глицирризиновой кислоты и флавоноидов – 1,03 и 0,45 %

соответственно, и наименьшее количество сопутствующих соединений.

73

Таблица 3.6 – Количественный и качественный состав фенольных соединений,

извлекаемых из сырья и шрота корня солодки различными экстрагентами (n = 3-

5, P = 0,95)

Объект

исследования

Экстрактивные

вещества,

% от сырья/шрота

Фенольные соединения

количество пиков

на хроматограмме отнесение

% от сырья/

шрота

Экстрагент – 0,25 % раствор гидроксида аммония

Экстракт из

сырья 17,13*

4 простые фенолы 0,04±0,01

6 флавоноиды в т.ч.

ликвиритигенин 3,37±0,13

Экстракт из

шрота 7,08*

1 простые фенолы 0,01±0,01

1 флавоноиды в т.ч.

ликвиритигенин 0,43±0,04

Экстрагент – ацетон, подкисленный 3 % раствором азотной кислоты

Экстракт из

сырья 24,32

3 простые фенолы 0,51±0,01

10 флавоноиды в т.ч.

ликвиритигенин 1,29±0,50

Экстракт из

шрота 21,51

4 простые фенолы 0,43±0,08

1 флавоноиды в т.ч.

ликвиритигенин 0,22±0,03

Экстрагент – 80 % этанол

Экстракт из

сырья 26,74

4 простые фенолы 0,32±0,01

7 флавоноиды в т.ч.

ликвиритигенин 3,83±0,06

Экстракт из

шрота 9,13

4 простые фенолы 0,24±0,03

4 флавоноиды в т.ч.

ликвиритигенин 0,45±0,03

* сумма экстрактивных веществ, уменьшена на долю крахмала и долю белков

3.4 Подбор условий экстракции шрота корня солодки этанолом для

максимального извлечения из него глицирризиновой кислоты и

флавоноидных соединений

Известно, что состав соединений, извлекаемых этанолом из корня солодки,

главным образом зависит от его концентрации. Например, показано, что при

74

использовании 96 % этанола преимущественно извлекаются гидрофобные

агликоны флавоноидов, а при снижении концентрации спирта в составе

экстракта начинают преобладать гликозидные формы флавоноидов. Кроме того,

эти экстракты содержат в качестве сопутствующих соединений – углеводы, в

том числе полисахариды [13, 143].

Подбор концентрации спирта в экстрагенте. Проведена исчерпывающая

экстракция шрота корня солодки при подобранных параметрах [125]: кипячение

в течение 2 часов с этанолом различной концентрации в соотношении шрот:

экстрагент 1:40. Показано, что независимо от концентрации этанола

максимальный выход экстрактивных веществ из шрота достигается за 3 стадии.

При этом, как видно из таблицы 3.7, наибольший выход экстрактивных веществ

из шрота – около 15 %, наблюдается при его экстракции 40 % этанолом. При

использовании в качестве экстрагента 70 %, 80 % и 96 % спирта выход

экстрактивных веществ ниже на 8-37 %.

Таблица 3.7 – Содержание и состав экстрактивных веществ в этанольных

экстрактах из шрота корня солодки (n=5, P=0,95)

Экстракт из

шрота корня

солодки:

Содержание, % от шрота

экстрактивных

веществ флавоноидов

суммы

углеводов

глицирризиновой

кислоты

40 %

этанолом 15,06±0,21 0,50±0,07 9,93±0,21 0,35±0,02

70 %

этанолом 11,98±0,11 0,38±0,04 5,31±0,16 0,86±0,01

80 %

этанолом 13,88±0,21 0,70±0,03 5,65±0,06 0,91±0,02

96 %

этанолом 9,42±0,12 0,32±0,05 3,14±0,29 0,51±0,03

Анализ состава экстрактивных веществ в полученных экстрактах показал,

что с увеличением концентрации этанола в экстрагенте до 80 %, в них возрастает

содержание флавоноидов в 1,8 раза и глицирризиновой кислоты в 2,6 раза, и при

этом снижается содержание сопутствующих веществ, углеводов, в 1,8 раза [148].

75

На основании полученных данных, для экстракции шрота корня солодки

целесообразным является применение в качестве экстрагента 80 % этанола,

позволяющего извлечь максимальное количество флавоноидов и

глицирризиновой кислоты.

Качественный состав этанольных экстрактов из шрота корня солодки

проанализирован методом инструментальной тонкослойной хроматографии на

лабораторном комплексе «СAMAG» (рисунок 3.3, таблица 3.8). Показано, что

анализируемые экстракты, в независимости от концентрации этанола в

экстрагенте, содержат до 14 соединений, в том числе ГК с Rf, равным 0,22-0,25 и

ликвиритигенин с Rf, равным 0,83 по соотнесению с Rf стандартов (трек 5 и 6

рисунок 3.3).

Соединения, обнаруженные на хроматограмме, по специфической окраске

могут быть отнесены к разным классам флавоноидов [147]. Стоит отметить, что

во всех экстрактах преобладает соединение с Rf = 0,92 отнесенное к изофлавону –

формононетину [125]. Известно, что этот агликон обладает антиоксидантной,

гиполипедимический, эстрогенной и другими видами биологической активности

[1, 95].

76

Рисунок 3.3 – Хроматограмма экстрактов из шрота корня солодки, полученных

при его исчерпывающей экстракции экстрагентом с концентрацией этанола: 40

% (трек 1); 70 % (трек 2); 80 % (трек 3); 96 % (трек 4) в видимом свете после

дериватизации

Таблица 3.8 – Качественный и количественный состав фенольных соединений в

этанольных экстрактов из шрота корня солодки

Экстракт из

шрота корня

солодки

Экстрактивные

вещества, % от

шрота

Количество пиков

на хроматограмме Отнесение % от шрота

1 2 3 4 5

40 % этанолом 15,06±0,21

10 Фенольные соединения 0,24

1 Ликвиритигенин 0,02

1 Формононетин 0,24

70 % этанолом 11,98±0,11

8 Фенольные соединения 0,24

1 Ликвиритигенин 0,02

1 Формононетин 0,12

77

Продолжение таблицы 3.8

1 2 3 4 5

80 % этанолом 13,88±0,21

8 Фенольные соединения 0,41

1 Ликвиритигенин 0,06

1 Формононетин 0,23

96 % этанолом 9,42±0,12

8 Фенольные соединения 0,18

1 Ликвиритигенин 0,02

1 Формононетин 0,12

Как видно из данных таблицы 3.8, экстракция шрота 80 % этанолом

позволяет получить максимальное количество флавоноидов. Следовательно, эту

концентрацию экстрагента следует считать оптимальной для экстракции шрота с

целью максимального извлечения из него флавоноидных соединений [148].

Подбор соотношения шрот:экстрагент. Исчерпывающая экстракция шрота

корня солодки занимает 6 часов (3 стадии по 2 часа). Для сокращения

продолжительности процесса проведена экстракция шрота при кипячении в

течение 1 часа с 80 % этанолом и соотношении шрот: экстрагент – 1:40, 1:50,

1:60, 1:80, 1:100.

Показано, что наибольший выход экстрактивных веществ – 10,93 %

наблюдается при использовании соотношения 1:100 (таблица 3.9). В сравнении с

исчерпывающей экстракцией полученный выход экстрактивных веществ в 1,3

раза меньше. Это свидетельствует о том, что на увеличение выхода

экстрактивных веществ влияет продолжительность экстракции шрота [148].

78

Таблица 3.9 – Выход экстрактивных веществ в экстрактах, полученных с

применением одностадийной экстракции шрота 80 % этанолом, при изменении

соотношения шрот: экстрагент (n=5, P=0,95)

Условия экстракции Выход

экстрактивных

веществ, %

Соотношение

шрот: экстрагент

Продолжительность

стадии, ч

Количество

стадии

Контроль 1:40 2 3 13,88±0,21

1:40

1 1

9,98±0,21

1:50 9,50±0,11

1:60 10,73±0,52

1:80 9,20±0,23

1:100 10,93±0,31

Выбор фракции шрота, имеющей в своем составе большее содержание

глицирризиновой кислоты и флавоноидных соединений. Тритерпеноидные и

флавоноидные соединения в корне солодки локализуются преимущественно в

верхнем пробковом слое, и, соответственно, их значительная часть уже была

извлечена в ходе промышленной переработки сырья. Часть этих соединений

содержится в сердцевинных лучах корня [5]. Поэтому для повышения их

доступности к извлечению проведено измельчение шрота. При просеивании

были получены две фракции, сильно различающиеся по морфологии: фракция 1

– преимущественно тонкие волокна; фракция 2 – тонкодисперсный порошок с

размером частиц менее 2 мм (рисунок 3.4).

Проведен микроскопический анализ [148], полученных фракций. По

качественной реакции с 80 % раствором H2SO4 и 1 % раствором хлорида железа

показано, что фракция 2 в большем количестве содержит глицирризиновую

кислоту и флавоноиды (рисунок 3.5).

79

Рисунок 3.4 – Фракции, полученные при измельчении шрота корня солодки

Рисунок 3.5 – Микроскопия срезов шрота корня солодки и фракций,

полученных при его измельчении

Проведен количественный анализ основных компонентов шрота корня

солодки и его фракций, полученных при измельчении (таблица 3.10).

80

Таблица 3.10 – Химический состав шрота корня солодки и фракций, полученных

при его измельчении (n=3-5, р=0,95)

Массовая доля веществ Содержание, % в

Шроте Фракция 1 Фракция 2

Глицирризиновой кислоты 2,76±0,14 - -

Веществ, экстрагируемые

петролейным эфиром 1,66±0,11 0,94±0,07 1,26±0,02

Сырого протеина 12,36±0,904 7,43±0,68 9,49±0,31

Сырая клетчатка 31,69±0,08 33,18±0,11 23,77±0,08

Минеральных веществ 3,49±0,02 4,84±0,23 3,90±0,39

По сравнению с исходным шротом полученная фракция 2 содержит на 0,32

% больше веществ, экстрагируемых петролейным эфиром (в том числе

терпеноидные и стероидные соединения) и меньше балластных веществ – сырой

клетчатки на 9,41 % и зольных веществ на 0,94 %. Следовательно, измельчение

шрота с отбором фракции 2 позволит более эффективно извлекать из него

целевые вещества, а фракцию 1 можно использовать в фармацевтической,

пищевой и косметической промышленности, за счет высокого содержания в ней

клетчатки.

Проведена исчерпывающая и одностадийная экстракция фракции 2

этанолом с концентрацией 80 % при соотношении фракция 2:экстрагент 1:40 и

1:100. Результаты анализа полученных экстрактов приведены в таблице 3.11.

Сравнение экстрактов фракции 2, полученных исчерпывающей

экстракцией и одностадийной показывает, что последняя более эффективна для

извлечения большего количества флавоноидов и глицирризиновой кислоты. При

длительном температурном воздействии во время исчерпывающей экстракции

фракции 2 по-видимому происходит разрушение части глицирризиновой

кислоты, т.к. ее содержание в экстракте в 1,6 раза ниже, по сравнению с

экстрактом, полученным одностадийной экстракцией фракции 2 (таблица 3.11).

Анализ качественного состава экстрактов фракции 2 методом

инструментальной тонкослойной хроматографии показал, что в отличие от

81

экстрактов из шрота в них содержится меньший спектр фенольных веществ

(рисунок 3.6, таблица 3.12).

Таблица 3.11 – Содержание и состав экстрактивных веществ в этанольных

экстрактах фракции 2 (n=5, P=0,95)

Экстракт

фракции 2,

полученный

при

соотношении

Содержание, % от фракции 2 шрота

экстрактивных

веществ флавоноидов

суммы

углеводов

глицирризиновой

кислоты

Исчерпывающая экстракция

1:40 14,00±0,21 0,23±0,03 3,90±0,06 0,56±0,01

1:100 14,09±0,22 0,24±0,01 6,06±0,31 0,46±0,03

Одностадийная экстракция

1:40 10,73±0,15 0,22±0,01 3,32±0,05 0,88±0,02

1:100 10,93±0,51 0,51±0,06 3,87±0,22 0,62±0,01

Рисунок 3.6 – Хроматограмма в видимом свете после дериватизации экстрактов

из фракции 2 шрота корня солодки, полученных при одностадийной экстракции

80 % раствором при соотношении 1:40 (трек 1) и 1:100 (трек 2); исчерпывающей

экстракцией 80 % раствором при соотношении 1:40 (трек 3) и 1:100 (трек 4);

растворов стандартов – глицирризиновой кислоты (трек 5) и ликвиритигенина

(трек 6)

82

Таблица 3.12 – Качественный и количественный состав фенольных соединений в

этанольных экстрактов из фракции 2 шрота корня солодки

Экстракт из

фракции 2

Экстрактивные

вещества, % от

фракции 2

Количество пиков

на хроматограмме Отнесение

% от

фракции 2

Одностадийная экстракция

80 % этанолом

(1:40) 10,73±0,11

5 Фенольные соединения 0,35

1 Ликвиритигенин 0,16

1 Формононетин 0,40

80 % этанолом

(1:100) 10,93±0,51

6 Фенольные соединения 0,54

1 Ликвиритигенин 0,10

1 Формононетин 0,30

Исчерпывающая экстракция

80 % этанолом

(1:40) 14,00±0,21

6 Фенольные соединения 0,72

1 Ликвиритигенин 0,14

1 Формононетин 0,36

80 % этанолом

(1:100) 14,09±0,22

6 Фенольные соединения 0,67

1 Ликвиритигенин 0,15

1 Формононетин 0,46

Сопоставляя результаты, по содержанию глицирризиновой кислоты и

флавоноидов в этанольных экстрактах из шрота и полученной на его основе

фракции 2, можно сделать вывод о том, что использование фракции 2 позволяет

сократить время проведения экстракции в 6 раз, снизить расход экстрагента в

1,5-3,0 раза, и, соответственно, энергозатраты для извлечения целевых веществ

из шрота корня солодки.

Таким образом, на основе полученных данных показано, что, для

извлечения флавоноидов и глицирризиновой кислоты из шрота корня солодки

эффективно проводить одностадийную экстракцию измельченного шрота

(фракция 2) 80 % этанолом [148]. Для получения высокого выхода флавоноидов

(0,51 % от шрота) целесообразно использовать соотношение измельченный

шрот: экстрагент 1:100, а для высокого выхода глицирризиновой кислоты (0,88%

от шрота) – соотношение 1:40 [148].

83

3.5 Фракционирование экстракта, полученного из измельченного

шрота 80 % раствором этанола

Проведённые исследования показали, что этанольный экстракт из шрота

содержит глицирризиновую кислоту, предположительно другие липофильные

вещества, и широкий спектр фенольных соединений, представляющих интерес с

точки зрения изучения их состава и определения биологической активности для

разработки на их основе БАД и/или лекарственных средств.

Для определения состава веществ, содержащихся в шроте корня солодки,

был выбран экстракт, полученный исчерпывающей экстракцией фракции 2

(далее шрот*) при соотношении шрот*:экстрагент 1:40, 80 % этанолом. Выбор

этого экстракта обоснован высоким содержанием в нем экстрактивных веществ,

в том числе липофильных (таблица 3.10).

