CAICET, Pub/. Cient. N° 3, 1985, 125-138 125 ------------------------------------

Estudio morfológico comparativo de microfilarias de Onchocerca volvulus

de Liberia, Togo y Venezuela (Comunicación preliminar)

CARLOS BOTT01, LIGIA SAMPSON2, MYRTHA ARANGd, PEDRO BELMONTE2, CARLOS AYESTA3 Y LUIS YARZABAL2

1 Sección de Endemias Rurales, Instituto de Medicina Tropical, Universidad Central de Venezuela, Apartado 2109, Caracas, Venezuela.

2Centro Amazónico para Investigación y Control de Enfermedades Tropicales «Simón Bolívar» (CAICET), Apartado 59, Puerto Ayacucho 7101, Territorio

Federal Amazonas, Venezuela.

3 Laboratorio de Fotografía, Facultad de Ciencias, Universidad Central de Venezuela, Caracas, Venezuela

Resumen

Se estudiaron las características morfológicas de microfilarias de Onchocerca vo/vu­lus de la Sierra Parima (Alto Orinoco, Venezuela), Togo y Liberia, procesadas con una técnica estandarizada de fijación y coloración y se determinaron los recuentos nucleares de mfs de Togo y Parima, de acuerdo con la técnica de Tada et al. (1981), comparán­dose las diferentes poblaciones por análisis de varianza. Los resultados demostraron di­ferencias significativas en todas las variables examinadas entre Parima y Liberia y en 6 de 9 variables entre Parima y Togo, así como en los recuentos nucleares . En Liberia se comprobó la existencia de una variedad fácilmente distinguible de las mfs de Parima y Togo. Los hallazgos preliminares apoyan la existencia de razas geográficas de O. vol­vulus asociadas a diferentes especies de simúlidos vectores y sugieren que podrían ser diferenciables morfológicamente en la fase de microfilaria.

Introducción

Onchocerca volvulus comprende un conjunto de razas geográficas, que se diferen­cian por su capacidad para infectar distintas especies de simúlidos vectores, por su pa­togenicidad para el hombre y animales de experimentación y por los patrones de activi­dad enzimática de las microfilarias (De León et al., 1966; Duke et al., 1966 y 1972; Du­ke, 1970 y 1981; Ornar, 1978 y 1982; Prost et al., 1980; Yarzábal et al., 1983c).

El reconocimiento de que la adaptación a los ve.:tores locales parece ser un factor importante de selección natural (Sasa, 1979) ha llevado a distinguir a dichas razas geo­gráficas con el nombre de complejos Onchocerca- Simulium.

Évidencias preliminares sugieren que en el Alto Orinoco (Venezuela) y en el Territo­rio Roraima (Brasil) existe un peculiar complejo Onchocerca-Simulium, responsable de la severa endemia oncocercósica que sufre el grupo indígena yanomama. Este foco geo-

126 C. Botto el al.

gráficamente aislado se caracteriza por presentar pacientes con altas cargas parasitarias en la piel y con microfilarias en la cámara anterior del ojo, en la sangre y en la orina de un elevado número de individuos (Rassi el al., 1978; Botto el al., 1982; Yarzábal el al., 1983a)

En estos pacientes son frecuentes los nódulos cefálicos, las lesiones oculares y las le­siones severas de piel y sistema linfático (ingle colgante). Los transmisores principa­les en este foco son S. pinloi y S. cuasisanguineum (Ramírez-Pérez el al., 1982) .

El objetivo de este trabajo es investigar si las características fisiológicas antes mencio­nadas (patrones de actividad enzimática, patogenicidad para el hombre, infectividad para el vector) se asocian con caracteres morfológicos de las microfilarias

Tal tipo de estudio ha sido desalentado por la diversidad de técnicas y de resultados obtenidos , a pesar de la importancia taxonómica que en el nivel específico posee la ana­tomía de las microfilarias (Bain, 1975 y 1981). Sin embargo, Schiller et al. (1979), de­mostraron diferencias significativas entre microfilarias de Alto Volta y Guatemala em­pleando una técnica estandarizada de fijación, y estudios realizados en la Sierra Parima revelan que algunas de las técnicas para el estudio de microfilarias producen resultados fácilmente reproducibles (Botto el al., 1983). Por otra parte, la técnica de recuentos nu­cleares empleada para diferenciar poblaciones mendelianas de filarías también encuen­tra en este campo fértil aplicación (Schacher el al., 1969; Tada el al., 1981).

Material y métodos

Los ejemplares estudiados provenían de las siguientes localidades: 1) Parima B, re­gión de sabana de altura de la Sierra de Parima, rodeada por áreas de bosque húmedo premontano (altitud 1.050 mts; precipitación anual de 1.100 a 1.200 mm; latitud 2° 44' N; longitud 64° 05' Oeste), Venezuela, Sudamérica. 2) Región de selva húmeda de Libe­ría, Africa . 3) Región de sabana de Togo, Africa.

