DISSERTAÇÃO Katarine Mizan Barbosa Santos.pdf - RI UFPE

UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO DEPARTAMENTO DE ENERGIA NUCLEAR

COMISSÃO NACIONAL DE ENERGIA NUCLEAR CENTRO REGIONAL DE CIÊNCIAS NUCLEARES DO NORDESTE

Programa de Pós-Graduação em Tecnologias Energéticas e Nucleares

DISSERTAÇÃO

PRESSÃO AMBIENTAL SOBRE LITTORARIA ANGULIFERA:

ACUMULAÇÃO DE ELEMENTOS QUÍMICOS E MUTAGENICIDADE

ASSOCIADAS A ALTERAÇÕES HISTOLÓGICAS

KATARINE MIZAN BARBOSA SANTOS

Orientador: Prof. Dr. Elvis Joacir De França

Co-Orientadora: Dra. Rebeca da Silva Cantinha

Recife, PE

Agosto, 2016

KATARINE MIZAN BARBOSA SANTOS

PRESSÃO AMBIENTAL SOBRE LITTORARIA ANGULIFERA:

ACUMULAÇÃO DE ELEMENTOS QUÍMICOS E MUTAGENICIDADE

ASSOCIADAS A ALTERAÇÕES HISTOLÓGICAS

Dissertação submetida ao Programa de Pós-

Graduação em Tecnologias Energéticas e

Nucleares do Departamento de Energia Nuclear da

Universidade Federal de Pernambuco como parte

dos requisitos para a obtenção do título de Mestre

em Ciências. Área de concentração: Aplicações de

Radioisótopos na Agricultura e Meio Ambiente.

Orientador: Prof. Dr. Elvis Joacir De França

Co-orientadora: Dra. Rebeca da Silva Cantinha

Recife, PE

Agosto, 2016

Catalogação na fonte

Bibliotecário Carlos Moura, CRB-4 / 1502

S237p Santos, Katarine Mizan Barbosa.

Pressão ambiental sobre Littoraria angulifera:

acumulação de elementos químicos e mutagenicidade

associadas a alterações histológicas. / Katarine Mizan

Barbosa Santos. - Recife: O Autor, 2017.

100 f. : il., tabs.

Orientador: Prof. Dr. Elvis Joacir de França.

Coorientadora: Dra. Rebeca da Silva Cantinha.

Dissertação (mestrado) – Universidade Federal de

Pernambuco. CTG. Programa de Pós-Graduação em

Tecnologias Energéticas e Nucleares, 2017.

Inclui referências bibliográficas.

1. Caramujo. 2. Manguezal. 3. EDXRF. 4. FAAS.

5. Histologia. 6. Impactos ambientais. I. França, Elvis

Joacir de, orientador. II. Cantinha, Rebeca da Silva,

coorientadora. III. Título.

UFPE

CDD 621.48 (21. ed.) BDEN/2017-17

bdtd

Máquina de escrever

2016

bdtd

Máquina de escrever

2016

Pressão Ambiental sobre Littoraria

Angulifera: Acumulação de Elementos

Químicos e Mutagenicidade Associadas

a Alterações Histológicas

Katarine Mizan Barbosa Santos

APROVADA EM: 03.08.2016

ORIENTADOR: Prof. Dr. Elvis Joacir de França

CO-ORIENTADORA: Profa. Dra. Rebeca da Silva Cantinha

COMISSÃO EXAMINADORA:

Profa. Dra. Mércia Liane de Oliveira– CRCN/NE

Profa. Dra. Ana Maria Mendonça de Albuquerque Melo – DBR/UFPE

Profa. Dra. Luanna Ribeiro Santos Silva – FAINTVISA

Visto e permitida a impressão

____________________________________

Coordenador(a) do PROTEN/DEN/UFPE

““...Mas não quero me meter com gente louca”, Alice observou. “Oh! É inevitável”, disse o

Gato; “somos todos loucos aqui. Eu sou louco. Você é louca.” “Como sabe que sou louca?”

perguntou Alice. “Só pode ser”, respondeu o Gato, “ou não teria vindo parar aqui...””

(Lewis Carrol)

AGRADECIMENTOS

Com a satisfação de poder ter conseguido chegar ao final de mais uma etapa da vida,

venho agradecer a cada pessoa que participou dessa história:

Primeiramente a Deus e meu mentor espiritual, por me guiarem nessa trajetória. Em

seguida, a meus pais, Lucia e Williams, principalmente minha mãe, por terem me trazido ao

mundo e cuidado para que minha educação básica fosse concluída além de também terem

gerado os melhores seres humanos do mundo, que fazem meus dias melhores e mais felizes,

meus irmãos Caio e Caled. Aos meus irmãos, agradeço por tudo que sou e quem possa ser um

dia, tanto na vida profissional quanto na pessoal, também agradeço pelas partidas de “League

of Legends”, papas envenenadas, idas ao médico, doenças compartilhadas, noites assistindo

canais de youtubers, conversas intermináveis, apoio incondicional e discussões estúpidas.

Ao meu marido Robson, só tenho a dizer o quanto dividir o peso da vida com você, a

torna suportável e prazerosa, e o quanto amar você é fácil, exceto durante a TPM.

Da minha família, não posso esquecer nunca de agradecer as minhas tias Alba, Rosa,

Mira e Sofia, e aos meus tios, Fábio “Bito”, Cledson, Jaimessom “Jeminho” e Ricardo

“Rico”. Espero que a bondade e o cuidado com que tratam a mim, meu marido e meus irmãos

nunca acabe. Aos meus primos Diogo, Irla, Jôse, Júlia, Monique, Ricardinho e Vinícius pelo

carinho, respeito e consideração. A minhas primas irmãs, Kayllane “Kay”, por ser um doce,

não comer camarão e arrasar no “Mortal Kombat”, e Isabella “Bella” por conhecer as

Kardashians, assistir todos os high school musical, e sempre responder as minhas marcações

nas redes sociais. Aos agregados, Lucas, Gabriel, “Biel”, Gabriel “pequeno” e a minha

cachorra Aurora por serem uma parte importante da família.

Aos amigos queridos da escola, Ilma e Patrícia, por não me abandonarem na minha

pior época. Também a Érica, Gilberto “Beto”, Hellysson “Da Pipoca”, Luan, Tawana,

Williams “Will”, por serem especiais e “pra vida toda”. Agradeço as minhas amigas mais

queridas da faculdade e da vida Isabella e Lethicia por serem tão especiais e presentes, além

de Rayanne “Ray” independente do que estiver fazendo e o quanto tenha se afastado.