Проведено разделение этанольного экстракта шрота* по разработанной

схеме, приведенной на рисунке 3.7, по которой на первом этапе получены

фракции, отличающиеся по полярности, путем концентрирования исходного

экстракта. Проведение подкисления фракции I позволило разрушить сложно

организованные комплексы органических соединений и разделить вещества по

их кислотно-основным свойствам. На втором этапе разделение веществ фракций

II, III (после нейтрализации) и IV проведено последовательной их обработкой

органическими растворителями с возрастающей полярностью. Получены

фракции, разделение которых позволило определить количество и состав в них

липофильных и фенольных соединений.

Концентрирование исходного этанольного экстракта под вакуумом

приводит к выделению из него осадка (фракцияII – 3,98 % от шрота). В осадке

должны присутствовать липофильные соединения, простые фенолы и

преимущественно агликоны флавоноидов. Для их разделения осадок

последовательно обрабатывали органическими растворителями с возрастающей

полярностью. Получены 4 фракции, в которых предположительно находятся:

84

липофильные соединения (фракция XVII – 0,05 %), простые фенолы (фракция

XIX – 0,28 %), агликоны флавоноидов (фракции: XXI – 2,03 %, XXIII – 1,08 %).

Для разделения веществ фильтрата (фракция I), применили подкисление,

при этом в осадок (фракция IV – 3,89 %) должны прийти глицирризиновая

кислота и кислые полифенолы (фенолкарбоновые кислоты и их производные,

флавоноиды, имеющие в своей структуре карбоксильные группы). Полученную

фракцию последовательно обрабатывали органическими растворителями с

возрастающей полярностью с получением 4 фракций. В них предположительно

находятся: липофильные соединения (фракция IX – 0,04 %), фенолкарбоновые

кислоты (фракция XI – 0,36 %), флавоноиды (фракции: XIII – 1,58 %, XV –

1,09 %).

Во фракции III (4,78 % от шрота), должны оставаться сложно

организованные полифенолы преимущественно их гликозидированные формы.

Проведя нейтрализацию исследуемого объекта, и обработку его петролейным и

диэтиловым эфирами отделены липофильные и простые фенольные соединения

в фракции V – 0,21 % и VII – 0,27 %. Остаток, фракция VIII – 4,10 % может

содержать как гликозидированные формы полифенолов, так и

спирторастворимые углеводы (таблица 3.2).

Фракции V, IX и XVII исследованы с помощью инструментальной

тонкослойной хроматографии на количественное содержание и качественный

состав липофильных веществ (рисунок 3.8, таблица 3.13).

В целом, в этанольном экстракте содержится 0,3 % липофильных

соединений из них до 28 % (0,07 % от шрота*) приходится на углеводороды, в

том числе сквален, и около 18 % (0,05 % от шрота*) на стерины и их эфиры.

Суммарно качественный состав липофильных веществ во фракциях представлен

пятнадцатью соединениями, в том числе жирными кислотами 5,1 % (0,015 % от

шрота*), триацилглицеридами 5,1 % (0,015 % от шрота*).

85

Рисунок 3.7 – Разделение этанольного экстракта шрота*

86

Рисунок 3.8 – Хроматограмма фракций IX (трек 1), XVII (трек 2), V (трек 3),

растворов стандартов – ситостерола (трек 4), триолеина (трек 5) и олеиновой

кислоты (трек 6) в видимом свете после дериватизации

Таблица 3.13 – Липофильные соединения этанольного экстракта из шрота*

Пик Содержание, % от веществ фракций

Rf V IX XVII Отнесение

1 0,05-0,06 19,32 30,64 12,97 неидентифицированное

2 0,10 2,09 - - неидентифицированное

3 0,13-0,15 8,23 2,48 4,37 неидентифицированное

4 0,17 - 3,51 3,48 неидентифицированное

5 0,22 4,87 7,35 6,51 стерины, в том числе ситостерол

6 0,27-0,28 6,78 10,28 11,34 неидентифицированное

7 0,35-0,37 1,38 - 3,54 неидентифицированное

8 0,43-0,45 4,12 9,08 6,74 жирные кислоты, в том числе олеиновая кислота

9 0,56-0,60 6,91 2,48 0,57 триглицериды, в том числе триолеин

10 0,70-0,73 1,3 0,66 2,41 неидентифицированное

11 0,76 - - 1,56 неидентифицированное

12 0,80-0,84 3,69 4,96 12,97 неидентифицированное

13 0,88 - 4,63 - неидентифицированное

14 0,90-0,93 12,97 10,51 7,09 эфиры стеринов

15 0,96 28,33 13,44 26,43 углеводороды, в том числе сквален

87

Фракции XIX, XI, VII, XXI, XIII, XXIII, XV и VIII исследованы с помощью

инструментальной тонкослойной хроматографии на количественное содержание

и качественный состав фенольных веществ и глицирризиновой кислоты

(рисунок 3.9 и 3.10). На основе литературных данных [10] были выбраны две

системы растворителей: гексан – ацетон (6:4) для анализа фракций XIX, XI, XXI,

XIII и VII; хлороформ– метанол – вода (26:14:3) для анализа фракций XXIII, XV

и VIII. Для полученных хроматограмм снимали денситограммы при длине волны

254 нм и 354 нм. После сканирования полученные хроматограммы обрабатывали

специфическими проявителями: спиртовым раствором хлористого алюминия,

водным раствором карбоната натрия и раствором серной кислоты в метаноле. На

основе спектральных характеристик и окраски после дериватизации провели

отнесение обнаруженных фенольных соединений к конкретным классам

(таблица 3.14 и 3.15).

Рисунок 3.9 – Хроматограмма фракций XIX, XI, XXI, XIII и VII и растворов

стандартов – глицирризиновой кислоты (трек 1) и ликвиритигенина (трек 2) в

видимом свете после дериватизации

88

Рисунок 3.10 – Хроматограмма фракций XXIII, XV и VIII в видимом свете после

дериватизациии растворов стандартов – глицирризиновой кислоты (трек 1) и

ликвиритигенина (трек 2) в видимом свете после дериватизации

Как и ожидалось, в фракциях XIX и XI содержатся простые

фенолы/оксибензойные кислоты. А во фракции VII, которая получена в конце

разделения фракции III, преобладают ликвиритигенин и изофлавоны. Фракции,

отделенные с применением диэтилового эфира, содержат небольшое количество

экстрактивных веществ 0,27-0,36 % от шрота*.

Во фракциях, полученных с использованием этилацетата XXI и XIII

(таблица 3.15), содержатся самое большое количество экстрактивных веществ

1,58-2,03 % (от шрота*). Преобладают в этих фракциях изофлавоны, которые

представлены 7-9 соединениями. Кроме этих соединений, во фракциях

присутствуют простые фенолы/оксибензойные кислоты, которых в фракции XXI

меньше в 3,8 раза, а в XIII – в 2,1 раза, по сравнению с количеством

изофлавонов.

89

Таблица 3.14 – Состав фенольных соединений фракций XIX, XI и VII

полученных с использованием диэтилового эфира

Фракция Содержание, %

шрота*

Количество пиков

на хроматограмме

Отнесение фенольных

соединений

% от

шрота*

XIX 0,28

2 флаваноны 0,01

1 ликвиритигенин 0,03

5 халконы 0,04

3 флавоны/ флавонолы 0,02

2

простые фенолы

оксибензойные

кислоты

0,11

2 изофлавоны 0,01

3 терпеноидное

соединение/флавоны 0,07

XI 0,36

5 Флаваноны 0,02

1 ликвиритигенин 0,01

4 халконы 0,04

2 флавоны/ флавонолы 0,02

4

простые фенолы/

оксибензойные

кислоты

0,15

5 изофлавоны 0,05

1 терпеноидное

соединение/флавоны 0,05

VII 0,27

3 флаваноны 0,03

1 ликвиритигенин 0,07

4 халконы 0,05

3 флавоны/ флавонолы 0,01

1

простые фенолы /

оксибензойные

кислоты

0,01

3 изофлавоны 0,08

90

Таблица 3.15 – Состав фракции, полученных с использованием этилацетата (XXI

и XIII), этанола (XXIII и XV), и остатка этанольного экстракта после разделения

(VIII)

Фракция Содержание,

% от шрота*

Количествово

пиков на

хроматограмме

Отнесение фенольных

соединений

% от

шрота*

XXI 2,03

5 флаваноны 0,12

1 ликвиритигенин 0,01

2 халконы 0,06

1 простые фенолы/

оксибензойные кислоты 0,37

9 изофлавоны 1,4

XIII 1,58

8 флаваноны 0,03

1 ликвиритигенин 0,01

5 халконы 0,21

1 флавон/ флавонол 0,01

2 простые фенолы/

оксибензойные кислоты 0,29

7 изофлавоны 0,61

XXIII 1,08

6 флаваноны 0,37

1 ликвиритигенин 0,05

1 флавон/ флавонол 0,17

1 простые фенолы/

оксибензойные кислоты 0,04

5 изофлавоны 0,45

XV 1,09

6 флаваноны 0,14

1 ликвиритигенин 0,19

3 халконы 0,1

3 флавоны/ флавонолы 0,41

2 простыефенолы/

оксибензойные кислоты 0,07

2 изофлавоны 0,15

VIII 4,1

1 флаванон 0,22

1 ликвиритигенин 0,36

2 халконы 1,02

1 флавон/ флавонол 0,34

4 изофлавоны 1,57

91

Вторые по количеству извлеченных из экстракта веществ являются

фракции XXIII и XV, полученные с использованием этанола. Они отличаются по

составу фенольных соединений. Вфракции XXIII основными компонентами

являются флаваноны и изофлавоны, содержащиеся в равном количестве

(таблица 3.15). В фракции XV, по сравнению со всеми другими фракциями

преобладает ликвиритигенин (кроме остатка –VIII) и флавон/флавонолы.

Проведенное разделение спиртового экстракта из шрота* позволило

отделить 62 % экстрактивных веществ и получить в остатке фракцию VIII. По

сравнению с другими фракциями она была мутной с выраженной опалесценцией

и имела наименее интенсивную, слабожелтую окраску. Установлено, что

фракция VIII содержит наибольшее количество глицирризиновой кислоты

(таблица 3.16). По-видимому, мутность в этом объекте исследования связана с

плохой растворимостью глицирризиновой кислоты в органических

растворителях. Можно предположить, что в фракциях XIX, XI, VII, XXI и XIII

содержится агликон глицирризиновой кислоты – глицирретовая кислота, а в VIII

фракции именно глицирризиновая кислота. Также в этой фракции остается самое

большое количество изофлавонов, халконов и флавононов в соотношении

1,6:1,0:0,9. Причем в составе флавононов около 70 % составляет

ликвиритигенин. Изофлавоны и халконы являются преобладающими

фенольными соединениями корня солодки и их высокое содержание в фракции

VIII может быть связано с их комплексообразованием, как с глицирризиновой

кислотой, так и с полисахаридами, переходящими в эту фракцию.

Доказательством этого является факт образования коллоидной системы в

фракции VIII, с размером частиц дисперсной фазы в диапазоне 122,4-164,2 нм.

92

Таблица 3.16 – Характеристика и антиоксидантная активность фракций,

полученных при разделении этанольного экстракта шрота*

Фракция

Содержание, Преобладающий компонент IC50,

% шрота* название % от

шрота* мкг/мл

VII 0,27

флаваноны 0,03

12,23 ликвиритигенин 0,07

изофлавоны 0,08

глицирризиновая кислота 0,02

XIII 1,58 изофлавоны 0,61

100,99 глицирризиновая кислота 0,09

XXI 2,03 изофлавоны 1,4

144,54 глицирризиновая кислота 0,04

XV 1,09

флавоны/флавонолы 0,41

156,17 флаваноны 0,14

ликвиритигенин 0,19

XXIII 1,08

изофлавоны 0,45

164,61 флаваноны 0,37

ликвиритигенин 0,05

XIX 0,28

простые фенолы/

оксибензойные кислоты 0,11

205

глицирризиновая кислота 0,01

XI 0,36

простые фенолы/

оксибензойные кислоты 0,15

478,29

глицирризиновая кислота 0,02

VIII 4,1

изофлавоны 1,57

-- халконы 1,02

глицирризиновая кислота 0,32

Для оценки антиоксидантной активности экстрактов применили наиболее

широко используемый метод определения антирадикальной активности в

отношении радикалов DPPH. Полученные результаты представлены в таблице

2.16 и приложении Г. Самую высокую антиоксидантную активность проявляют

вещества фракции VII (12,23), занимающее промежуточное положение по

активности между тролоксом (9,75±0,06мкг/мл [149]) и витамином Е (29,8±0,38

мкг/мл [150]), что можно объяснить высоким содержанием в ней

93

ликвиритигенина, изофлавонов, 2,3-дигидробензофурана и гидрохинона,

идентифицированные методом ГХ/МС (таблица 3.17).

Таблица 3.17 – Состав идентифицированных соединений методом ГХ/МС в

фракции VII

Пик

Время

удерживания,

мин

Соединение Молекулярный

ион M+

1 3,07 гваякол (2-метоксифенол) 109

2 4,48* 2,3-дигидробензофуран 120

3 5,27 гидрохинон 110

4 10,41 метил 3-4-гидроксифенил пропионат 107

5 29,34 не идентифицировано 57**

6 31,87 не идентифицировано 57**

7 32,48 не идентифицировано 149

8 34,34 не идентифицировано 57**

* имеет наибольшую интенсивность

** - дополнительный молекулярный ион М+ равный 207 (Приложение Д)

Фракции XIII, XXI с высоким выходом экстрактивных веществ имеют

значения антиоксидантной активности IC50

выше, чем исходный экстракт, до

разделения (222,19 мкг/мл), и близкое значение к активности, проявляемой

водно-метанольным (111,54±6,04 мкг/мл [151]), этанольным (165,18±6,49 мкг/мл

[149]) и метанольным (184,99 мкг/мл [134]) экстрактами из сырья – корня

солодки. Высокую антиоксидантную активность этим фракциям может

обеспечить преобладающее содержание в них изофлавонов.

На основе проведенных исследований для определения биологической

активности были выбраны фракции VII и VIII, способные обеспечить

противомикробные свойства и фракции XXI иVIII антимутагенную активность.

94

3.6 Биологическая активность фракций, полученных при разделении

этанольного экстракта шрота*

3.6.1 Исследование антимикробной активности объектов, выделенных

из шрота* солодки

Определение антимикробной активности этанольного экстракта шрота*,

фракций VII иVIII проведено методом диффузии в агар методом дисков [134] по

отношению к тест-культуре Staphylococcus aureus. Метод основан на оценке

угнетения роста тест-микроорганизмов определенными объектами исследования

примененных в диапазоне концентраций 50-500 мкг. Оценку результатов

проводили путем измерения диаметра зон задержки роста вокруг диска, включая

диаметр самого диска: отсутствие зоны задержки роста – испытуемая культура

не чувствительна к данной концентрации препарата; диаметр зоны задержки

роста 12 мм – умеренная чувствительность культуры к данной концентрации

препарата; диаметр зоны задержки роста более 14 мм – высокая

чувствительность испытуемой культуры к данной концентрации объекта

исследования. Результаты определения антимикробной активности исследуемых

объектов представлены на рисунке 3.11 и в таблице 3.18.