Los ejemplares de Liberia y Togo fueron obtenidos por gentileza del Dr. B. O. L. Duke (Unidad de Filariasis, OMS), del Dr. H. Schulz-Key (Bernhard-Nocht Institut, Hamburg) , y de la Universidad de Tubingen (Tropenmedizinisches Institut).

Todas las microfilarias (mfs) estudiadas fueron obtenidas del útero de diferentes ejem­plares hembra de O. volvulus, de cada localidad, secadas sobre una lámina, fijadas en metano! en el campo y coloreadas en los laboratorios del CAICET, Puerto Ayacucho (Venezuela) con Giemsa Merck en tampón fosfato de Sorensen de pH 7.2 (KH2P04 2.0mM Na2HP04 12Hp 4.7mM).

Se estudiaron 100 mfs intrauterinas de Parima B (1 ejemplar hembra/2 láminas), 87 mfs intrauterinas de Liberia (2 ejemplares hembra 360-1 y 360-3/4 láminas) y 50 mfs intrauterinas de Togo (1 ejemplar hembra 55-8/2 láminas) .

Las microfilarias de O. volvulus para recuentos nucleares fueron obtenidas de la mis­ma fuente, fijadas en etanol absoluto: ácido acético en proporción 3:1, lavadas en eta­nol al 70o/o y trasladadas al laboratorio, donde se codificaron para ser estudiadas por dos observadores, sin conocimiento de la localidad de procedencia. Las microfilarias fueron coloreadas con orceína acética y sometidas a la técnica de «squash» (Tada el al., 1981). Aquéllas adecuadamente fijadas y coloreadas por esta técnica resultaron per­tenecer a 3 ejemplares hembra de Togo (53-1, 55-8 y 64-1), con un total de 120 mfs y a 1 ejemplar hembra de Parima (115 mfs).

Para cada población se determinó el tamaño de la muestra (N), la media aritmética (X), el desvío estándar (DE), y el coeficiente de variabilidad (CV = DE x 100/ X).

Comparación de microfilarias de Africa y Venezuela 127

Las diferencias entre distintas poblaciones se investigaron mediante los coeficientes de diferencia CD = [Xa- Xb 1 DEa + DEb], donde a y b son las poblaciones compara­das, y mediante análisis de varianza, con la ayuda de una computadora Apple II Plus, determinándose la probabilidad (P) de que las diferencias halladas sean debidas al azar. El valor CD = 1.28 indica que más del 900Jo de la población A difiere del 90% de la población B, si la distribución de ambas poblaciones es normal y si DEa ~ 1.5 DEb (Mayr

1et al., 1953; Schacher y Geddawi, 1969). -

Resultados

l. Estudios morfobiométricos

En las microfilarias adecuadamente fijadas se tiñeron intensamente los núcleos con el colorante de Giemsa, destacándose nítidamen te el espacio cefálico (EC), el anillo ner­vioso (AN), la célula R1 (R-1) y el último núcleo (UN) que delimita el espacio caudal. La célula excretora, las células R2 a R4 y la vesícula anal habitualmente tienen límites menos precisos con esta técnica.

En todos los casos se determinó la distancia de cada una de las estructuras anatómi­cas al extremo cefálico, tanto en valor absoluto como en porcentaje de longitud total.

Las microfilarias de Parima 8 miden con esta técnica, en promedio, 249.9 micras de longitud por 5.7 micras de diámetro mayor, y presentan un espacio cefálico muy corto, de 6.2 micras en promedio, que representa el 2.2% de la longitud corporal (Fig. 1-A). Las características biométricas comparativas se presentan en el Cuadro l .

Las microfilarias de O. volvulus de Liberia son notables por presentar un cuerpo muy corto, un diámetro mayor que en las cepas de Togo y Parima, y un espacio cefálico llamativamente largo, de 10.0 micras en promedio, que representa el4.8% de la longitud corporal y que a veces alcanza hasta el 11.1 OJo de la longitud corporal. (Fig. 1-B).

Las microfilarias de O. volvulus de Togo son en general más largas y finas y poseen un espacio cefálico de 7.6 micras en promedio, que representa el 2.8% de la longitud corporal, inás grande que en la cepa de Parima, pero mucho más pequeño que en la cepa de Liberia.

Los histogramas de frecuencias mostraron en la mayor parte de las variables estudia­das una distribución normal o una clara tendencia hacia ese tipo de distribución.