Aos amigos de vida feitos no espaço ciência, Aninha, Eduardo, Enatiely e a mais

incrível de todas que é a Zenaide, agradeço pelo apoio incondicional e a torcida para que eu

alcance meus objetivos.

Para a realização desse trabalho, durante os dois anos do curso, pessoas incríveis

foram muito importantes para que esse resultado fosse alcançado.

Agradeço ao meu Orientador Dr. Elvis, por ser meu maior exemplo de profissional,

por ter me aceitado sem me conhecer e ter me recebido em seu laboratório de maneira tão

amigável, sem sua atuação e apoio eu não seria a pessoa que sou hoje, agradeço por tudo que

tenho aprendido. A minha Co-orientadora Dra. Rebeca pela parceria e presença mesmo

quando estava distante geograficamente, serei sempre muito grata pelo aprendizado e

companheirismo que essa pesquisa me proporcionou.

Aos parceiros para a concretização desse estudo, a Profa. Dra. Ana Mendonça da

Radiobiologia da UFPE por ser presente e querida, sem mencionar o apoio e ensinamento, a

Profa Dra. Paloma da Histologia da UFPE que mesmo com sua agenda cheia, tirou dias para

estudar sobre invertebrados e me passar todas as informações para que os resultados se

concretizassem. Agradeço imensamente ao Prof. Dr. José Carlos da Malacologia da UFRPE,

por dedicar um dia da sua agenda atarefada para me ensinar sobre anatomia de moluscos.

Também ao laboratório de Dosimetria do CRCN-PE, por possibilitar a captura das imagens

das células utilizadas nessa pesquisa e Jullyane e Laís por me ajudarem na tarefa.

Aos companheiros de jornada do laboratório de Radiobiologia, Alessandra, Douglas,

Hassan, Hianna, João, Dra. Luana, Luís, Maíra, Maria Luíza e Williams, por terem sido

sempre tão solícitos e amigáveis, além de proporcionarem os cafés mais divertidos. Aos

técnicos do laboratório de Análise Ambiental do CRCN-PE, Ana Cláudia, Crescêncio,

Gilberto e Márcia, pelo ambiente amigável e em especial a Alesxandro pelo auxílio no

laboratório, pelas conversas, cafés e ensinamentos. Aos companheiros de curso Adriana,

Cláudia, Daniel, Denilson, Emerson, Fernanda, Julyanne, Marcelo, Paulo, Thiago, em

especial para Mariana, pelos melhores conselhos e ouvidos e Fabiano, pela amizade e

companheirismo. Aos terceirizados do CRCN Margarete, Dona Ana e Bruno, por serem

sempre cordiais e prestativos. Aos IC’s mais simpáticos, Danielle, Jonas e Mechele, em

especial a Karolayne por ter se tornado uma pessoa tão querida em pouco tempo e Thiago

“Thiaguinho” por ser o rapaz mais empenhado em dar seu melhor que já conheci.

Aos membros da banca Dra. Ana Mendonça e Dra. Luana Silva, já mencionadas

anteriormente, e a Dra. Mércia por se disponibilizarem a avaliar esse trabalho.

Ao Programa de Pós-graduação em Tecnologia Energética e Nuclear – PROTEN, por

me aceitar no seu quadro de alunos. Ao CNPq, por custear a mim e a pesquisa. Também as

secretárias do Departamento de Energia Nuclear, as mais simpáticas e prestativas Nilvânia e

Kalidja, por sempre nos ajudarem com prazos e informações. A todos, meus mais sinceros

agradecimentos.

RESUMO

Manguezais são ecossistemas costeiros sujeitos a grandes impactos antropogênicos,

porém pouco se conhece a respeito da pressão ambiental exercida sobre a biota. Nesses

ambientes, os agentes estressores podem intensificar a acumulação de substâncias químicas,

induzir a mutagenicidade e causar alterações histológicas nos tecidos. Dentre os organismos,

os moluscos terrestres como é o caso de Littoraria angulifera merecem atenção especial

devido à possibilidade de emprego em estudos de monitoração da qualidade ambiental. Por

isso, foi avaliada a distribuição de Ca, Cl, Cu, Fe, K, Mg, P, S, Sr e Zn nas glândulas

digestivas, gônadas e demais tecidos moles dos moluscos coletados em manguezal impactado

do Espaço Ciência, em Olinda, a partir da Espectrometria de Fluorescência de Raios-X por

Dispersão de Energia (EDXRF) e de Absorção Atômica com Chama (FAAS). Desenvolvida

neste trabalho, a técnica inovadora de extração da hemolinfa de L. angulifera permitiu a

verificação de frequência de micronúcleos, binucleação e apoptose por meio da observação

dos hemócitos. O estudo das principais alterações histológicas nos tecidos desses animais

também foi realizado, comparando-se os resultados com os animais de manguezal menos

impactado localizado no Município de Rio Formoso, Estado de Pernambuco. No manguezal

do Espaço Ciência, Cu, Fe e Zn foram acumulados nas gônadas, glândulas digestivas e

demais órgãos e tecidos em quantidades até 20 vezes superioras quando comparadas com os

resultados dos animais de Rio Formoso. Não foram observadas diferenças significativas entre

as médias das frequências de micronúcleos e binucleação em nível de 95% de confiança nos

hemócitos dos animais de ambos os manguezais. Contudo, maior frequência de células

apoptóticas foi encontrada nos animais do manguezal do Espaço Ciência. Por meio dos

estudos histológicos, detectou-se número elevado de parasitas nesses animais, sugerindo que a

grande quantidade de Cu e Zn encontrada nos órgãos pode estar associada aos mecanismos de

desinfestação. Todos os resultados obtidos demonstraram a aplicabilidade da espécie

Littoraria angulifera para uma avaliação mais detalhada da qualidade ambiental de

manguezais.

Palavras-chave: CARAMUJO; MANGUEZAL; EDXRF; FAAS; HISTOLOGIA;

IMPACTOS AMBIENTAIS.