Рисунок 3.11 – Задержка роста Staphylococcus aureus (ATCC 29213): А - этанольный

экстракт шрота*; Б- фракцияVII; В- фракция VIII

95

Таблица 3.18 – Антимикробная активность этанольного экстракта из шрота* и

выделенных из него фракций (n=3)

Объект

исследования

Диаметр зоны задержки роста

Staphylococcus aureus (ATCC 29213), мм

50 мкг/диск 125

мкг/диск

250

мкг/диск

500

мкг/диск

Исходный

этанольный

экстракт

0 16,33±0,58 17,00±1,00 19,33±2,31

Фракция VII 0 12,23±0,68 17,33±2,52 25,00±4,36

Фракция VIII 0 0 0 0

*- контроль: диск с гентамицином в количестве 10 мкг дает диаметр зоны

задержки роста – 19 мм

Согласно полученным данным исходный этанольный экстракт, до

разделения, в концентрации 125-500 мкг/диск, и фракция VII, в концентрации

250-500 мкг/диск проявляют высокую антимикробную активность в отношении

Staphylococcus aureus (ATCC 29213). В концентрации 500 мкг/диск

антимикробная активность фракции VII превосходит активность исходного

этанольного экстракта в 1,3 раза. Высокую антимикробную активность фракции

VII вероятно обеспечивают содержащиеся в ней, кроме ликвиритигенина, 2,3-

дигидробензофуран и гидрохинон (таблица 3.17). Эти вещества обладают

широким спектром высокой антимикробной, фунгицидной и

противолейшманиозной активности [152-154]. Кроме того, 2,3-

дигидробензофуран обладает способностью ингибировать образование NO in

vitro, что актуально для лечения и/или контроля различные воспалительных

нарушений, например, при артрите, астме, желудочно-кишечных заболеваниях и

воспалительных состояниях центральной нервной системы [152-154].

Несмотря на то, что фракция VIII содержит наибольшее количество

глицирризиновой кислоты, халконов и изофлавонов, обладающих выраженными

96

антимикробными свойствами [155-157], она не показала активность во всем

исследуемом диапазоне 50-500 мкг. Это может быт связано с тем, что фракция

VIII остается после разделения веществ спиртового экстракта шрота* и в ней

подтверждено наличие дисперсной фазы, то есть вещества, способные проявлять

антимикробную активность, могут находиться в связанном состоянии. Защитный

эффект в отношении Staphylococcus aureus могут проявлять полисахариды

показанные в этой фракции, способствуя их интенсивному росту (рисунок 3.11,

В). Такой состав этой фракции предполагает то, что она должна проявлять

гепатопротекторные, иммуномодулирующие свойства, по аналогии с

лекарственным средством фосфоглив [110].

Исследованию антимикробной активности экстрактов из корня солодки,

полученных на их основе фракций, и индивидуальных соединений посвящено

большое количество работ [1, 155-157]. Полученный спиртовой экстракт из

шрота* и выделенная из него фракция VII, по сравнению с другими

извлечениями, полученными на основе корня солодки, обладают более высокой

антимикробной активностью.

Например, водный и спиртовой экстракты корня солодки при нанесении на

диск в два раза большем количестве (1000 мкг) дают сопоставимую зону

задержки роста Staphylococcus aureus (17,7 и 18,67 мм) [156]. Высокая

активность спиртового экстракта из шрота*, в сравнении с спиртовым

экстрактом из сырья, вероятно связана с тем, что последний получен с

использованием 95 % этанола, и в нем должно содержаться меньшее количество

гликозидированных фенольных соединений. Согласно полученным нами

данным (таблица 3.7) при применении 96 % этанола – экстракт содержит 0,32 %,

а 80 % этанола – экстракт содержит 0,70 % флавоноидов. Водный экстракт

получен после извлечения из сырья липофильных веществ хлороформом,

следовательно, часть терпеноидных веществ в его составе отсутствует.

В сравнении с гексановым и дихлорметановым экстрактами, полученными

из мелкоизмельченного корня солодки после водной экстракции [157],

этанольный экстракт и фракция VII имеют в 7,5 раза большую антимикробную

97

активность. Применение таких не полярных растворителей существенно снижает

в этих экстрактах содержание гликозидированных фенольных соединений и

глицирризиновой кислоты.

Таким образом, можно рекомендовать как исходный 80 % этанольный

экстракт из шрота*, так и выделенную из него фракцию VII для разработки на их

основе БАД или лекарственных средств, обладающих высоким антимикробным

действием.

3.6.2 Исследование антимутагенной активности объектов, выделенных

из шрота* солодки

Проведено определение антимутагенной активности по тесту Эймса в

отношении Salmonella typhimurium ТА 100 и Salmonella typhimurium ТА 98

фракций VIII и XXI (таблица 3.19).

Штамм S. typhimurium ТА 100 использован для определения

антимутагенной активности в отношении мутаций типа замены пар оснований, а

S. typhimurium ТА 98 для определения антимутагенной активности в отношении

мутаций типа сдвига рамки считывания [135]. Фракции VIII и XXI выбраны на

основании высокого содержания в них изофлавонов, а во фракции VIII еще и

халконов, кроме того они выходят при разделении спиртового экстракта с

высоким содержанием экстрактивных веществ. Известно, что выраженной

антимутагенной активностью обладают изофлавоны (глабридин) и халконы

(ликохалкон А) [158].

В выбранных для исследования фракциях присутствует незначительное

количество глицирризиновой кислоты, 2,9 % и 12,3 %, от количества

преобладающих фенольных соединений. Однако, согласно литературным

данным, глицирризиновая кислота и её аналоги не обладают антимутагенной

активностью [54].

98

Таблица 3.19 – Результаты исследования фракций XXI и VIII в тесте Эймса

Объект

исследования

Штамм

S. typhimurium ТА 100

Штамм

S. typhimuriumТА 98

50 мкг 250 мкг 500 мкг 50 мкг 250 мкг 500

мкг

Выживаемость, %

Фракция XXI 95,81 116,05 115,53 - - -

Фракция VIII 113,44 104,01 115,53 - - -

Мутагенность

Фракция XXI 1,14 1,12 1,16 0,91 1,25 1,16

Фракция VIII 1,08 1,03 1,23 1,22 1,22 0,99

Антимутагенность, %

Фракция XXI 7,35 8,12 36,71 3,24 10,90 34,38

Фракция VIII 35,76 37,06 44,43 5,69 10,41 11,01

При их исследовании (тест Эймса) в отношении S. typhimurium ТА 100 и S.

typhimurium ТА 1535даже в концентрации 2000 мкг они показывают только от

минус 3 % до 11 % активности.

Проверка исследуемых объектов на цитотоксичность (таблица 3.19)

показала, что они не проявляют этой активности, выживаемость микробных

клеток выше 95 %. Число колоний ревертантов, для двух штаммов, выросших в

присутствии исследуемых фракций и в негативном контроле, достоверно

различаются менее чем в 2,5 раза, что свидетельствует об отсутствии у них

мутагенной активности [135].

Для определения антимутагенной активности исследуемых фракций в

отношении мутаций типа замены пар оснований в качестве мутагена

использован азид натрия в дозировке 10 мкг/чашку. Показано, что фракция VIII

проявляет выраженную антимутагенную активность уже в концентрации 50 мкг,

почти в пять раз выше, по сравнению с активностью фракции XXI. Только в

99

концентрации 500 мкг они имеют сопоставимую активность – 44,43 % и 36,71 %.

Это вероятно связано с присутствием в фракции VIII халконов и большего

количества глицирризиновой кислоты. Можно предположить, что сочетание во

фракции VIII изофлавонов, халконов и глицирризиновой кислоты в

определенном соотношении 1,6:1,0:0,3 (таблица 3.15) приводит к

синергетическому эффекту в проявлении ею выраженной антимутагенной

активности.

Согласно литературным данным [159], изучена антимутагенная активность

в отношении мутаций типа замены пар оснований этилацетатной фракции и

остатка, полученных при разделении этанольного экстракта корня солодки,

которые близки по способу извлечения фракции XXI и фракции VIII,

выделенных из этанольного экстракта шрота* корня солодки. Сравнение

полученных результатов с литературными данными показывает, что активность

фракции XXI выше этилацетатной фракции в 1,8-2,2 раза, а остаток этанольного

экстракта корня солодки не проявляет антимутагенной активности.

Определение антимутагенной активности в отношении мутаций типа

сдвига рамки считывания для экстрактов из корня солодки и выделенных из него

индивидуальных соединений проведено впервые. В качестве мутагена

использован 2-нитрофлуорен в дозировке 10 мкг/чашку. Фракция XXI обладает

самой высокой антимутагенной активностью 34,38 % в концентрации 500

мкг/чашка. Фракция VIII проявляет слабую антимутагенную активность во всем

исследуемом диапазоне концентраций. В этом случае вещества этой фракции не

проявляют синергетический эффект в подавлении мутаций типа сдвига рамки

считывания, наблюдаемый для мутаций типа замены пар оснований.

Таким образом, можно рекомендовать фракцию XXI, выделенную из 80 %

этанольного экстракта из шрота*, для разработки на её основе БАД или

лекарственных средств, обладающих антимутагенным действием.

Проведенное исследование шрота корня солодки, полученного с

производства сиропа корня солодки, позволило получить ценные результаты,

которые могут быть внедрены на фармацевтических предприятиях отрасли.

100

Доказано, что из шрота корня солодки, полученного с производства сиропа

корня солодки, можно дополнительно извлечь около 41 % глицирризиновой

кислоты, основного компонента сырья, что позволят увеличить объем

производства препаратов из корня солодки.

На основе проведенных исследований показано, что в шроте содержится

большое количество углеводов различной структурной организации. Шрот

может быть использован для получения углеводов и разработки на их основе

БАД, например, из спирторастворимых полисахаридов (0,8 %), в виде

галактоглюканов, могут быть созданы иммуномодуляторы, на основе

структурных полисахаридов (31,7 %) – эффективные сорбенты. Крахмал (10,3 %)

может быть использован в фармацевтическом производстве как

вспомогательный компонент.

Определены оптимальные условия проведения экстракции шрота, которые

при практической реализации в условиях фармацевтического предприятия

позволят увеличить объем производства препаратов из корня солодки на основе

глицирризиновой кислоты и флавоноидов. Сопоставительный анализ

использования различных экстрагентов - водно аммиачный раствор,

подкисленный раствор ацетона и этанольные растворы с различным

содержанием спирта, позволил установить, что наилучшие результаты для

извлечения из шрота глицирризиновой кислоты (1,03 %) и флавоноидов (0,45 %)

показал 80 % раствор этанола. Фракционирование измельченного шрота

позволило сократить время проведения экстракции в 6 раз и снизить расход

экстрагента в 1,5-3,0 раза, по сравнению с экстракцией не измельченного шрота.

Для получения высокого выхода флавоноидов (0,51 % от шрота) целесообразно

использовать соотношение измельченный шрот: экстрагент 1:100, а для

высокого выхода глицирризиновой кислоты (0,88 % от шрота) – соотношение

1:40.

Установлено, что 80 % этанольный экстракт из шрота* корня солодки,

полученного с производства сиропа корня солодки, содержит:

101

- 0,3 % липофильных соединений, из них – 0,07 % углеводороды, в том

числе сквален, 0,05 % стерины и их эфиры, 0,015 % жирные кислоты и 0,015 %

триацилглицериды;

- 9,35 % фенольных соединений, из них – 4,32 % изофлавонов, 1,67 %

флавононов в том числе 0,31 % ликвиритигенина, 1,52 % халконов, 0,98 %

флавонов/флавонолов, 1,04 % простых фенолов/ оксибензойных кислот,

идентифицированы – 2,3-дигидробензофуран, гидрохинон, гваякол и метил 3-4-

гидроксифенил пропионат;

- 0,5 % глицирризиновой кислоты.

Фракционирование 80 % этанольного экстракт из шрота* корня солодки

позволило получить:

- фракцию VII (выход 0,3 %) проявляющую высокую антиоксидантную

активность IC50

12,23 мкг/мл, что в 18,5 раз выше, чем исходный экстракт, а

также высокую антимикробную активность в отношении Staphylococcus aureus

ATCC 29213, которая выше в 1,3 раза, чем исходный экстракт, что может быть

связано с совместным присутствием в ней глицирризиновой кислоты,

флавононов и изофлавонов; 2,3-дигидробензофурана и гидрохинона;

- фракцию XXI (выход 2,0 %), которая проявляет антимутагенную

активность 36,7 % - в отношении мутаций типа замены пар оснований и 34,4 % –

сдвига рамки считывания в концентрации 500 мкг,

- фракцию VIII (выход 4,1 %) которая проявляет антимутагенную

активность 35,8 % - в отношении мутаций типа замены пар оснований в

концентрации 50 мкг.

На основании проведенных исследований можно рекомендовать как

исходный 80 % этанольный экстракт из шрота*, так и выделенные из него

фракции, для разработки на их основе БАД или лекарственных средств,

обладающих высоким антиоксидантным, антимикробными антимутагенным

действием.

102

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В результате проделанной работы были сделаны следующие выводы:

1. Показано, что при переработке шрота корня солодки – отхода

производства сиропа корня солодки, при использовании в качестве экстрагента

подкисленного раствора ацетона, можно получить 2,76% глицирризиновой

кислоты (41% от ее содержания в сырье), 0,43% простых фенольных соединений

и 0,51% простых углеводов; а в качестве экстрагента 80%-ный водный раствор

этанола – 0,45% флавоно-идов.

2. Установлено, что в шроте корня солодки – отходе производства сиропа

корня солодки, содержится до 6,83% углеводов, из них простых углеводов 0,3%,

спирторастворимых полисахаридов (галакто-глюканы) – около 0,8%, пектиновых

веществ – 1,6%, крахмал – 10,3%, структурных полисахаридов (целлюлоза,

гемицеллюлоза) – 31,7%, и 12,33% белка.

3. Разделение веществ этанольного экстракта измельченного шрота

(фракция 2), позволило установить содержание в нём липофильных веществ –

0,32%, изофлавонов – 4,32%, флавононов, в т.ч. ликвирити-генина – 1,67%,

халконов –1,52%, флавонов/флавонолов –0,98%, простых фенолов/оксибензойных

кислот – 1,04%.

4. Установлена высокая антиоксидантная активность (IC50 12 мкг/мл)

фракции VII, выделенной из 80%-ного этанольного экстракта измельченного

шрота (фракция 2), наблюдаемая за счет совместного присутствия в ней

глицирризиновой кислоты, флавононов и изофлавонов в соотношении 1,6:1,0:0,3

и содержания в ней гидрохинона.