Los coeficientes de variabilidad fueron relativamente pequeños en Parima, mayores en Togo y muy grandes en Liberia. Las diferencias en la dispersión de los valores entre Parima y Liberia se aprecian bien en la Figura 2. Sin embargo, los valores expresados en porcentaje de longitud total mostraron una variabilidad mucho menor. Cuando se comparan los valores porcentuales obtenidos para cada una de las variables por análisis de varianza se obtienen los resultados presentados en la Figura 3. Dentro de cada pobla­ción se compararon microfilarias procedentes de diferentes láminas y/,o de diferentes ejemplares hembra. Resuita claro que dentro de cada población se revelaron pocas dife­rencias significativas (A, B, C), pero entre Parima y Togo (D) se observaron diferencias significativas en 6 sobre 9 variables y entre Parima y Liberia en todas las variables anali­zadas (F); asimismo, los CD mostraron valores significativamente elevados entre Pari­ma y Liberia .

Las microfilarias de Parima se diferencian fácilmente de las de Liberia. En esta últi­ma localidad la mayor parte (84.2%) de los ejemplares corresponden a una variedad pequeña y gruesa, de espacio cefálico grande, en tanto que un 15 .8% corresponden a una variedad grande y fina, de espacio cefálico pequeño. Cuando se disponen en una

128 C. Botto et al.

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FIGURA 1

Microfilarias intrauterinas de Onchocerca volvu/us s.l. fijadas en metano! y colo-readas en Giemsa (1000 X). A Sierra de Parima, Alto Orinoco, Venezuela. B Liberia, Africa. Las flechas indican el espacio cefálico y el anillo nervioso.

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Comparación de microfilarias de Africa y Venezuela 131

gráfica x = Longitud total/Diámetro máximo y = EC OJo (espacio·cefálico expresa­do en porcentaje de longitud total) ambas poblaciones se separan claramente, obser­vándose que algunos ejemplares de Liberia tienen valores semejantes a los de Parima (Fig. 4).

Las mfs de Togo son morfológicamente similares a las de Parima y a la variedad grande de Liberia .

2. Recuentos nucleares

Las microfilarias de O. vo/vu/us de Parima presentan valores de recuentos nucleares entre espacio cefálico y anillo (Fig. 5) claramente supe,riores a los de Togo {Cuadro 2). Tales diferencias son estadísticamente significativas (P < 0.01). Las diferencias entre dis­tintos ejemplares hembras en Togo no son en cambio significativas (P > 0.01) .

Discusión

Diversos autores están de acuerdo en la importancia de la anatomía y de los recuentos nucleares de las microfilarias para su identificación a nivel específico y poblacional (Scha­cher y Gedawi, 1969; Bain 1975 y 1981; Yarzábal et al., 1983b). En este sentido, son yaliosas las coincidencias registradas en el estudio del complejo_Onch_oqerca- Simulium de Centroamérica por Gibson (1952}, Martínez Palomo et al. (1977) y Schiller et al. (1979), en períodos muy alejados en el tiempo.

El presente trabajo constituye una comunicación preliminar, basada en el estudio de un número pequeño de microfilarias y de ejemplares hembra de cada localidad, lo cual impide extraer conclusiones definitivas. Sin embargo, puede señalarse que la posi­ción relativa de las diferentes estructuras anatómicas de la microfilaria es muy constan­te dentro de cada localidad, hecho reconocido por varios autores (Fülleborn, 1913; Gra­tama, 1970; Botto et al., 1983). La ausencia de diferencias significativas dentro de cada localidad y la presencia de tales diferencias entre localidades alejadas sugiere la existen­cia de razas geográficas morfológicamente diferenciables .

La existencia de una variedad dominante en Liberia, con espacio cefálico grande, fá­cilmente distinguible de las mfs de Parima o de Togo, constituye el hallazgo más sor­prendente. El valor promedio de longitud del espacio cefálico, de 4.8% en Liberia se aproxima al hallado por Gratama (1970) y casi duplica los valores observados en Pari­ma (2.5%) y Togo (2.8%). No obstante, debe notarse que la variabilidad intrapoblacio­nal no ha sido adecuadamente investigada. La mayor variabilidad observada en Liberia podría depender del mayor número de ejemplares hembra incluidos en el estudio en esta localidad, aunque la coexistencia en Africa de una variedad pequeña y una variedad grande de microfilarias de O. vo/vu/us ha sido mencionada reiteradamente por diversos autores ~iacklock, 1926; Gratama, 1970; Sasa, 1979). Según Gratama (1970), M. Wan­son sugiere que podrían representar formas incipientes de diferenciación sexual aunque tal interpretación no está de acuerdo con las frecuencias de cada una de las variedades observadas en este trabajo. Gratama (1970) sostiene que tales variedades pueden expre­sar un diferente grado de retracción de las microfilarias en frotis de espesor desigual. Aunque un proceso de secado lento en atmósfera húmeda puede producir una marcada retracción de las microfilarias en frotis gruesos (Fülleborn, 1913; Gratama, 1970; Botto et al., 1984), tal efecto no se observa con la misma intensidad con la técnica de fijación en metano!. Por otra parte, este efecto no explica las llamativas diferencias en la longi­tud del espacio cefálico entre las microfilarias de Liberia y las de Parima y Togo. Las observaciones realizadas sugieren que tales diferencias no traducen una diferenciación sexual ni constituyen un artefacto de técnica, sino que _expresan más bien la existencia