ABSTRACT

Mangroves are coastal ecosystems subjected to huge anthropogenic impacts, although

little is known about the environmental pressure on the biota. In these environments, the

stressor agents may intensify the chemical element accumulation, induce the mutagenicity and

cause histological changes in tissues. Among the organisms, terrestrial mollusks such as

Littoraria angulifera deserve a special attention due to its applicability in environmental

quality monitoring studies. Therefore, the distribution of Ca, Cl, Cu, Fe, K, Mg, P, S, Sr e Zn

in the digestive glands, gonads and other soft tissues of mollusks collected in the impacted

mangrove from the Espaço Ciência located in Olinda, Pernambuco State, Brazil, was assessed

by means of the Dispersive Energy X-ray Fluorescence (EDXRF) and Flame Atomic

Absorption Spectrometry (FAAS). Here, the novel hemolymph extraction technique for

L. angulifera allowed verifying the micronuclei, binucleation and apoptosis frequencies

through the hemocyte observation. The study of main histological changes on the animal

tissues was also carried out, comparing the results to the animals from a more preserved

mangrove, located in the Municipality of Rio Formoso, Pernambuco State, Brazil. In the

Espaço Ciência mangrove, accumulation of Cu, Fe and Zn was found in the gonads, digestive

glands and other soft tissues in quantities up to 20 times higher when compared to the results

from Rio Formoso animals. No significant differences at the 95% confidence level between

the average frequencies of micronuclei and binucleation were observed for the hemocytes of

animals from both mangroves. However, a high frequency of apoptotic cells was found for

animals from the Espaço Ciência mangrove. By means of histological studies, a high number

of parasites was detected in these animals, suggesting that the high quantities of Cu and Zn

found in the organs may be associated to the disinfestation mechanisms. All results

demonstrated the applicability of Littoraria angulifera species for a more detailed evaluation

of mangrove environmental quality.

Keywords: SNAIL; MANGROVE; EDXRF; FAAS; HISTOLOGY; ENVIRONMENTAL

IMPACTS.

LISTA DE ILUSTRAÇÕES

Figura 1 - Áreas originais dos biomas do brasileiros............................................................. 19

Figura 2 - Manguezais distribuídos mundialmente................................................................ 20

Figura 3 - Manguezais urbanos presentes no Complexo de Salgadinho, Olinda,

destacados em vermelho. A. Detalhe do Manguezal Chico Science. Em

amarelo, o Parque Memorial Arcoverde............................................................... 22

Figura 4 - Estuário no Rio Ariquindá, em vermelho área de coleta ao lado da Ponte

Rosalvo Ramos Rocha na porção pertencente ao município de Rio Formoso...... 23

Figura 5 - Fauna bentônica de manguezais............................................................................ 24

Figura 6 - Ilustração anatômica de molusco gastrópode........................................................ 26

Figura 7 - Divisões da concha do gastrópode Achatina fulica............................................... 28

Figura 8 - Concha de Littoraria angulifera........................................................................... 29

Figura 9 - Representação anatômica frontal de Littoraria sp................................................ 29

Figura 10 - Sistema Biológico dos Elementos (SBE).............................................................. 32

Figura 11 - Excitação de átomo a partir de Raios-X................................................................ 36

Figura 12 - Funcionamento de um equipamento de FAAS..................................................... 37

Figura 13 - Fotomicrografia de células micronucleadas de Mytilus galloprvincialis.............. 38

Figura 14 - Fotomicrografia de tecido digestivo de Crassostrea rhyzophorae com setas

indicando parasita da espécie Namatopsi sp......................................................... 40

Figura 15 - Localização geográfica dos manguezais de estudo............................................... 42

Figura 16 - Procedimentos para preparaçãodos moluscos/ amostras....................................... 43

Figura 17 - Remoção da concha de L. angulifera do Rio Formoso......................................... 44

Figura 18 Equipamento EDX-720 para análise química por Fluorescência de Raios-X por

Dispersão de Energia............................................................................................ 46

Figura 19 - Cápsula de polipropileno específica para análise química por EDXRF............... 47

Figura 20 - Tubos com amostra no equipamento de ultrassom............................................... 48

Figura 21 Forno digestor Mars Xpress 5 CEM..................................................................... 49

Figura 22 - Procedimentos de filtragem da amostra tratada quimicamente em forno

digestor.................................................................................................................. 50

Figura 23 - Equipamento SpectrAA 220 da Varian/Agilent.................................................... 51

Figura 24 - Punção no molusco L. angulifera (A), com agulha de 25 mm (B), pelo sinus

bucal para extração da hemolinfa.......................................................................... 52

Figura 25 - Representação das metodologias do preparo da hemolinfa para deposição na

lâmina.................................................................................................................... 53

Figura 26 - Cortes histológicos de peças de moluscos. Peças emblocadas (A), micrótomo

(B) e lâminas histológicas (C)............................................................................... 54

Figura 27 - Critérios de identificação de MN.......................................................................... 57

Figura 28 - Gráfico de impressão digital dos órgãos dos animais coletados no Rio

Formoso................................................................................................................. 64

Figura 29 - Impressão digital dos órgãos dos animais coletados no Espaço Ciência quanto

à distribuição dos elementos químicos.................................................................. 65

Figura 30 - Impressão digital das gônadas de L. angulifera dos manguezais Espaço Ciência

(EC) e do Rio Formoso (RF)................................................................................. 66

Figura 31 - Impressão digital de glândula digestiva das amostras do Espaço Ciência (EC) e

Rio Formoso (RF)................................................................................................. 66

Figura 32 - Impressão digital de elementos químicos nos demais órgãos e tecidos das

amostras do Espaço Ciência (EC) e Rio Formoso (RF)........................................ 67

Figura 33 - Fotomicrografia de tipos de hemócitos encontrados em hemolinfa de

L. angulifera.......................................................................................................... 69

Figura 34 - Fotomicrografia de alterações celulares observadas durante ensaio de

micronúcleo realizado em hemolinfa de L. angulifera......................................... 69

Figura 35 - Comparação entre a morfologia dos hemócitos de L. angulifera coletados nos

manguezais do Rio Formoso (A) e do Espaço Ciência (B)................................... 70

Figura 36 - Intervalo de confiança de Wald em nível de 95% de confiança........................... 73

Figura 37 - Intervalo de confiança de Wilson em nível de 95% de confiança........................ 74

Figura 38 - Fotomicrografia da gônada feminina de L. angulifera coletado em manguezal

do Rio Formoso (A) e Espaço Ciência (B)........................................................... 75

Figura 39 - Fotomicrografia do compartimento gametogênico de L. angulifera coletado em

manguezal do Rio Formoso (A) e Espaço Ciência (B)......................................... 76

Figura 40 - Fotomicrografia do sistema digestivo de L. angulifera coletado em manguezal

do Rio Formoso (A, B) e Espaço Ciência (C, D).................................................. 77