5. Показано, что антимикробная активность фракции VII, выделенной из

80% этанольного экстракта, полученного из измельченного шрота (фракция 2), в

концентрации 500 мкг/диск превосходит на 30% активность этого экстракта в

отношении Staphylococcus aureus (ATCC 29213).

6. С помощью теста Эймса показано, что фракции XXI, VIII, выделенные из

80% этанольного экстракта из измельченного шрота (фракция 2), не токсичны и

103

не обладают мутагенной активностью. Фракция VIII проявляет антимутагенную

активность в отношении мутаций типа замены пар оснований в концентрации 50

мкг, фракция XXI проявляет антимутагенную активность в отношении мутаций

типа замены пар оснований и сдвига рамки считывания в концентрации 500 мкг.

104

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ

1. Толстиков, Г.А. Солодка: биоразнообразие, химия, применения в

медицине / Г.А. Толстиков, Г.А. Балтина, Л.А. Гранкина, Р. М. Кондратенко, Т.Г.

Толстикова. – Новосибирск: Изд-во Новосибирского института органической

химии, 2007. – 314 с.

2. Литвиненко, В.И. Фармако-биологические и терапевтические свойства

препаратов солодки (обзор) [Электронный ресурс] / В.И. Литвиненко, А.С.

Аммосов, Т.П. Попова // Фармаком. – 2004. – 4. – Режим доступа:

http://farmacomua.narod.ru/licorice.

3. Резенькова, О.В. Изучение влияния экстракта солодки голой на процессы

адаптации организма: дис. … канд. биол. наук: 03.00.13 / Резенькова Ольга

Владимировна. – Ставрополь, 2003. – 175 с.

4. Монографии ВОЗ о лекарственных растениях, широко используемых в

новых независимых государствах (ННГ) [Электронный ресурс]. – ВОЗ, 2010. –

464 с. – Режим доступа: http://www.who.int/medicines/areas/traditional/monograph

_russian.pdf.

5. Егоров, М.В. Стандартизация сырья и препаратов солодки: дис. … канд.

фарм. наук: 15.00.02 / Егоров Максим Валерьевич. – Пермь, 2005. – 145 с.: ил.

6. Муравьев, И.А. Об установлении оптимальных сроков заготовки

солодкового корня / И.А. Муравьев // Ученые записки. – 1957. – С.73-83.

7. Правила сбора и сушки лекарственных растений: сборник инструкций //

М.: Медицина. – 1985. – С. 232-236.

8. Государственная фармакопея СССР. X издание, под. ред М.Д.

Машковского. – М.: Медицина, 1968. – 1074 с.

9. Ковалев, В.Н. Практикум по фармакогнозии: учеб. пособие для ВУЗов /

В.Н. Ковалев, Н.В. Попова, В.С. Кисличенко [и др.]. – Харьков: Золотые

страницы, 2003. – 512 с.

10. Tian, M. Extraction of glycyrrhizic acid and glabridin from Licorice / M.

Tian, H. Yan, K. Ho Row // International Journal of Molecular Sciences. – 2008. – V 9.

105

– P. 571-577.

11. Абжалелов, Б.Б. Получение глицирризиновой кислоты из солодкового

корня / Б.Б. Абжалелов, С.Ж. Кужамбердиева, А.Б. Асемов, А.Т. Мустафа //

Международный журнал экспериментального образования. – 2016. – № 5-1. – С.

100-104.

12. Рыбальченко, А.С.Исследование экстракции солодкового корня / А.С.

Рыбальченко, В.П. Голицын, Л.Ф. Комарова // Химия растительного сырья. –

2002. – № 4. – С. 55-59.

13. Денисова, С.Б. Жидкостно-твердофазная экстракция основных классов

биологически активных веществ корня солодки: дис. … канд. хим. наук: 02.00.04 /

Денисова Светлана Борисовна. – Уфа, 2000. – 166 с.: ил.

14. Гаврилин, М.В. Совершенствование способов оценки качества корней и

сиропа солодки / М.В. Гаврилин, С.П. Сенченко, А.М. Тамирян, А.В. Печенова //

Химия растительного сырья. – 2009. – № 4. – С. 147-150.

15. Тихомирова, К.С. Экстракция глицирризиновой кислоты из корня

солодки в среде субкритической воды / К.С. Тихомирова, Р.Н. Борисенко, Е.В.

Ветрова, С.Н. Борисенко, Е.В. Максименко, Н.И. Борисенко, В.И. Минкин //

Сверхкритические флюиды: Теория и Практика. – 2008. – Т. 3, № 3. – С. 71-74.

16. Азарова, О.В. Флавоноиды: механизм противовоспалительного действия

/ О.В. Азарова, Л.П. Галактионова // Химия растительного сырья. – 2012. – № 4. –

С. 61-78.

17. Толстиков, Г.А. Глицирризиновая кислота / Г.А. Толстиков, Л.А.

Балтина, Э.Э. Шульц, А.Г. Покровский / Биоорганическая химия. – 1997. – Т. 23,

№ 9. – С. 691-709.

18. Khaled A. Shams Green extraction: enhanced extraction yield of glycyrrhizic

acid from Glycyrrhiza glabra L. / Khaled A. Shams, Nahla S. Abdel-Azim, Sherin A.

Kamal, Husseiny A. Husseiny, Faiza M. Hammouda // Journal of Chemical and

Pharmaceutical Research. – 2015. – V 7 (4). – P. 725-728.

19. Яковишин, Л.А. Супрамолекулярные комплексы тритерпеновых

гликозидов солодки и пюща с бромгексино / Л.А. Яковишин, В.И. Гришковец,

106

Е.Н. Корж // Ученые записки Таврического национального университета им. В.И.

Вернадского. – 2013. – Т. 26, № 4. – С. 428-435.

20. Столярова, О.В. Выделение глицирризиновой кислоты и ее

моноаммонийной соли из корней и корневищ солодки Коржинского (Glycyrrhiza

korshinskyi grig) / О.В. Столярова, Г.Ф. Фаррахова, Л.А. Балтина (мл.) [и др.] //

Вестник Башкирского университета. – 2008. – Т. 13, № 2. – С. 256-258.

21. Martins, N. Characterization of phenolic compounds and antioxidant

properties of Glycyrrhiza glabra L. rhizomes and roots / N. Martins, А.L. Barros, А.M.

Duenas, С.C. Santos-Buelgac, I.C.F.R. Ferreira // RSC Advances – 2015. – V 5. – P.

26991-26997.

22. Suhayla K. Mohammed Antioxidative activities of aqueous and ethanolic

extracts of Licorice roots / Suhayla K. Mohammed // Pakistan Journal of Nutrition. –

2014. – V 13 (5). – P. 267-270.

23. Chung, J.G. Inhibitory actions of glycyrrhizic acid on arylamine N-

acetyltransferase activity in strains of Helicobacter pylori from peptic ulcer patients /

J.G. Chung // Drug and Chemical Toxicology. – 1998. – V 21. – P. 355-370.

24 Morsi, Mohamed K.S Study of antioxidants and anticancer activity of licorice

(Glycyrrhiza glabra) extracts [Электронный ресурс] / Mohamed K.S Morsi, Salwa B.

EL-Magoli, Nadia T. Saleh, Eshak M.G EL-Hadidy, Heba A. Barakat. – Режим

доступа: https://www.researchgate.net/publication/274193195_Study_of_antioxi

dants_and_anticancer_activity_of_licorice_Glycyrrhiza_glabra_extracts.

25. Harbome, J.B. The Flavonoids / J.B. Harbome, T.J. Mabry, H. Mabry. –

London, New York: Chapman and Hall. – 1975. – 1204 p.

26. Плясунова, О.А. Изучение анти-ВИЧ активности β-глицирризиновой

кислоты / О.А. Плясунова, И.Н. Егоричева, Н.В. Федюк, А.Г. Покровский, Л.А.

Балтина, Ю.И. Муринов, Г.А. Толстиков // Вопросы вирусологии. – 1992. – № 5-6.

– С. 235-238.

27. Chen, F. CONG, J. Technical optimization on ultrasonic extraction of

polysaccharide from liquorice / Department of Biology, Baicheng Normal Institute,

Baicheng 137000, China 2009 – 1 Serial P. 202-205.

107

28. Сабоиев, С.С. Химический состав подземных органов двух видов P.

Glycyrhiza L., произрастающих в Горно-Бадахшанской АО Таджикистана / С.С.

Сабоиев, Х.С. Мастоншоева, А.С. Султонназаров / Растительные ресурсы. – 1992.

– Т 28, № 2 . – С. 66-69.

29. Akmamedov, К. Chemical composition and hydrolysis of licorice oil cake / К.

Akmamedov, Kh. Annadurdyev, К. Dovletmuradov // Izv. AN Turkm. SSR. Ser. Biol.

Nauk. – 1984. – V 3. – P. 73-76.

30. Аммосов, А.С. Фенольные соединения родов солодки (Glycyrrhiza L.) и

раздельно лодочник (meristotropis fisch. Et Mey.) (Обзор) / А.С. Аммосов, В.И.

Литвиненко // Химико-фармацевтический журнал. – 2007. – Т. 41, № 7. – С. 30-52.

31. Тарасенко, Н.А. Натуральные сахарозаменители и подсластители для

профилактики сахарного диабета / Н.А. Тарасенко, Н.Р. Третьякова //

Современные проблемы науки и образования. – 2015. – № 2-2. – С. 87-94.

32. Дорохович, А.Н. Природные (натуральные) подсластители:

преимущества и недостатки с позиции применения при производстве

кондитерских изделий / А.Н. Дорохович, О.М. Яременко, В.В. Дорохович //

Продукты & Ингредиенты. – 2007. – № 4. – С. 32-34.

33. Муравьев, И.А. Замораживание как фактор очистки водных вытяжек

солодкового корня / И.А. Муравьев, В.И. Клипуновский // Материалы всесоюзной

научной конференции по совершенствованию производства лекарств и галеновых

препаратов. – Ташкент, 1969. – С. 160-162.

34. Немецкая фармакопея, DAB 9, S. 1331.

35. Георгиевский, В.П. Биологически активные вещества лекарственных

растений / В.П. Георгиевский, Н.Ф. Комиссаренко, СЕ. Дмитрук. – Новосибирск:

Наука, 1990. – 333 с.

36. Аммосов А.С. Фенольные соединения родов солодки (Glycyrrhiza L.) и

раздельноладочник (Meristotropis Fisch. et Mey.) (обзор) / А.С. Аммосов, В.И.

Литвиненко // Фармаком. – 2003. – № 2 – С.34-80.

37. Быков, В.А. Эффективность разработки лекарственных средств из

растительного сырья / В.А. Быков, В.К. Колхир, С.А. Вичканова, Т.А. Сокольская,

108

Н.М. Крутикова // Химия, технология, медицина: труды всеросс. научно-

исследовательского института лекарственных и ароматических растений. – М.,

2000. – С.177-185.

38. Ахтанова, Н.К. Анализ ликвиритона и халкорина методом ВЭЖХ / Н.К.

Ахтанова, Н.А. Тюкавкина, Ю.А. Колесник, В.Е. Ручкин, И.А. Руленко, В.И.

Литвиненко // Сборник тезисов докладов научно-практической конференции

«Резервы совершенствования лекарственного обеспечения населения РСФСР». –

Владимир, 1991. – С. 6-8.

39. Быков, В.А. Биомедицинская концепция создания лекарственных

препаратов на основе солодки / В.А. Быков, Г.Г. Запесочная // Биомедицинские

технологии: труды НПО. – Вып. 3. – М., 1996. – С. 31-42.

40. Заявка 2225491 Япония, МКИ С 07 H 15/256, а 61 К 35/78. Способ

экстракции глицирризина / Ф. Ясуо, Я. Хироси, Т. Хидэтоси, Т. Ку-нио, И.

Сусуму. – № 1-46954; заявл. 28.02.89; опубл. 07.09.90. // Кокай токкё, кохо. - Сер.

3(2). – 1990. – 79. – С. 1027-1030. – РЖ Хим. – 1992:110208П.

41. Государственная фармакопея СССР. 10-е изд. – М.:Медицина, 1968. –

1081 с.

42. Sultana, S. Antimicrobial, cytotoxic and antioxidant activity of methanolic

extract of Glycyrrhiza glabra / S. Sultana., A. Haque., K. Hamid., K.F. Urmi., S. Roy //

Agric. Biol. J. N. Am. – 2010. – V 1 (5). – P. 957-960.

43. Bassyouni, R.H. Antimicrobial potential of licorice: Leaves versus roots/ R.H.

Bassyouni, Z. Kamel, A. Megahid, E. Samir // African Journal of Microbiology

Research. – V. 6 (49). – P. 7485-7493.

44. Wang, L. The antiviral and antimicrobial activities of licorice, a widely-used

Chinese herb / L. Wang, R. Yang, B. Yuan, Y. Liu, C. Liu // Acta Pharmaceutica Sinica

B. – 2015. – V. 5, I. 4. – P. 310-315.

45. Балтина, Л.A. Перспективы создания новых противовирусных

препаратов на основе глицирризиновой кислоты и ее производных (обзор) / Л.A.

Балтина, Р.М. Кондратенко, Л.А. Балтина, О.А. Плясунова, А.Г. Покровский, Г.А.

Толстиков // Химико-фармацевтический журнал. – 2009. – Т. 43, № 10. – С. 3-12.

109

46. Аммосов, А.С. Солодка – технология, препараты, применение в мировой

практике: краткий обзор патентных источников / А.С. Аммосов, В.И. Литвиненко

// Фармаком. – 2003. – № 4. – С. 2-8.

47. Sakr, S.A. Protective effect of licorice on metiram fungicide induced liver

injury in mice / S.A. Sakr, A. EL-Kenawy, D. El-Sahra. // Canadian J. Pure Appl. –

2009. – V. 3, № 2. – P. 787-793.

48. Кондратенко, P.М. Получение глицирризиновой кислоты и её

практически важных солей из экстракта солодкового корня / P.М. Кондратенко,

Л.А. Балтина, Л.Р. Михайлова, В.Т. Данилов, Т.М. Габбасов, Ю.И. Муринов, Г.А.

Толстиков // Химико-фармацевтический журнал. – 2005. – Т. 39, № 2. – С. 30-35.

49. Imai, K. Radical scavenging ability of Glycyrrhizin/ K. Imai, Y. Takagi, A.

Iwazaki, K. Nakanishi // Free Radicals and Antioxidants. – 2013. – V. 3. – P. 40-42.

50. Chopra, P.K.P.G. Antimicrobial and antioxidant activities of methanol extract

roots of Glycyrrhiza glabra and hplc analysis / P.K.P.G. Chopra, B.D. Saraf, F.Inam,

S.S. Deo // International Journal of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences. – 2013. –

V. 5 (2). – P. 157-160.

51. Бескина, О.А. Возможные механизмы антиоксидантной активности

глицирризиновой кислоты / О.А. Бескина, А.Ю. Абрамов, А.Г. Габдулхакова, А.В.