132 C. Botto et al.

FIGURA 4

Longitud del espacio cefálico y relación longitud/ancho máximo

en microfilarias de Liberia y Parima

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Comparación de microfilarias de Africa y Venezuela

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FIGURA 5 Microfilarias de Onchocerca volvulus s.l. de la Sierra de Parima, Venezuela. Tin-ción con orcefna para recuentos nucleares. La flecha indica el anillo nervioso. A 400 X. B. 2000 X.

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136 C. Botto et al.

de diferentes razas geográficas, asociadas con distintas especies de simúlidos: S. pintoi - S. cuasisanguineum en la sabana de Parima, S. damnosum s.s. en la sabana de Togo y S. yahense- S. sanctipauli en la selva húmeda de Liberia (Duke, 1981; Ramírez Pérez et al., 1982).

Las mfs de Parima difieren de las mfs de Liberia no solamente en la morfología y biometría, sino también en los patrones de fosfatasa áCida y en la prevalencia en el hu­mor acuoso y en la sangre. Sin embargo, esta última diferencia puede depender también de la carga parasitaria, que es mayor en Parima, (Prost et al., 1980; Yarzábal et al., 1983b) o bien de una menor destrucción de mfs por mecanismos inmunes . En relación. con ésto debe señalarse que en Parima se han evidenciado antígenos circulantes, que son capaces de inhibir in vitro la proliferación de linfocitos por activación de células supresoras (Arango et al., 1983; Des Moutis et al., 1983; Ouaissi el al., 1983).

La separación entre las mfs de sabana de Togo y de selva húmeda de Liberia es igual­mente nítida, como lo son las diferencias en la patogenicidad, infectividad para el vec­tor y patrones de fosfatasa ácida entre las cepas de selva y de sabana de O. volvulus en Africa Occidental (Duke et al., 1966; Duke & Anderson, 1972; Ornar, 1978; Prost, 1980; Prost et al., 1980; Duke, 1981).

Las diferencias morfológicas y biométricas entre las microfilarias de Parima y Togo no son tan claras. Aunque difieren significativamente por análisis de varianza, existe clara sobreposición de los valores, que muestran mayor dispersión en Togo. La escasa variabilidad observada en Parima podría ser un atributo de una pequeña población ais­lada, pero también puede expresar el pequeño número de láminas examinadas, similar por otra parte al de Togo.

Los recuentos nucleares mostraron diferencias significativas entre microfilarias de Pa­rima y Togo, así como entre Parima y Guatemala (Tada et al., 1981; Yarzábal et al., 1983b). Aunque la variabilidad intrapoblacional no ha sido bien estudiada en estas lo­calidades, en Togo no se detectaron diferencias intrapoblacionales significativas.

Los hallazgos morfológicos y en los recuentos nucleares confirman que los complejos Onchocerca-Simulium de Centroamérica y Sudamérica se separan nítidamente de los complejos africanos, como lo sugieren las experiencias de infección cruzada de Simúli­dos (Duke, 1970) y los patrones de actividad enzimática de las microfilarias (Ornar, 1978 y 1982; Yarzábal et al., 1983c).

Son necesarias aún nueva,¡; investigaciones, asociando estudios morfológicos de mfs fijadas en formaldehido cori estudios enzimáticos y de infección cruzada de simúlidos, para esclarecer las relaciones del complejo Onchocerca-Simulium del Alto Orinoco con otros complejos de Centroamérica y Africa.

Summary

Morphological characteristics of Onchocerca volvulus microfilariae from Parima (Up­per Orinoco Basin), Togo and Liberia were studied, using the same fixing and staining techniques. Significant differences in severa! biometric variables and in nuclear counts were found among these demes . This preliminary evidence suggests the existence of mor­phologically distinct geographical strains of O. volvulus.

Agradecimientos

Se agradece especialmente al Dr. B.O.L. Duke (Unidad de Filariasis, OMS) y al Dr. H. Schulz-Key (Bernhard-Nocht Institut. Hamburg), el envío de microfilarias de

Comparación de microjilarias de Africa y Venezuela 137

Togo y Liberia . Este trabajo fue financiado en parte mediante subvenciones del CONI­CIT (Proyecto Sl -1128), del PROICET-Amazonas y del Ministerio de la Investigación .y la Industria de Francia (Proyecto 81-L-0013).

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