Figura 41 - Comparação entre a acumulação de Cu, Fe e Zn nos compartimentos

biológicos de Littoraria angulifera do Espaço Comparação................................ 80

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 - Acumulação de elementos químicos em órgãos/tecidos de invertebrados

empregados como biomonitores........................................................................... 34

Tabela 2 - Total de indivíduos por amostra, total de amostras e amostras compostas

analisadas para a quantificação de elementos químicos em L. angulifera. RF =

manguezal do Rio Formoso. EC = manguezal do Espaço Ciência....................... 45

Tabela 3 - Valores obtidos e certificados (mg kg-1), incertezas analíticas expandidas para

95% de confiança e valores de Número En para os materiais de referência

analisados por EDXRF e FAAS........................................................................... 61

Tabela 4 - Concentrações médias (M) dos elementos químicos em mg kg-1, desvio

padrão (DP), número de amostras (n) e incerteza analítica expandida em nível

de 95% de confiança para as amostras de gônada – G, glândula digestiva – GD

e demais órgãos e tecidos – DOT dos animais dos manguezais do Rio Formoso

– RF e do Espaço Ciência – EC............................................................................ 62

Tabela 5 - Frequência de alterações encontradas nos hemócitos de L. angulifera dos

espécimes do Rio Formoso (RF) e do Espaço Ciência (EC)................................ 71

Tabela 6 - Resultados do intervalo de confiança em nível de 95% de confiança (IC95%)

coeficiente de variação (CV%) e tamanho mínimo de amostra (n*) para as

variáveis micronúcleo - MN, binucleação - BN e apoptose – AP........................ 72

Tabela 7 - Concentrações máximas de elementos químicos (mg kg-1) em manguezais........ 78

LISTA DE SIGLAS E ABREVIAÇÕES

AP - apoptose

BN - binucleação

c - citoplasma

cdg - célula digestiva

cei - célula do epitélio intestinal

Cg - compartimento gametogênico

CLGM - Células da Linhagem Gametogênica Masculina

DOT - Demais Órgãos e Tecidos

EC - Espaço Ciência

EDXRF - Fluorescência de Raios-X por Dispersão de Energia

FAAS - Espectrometria de Absorção Atômica com Chama

G - gônada

gr - grânulo

GD - glândula digestiva

L - lúmen

MN micronúcleo

n - núcleo

Ovo - ovócito

p - parasita

ps - pseudópodes

sp - esperma

RF - Rio Formoso

Seta F - folículo

Seta M - paraesperma

TGD - Túbulo de Glândula Digestiva

v - vacúolo

Vs - vesícula seminal

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO.................................................................................................. 16

2 REVISÃO DE LITERATURA......................................................................... 18

2.1 Biomas brasileiros.............................................................................................. 18

2.2 Manguezais......................................................................................................... 19

2.2.1 Manguezais pernambucanos............................................................................. 21

2.3 Fauna de invertebrados do manguezal............................................................ 23

2.3.1 Moluscos.............................................................................................................. 24

2.3.1.1 Gastrópodes.......................................................................................................... 27

2.3.1.2 Littoraria angulifera (Lamarck,1822).................................................................. 28

2.4 Estudos ambientais utilizando moluscos gastrópodes.................................... 30

2.4.1 Acumulação de elementos químicos: biomonitoração.................................... 30

2.4.1.1 Definições............................................................................................................. 30

2.4.1.2 Uso de elementos químicos por organismos........................................................ 31

2.4.1.3 Moluscos como bioindicadores/biomonitores de qualidade ambiental................ 32

2.4.1.4 Bioacumulação de elementos químicos em órgãos de invertebrados.................. 33

2.4.2 Técnicas analíticas em matrizes biológicas...................................................... 35

2.4.2.1 Espectrometria de Raios-X por Dispersão de Energia (EDXRF)........................ 35

2.4.2.2 Espectrômetro de absorção atômica por Chama (FAAS).................................... 36

2.4.3 Avaliação da mutagenicidade pelo teste do micronúcleo............................... 38

2.4.4 Alterações histológicas e morfológicas............................................................. 39

3 MATERIAL E MÉTODOS............................................................................... 41

3.1 Descrição das áreas de estudo........................................................................... 41

3.1.1 Manguezal Espaço Ciência................................................................................ 41

3.1.2 Manguezal Rio Formoso.................................................................................... 41

3.2 Amostragem........................................................................................................ 42

3.3 Procedimentos de laboratório para preparação das amostras...................... 43

3.3.1 Dissecação dos animais...................................................................................... 43

3.4 Análise química.................................................................................................. 44

3.4.1 Preparação das amostras................................................................................... 44

3.4.2 Análise química por EDXRF............................................................................. 45

3.4.3 Tratamentos químicos........................................................................................ 47

3.4.3.1 Banho de ultrassom.............................................................................................. 47

3.4.3.2 Forno digestor...................................................................................................... 49

3.4.4 Análise química por FAAS................................................................................ 50

3.5 Extração da hemolinfa para teste do micronúcleo.......................................... 51

3.6 Preparo das lâminas histológicas...................................................................... 54

3.7 Análise dos resultados........................................................................................ 55

3.7.1 Análises químicas............................................................................................... 55

3.7.1.1 Incerteza analítica................................................................................................ 55

3.7.1.2 Qualidade do Procedimento analítico.................................................................. 55

3.7.2 Análise de hemócitos.......................................................................................... 56

3.7.2.1 Critérios para identificação de células micronucleadas....................................... 56

3.7.2.2 Intervalos de confiança para a frequência de variáveis relacionadas com a

mutagenicidade em L. angulifera......................................................................... 57

3.7.2.3 Tamanho mínimo de amostra ou suficiência amostral......................................... 58

3.7.3 Alterações histológicas....................................................................................... 59

4 RESULTADOS DISCUSSÃO........................................................................... 60

4.1 Elementos químicos em órgãos de L. angulifera.............................................. 60

4.1.1 Demonstração da qualidade dos procedimentos analíticos............................ 60

4.1.2 Variabilidade das concentrações de elementos químicos determinados nos

órgãos de L. angulifera....................................................................................... 61

4.1.3 Impressões digitais (fingerprints) dos órgãos estudados de L.

angulifera............................................................................................................ 64