Миллер, В.Г. Сафронова, М.В. Замараева. // Биоорганическая химия. – 2006. – Т.

52, № 1. – С. 60-68.

52. Астафьева, О.В. Использование Glycyrrhiza glabra L., Achillea micrantha

willd. и Helichrysum arenarium L. для разработки биопрепаратов с

антибактериальными свойствами: дис. ... канд. биол. наук: 03.01.06 / Астафьева

Оксана Витальевна. – Астрахань, 2013. – 193 с.: ил.

53. Астафьева, О.В. Противомикробная активность выделенных

биологически активных веществ и экстракта корня Glycyrrhiza glabra L / О.В.

Астафьева, Л.Т. Сухенко, М.А. Егоров // Химия растительного сырья. – 2013. – №

3. – С.261-263.

54. Zani, F. Inhibition of mutagenicity in salmonella-typhimurium by Glycyrrhiza

glabra extract, glycyrrhizinic acid, 18- alpha-glycyrrhetinic and 18-beta-glycyrrhetinic

110

acids / F. Zani, M.T. Cuzzoni, M. Daglia, S. Benvenuti, G. Vampa, P. Mazza // Planta

Med. – 1993. – V. 59 (6). – P. 502-507.

55. Utomski, J. Liquorice, Glycyrrhiza glabra L. biological properties / J.

Utomski, C. Nieman, G.R. Fenwick // Herba Polonica. – 1991. – V. 37 (3-4). – P. 163-

178.

56. Segal, R Anticariogenic activity of licorice and glycyrrhizine. 1. Inhibision of

in vitro plaque-formation by streptococcus-mutans / R. Segal, S. Pisanty, R. Wormser et

al. // J. Pharm. Sci. – 1985. – V. 74 (l). – P. 79-81.

57. Mitscher, L.A. Anti-microbial agents from higher-plants - antimicrobial

isoflavonoids and related substances from Glycyrrhiza glabra L. var typical / L.A.

Mitscher, Y.H. Park, D. Clark, J.L. Beal // J. Nat. Prod. – 1980. – V. 43 (2). – P. 259-

269.

58. Haraguchi, H. Mode of antibacterial action of retrochalcones from

Glycyrrhiza inflate / H. Haraguchi, K. Tanimoto, Y. Tamura, K. Mizutani, T. Kinoshita

// Phytochemistry. – 1998. – V. 48 (1). – P. 125-129.

59. Орманов, Н.Ж. Биологическая активность и фармакологические

свойства препаратов из корня солодки / Н.Ж. Орманов, Р.К. Пернебекова, Л.Н.

Орманова, Л.Д. Жолымбекова, Киргизбаева А.А. // Вестник КазНУ. Серия

биологическая. – 2013. – № 2 (58). – С. 147-151.

60. Nirmala, P. Anti-inflammatory and anti-bacterial activities of Glycyrrhiza

glabra L. / P. Nirmala, T. Selvaraj // Journal of Agricultural Technology. – 2011. –

Vol. 7 (3). – P. 815-823.

61 Базекин, Г.В. Антибактериальные свойства комплекса глицирризиновой

кислоты с левомицетином / Г.В. Базекин, А.Ф. Исмагилова, А.П. Апасова и др. //

Сборник тезисов докладов VIII Российского национального конгресса «Человек и

лекарство». – Москва, 2001. – С. 544.

62. Астафьева, О.В. Исследование возможности применения биологически

активных компонентов растительных экстрактов в производстве препаратов для

нужд косметологии и фармакологии / О.В. Астафьева // Рациональное питание,

пищевые добавки и биостимуляторы. – 2014. – № 1. – С. 13-13.

111

63. Дикусар, Е.А. Синтез и изучение фунгицидной активности аминовых

солей глицирризиновой кислоты / Е. А. Дикусар, В. И. Поткин, Н. Г. Козлов, Р. А.

Гаджилы, Р. Т. Тлегенов, А. П. Ювченко, Р. А. Желдакова // Химия растительного

сырья. – 2011. – № 4. – С. 53-56.

64. Плясунова, О.А Изучение анти-ВИЧ-активности глицирризиновой

кислоты / О.А. Плясунова, И.П. Егорычева, Н.В. Федюк и др. // В вопросе

вирусологии. – 1992. – № 5. – С. 235-237.

65. Pompei, R. Activity of glycyrrhiza glabra extract and glycyrrhizic acid on

vims growth and infectivity / R. Pompei // R. Riv. Farmacol. Ter. – 1979. – V. 10 (3). –

P. 281-284.

66. Utsunomiya, Т. Glycyrrhizin improves the resistance of thermally injured

mice to opportunistic infection of herpes-simplex- virus type-1 / T. Utsunomiya, M.

Kobayashi, D.N. Herndon, R.B. Pollard, F. Suzuki // Immunol. Lett. – 1995. – V. 44

(1). – P. 59-66.

67. Ito, M. Inhibitory effect of glycyrrhizin on the in vitro infectivity and

cythopathic activity of the human immunodeficiency virus [HIV (HTLV-III/LAV)] / M.

Ito, H. Nakashima, M. Baba, R. Pauwels, E. De Clercq, S. Shigeta, N. Yamamoto //

Antiviral. Res. – 1989. – V. 7. – P. 127-137.

68. Hirabayashi, K. Antiviral activities of glycyrrhizin and its modified

compounds against human immunodeficiency virus type I (HTV-I) and herpes simplex

virus type I (HSV-I) in vitrto / K. Hirabayashi, S. Iwata, H. Matsumoto, T. Mori, Sh.

Shibata, M. Baba, M. Ito, Sh. Shigeta // Chem. And Pharm. Bull. – 1991. – V. 39 (1). –

P. 112-115.

69. Fiore, C. Antiviral Effects of Glycyrrhiza species / C. Fiore., M. Eisenhut, R.

Krausse, E. Ragazzi, D. Pellati, D. Armanini, J. Bielenberg // Phytother. Res. – 2008. –

V. 22. – P. 141-148.

70. Uto, T. Interaction Analysis of Glycyrrhizin on Licorice Extract-Induced

Apoptosis of Human Leukemia Cells y Knockout Extract / T. Uto, N. Huu Tung, O.

Morinaga, Y. Shoyama // Nat Prod Chem Res. – 2013. – V. 1 (2).

112

71. Li, Xiao-Lan. Evaluation of the Immunity Activity of Glycyrrhizin in AR

Mice / Xiao-Lan Li, Ai-Guo Zhou // Molecules. – 2012. – V. 17. – P. 716-727.

72. Муравьев, И.А. Противовоспалительные и ранозаживляющие свойства 1

% мазей натриевой соли 18-дегидроглицирретовой кислоты в эксперименте / И.А.

Муравьев, С.А. Кулешова, Е.В. Сиверская // Экспериментальная и клиническая

фармакология. – 2001. – Т. 64, № 4. – С.50-52.

73. Bae, E.A. In Vitro inhibitory effect of some flavonoids on Rotavirus

infectivity / E.A. Bae, M.J. Han, M. Lee et al // Biol. Pharm. Bull. – 2000. – Vol. 23 (9).

– P. 1122-1224.

74. Yu, Ji-Yeon. Anti-Inflammatory Activities of Licorice Extract and Its Active

Compounds, Glycyrrhizic Acid, Liquiritin and Liquiritigenin, in BV2 Cells and Mice

Liver / Ji-Yeon Yu, Jae Yeo Ha, Kyung-Mi Kim, Young-Suk Jung, Jae-Chul Jung,

Seikwan Oh // Molecules. – 2015. – V. 20. – P. 13041-13054.

75. Абрамова, Г.А. Солодка уральская и ее использование в пищевой и

фармацевтической промышленности / Г.А. Абрамова, М.В. Палагина // Вестник

ТГЭУ. – 2005. – № 1. – С. 77-87.

76. Ложкин, Ю.Г. Разработка состава и технологии комплексных

противокашлевых препаратов природного происхождения: дис. … канд. фарм.

наук: 14.04.01 / Ложкин Юрий Геннадьевич. – Москва, 2015 – 127 с.

77. Павлова, С.И. Корень солодки. Возможные механизмы антитоксических,

антиканцерогенных и противоопухолевых свойств (обзор) / С.И. Павлова, Б.С.

Утешев, А.В. Сергеев // Химико-фармацевтический журнал. – 2003. – Т. 37, № 6. –

С. 36-39.

78. Авдеева, Е.В. Изучение некоторых фенольных и терпеноидных соедине-

ний, используемых в стандартизации лекарственных растений: автореф. дис. …

канд. фарм. наук: 15.00.02 / Авдеева Елена Владимировна. – М., 1997. – 23 с.

79. Mohamed, H.M. Abd El Azim. Some Biological Effects of the Phenolic

Content of Licorice Roots (Glycyrrhiza glabra L.) / H. M. Abd El Azim. Mohamed, El-

Gerby Mohamed, A. M. Abdelgawad Ahmed, M. D. ElMesallamy Amani // Global

Advanced Research Journal of Agricultural Science. – 2016. – V. 5 (2). – Р. 88-93.

113

80. Chen, M. Licochalcone-A, a new antimalarial agent, inhibits in vitro growth

of the human malaria parasite plasmodium-falciparum and protects mice from P-yoelii

infection / M. Chen, T.G. Theander, S.B. Christensen, L. Hviid, L. Zhai, A. Kharazmi //

Antimicrob. Agents Chemother. – 1994. – V. 38 (7). – P. 1470-1475.

81. Christensen, S.B. An antileishmaial chalcone from Chinese licorice roots /

S.B. Christensen, C. Ming, L. Andersen, U. Hjorne, C.E. Olsen, C. Cornett, T.G.

Theander, A. Kharazmi // Planta Med. – 1994. – V. 60 (2). – P. 121-123.

82. Bi, W. Studies on the antiviral effect of Glycyrrhiza Uralensis Fish,

polysaccharide (GPS) / W. Bi, G. Yang // Zhongguo Zhougyao. Zazhi. – 1989. – V. 14

(4). – P. 236-238.

83. Pat. 02304024 [90304024] Japan, CI. A 61 К 31/70. Synergistic virucide

containing glycy- coumarin, licochalcone A, and/or isolicoflavonol and glycyrrhizin for

HIV virus / K. Miyamoto, T. Okuda, K. Hirabayashi – № 89/125251; заявл. 18.05.89,

опубл. 17.12.1990. – C.A. 1991:115:5:41976j.

84. Заявка 27118.353 Франция, МКИ 6 A 61 К 31/525. Лекарственные

препараты на основе нетоксичных биологических веществ, предназначенные для

защиты гениталий и слизистой оболочки прямой кишки / Berque J. - № 9404232;

Заявл. 11.04.94; Опубл. 13.10.95. -РЖ Хим. 1997:150123П.

85. Zadeh, J.B. Licorice (Glycyrrhiza glabra Linn) As a Valuable Medicinal Plant

/ J.B. Zadeh, Z.M. Kor, M.K. Goftar // International journal of Advanced Biological and

Biomedical Research. – 2013. – V. 1, I. 10. – Р. 1281-1288.

86. Кароматов, И.Д Солодка, лакричник, лакрица – применение в медицине

(обзор литературы) / И.Д. Кароматов // Актуальные проблемы гуманитарных и

естественных наук. – 2013. – № 11-2. – С. 230-235.

87. Eerdunbayaer, Structures of two new flavonoids and effects of licorice

phenolics on vancomycin-resistant Enterococcus Species / Eerdunbayaer, M.A. Orabi,

H. Aoyama, T. Kuroda, T. Hatano // Molecules. – 2014. – V. 19 (4). – P. 3883-3897.

88. Hu Zhiyong. Optimization of Ultrasound Assisted Extraction of

Isoliquiritigenin from Licorice by Response Surface Methodology / Hu Zhiyong, Zhou

114

Yajing, Xu Xia, Liu Shuyan, Jing Jie // The Open Chemical Engineering Journal. –

2015. – V. 9. – P. 149-154.

89. Gupta, M. Free radical scavenging activity of aqueous and alcoholic extracts

of Glycyrrhiza glabra Linn. measured by ferric reducing antioxidant power (FRAP),

ABTS bleaching assay (αTEAC), DPPH assay nd peroxyl radical antioxidant assay /

M. Gupta, N. Karmakar, S. Sasma, S. Chowdhury, S. Biswas // International Journal of

Pharmacology and Toxicology. – 2016. – V. 4 (2). –P. 235-240.

90. Damle, M. Glycyrrhiza glabra (liquorice) – a Potent medicinal herb/ M.

Damle // International Journal of Herbal Medicine. – 2014. – V. 2 (2). – P. 132-136.

91. Сhopraa, P.K.P. Antimicrobial and antioxidant activities of methanol extract

roots of Glycyrrhiza glabra and HPLC-analysis / P.K.P. Сhopraa, Binda D. Sarafa,

Farhin Inama, Sujata S. Deoa // International Journal of Pharmacy and Pharmaceutical

Sciences. – 2013. – V. 5 (2). – P. 0975-1491.

92. Park, Chun-Geon Biological activities of licorice F1 lines and content

analysis of phytochemical constituents / Chun-Geon Park, Ah Young Lee, Jeong Hoon

et.al. // Natural Product Sciences. – 2014. – V. 20 (3). – Р. 137-145.

93. Park, Chun-Geon Comparison of biological activities of Glycyrrhiza glabra

and G. uralensis / Chun-Geon Park, Ah Young Lee, Jeong Min Lee1 et al. // Arch. Biol.

Sci. – 2014. – V. 66 (4). – P. 1431-1439.

94. Насибуллин, Р.С. Комплекс 3,5,7,3,4-пентаоксифлавонола с

фосфатидилхолином / Р.С. Насибуллин, Т.И. Никитина, Ю.Г. Афанасьева и др. //

Химико-фармацевтический журнал. – 2002. – Т. 36, № 9. – С. 33-36.

95. Оболенцева, Г.В. Фармакологические и терапевтические свойства

препаратов солодки (обзор) / Г.В. Оболенцева, В.И. Литвиненко, А.С. Аммосов и

др. // Химико-фармацевтический журнал. – 1999. – Т. 33, № 8. – С. 24-31.

96. Li, Ch. Characteristics of delayed excretion of flavonoids in human urine after

administration of Shosaikoto, a herbal medicine / Ch. Li, M. Homman, K. Oka // Biol.

and Pharm. Bull. – 1998. – V. 21 (12). – P. 1251-1257.

97. Павлова, С.И. Флавоноиды корня солодки влияют на функции

активированных Т-лимфоцитов мыши и человека / С.И. Павлова, Д.З. Албегова,

115

Г.О. Дибирова, Н.Б. Дмитриева, И.Г. Козлов // Российский иммунологический

журнал. – 2011. – Т. 5 (14), № 1. – 62-678.

98. Албегова, Д.З. Механизмы иммуносупрессивного действия флавоноидов

корня солодки при контактной чувствительности у мышей: угнетение функции T-

лимфоцитов-эффекторов опосредуется неэффекторными клетками / Д.З.

Албегова, А.А. Кягова, И.Г. Козлов, С.И. Павлова // Медицинская иммунология. –

2010. – Т. 12, № 6. – С. 503-510.

99. Цицуашвили, М. Исследование на доклиническом уровне

противоопухолевых эффектов флавоноидов корня солодки: дис. … канд. биол.

наук: 14.03.06 / Цицуашвили Майя. – М., 2012. – 22 с.

100. Xia, GUO Anti-cancer activity of flavonoids from Xinjiang Glycyrrhiza

inflata Licorice on proliferation, cytotoxicity and apoptosis in cervical carcinoma cells /

GUO Xia, Rukiya Мatsidik, Sheng lei, Abulizi Аbudula // Journal of Medicinal Plants

Researchю – 2013. – V. 7 (5). – Р. 173-178.

101. Литвиненко, В.И. Ретрохалканоиды. Перспективы применения

ликохалконов в создании оригинальных лекарственных средств с

противовоопухолевым, спазмолитическим, противодиабетическим действием.

Сообщение 2 (обзор литературы) / В.И. Литвиненко, А.С. Аммосов, Н.В. Попова,

С.И. Дихтярев, Н.Ф. Маслова // Біологія та фармація. – 2013. – № 4. – С. 46-49.

102. Wittschier, N. Aqueous extracts and polysaccharides from Liquorice roots

(Glycyrrhiza glabra L.) inhibit adhesion of Helicobacter pylori to human gastric

Mucosa / N. Wittschier, G. Faller, A. Hensel // Journal of Ethnopharmacology – 2009. –

V. 125, I. 2. – P. 218-223.

103 Shen, H. A polysaccharide from Glycyrhiza inflate Licorice inhibits

proliferation of human oral cancer cells by inducing apoptosis via mitochondrial

pathway / H. Shen, G. Zeng, B. Sun, X. Cai // Tumor Biol. – 2015. – V. 36. – P. 4825-

4831.

104. Zhao, C.F. Heterogeneity and characterization of mitogenic and

anticomplementary pectic polysaccharides from the roots of Glycyrrhiza uralensis Fisch

116

et D.C. / C.F. Zhao, K. Hiroaki, Y. Haruki, T. Norito, K. Hideki //Carboted, hydr.Res. –

1991. – V. 219. – P. 149-172.

105. Куркин, В.А. Стандартизация корней солодки голой и лекарственного

препарата «Cолодки экстракт жидкий» / В.А. Куркин, М.В. Егоров //

Фундаментальные исследования. – 2014. – № 6-6. – С. 1232-1236.

106. Li, G. Migration behavior and separation of active components in

Glycyrrhiza uralensis Fisch and its commercial extract by micellar electrokinetic

capillary chromatography / G. Li, H. Zhang, Y. Fan, L. Zhao, Z. Hu // Chromatography.

– 1999. – V. 863. – P. 105-114.

107. ВФС 42-419-75 «Глицирам».

108. Муравьев, И.А. Способ получения глицирама / И.А. Муравьев, Т.П.

Зюбр // Авт. свид. СССР 914060 (заявл. 21.05.79).2.

109. ВФС 42-482-75 «Таблетки глицирама 0,05г.» Изменение № 1 от 26.

02.80г.

110. Ипатова, О.М. Фосфоглив: механизм действия и применение в клинике

/ О.М. Ипатова. – М., 2005. – 318 с.

111. Ипатова, O.M. Сравнительное исследование действия эссенциале и

нового отечественного гепатопротектора «Фосфолив» на модели острого гепатита

у крыс / О.М. Ипатова, Т.И. Торховская, В.А. Княжев и др. // Вопросы

медецинской химии. – 1998. – Т. 44, вып. 6. – С. 544-550.

112. Арыстанова, Т.Н. Рувимин – гепатопротектор растительного

происхождения / Т.Н. Арыстанова, А.Ж. Арыстанова, А.О. Сонбекова // Сборник

тезисов докладов VIII Российского национального конгресса «Человек и

лекарство». – М., 2001. – С. 541.

113. Венгеровский, А.И. Влияние препаратов глюкокортикоидов на

метаболизм печени / А.И. Венгеровский, Н.О. Батурина, А.С. Саратиков //

Экспериментальная и клиническая фармакология. – 1999. – Т. 62, № 1. – С. 75-80.

114. ГОСТ 42-505-96 Продукция медицинской промышленности.

Технологические регламенты производства. Содержание, порядок разработки,

согласования и утверждения. – М., 1996.

117

115. ФС 42-2656-89 «Таблетки ликвиритона 0,1 г.»

116. Литвиненко, В.И. Способ получения ликвиритона /В.И Литвиненко,

Г.В.Оболенцева, Е.Е. Борзунов, В.П. Георгиевский // Авт. свид. СССР (ДСП)

345714 (1972 г.).

117. ФС 42-2425-86 «Ликвиритон».

118. Краев, Л.Н. Шрот солодки – ценное сырье для получения белковых

кормовых дрожжей / Л.Н. Краев, И.Ф. Высоцкая, Н.Г. Баринова // Гидролизная и

лесохимическая промышленность. – 1989. – № 4. – С. 5.

119. Государственная фармакопея СССР. Вып. 1: Общие методы анализа. –

11-е изд., доп. – М., 1987. – 336 с.

120. ГОСТ Р 52838-2007 Корма. Методы определения содержания сухого

вещества. – Введ. 2009-01-01. – М.: Стандартинформ, 2008. – 11 с.

121. ГОСТ 26226-95 Корма, комбикорма, комбикормовое сырье. Методы

определения сырой золы. – Взамен ГОСТ 26226-84; введ. 2003-07-01. – Минск:

Межгосударственый совет по стандартизации, метрологии и сертификации, 2003.

– 8 с.

122. ГОСТ 13496.4-93. Корма, комбикорма, комбикормовое сырье. Методы

определения содержания азота и сырого протеина. – Взамен ГОСТ 13496.4-84;

введ. 1995-01-01. – Минск: Межгосударственный совет по стандартизации,

метрологии и сертификации, 2011. – 18 с.

123. ГОСТ Р 52839-07 Методы определения содержания сырой клетчатки с

применением промежуточной фильтрации. – Введ. 2007-12-27. – М.:

Стандартинфо, 2011. – 30 с.

124. ГОСТ 13496. 15-97 Корма, комбикорма, комбикормовое сырье. Методы

определения содержания сырого жира. – Взамен ГОСТ 13496.15-85; введ. 2005-

02-01. – Минск: Межгосударственный совет по стандартизации, метрологии и

сертификации, 1997. – 13 с.

125. Ермаков, А.И. Методы биохимического анализа растений / А.И.

Ермаков, В.В. Арасимович, М.И. Смирнова-Иконникова и др. – Ленинград:

Колос, 1972. – 456 с.

118

126. ГОСТ 29059-9. Продукты переработки плодов и овощей.

Титриметрический метод определения пектиновых веществ. – Введ. 1992-06-30. –

М.: Стандартинформ, 2010. – 5 с.

127. Полюдек-Фабини, Р. Органический анализ / Р. Полюдек-Фабини, Т.

Бейрих. – Ленинград: Химия, 1981. – 623 с.

128. Государственная фармакопея СССР: Вып. 2. Общие методы анализа.

Лекарственное растительное сырье. 11-е изд., доп. – М.: Медицина, 1990. – 400 с.

129. Бибикова, Н.Е. Комплексная технология переработки корня солодки:

автореф. дис. … канд. фарм. наук. 15.00.01 / Бибикова Наталья Евгеньевна. – М.,

1999. – 24 с.

130. Reich, E. High-performance thin-layer chromatography for the analysis of

medicinal plants. 1st edition / E. Reich, A. Schibli. – New-York, 2006. – 280 p.

131. База данных NIST [Электронный ресурс]. – Режим доступа:

http://webbook.nist.gov/chemistry.

132. Mensor, L.I. Screening of Brazilian plants extracts for antioxidants activity

by the use of DPPH free radical method / L.I. Mensor, F.S. Menezes, G.G. Leitao //

Phytother. Res. – 2001. – V. 15. – P. 127-130.

133. Brand-Williams, W. Use of a free radical method to evaluate antioxidant

activity / W. Brand-Williams, M.E. Cuvelier, С. Berset // LWT Food Sciene and

Technology. – 1995. – Т. 28, V. 1. – Р. 25-30.

134. NCCLS. Performance standards for antimicrobial susceptibility testing; ninth

informational supplement M100-S9.- 1999.- V.19.- N.1.

135. Ильинская, О.Н. Методы генетической токсикологии: учебно-

методическое пособие / О.Н. Ильинская, Н.С. Карамова, А.Б. Маргулис – Казань:

Казанский университет, 2012. – 36 с.

136. Халед, Ш.М. Переработка шрота солодки. I Анализ экстрактивных

веществ / Ш.М. Халед, Е.И. Голубина, В.Р. Хабибрахманова, М.А. Сысоева //

Вестник Казанского технологического университета, 2014.–Т.17, №14.– 426-427 с.

119

137. Джумамуратова, А. Углеводный состав солодки / А. Джумамуратова,

С.Т. Алламбергенова, Т. Сдыков // Вестник КК ФАН УзССР. – 1990. – № 4. – С

52-57.

138. Shimizu, N. A novel neutral polysaccharide having activity on the

reticuloendothelial system from the root of Glycyrrhiza uralensis / N. Shimizu, M.

Tomoda, M. Kanari, R. Gonda, A. Satoh, N. Satoh // Chem Pharm Bull Nov. – 1990. –

V. 38 (11) – P. 3069 – 3071.

139. Kardošova, A. A biologically active fructan the roots of Arctium lappa L.

var. Herkules / A. Kardošova, A. Ebringerová, J. Alföldi, G. Nosál’ova, S. Fraňova, V.

Hříbalová // Biological macromolecules. – 2003. –V. 33. –P. 135-140.

140. Габдрахманова, А.Р. Выделение крахмала из шрота корня солодки/ А.Р.

Габдрахманова, Ш.М. Халед, В.Р. Хабибрахманова, М.А. Сысоева // XV

Международная конференция молодых ученых «Пищевые технологии и

биотехнологии». – Казань, 2016. – С. 164-166.

141. Наканиси, К. Инфракрасные спектры и строение органических

соединений / К. Наканиси. – М.: Мир, 1965. – 216 с.

142. Халед, Ш.М. Содержание углеводов в шроте корня солодки / Ш.М.

Халед, В.Р. Хабибрахманова, М.А. Сысоева // XIII Международная конференция

молодых ученых «Пищевые технологии и биотехнологии». – Казань, 2014. – С.18.

143. Гагиева, Л.Ч. Определение технологических параметров получения

жидкого экстракта из солодки голой / Л.Ч. Гагиева, А.Г. Ваниев, В.Н. Габеев, Б.Г.

Цугкиев, О.Н. Макиев // Известия горского государственного аграрного

университета. – 2011. – Т. 48, ч. 2. – С. 266-268.

144. Государственная фармакопея РФ. Том III. Изд. 13-е. – М.: ФЭМБ, 2015.

– 1294 с.

145. Хабибрахманова, В.Р. Выбор экстрагента для увеличения выхода

тритерпеноидных веществ и флавоноидов из сырья и шрота корня солодки

(GLYCYRRHIZAE RADICES) / В.Р. Хабибрахманова, М.А. Сысоева, Ш.М.

Халед, А.Р. Габдрахманова // Вопросы биологической медицинской и

фармацевтической химии. 2016. – Т.19, №11. – С. 16-20.

120

146. Ranpariya, M.G. Evaluation of total phenols and antibacterial activity of

certain drug plants against some bacterial species / M.G. Ranpariya, R.S. Chudasama //

Journal of applied and natural science. – 2010. – V. 2 (1). – P. 140-144.

147. Корулькин, Д.Ю. Природные флавоноиды / Д.Ю. Корулькин, Ж.А.

Абилов, Р.А. Музычкина, Г.А. Толстиков. – Новосибирск: Тео, 2007. – 232 с.

148. Хабибрахманова, В.Р. Переработка шрота корня солодки II.

Тритерпеноидные и флавоноидные вещества этанольных экстрактов / В.Р.

Хабибрахманова, Ш.М. Халед, А.Р. Габдрахманова, М.А. Сысоева // Химия

растительного сырья. 2016, №11. – С. 97-102.

149. Корниевская, В.С. Изучение влияния супрамолекулярных структур глиц-

ирризиновой кислоты на реакционную способность органических молекул методами

1Н-ЯМР и ХПЯ / В.С. Корниевская, А.И. Круппа, Т.В. Лешина // Химическая,

биологическая и медицинская физика. – 2008. – Т. 3, вып. 1. – С. 37-46.

150. Radha, R. Phytochemical analysis of Glycyrrhiza glabra / R. Radha, G.

Rajaathi // Indian journal of science. – 2015. – V. 22. – P. 59-68.

151. Visavadiya, N.P. Evaluation of antioxidant and anti-atherogenic properties of

Glycyrrhiza glabra root using in vitro models / N.P. Visavadiyа, B. Soni, N. Dalwadi //

International journal of food sciences and nutrition. – 2009. – V. 60. – P 135-149.

152. Dang, N.H. 2-Benzyl-benzofurans from the tubers of Ophiopogon japonicas

[Электронный ресурс] / N.H. Dang, N.D. Chung, H.M. Tuan et al. // Chemistry Central

Journal. – 2017. Режим доступа: https://doi.org/10.1186/s13065-017-0242-z.

153. Волобой, Н.Л. Изучение антимикробного действия арбутина и

гидрохинона в отношении некоторых представителей грамотрицательной флоры /

Н.Л. Волобой, Л.Ю. Бутакова, И.В. Смирнов // Химия растительного сырья. –

2013. – № 1. – С. 179-182.

154. De Castro Oliveira L.G. In vitro effects of the neolignan 2,3-dihydrobenzofuran

against Leishmania Amazonensis / L.G. de Castro Oliveira, L.M. Brito, M.M. de Moraes

Alves // Basic and clinical pharmacology and toxicology. – 2017. – V. 120 (1). –.P. 52-58.

121

155. Gaur, R. Drug resistance reversal potential of isoliquiritigenin and

liquiritigenin isolated from Glycyrrhiza glabra against methicillin-resistant

Staphylococcus aureus (MRSA) / R. Gaur, V. Kumar Gupta, P. Singh, A. Pal, M.

Padurang Darokar, R. Singh Bhakuni // Рhytotherapy research. – 2016. – V. 30, I. 10. –

P. 1708-1715.

156. Patil, S.M. Antimicrobial activity of Glycyrrhiza glabra linn. roots / S.M.

Patil, M.B. Patila, G.N. Sapkale // Journal of chemical sciences. – 2009. – V. 7 (1). – P.

585-591.

157. Asan-Ozusaglam, M. Evaluation of biological activity and antioxidant

capacity of Turkish licorice root extracts / M. Asan-Ozusaglam, K. Karakoca //

Romanian biotechnological letters. – 2014. – V. 19 (1). – P. 8994-9005.

158. Inamia, K. Antimutagenic components in Glycyrrhiza against N-methyl-N-

nitrosourea in the Ames assay / K. Inamia, Y. Mine, Y. Kojob, S. Tanakaa, S.