4.2 Mutagenicidade em L. angulifera de diferentes manguezais.......................... 67

4.2.1 Otimização na obtenção das lâminas de hemócitos......................................... 68

4.2.2 Resultados de mutagenicidade.......................................................................... 70

4.3 Resultado da análise histológica....................................................................... 75

4.4 Comparação entre as concentrações dos elementos químicos

quantificados em L. angulifera de manguezais de Pernambuco.................... 78

4.5 Efeitos biológicos da acumulação de Cu, Fe e Zn sobre

L. angulifera........................................................................................................ 80

5. CONCLUSÕES.................................................................................................. 83

6. PERSPECTIVAS............................................................................................... 84

7. REFERÊNCIAS................................................................................................. 85

16

1. INTRODUÇÃO

Em ambientes impactados, devido às alterações na disponibilidade de recursos, moluscos

tendem a absorver altas concentrações de elementos químicos, a partir do fenômeno

denominado de bioacumulação (AL-SUBIAI et al., 2011). Estudos investigando a

bioacumulação de substâncias químicas são capazes de relacionar os impactos sofridos pelo

ambiente às respostas biológicas a partir de estudos de biomonitoração da qualidade

ambiental (MARKERT, 1991; PHILLIPS; RAINBOW, 2013). Os organismos biomonitores,

permitem quantificar a qualidade ambiental, além de associar a alteração da composição

química no seu organismo às principais fontes antropogênicas de elementos químicos

(MARTIN; COUGHTREY, 1982; MARKERT, 1991; MARKERT, 2000). Assim, para a

biomonitoração são utilizadas espécies de moluscos com maior resistência à toxicidade das

substâncias químicas.

As consequências da exposição dos animais a compostos químicos presentes no ambiente

podem ser também estudadas por meio de alterações em funções biológicas básicas como

sobrevivência e reprodução. Dentre os diversos marcadores biológicos possíveis de avaliação

em organismos coletados de ambientes impactados, a presença de alterações no material

genético dos organismos tem sido utilizada para moluscos, avaliando-se os impactos

ambientais sofridos pelas espécies (FENECH; MORLEY, 1985; DEPLEDGE, 1998;

NAKANO et al., 2003; REGOLI et al., 2006; TALLARICO et al., 2014).

Dentre os ensaios biológicos mais utilizados em estudos desse tipo, encontra-se o teste do

micronúcleo, caracterizado por sua fácil execução e rapidez de análise, quando comparado a

outras técnicas empregadas para avaliação de mutações genéticas (SILVA, 2010;

PINHEIRO et al., 2013). Esse teste consiste na análise de células de organismos e

quantificação da frequência de alterações como a micronucleação, binucleação e apoptose

(FLORES; YAMAGUSHI, 2008). Os protocolos adaptados para estudos mutagênicos, como

o teste do micronúcleo, para moluscos ainda são escassos, considerando-se a alta diversidade

de espécies.

Outra forma de observar os impactos ambientais nos organismos está na análise de

lâminas histológicas para a avaliação de danos nos tecidos dos animais. Essa técnica não é

bastante difundida em moluscos terrestres, sendo escassos estudos tanto naqueles de áreas

impactadas quanto não impactadas. Alterações na glândula digestiva foram observadas em

moluscos marinhos, indicando esse órgão como sensível a poluentes nesse ambiente

(USHEVA et al. 2006). Dessa forma devido a escassez de trabalhos com moluscos terrestres

17

abordando testes mutagênicos e histológicos, torna-se altamente relevante os estudos

envolvendo esses organismos em estudos ambientais.

Os moluscos em sua riqueza de espécies e características anatômicas e fisiológicas, estão

sendo utilizados em estudos ambientais como biomonitores passivos (CAETANO;

ABRASÃO, 2002; OEHLMANN; OEHLMANN, 2003; FERREIRA-JR et al., 2014). O

gastrópode prosobrânquio Littoraria angulifera (Lamarck, 1822), da família Littorinidae, que

habita manguezais de continentes americanos (WORMS, 2014), tem sido utilizados para a

monitoração ambiental (MELO et al., 2012; MÉLO, 2014; RIBEIRO, 2013) a partir de sua

capacidade de acumulação de elementos químicos relacionada com a presença de impacto

antropogênico em manguezais (MÉLO, 2014).

Para corroborar a aplicação de L. angulifera como biomonitora de qualidade ambiental de

manguezais, o presente trabalho tem como objetivos:

Comparar as concentrações de Cl, Cu, Fe, K, Mg, P, S, Sr e Zn determinadas por

Fluorescência de Raios-X por Dispersão de Energia - EDXRF e por Espectrometria de

Absorção Atômica – AAS nos órgãos glândula digestiva e ovoteste, assim como nos

demais órgãos e tecidos de animais coletados nos manguezais do Espaço Ciência e do

Rio Formoso,

Otimizar técnica de extração de hemolinfa para a realização de ensaios de

biomarcadores em moluscos terrestres;

Quantificar a mutagenicidade sofrida pelos animais coletados no manguezal do

Espaço Ciência, em Olinda, comparado com os exemplares do manguezal de Rio

Formoso, em Rio Formoso,

Comparar danos histológicos em mesmo tecido de diferentes exemplares de L.

angulifera coletados em Rio Formoso e Espaço Ciência.

18

2. REVISÃO DE LITERATURA

2.1 Biomas brasileiros

Segundo Ricklefs (2009), Bioma é definido como uma forma de agrupar semelhantes

fitofisionomias com o objetivo de facilitar a comparação entre os mais características

ecossistemas e comunidades. No Brasil, os biomas são Amazônia, Caatinga, Cerrado, Pampa,

Pantanal e Mata Atlântica como mostra a Figura 1 (BALBINO et al., 2012). Em todos esses,

os impactos são impulsionados principalmente pelo desenvolvimento da civilização,

resultando em atividades como a monocultura, a pecuária e a expansão imobiliária (DEAN,

1996). Com isso, a supressão e a fragmentação de habitat, eutrofização e extinção de espécies

continuamente afeta todos os níveis tróficos (ODUM, 2012).

A Mata Atlântica é um dos biomas de maior biodiversidade, com apenas 15% de sua

cobertura vegetal original remanescentes (HIROTA, 2015). Estando inseridos em seu

território, de acordo com o Decreto Federal nº 750 de 10-02-93, art. 3º, a Floresta Ombrófila

Densa Atlântica, Floresta Ombrófila Mista, Floresta Ombrófila Aberta, Floresta Estacional

Semidecidual, Floresta Estacional Decidual, Manguezais, Restingas, Campos de Altitude,

Brejos Interioranos e Encravos Florestais do Nordeste (BRASIL, 1993). Dentre esses, o

manguezal apresenta maior impacto antropogênico, com maior necessidade de cuidados

quanto a sua conservação (SCHAEFFER-NOVELLI, 1995).