Ishikawab, M. Mochizukia // Natural product research. – 2016. – V. 31, I. 6. – P. 691-

695.

159. Inami, K. Isolation and characterization of antimutagenic components of

Glycyrrhiza aspera against N-methyl-N-nitrosourea / K. Inami, Y. Mine, J. Tatsuzaki,

C. Mori, M. Mochizuki // Genes and environment. – 2017. – V. 39 (5).

122

Приложение А

Рисунок А1 - Протокол анализа сырья

123

Приложение А

Рисунок А2 – Протоколы анализа сырья, шрота и его фракций

124

Приложение А

Рисунок А3 – Протоколы анализа сырья и шрота

125

Приложение Б

Протоколы анализа ТСХ стандарта глицирризиновой кислоты, на

(лабораторный комплекс «GAMAG»)

126

127

128

Рисунок Б1 – Протоколы анализа качественного состава БАВ в экстракте

сырья и шрота корня солодки, полученные извлечением, различными

экстрагентами (0,25 % раствора гидраксида аммония, ацетон подкисленный 3 %

раствором азотной кислоты и 80 % этанол) методом ТСХ (лабораторный

комплекс «GAMAG»)

129

130

Рисунок Б 2– Протоколы анализа качественного состава БАВ в экстрактах

шрота, полученных извлечением 40 %, 70 %, 80 % и 96 % этанолом, методом

ТСХ (лабораторный комплекс «GAMAG»)

131

132

Рисунок Б3 – Протоколы анализа качественного состава БАВ в экстрактах

фракции 2, полученных извлечением 80 % этанолом, методом ТСХ

(лабораторный комплекс «GAMAG») при следующих условиях: А –

соотношение фракция 2 : экстрагент 1:40, n = 3, B – соотношение фракция 2 :

экстрагент 1:100, n = 3, В – соотношение фракция 2 : экстрагент 1:40, n = 1, D

– соотношение фракция 2 : экстрагент 1:100, n = 1.

133

Приложение Б

Рисунок Б4 – Протоколы анализа качественного состава БАВ в фракциях этанольного экстрата фракции 2 методом ТСХ

(лабораторный комплекс «GAMAG»). 1 и 2 – диэтилэфирная фракция VII при 254 и 354 нм соответственно; 3 и 4 –

фракция VIII при 254 и 354 нм соответственно; 5 и 6 – этанольная фракция XXIII при 254 и 354 нм соответственно; 7 и 8 –

этанольная фракция XV при 254 и 354 нм соответственно; 9 и 10 – диэтилэфирная фракция XIX при 254 и 354 нм

соответственно; 11 и 12 – диэтилэфирная фракция XI при 254 и 354 нм соответственно; 13 и 14 – этилацетатная фракция

XXI при254 и 354 нм соответственно; 15 и 16 – этилацетатная фракция XIII при254 и 354 нм соответственно.

134

Таблица Б5-Результаты хроматографирования фракции VII (0,27 % от шрота)

№

Без обработки После обработки

Отнесение видимый свет λ= 254 нм λ= 354 нм AlCl3,

видимый

свет

Na2CO3,

видимый

свет

Метанол +

H2SO4,

видимый

свет Цвет пятна

Rf

пика

Rf

пика

% пика по

площади

Rf

пика

% пика по

площади

1 светло-корич. 0,04 0,04 0,38 0,04 0,27 светло-корич. корич. бледно-корич. флавон/ флавонол

2 светло-корич. 0,05 0,05 2,75 0,05 2,57 светло-корич. корич. бледно-корич. флавон/ флавонол

3 -- -- 0,07 1,97 0,07 4,58 светло-корич. корич. красно-корич. халкон

4 -- -- 0,08 2,82 -- -- бледно-желт. светло-желт. светло-желт. изофлавон

5 -- -- 0,11 1,01 0,11 1,90 бледно-корич. бледно-корич. светло-желт. флавон/ флавонол

6 бледно-корич. 0,18 0,18 4,01 0,17 1,33 светло-корич. корич. бледно-корич. простые фенолы

/оксибензойные кислоты

7 -- -- 0,21 5,62 0,20 7,43 -- -- розово-фиолет. ГК и её производные

8 бледно-желт. 0,27 0,28 3,63 0,28 13,46 бледно-корич. корич. бледно-корич. халкон

9 -- -- 0,33 16,73 -- -- бледно-желт. светло-желт. светло-желт. изофлавон

10 -- -- -- -- 0,36 2,67 бледно-корич. бледно-желт. ярко-желт. флаванон

11 светло-желт. 0,39 0,40 38,25 0,40 13,71 бледно-корич. бледно-желт. ярко-желт. флаванон

12 -- -- -- -- 0,45 41,60 бледно-корич. светло-корич. желто-оранж. ликвиритигенин

(флаванон)

13 бледно-корич. 0,57 0,57 8,86 -- -- бледно-желт. светло-желт. светло-желт. изофлавон

14 -- -- -- -- 0,63 0,31 бледно-корич. бледно-желт. бледно-корич. флаванон

15 бледно-корич. 0,74 0,75 0,66 0,74 2,45 бледно-корич. бледно-желт. бледно-корич. халкон

16 бледно-корич. 0,97 0,98 13,32 0,97 7,72 бледно-корич. бледно-желт. бледно-корич. халкон

135

Таблица Б6- Результаты хроматографирования фракции VIII (4,10% от шрота)

№

Без обработки После обработки

Отнесение видимый свет λ= 254 нм λ= 354 нм AlCl3,

видимый

свет

Na2CO3,

видимый

свет

Метанол

+H2SO4,

видимый свет Цвет

пятна

Rf

пика

Rf

пика

% пика по

площади

Rf

пика

% пика по

площади

1 -- -- 0,01 3,51 0,01 5,78 бледно-корич. корич. бледно-корич. халкон

2 -- -- 0,03 14,11 -- -- бледно-желт. светло-желт. светло-желт. изофлавон

3 -- -- 0,11 8,39 0,11 6,00 светло-корич. корич. бледно-корич. флавон/ флавонол

4 -- -- 0,21 8,52 -- -- бледно-желт. светло-желт. светло-желт. изофлавон

5 -- -- 0,28 8,25 -- -- бледно-желт. светло-желт. светло-желт. изофлавон

6 -- -- 0,36 7,79 -- -- -- -- розово-фиолет. ГК и её производные

7 --. -- 0,43 7,32 -- -- бледно-желт. светло-желт. светло-желт. изофлавон

8 -- -- -- -- 0,86 8,66 бледно-корич. бледно-желт. бледно-корич. флаванон

9 -- -- 0,89 0,62 0,89 25,63 бледно-корич. светло-корич. желто-оранж. ликвиритигенин

(флаванон)

10 -- -- 0,97 21,49 0,96 53,93 бледно-корич. корич. бледно-корич. халкон

136

Таблица Б7 – Результаты хроматографирования фракции XI (0,36 % от шрота)

№

Без обработки После обработки

Отнесение видимый свет λ= 254 нм λ= 354 нм AlCl3,

видимый

свет

Na2CO3,

видимый

свет

Метанол +

H2SO4,

видимый свет Цвет пятна

Rf

пика

Rf

пика

% пика по

площади

Rf

пика

% пика по

площади

1 светло-оранж. 0,10 0,09 1,95 0,10 2,76 светло-корич. светло-корич. бледно-корич. флавон/ флавонол

2 -- -- -- -- 0,13 2,31 светло-корич. светло-корич. светло-корич. флаванон 3 корич. 0,16 0,15 2,24 0,16 3,83 светло-корич. светло-корич. темно-корич. халкон 4 -- -- 0,17 2,13 -- -- светло-корич. светло- желт. бледно-корич. изофлавон 5 светло-оранж. 0,20 0,19 3,17 0,19 5,98 светло-корич. светло-оранж. оранж. халкон 6 -- -- 0,24 5,87 0,23 6,84 -- -- розово-фиолет. ГК и её производные 7 -- -- -- -- 0,27 2,23 светло-корич. светло-корич. бледно-корич. флаванон

8 бледно-желт. 0,29 0,29 8,00 -- -- бледно-корич. светло-корич. розово-красн. простые фенолы

/оксибензойные кислоты 9 -- -- 0,33 1,73 0,31 7,30 бледно-корич. светло-корич. ярко-желт. ликвиритигенин

(флаванон) 10 светло-желт. 0,36 0,37 2,49 0,37 16,56 светло-корич. светло-корич. ярко-желт. флаванон 11 -- -- 0,44 1,55 -- -- бледно-корич. светло-корич. светло-желт. изофлавон

12 бледно-желт. 0,48 0,49 14,70 0,50 12,54 бледно-корич. бледно-корич. розово-фиолет.

в центре желт.

терпеноидное

соединение/флавон

13 -- -- -- -- 0,53 3,70 светло-корич. желто-оранж. бледно-желт. флаванон

14 бледно-желт. 59 0,60 0,20 -- -- бледно-корич. бледно-желт. бледно-желт. изофлавон

15 -- -- 0,61 0,24 -- -- бледно-корич. бледно-желт. бледно-желт. изофлавон 16 -- -- 0,65 1,19 0,64 6,85 бледно-корич. бледно-желт. бледно-желт. халкон 17 -- -- 0,69 6,34 0,68 9,33 бледно-корич. бледно-желт. бледно-желт. халкон

18 -- -- -- -- 0,72 6,15 бледно-корич. бледно-желт. бледно-желт. флаванон

19 бледно-желт. 0,74 0,74 9,58 -- -- бледно-корич. бледно-желт. бледно-желт. изофлавон

20 светло-желт. 0,79 0,79 10,82 0,79 5,51 бледно-корич. бледно-желт. бледно-желт. простые фенолы

/оксибензойные кислоты

21 -- -- 0,87 3,21 0,88 2,24 бледно-корич. бледно-желт. бледно-желт. флавон/ флавонол

22 -- -- 0,9

0 13,22

0,9

0 1,42 бледно-корич. бледно-желт. бледно-желт.

простые фенолы

/оксибензойные кислоты

23 -- -- 0,9

3 11,35

0,9

3 4,45 бледно-корич. бледно-желт. бледно-желт.

простые фенолы

/оксибензойные кислоты

137

Таблица Б8 – Результаты хроматографирования фракции XIII (1,58 % от шрота)

№

Без обработки После обработки

Отнесение видимый свет λ= 254 нм λ= 354 нм AlCl3,

видимый

свет

Na2CO3,

видимый

свет

Метанол

+ H2SO4,

видимый свет Цвет пятна

Rf

пика

Rf

пика

% пика по

площади

Rf

пика

% пика по

площади

1 бледно-корич. 0,12 0,12 0,76 0,13 1,38 бледно-корич. светло-корич. светло-корич. флавон/ флавонол 2 -- -- 0,14 0,79 -- -- бледно-корич. светло-корич. светло-корич. изофлавон 3 светло- оранж. 0,16 0,16 1,83 0,16 3,95 бледно-корич. светло-корич. светло-корич. халкон 4 светло- оранж. 0,18 0,18 6,22 0,18 10,11 бледно-корич. желто-корич. желто-оранж. халкон 5 -- -- 0,22 6,00 0,22 11,06 -- -- розово-фиолет. ГК и её производные 6 бледно-корич. 0,24 0,27 4,16 0,26 13,20 бледно-корич. светло-желт. светло-корич. халкон

7 бледно-корич. 0,29 0,28 6,86 -- -- бледно-корич. светло-желт. ярко-розово. простые фенолы

оксибензойные кислоты 8 -- -- 0,33 1,07 0,35 10,54 бледно-корич. светло-желт. желт. ликвиритигенин

(флаванон) 9 бледно-желт. 0,39 0,39 0,53 0,39 1,39 бледно-корич. бледно-желт. бледно-желт. халкон 10 -- -- -- -- 0,51 6,68 светло-корич. светло-

корич.

бледно-корич. флаванон 11 бледно-желт. 0,57 0,58 0,74 -- -- бледно-корич. светло-желт. светло-корич. изофлавон 12 бледно-желт. 0,64 0,63 0,83 0,62 4,08 бледно-корич. бледно-желт. бледно-корич. халкон 13 -- -- 0,65 0,46 -- -- бледно-корич. светло-желт. светло-корич. изофлавон 14 -- -- 0,66 1,03 -- -- бледно-корич. светло-желт. светло-корич. изофлавон 15 -- -- -- -- 0,71 0,87 светло-корич. светло-корич. бледно-корич. флаванон 16 -- -- -- -- 0,73 0,39 светло-корич. светло-корич. бледно-корич. флаванон 17 -- -- -- -- 0,75 1,94 светло-корич. светло-корич. бледно-корич. флаванон

18 бледно-желт. 0,78 0,78 11,84 0,79 5,52 бледно-корич. бледно-желт. бледно-корич. простые фенолы/

оксибензойные кислоты 19 -- -- 0,80 8,75 -- -- бледно-корич. светло-желт. светло-корич. изофлавон

20 -- -- -- -- 0,84 0,93 светло-корич. светло-корич. бледно-корич. флаванон

21 -- -- -- -- 0,87 2,95 светло-корич. светло-корич. бледно-корич. флаванон

22 -- -- -- -- 0,88 2,60 светло-корич. светло-корич. бледно-корич. флаванон

23 -- -- -- -- 0,90 4,35 светло-корич. светло-корич. бледно-корич. флаванон

24 -- -- 0,92 26,42 -- -- бледно-корич. светло-желт. светло-корич. изофлавон

25 -- -- 0,98 0,41 -- -- бледно-корич. светло-желт. светло-корич. изофлавон

138

Таблица Б9- Результаты хроматографирования фракции XIX (0,28% от шрота)

№

Без обработки AlCl3,

видимый

свет

Na2CO3,

видимый

свет

Метанол

+ H2SO4,

видимый

свет

Отнесение видимый свет λ= 254 нм λ= 354 нм

Цвет пятна Rf

пика

Rf

пика

% пика по

площади

Rf

пика

% пика по

площади

1 светло-корич. 0,08 0,08 2,16 0,09 3,06 светло-корич. светло-корич. бледно-корич. флавон/ флавонол 2 светло-оранж. 0,12 0,12 2,13 0,13 3,62 светло-корич. светло-корич. темно-корич. халкон 3 -- -- 0,16 2,95 0,15 4,21 светло-корич. светло- желт. бледно-корич. халкон 4 -- -- 0,17 5,72 0,17 9,83 светло-корич. светло-оранж. оранж. халкон 5 бледно-желт. 0,21 0,22 5,38 0,22 9,84 -- -- розово-фиолет. ГК и её производные 6 -- -- 0,26 2,76 -- -- светло-корич. светло-корич. бледно-корич. изофлавон 7 бледно-желт. 0,27 0,27 4,58 0,27 5,74 бледно-корич. светло-корич. розово-красн. терпеноидное

соединение/флавон 8 бледно-желт. 0,32 0,31 1,97 0,30 5,94 бледно-корич. светло-корич. ярко-желт. ликвиритигенин

(флаванон) 9 -- -- 0,34 1,85 -- -- светло-корич. светло-корич. ярко-желт. изофлавон

10 бледно-желт. 0,36 0,36 2,21 0,36 15,55 бледно-корич. светло-корич. светло-желт. халкон 11 -- -- 0,38 1,07 -- -- бледно-корич. бледно-корич. розово-фиолет. терпеноидное

соединение/флавон 12 желт-оранж 0,50 0,50 18,26 0,50 16,34 светло-корич. желто-оранж. розово-фиолет.

в центре желт.

терпеноидное

соединение/флавон 13 бледно-желт. 0,54 0,54 1,82 0,54 8,53 бледно-корич. бледно-желт. бледно-желт. халкон 14 -- -- 0,68 3,83 0,67 3,84 бледно-корич. бледно-желт. бледно-желт. флавон/ флавонол 15 -- -- 0,73 1,92 0,72 1,06 бледно-корич. бледно-желт. бледно-желт. флавон/ флавонол

16 бледно-желт. 0,78 0,78 13,72 0,79 3,99 бледно-корич. бледно-желт. бледно-желт. изофлавон/оксибензо

йные кислоты 17 светло-желт. 0,85 -- -- 0,85 0,92 бледно-корич. бледно-желт. бледно-желт. флаванон 18 -- -- -- -- 0,88 1,07 бледно-корич. бледно-желт. бледно-желт. флаванон

19 -- -- 0,90 27,66 0,91 6,47 бледно-корич. бледно-желт. бледно-желт. изофлавон/оксибензо

йные кислоты

139

Таблица Б10- Результаты хроматографирования фракции XXI (2,03% от шрота)

№

Без обработки после обработки

Отнесение видимый свет λ= 254 нм λ= 354 нм

AlCl3,

видимый свет

Na2CO3,

видимый

свет

Метанол

+ H2SO4,

видимый

свет Цвет пятна

Rf

пика

Rf

пика

% пика по

площади

Rf

пика

% пика по

площади

1 -- -- −− −− 0,16 2,58 светло-корич. светло-корич. бледно-корич. флаванон

2 -- -- −− −− 0,17 2,69 светло-корич. светло-корич. бледно-корич. флаванон

3 -- -- 0,25 2,24 0,22 5,78 -- -- розово-

фиолет.

ГК и её

производные 4 -- -- 0,28 1,04 0,28 7,41 светло-корич. светло-желт. бледно-корич. халкон

5 -- -- −− −− 0,34 6,97 бледно-корич. светло-корич. желто-оранж. ликвиритигенин

(флаванон) 6 -- -- 0,44 0,37 −− −− светло-корич. светло-корич. бледно-корич. изофлавон

7 бледно-желт. 0,45 0,45 0,39 −− −− светло-корич. светло-корич. бледно-корич. изофлавон

8 -- -- 0,47 1,83 −− −− бледно-корич. светло-корич. светло-желт. изофлавон

9 бледно-желт. 0,48 0,48 1,99 0,48 9,59 светло-корич. светло-корич. бледно-корич. халкон

10 бледно-желт. 0,50 −− −− 0,50 3,53 светло-корич. светло-корич. бледно-корич. флаванон

11 -- -- 0,58 5,25 −− −− бледно-корич. светло-корич. бледно-корич. изофлавон

12 -- -- 0,67 1,12 −− −− бледно-корич. светло-корич. бледно-корич. изофлавон

13 -- -- 0,71 4,89 −− −− светло-корич. светло-желт. светло-желт. изофлавон

14 -- -- 0,72 2,53 −− −− светло-корич. бледно-корич. светло-желт. изофлавон

15 -- -- 0,73 3,59 0,73 5,99 светло-корич. светло-корич. бледно-корич. флаванон

16 -- -- 0,80 18,59 0,81 9,47 светло-корич. светло-корич. бледно-корич. Простые фенолы/

оксибензойные

кислоты

17 -- -- −− −− 0,89 49,52 светло-корич. светло-корич. бледно-корич. флаванон

18 -- -- 0,91 55,53 −− −− бледно-корич. бледно-корич. светло-желт. изофлавон

19 -- -- 0,98 0,66 −− −− светло-корич. светло-желт. бледно-корич. изофлавон

140

Таблица Б11- Результаты хроматографирования фракции XXIII (1,08% от шрота)

№

Без обработки После обработки

Отнесение видимый свет λ= 254 нм λ= 354 нм AlCl3,

видимый

свет

Na2CO3,

видимый

свет

Метанол

+ H2SO4,

видимый

свет

Цвет

пятна

Rf

пика

Rf

пика

% пика по

площади

Rf

пика

% пика по

площади

1 -- -- 0,28 1,39 -- -- бледно-корич. светло-корич. светло-корич. изофлавон

2 -- -- -- -- 0,37 1,99 светло-корич. светло-корич. бледно-корич. флаванон

3 -- -- -- -- 0,39 0,77 светло-корич. светло-корич. бледно-корич. флаванон

4 -- -- -- -- 0,44 2,26 светло-корич. светло-корич. бледно-корич. флаванон

5 -- -- -- -- 0,46 1,95 светло-корич. светло-корич. бледно-корич. флаванон

6 -- -- 0,49 4,19 0,4 2,30 бледно-корич. бледно-желт. бледно-корич. простые фенолы

/оксибензойные

кислоты 7 -- -- 0,59 17,82 -- -- бледно-корич. светло-желт. светло-корич. изофлавон

8 корич. 0,60 0,60 15,61 0,60 26,16 бледно-корич. светло-корич. светло-корич. флавон/ флавонол

9 -- -- -- -- 0,62 22,86 светло-корич. светло-корич. бледно-корич. флаванон

10 корич. 0,68 0,68 8,84 -- -- бледно-корич. бледно-желт. бледно-корич. изофлавон

11 -- -- 0,73 2,69 -- -- бледно-корич. бледно-желт. бледно-желт. изофлавон

12 -- -- 0,78 11,13 -- -- бледно-корич. светло-желт. светло-корич. изофлавон

13 -- -- -- -- 0,80 24,75 светло-корич. светло-корич. бледно-корич. флаванон

14

корич.

0,82 0,84 38,33 0,82 6,96 бледно-корич. светло-корич. желто-оранж. ликвиритигенин

(флаванон)

141

Таблица Б12- Результаты хроматографирования фракции XV (1,09% от шрота)

№

Без обработки После обработки

Отнесение видимый свет λ= 254 нм λ= 354 нм AlCl3,

видимый

свет

Na2CO3,

видимый

свет

Метанол

+ H2SO4,

видимый свет Цвет

пятна Rf пика Rf пика

% пика

по

площади

Rf

пика

% пика

по

площади

1 -- -- -- -- 0,05 0,40 светло-корич. светло-корич. бледно-корич. флаванон

2 -- -- -- -- 0,08 0,94 светло-корич. светло-корич. бледно-корич. флаванон 3 -- -- -- -- 0,10 0,91 светло-корич. светло-корич. бледно-корич. флаванон 4 -- -- 0,21 3,78 -- -- бледно-корич. светло-желт. светло-корич. изофлавон 5 -- -- 0,26 1,91 0,25 6,37 бледно-корич. бледно-желт. бледно-желт. халкон

6 -- -- 0,29 3,77 0,29 2,09 бледно-корич. бледно-желт. бледно-корич. Простые

фенолы/оксибензойные

кислоты 7 -- -- 0,31 0,87 0,31 3,02 бледно-корич. бледно-желт. бледно-желт. халкон

8 -- -- -- -- 0,36 2,34 светло-корич. светло-корич. бледно-корич. флаванон

9 -- -- 0,38 2,91 0,38 1,07 бледно-корич. бледно-желт. бледно-корич. Простые

фенолы/оксибензойные

кислоты 10 -- -- 0,47 7,12 0,43 4,61 светло-корич. светло- корич. бледно-корич. флаванон 11 -- -- 0,54 9,23 0,51 8,89 светло-корич. светло- корич. бледно-корич. флавон/ флавонол 12 -- -- -- -- 0,57 8,82 бледно-корич. светло-корич. желто-оранж. флаванон 13 корич. 0,60 0,59 14,00 0,60 10,21 бледно-корич. бледно-желт. бледно-корич. флавон/ флавонол 14 -- -- 0,63 6,44 0,62 15,58 бледно-корич. бледно-желт. бледно-желт. халкон

15 -- -- 0,66 9,76 -- -- бледно-корич. бледно-желт. бледно-корич. изофлавон 16 корич. 0,78 0,78 14,86 0,79 15,50 бледно-корич. светло-корич. светло-корич. флавон/ флавонол

17 -- -- 0,82 25,34 0,82 19,25 бледно-корич. бледно-желт. желто-оранж. ликвиритигенин

(флаванон)

142

Приложение В

Рисунок В1 – ВЭЖХ анализ исходного этанольного экстракта из шрота

Рисунок В2– ВЭЖХ анализ гидролизата исходного этанольного экстракта из

шрота

143

Приложение В

Рисунок В3– Калибровка хроматограммы и со стандартными углеводов

исходного этанольного экстракта из шрота

144

Приложение Г

Таблица Г1 – Анализ антиоксидантной активности экстракта и фракций корня солодки (D метанола = 0,0393)

Объекты

исследования

Концентрация

С, мкг/мл

Оптическая

плотность

контрольного

раствора

Оптическая

Плотность

Холостого

раствора

Оптическая

Плотность

Опытного

раствора

Ак Ао

Процент

Ингибирования

Iср, %

IС50**,

мкг/мл

1 2 3 4 5 6 7 8

222,19

экстракт

фракции 2

шрота,

извлеченный

80 % этанолом

(1:40, 2ч, n=3)

110

0,5180

0,0415 0,4186; 0,3987; 0,4139

0,4787

0,3771; 0,3572; 0,3724 22,94±2,17

220 0,0447 0,3308; 0,3273; 0,3171 0,2861; 0,2826; 0,2724 41,43±1,49

330 0,0509 0,2468; 0,2136; 0,2112 0,1959; 0,1627; 0,1603 63,87±4,17

440 0,0495 0,1532; 0,1529; 0,1563 0,1037; 0,1034; 0,1068 78,14±0,39

диэтилэфирн

ая фракция

VII

537

0,4582

0,0413 0,4108; 0,4006; 0,3990

0,4189

0,3695; 0,3593; 0,3577 13,54±1,53

12,23 1073 0,0423 0,3442; 0,3388; 0,3374 0,3019; 0,2965; 0,2951 28,90±0,86

1252 0,0435 0,3127; 0,3058; 0,3183 0,2692; 0,2623; 0,2748 35,84±1,49

1431 0,0431 0,2782; 0,2990; 0,2994 0,2351; 0,2559; 0,2563 40,53±2,89

диэтилэфирн

ая фракция

ХI

149

0,5180

0,0410 0,4075; 0,4153; 0,4202

0,4787

0,3665; 0,3743; 0,3792 22,01±1,33

478,29 298 0,0436 0,3373; 0,3431; 0,3483 0,2937; 0,2995; 0,3047 37,48±1,15

447 0,0448 0,1469; 0,2732; 0,2848 0,1021; 0,2284; 0,2400 51,07±1,36

596 0,0464 0,2257; 0,2259; 0,2230 0,1793; 0,1795; 0,1766 62,72±0,33

894 0,0475 0,1558; 0,1483; 0,1803 0,1083; 0,1008; 0,1328 76,19±3,49

этилацетатна

я фракция

XIII

46

0,5180

0,0417 0,3721; 0,3659; 0,3694

0,4787

0,3304; 0,3242; 0,3277 31,60±0,65 100,99

93 0,0449 0,3063; 0,3073; 0,3106 0,2614; 0,2624; 0,2657 45,02±0,47

187 0,0513 0,1354; 0,1389; 0,1311 0,0841; 0,0876; 0,0798 82,49±0,82

этанольная

фракция XV

81

0,5180

0,0499 0,3843; 0,3755; 0,3770

0,4787

0,3344; 0,3256; 0,3271 31,27±0,98 156,17

163 0,0609 0,2737; 0,2670; 0,2774 0,2128; 0,2061; 0,2165 55,76±1,10

326 0,0926 0,1678; 0,1666; 0,1640 0,0752; 0,0740; 0,0714 84,64±0,41

диэтилэфирн

ая фракция

3,6 0,4582

0,0428 0,4115; 0,4168; 0,4179 0,4189

0,3687; 0,3740; 0,3751 11,05±0,82 205,00

7,2 0,0446 0,3452; 0,3570; 0,3591 0,3006; 0,3124; 0,3145 26,19±1,78

145

Продолжение таблицы Г1

1 2 3 4 5 6 7 8 9

XIX

14,4

0,0472 0,2342; 0,2419; 0,2132

0,187; 0,1947; 0,1660 56,41±3,54

21,6 0,0467 0,173; 0,1806; 0,1740 0,1263; 0,1339; 0,1273 69,16±0,98

36 0,0506 0,1151; 0,1153; 0,1095 0,0647; 0,0645; 0,0589 85,03±0,78

этилацетатна

я фракция

ХXI

54

0,4787

0,0468 0,3982; 0,4161

0,4394

0,3514; 0,3693 17,99±2,33

144,54

108 0,0517 0,2779; 0,3041 0,2262; 0,2524 45,54±2,99

162 0,0561 0,2320; 0,2250 0,1759; 0,1689 60,76±0,91

216 0,0585 0,1872; 0,1905 0,1287; 0,1320 70,71±1,09

270 0,0653 0,1591; 0,1621 0,0938; 0,0968 78,65±0,92

этанольная

фракция ХXIII

110

0,5180

0,0531 0,3588; 0,3648; 0,3661

0,4787

0,3057; 0,3117; 0,3130 35,21±0,81

164,61 220 0,074 0,2443; 0,2322; 0,2392 0,1703; 0,1582; 0,1652 65,62±1,26

330 0,0799 0,1730; 0,1720; 0,1676 0,0931; 0,0921; 0,0877 80,99±0,60

440 0,097 0,1479; 0,1561; 0,1547 0,0509; 0,0591; 0,0577 88,32±0,92

Фракция VIII ---

* Оптическая плотность метанола равна 0,0393

** IС50 – концентрация объекта исследования, которая необходима для ингибирования 50 % DФПГ-радикала.

146

Рисунок Г1 – Оценка антиоксидантной активности объектов исследования с применением реактива ДФПГ

147

Приложение Д

Рисунок Д1- Масс-хроматограмма по полному ионному току фракции VII полученной из шрота

148

1. Масс-спектр 2,3-дигидробензофуран, 3. Масс-спектр метил 3-4-гидроксифенил пропионат,

время удерживания 4,48 мин время удерживание 10,41 мин

1. Масс-спектр гидрохинона, 4. Масс-спектр 1,2-benzenedicarboxylic acid, butyl

время удерживание 5,27 мин 2-methylpropyl ester, время удерживание 17,36

149

Приложение Е

Рисунок Е1- Антимикробная методика, методом диффузии в агар методом дисков по отношению к тест- культуре

Staphylococcus aureus ATCC® 29213™.

150