19

Figura 1- Áreas originais dos biomas brasileiros

Fonte: Adaptado de Serviço Florestal Brasileiro (2004).

2.2 Manguezais

Segundo Vanucci (2002), o nome manguezal é originário na língua Wolof, nativa do

Senegal. A atribuição à língua latina só aconteceu pelo contato desses povos com os

portugueses durante a colonização. Segundo registros paleontológicos, as espécies de fauna e

flora desse ecossistema são originárias da região Indo-Malasiana, datando dos períodos

Terciário e Quaternário (SPALDIN et al., 1997). Atualmente, os manguezais são

característicos de regiões próximas aos trópicos, presentes em áreas de transição entre rios e

oceanos (SCHAEFFER-NOVELLI, 1995).

É classificado como ecossistema, devido à interação de seus componentes bióticos e

abióticos em um determinado espaço temporal como um sistema aberto dotado de fontes de

entradas e saídas para ciclagem de nutrientes, sendo apto a harmonizar-se diante

desequilíbrios numa busca pela homeostasia (ODUM, 2012). Esse ecossistema encontra-se

20

globalmente distribuído em 15,2 milhões de hectares em 123 territórios (SANDILYAN;

KATHIRESAN, 2012), como é ilustrado na Figura 2. Na Costa Brasileira, percorrem

aproximadamente 6.800 km (KJERVE; LACERDA, 1993), ou seja, desde Santa Catarina

(Laguna, 28°53’S) até o Amapá (Rio Oiapoque, 04°20’N) (SCHAEFFER-NOVELLI, 1989).

Esses ecossistemas são exportadores de matéria orgânica para estuários, desempenhando um

importante papel para a produtividade primária da zona costeira, assim como para

manutenção da biodiversidade marinha (JENNERJAHN, ITTEKKOT, 2002).

Figura 2- Manguezais distribuídos mundialmente.

Fonte: Adaptado de Spalding et al (1997).

Embora reconhecidamente importantes, os ecossistemas de mangues encontram-se

poluídos e com área reduzida na maior parte dos estados brasileiros (SILVA, 2011;

ALONGI, 2015). Um ecossistema de manguezal localizado em áreas fortemente impactadas é

denominado por alguns autores como manguezal urbano (BRANDÃO et al., 2009). Segundo

Schaeffer-Novelli (1995), a urbanização do ecossistema manguezal foi facilitada por sua

localização, disponibilidade para deposição de resíduos sanitários, agrícolas e industriais e

expansão imobiliária, além da proximidade de portos.

É um ecossistema distinto, com flora adaptada a condições de estresse constantes como a

ausência de suporte rígido devido ao substrato lamoso, a alta concentração de sais e a baixa

oxigenação (ONG; GONG, 2013). Como consequência desses fatores, é possível ser

observado, em todo o mundo, 73 espécies de árvores e arbustos de mangue; dessas, apenas 8

ocorrem no Brasil (SANDILYAN; KATHIRESAN, 2012).

http://link.springer.com/search?facet-creator=%22Tim+C.+Jennerjahn%22

http://link.springer.com/search?facet-creator=%22Venugopalan+Ittekkot%22

21

A fauna é composta de espécies nativas e migratórias que utilizam os manguezais como

área reprodutiva (SCHAEFFER-NOVELLI, 1995). Os fungos estão presentes no solo e

auxiliam na decomposição da matéria orgânica (CHENG et al., 2009). A fauna

zooplanctônica é diversificada, enquanto os invertebrados compreendem espécies de potencial

econômico como alguns moluscos, crustáceos e peixes, além de ser uma área utilizada para

carcinicultura e maricultura (SANTOS et al., 2006).

2.2.1 Manguezais pernambucanos

Por despertarem o interesse da comunidade científica, devido à localização próxima a

áreas metropolitanas e agrícolas, alguns estudos relacionados a impactos ambientais vêm

sendo desenvolvidos nos últimos anos nos manguezais do complexo de Salgadinho (CUNHA;

GUIMARÃES, 2000; FIGUEIREDO et al., 2003; MÉLO, 2014) e Rio Formoso

(CPRH, 1998; VASCONCELOS et al., 2004; SILVA et al., 2009; MÉLO, 2014). Entretanto,

dada à situação atual dos manguezais pernambucanos, a quantidade de estudos ainda é

incipiente.

De acordo com Brandão et al. (2009), em 2002, o complexo de Salgadinho, localizado

entre os municípios de Olinda e Recife, possuía área de vegetação de mangue correspondente

a 46.526,7 m2 com área de espelho d’água medindo 24.626,2 m2. Nessa região, atualmente,

encontram-se distribuídos quatro ilhas de manguezais urbanos (Figura 3), formadas por

terraplenagem realizado na região nos anos 70 pela construção do Complexo Viário de

Salgadinho (CUNHA; GUIMARÃES, 2000). Nessa área, destaca-se o manguezal Chico

Science (A), influenciado indiretamente pelo canal do Derby – Tacaruna e classificado

atualmente como a maior da ilha de manguezais urbanos do Parque Memorial Arcoverde

(FIGUEIREDO et al., 2003).

22

Figura 3 - Manguezais urbanos presentes no Complexo de Salgadinho, Olinda, destacados em

vermelho. A, Detalhe do Manguezal Chico Science. Em amarelo, o parque Memorial Arcoverde.

Fonte: Brandão et al. (2009).

O estuário do Rio Formoso, se comparado com o manguezal Chico Science, possui

características ambientais contrastantes em termos da acumulação de substâncias químicas em

solos (PAIVA et al., 2015) e na vegetação (PAIVA, 2014). Situado na microrregião

geográfica da Mata Meridional de Pernambuco, possui área aproximada de 2.724 hectares

com 12 km de extensão (SILVA et al., 2009). O sistema fluvial do Município de Rio Formoso

é composto pelos rios: Ariquindá (Figura 4), dos Passos, Formoso e Lemenho, no qual 80%

do estuário compreende o manguezal em questão (VASCONCELOS et al., 2004). O

Município de Rio Formoso possui parte de seu território incluído na Área de Proteção

Ambiental (APA) de Guadalupe, que além de regulamentar a exploração, incentiva o

ecoturismo e a conservação da biodiversidade (CPRH, 1998).

23

Figura 4 - Estuário no Rio Ariquindá, em vermelho área de coleta ao lado da Ponte Rosalvo

Ramos Rocha na porção pertencente ao município de Rio Formoso.

Fonte: Adaptado de Google Maps (2016)

2.3 Fauna de invertebrados do manguezal

De acordo com Levinton (2001), os manguezais são habitados por vários invertebrados

constituintes da macrofauna bentônica, ou seja, organismos retidos em malha de coleta com

0,5 mm de abertura. Na Figura 5 são mostradas algumas espécies de invertebrados, presentes

em grande abundância nos manguezais (ADAMS, 2000).

24

Figura 5 - Fauna bentônica de manguezais. A.a. =Anphibalanus amphitrite. A.i. =

Amphibalanus improvisus. Ar.p. = Aratus pisoniie. B.e. = Brachidontes exustus. Bost =

Bostrychietum. Ch.p. = Chthamalus proteus. CI.s. = Clibanarius sclopetarius na concha de Cerithium

atratum. Cr.r. = Crassostrea rizophorae. F.c. = Fissurella clenchi. H. = Tubos de poliquetus

Hydroides sp. L.s. = Lottia subrugosa. Li.a. = Littoraria angulifera. Li.f. = Littoraria flava. Me.c. =

Melampus coffea. Mi.r. = Microeuraphia rizophorea. N.v. = Neritina virginea. O.e. = Ostrea

equestris. P. i. = Pinctada imbricata. P.m. = Pugilina morio.

Fonte: Farrapeira et al. (2009).

Estudos realizados com a fauna de manguezais qualificam entre os seres bentônicos mais

abundantes nesse ecossistema os filos Mollusca e Crustacea, em que Mollusca possui a maior

riqueza de espécies (OEHLMANN; OEHLMANN, 2003; FARRAPEIRA et al., 2009,

FERREIRA-JR et al., 2014).

2.3.1 Moluscos

Moluscos são o segundo maior filo de invertebrados, com primeiro registro fóssil datado

do Período Cambriano (entre 542 e 488 milhões de anos atrás). Estão divididos em sete

25

principais classes, sendo as mais representativas os Bivalvia, Cephalopoda e Gastropoda.

Bivalves são necessariamente aquáticos de água doce e salgada; a classe dos Cefalópodes é

formada por espécimes marinhos, enquanto a dos Gastrópodes é a mais diversificada com

espécimes que habitam os mais variados tipos de ambiente. Esta classe merece destaque no

filo Mollusca por possuir a maior quantidade de espécies não extintas. As cinco classes com

menor riqueza, isto é, Aplacophora, Monoplacophora, Poliplacophora e Scaphopoda, são

exclusivamente de habitat marinho (LEME, 1995; RUPERT et al., 2005).

Como característica anatômica geral, os representantes do filo possuem circulação aberta

(exceção: cefalópodes), são bilateralmente simétricos, protostômios e celomados restritos ao

coração, gônadas, intestino e rim. Apresentam conchas externas ou internas e genericamente,

são compostos por pé, massa visceral, manto ou pálio e concha (BRUSCA; BRUSCA, 2007).

Quanto à funcionalidade de seus órgãos e tecidos, podem ser observados nos moluscos

pares de músculos retratores podais inseridos em cada lado do pé, que são utilizados para

movimentar a concha para baixo, posicionando-a acima do animal. A cavidade do manto é a

região entre a concha e o manto, onde se alojam as brânquias (ctenídios). Alimentam-se a

partir da raspagem pela rádula e a digestão do alimento ocorre no meio intracelular das células

dos tubos distais e extracelular na região gástrica. Contudo, a digestão intracelular é o

principal mecanismo dos moluscos menos evoluídos. De forma generalizada, são dioicos com

a gônada inserida ao lado do pericárdio. O pericárdio, ou cavidade celômica, é pequeno e

localizado na região meio-dorsal do corpo. Os órgãos sensoriais comuns são os tentáculos, os

olhos, os estatocistos (órgãos de equilíbrio) e os osfrádios órgãos quimiorreceptores

(RUPERT; et al., 2005). Na Figura 6 são ilustrados os principais órgãos de um gastrópode

típico.

26

Figura 6 – Ilustração anatômica de molusco gastrópode.

Fonte: Brusca e Brusca (2007).

Os moluscos utilizam a hemolinfa como principal meio de transporte de substâncias no

corpo, cuja coloração depende da associação dos elementos químicos Fe ou Cu ao oxigênio.

Ficando vermelha quando associado ao Fe, o pigmento respiratório é denominado

hemoglobina e azul quando associado ao cobre, sendo chamado de hemocianina (SCHMIDT-

NIELSEN, 2002). Devido à anatomia celomática, além de realizar as funções de sangue e

linfa, a hemolinfa também é componente principal no mecanismo de locomoção “músculo-

hidráulico”, o movimento do animal acontece por expansão e retração a partir do aumento da

pressão hidráulica e contração muscular (LEME, 1995). Ainda, a hemolinfa possui em sua

composição células denominadas hemócitos, que diferem quanto à sua morfologia e funções.

Quando os hémocitos apresentam baixo número de lisossomos e pseudópodes poucos ou

ausentes, são denominados hialinócitos, responsáveis pela fagocitose de material estranho ao

corpo dos gastrópodes. Todavia, quando essas células apresentam número mais elevado de

27

lisossomos e presença de pseudópodes, esses, são classificados como granulócitos (VAN

DER KNAAP; LOKER 1990), associados ao estresse ambiental (ROHR; AMATO, 2014).

2.3.1.1 Gastrópodes

Os gastrópodes compõem a classe com maior diversidade de espécies descritas do filo

Mollusca. Além disso, é a classe de maior sucesso evolutivo por terem ocupado os mais

diversos habitats. Morfologicamente, apresentam o corpo torcido composto por uma concha

espiralada “encaixada” tubularmente ou em forma de capuz com funções de proteção contra

predadores e abrigo (RUPERT et al., 2005). Seus representantes são popularmente descritos

como lesmas, caracóis, e caramujos, dependendo da sua interação com a água (NAVARRO;

DOMINGUEZ, 2009).

As diferentes características de seu aparelho respiratório, permite que os gastrópodes

sejam classificados em prosobrânquios, opistobrânquios e pulmonados (BRUSCA;

BRUSCA, 2007). Os opistobrânquios respiram por meio de uma única brânquia localizada

atrás do coração e são, em sua maioria, marinhos. Já os pulmonados, se aquáticos, precisam

emergir para respirar, pois sua respiração acontece pela cavidade pulmonar, que é uma

modificação evolutiva da cavidade do manto. Por outro lado, os prosobrânquios respiram por

meio de brânquias e apresentam um opérculo calcário ou córneo, com a função de fechar a

cavidade da concha quando o seu corpo se retrai, auxiliando nas trocas gasosas

(LEME, 1995).

As conchas desses animais podem ser espiraladas para direita ou para esquerda, com

estruturas internas em formato laminar, denominadas lamelas (lâminas), resultantes da

deposição de carbonatos dentro da concha. Os gastrópodes se fixam às suas conchas por meio

do músculo columelar, resultado da evolução do par de músculos retratores, com função de

unir a parte mole do animal à estrutura interna centralizada às voltas da concha, denominada

columela. Isto possibilita a retração da cabeça e do pé para o interior da concha

(RUPERT et al., 2005). Na Figura 7 são mostradas as principais divisões da concha de um

gastrópode.

28

Figura 7 - Divisões da concha do gastrópode Achatina fulica.

Fonte: Adaptado de Fischer e Colley (2005)

2.3.1.2 Littoraria angulifera (Lamarck, 1822)

A espécie L. angulifera pertence à família Littorinidae. O primeiro fóssil associado a

manguezais foi datado do baixo e médio Eoceno, entre 34 a 40 milhões de anos atrás

(REID, 1989). Esse gênero, Littoraria, antes denominado Litorinopsis tem como habitat o

Atlântico Oriental e Ocidental (REID, 1989). Filogeneticamente foi descrito por Reid et al.

(2010) e o ancestral comum, mais próximo da espécie L. angulifera, data do período

Oligoceno, isto é, cerca de 23 a 34 milhões de anos atrás.

Anatomicamente, os indivíduos possuem concha em espiral cônica, com seis a oito voltas

e abertura em formato oval. De acordo com Mathews-Cascon e Lotufo (2006), a concha mede

aproximadamente 30 mm em adultos, com coloração variando de marrom a laranja (Figura 8).

Possui lábios interno liso e externo fino, seus olhos estão na base dos tentáculos e apresenta

dimorfismo sexual, em que o pênis do macho está alocado do lado direito da cabeça, próximo

ao tentáculo, posicionado anteriormente ao ânus. Nas fêmeas, na mesma região, que se

apresenta o pênis do macho, está o poro genital conforme mostrado na Figura 9 (BRUSCA;

BRUSCA, 2007).

29

Figura 8 - Concha de Littoraria angulifera

Fonte: A autora

Figura 9 - Representação anatômica frontal de Littoraria sp.

Fonte: Brusca e Brusca (2007).

30

Quanto à reprodução, L. angulifera se assemelha aos demais representantes da família

Littorinidae, com fecundação interna e desenvolvimento larval completo. Porém, como

característica marcante do gênero, possui a condição de ser ovovivípara incompleta. Assim,

retém os ovos até o estágio larval veliger ou de vida livre e os libera durante a maré alta

(GALLAGHER; REID, 1974; GUTIERREZ, 1988).

Os adultos são encontrados principalmente em manguezais, nas raízes, galhos e folhas

das espécies arbóreas Rhizophora mangle L., Avicenia sp. e Laguncularia racemosa L.

(REID, 1985). Segundo Gutierrez (1988), a brânquia pouco desenvolvida de L. angulifera e o

epitélio vascularizado para maior absorção de oxigênio do ar proporcionam baixa resistência à

submersão. Quanto aos predadores dessa espécie, os principais são as aves, os crustáceos, as

moscas parasitas e os peixes (REID, 1985).

Seu comportamento é aparentemente arborícola, alimentando-se de fungos livres ou

infestantes de plantas (KOHLMEYER; BEBOUT, 1986). Silva (2005) observou uma

alteração na rádula, justificando como uma possível consequência da mudança na dieta

influenciada pelo habitat do animal. Seu hábito alimentar é a principal via de absorção das

várias substâncias em seu organismo.

2.4 Estudos ambientais utilizando moluscos gastrópodes

2.4.1 Acumulação de elementos químicos: Biomonitoração

2.4.1.1 Definições

Seres vivos inseridos em ambientes poluídos tendem a acumular elementos químicos em

seu organismo como reflexo da disponibilidade de substâncias químicas em sedimentos, água

ou atmosfera (MARKERT, 1991; OEHLMANN; OEHLMANN, 2003). Assim, as espécies

são denominadas bioacumuladoras e podem ser utilizadas para fins de biomonitoração

ambiental (PHILLIPS; RAINBOW, 2013). No entanto, os bioindicadores são os seres vivos,

nos quais a abundância, riqueza e distribuição, entre outros aspectos populacionais

qualitativos e quantitativos são influenciados por mudanças nas condições ambientais. Assim,

alterações no seu comportamento ou mesmo sua extinção local são utilizados para

identificação de áreas impactadas (MARTIN; COUGHTREY, 1982; DALLINGER, 1994).

Essas espécies possuem um padrão de distribuição ambiental de acordo com seu nível de

31

tolerância à contaminação. É dessa forma, para os estudos de bioindicação são utilizadas

espécies mais sensíveis a fatores de estresse.

Para biomonitoração, são utilizadas espécies para obter os resultados quantitativos sobre

a qualidade do ambiente, podendo ser realizada de forma passiva e ativa. A ativa acontece por

meio da exposição de indivíduos criados em cativeiro a ambientes contaminados, enquanto a

biomonitoração passiva emprega espécimes “in situ”. O processo de biomonitoração é

iniciado e, por meio de medidas temporais, substâncias químicas e poluentes, podem ser

monitoradas diretamente no tecido do organismo biomonitor. Estas técnicas tornam-se

bastante atrativas por terem baixo custo e por utilizar a própria informação contida na

biodiversidade para a preservação da qualidade ambiental, principalmente no caso da

biomonitoração passiva (FRANÇA, 2006).

2.4.1.2 Uso de elementos químicos por organismos

O sucesso das técnicas de bioindicação e biomonitoração depende de como os elementos

químicos são utilizados pelos organismos. Para compreender melhor a interação desses com

os seres vivos, Fränzle e Markert (2000) criaram o Sistema Biológico dos Elementos (SBE)

como mostrado na Figura 11. Nele, foram consideradas as correlações entre os elementos

químicos e fatores evolutivos para construir o padrão de utilização dos elementos químicos,

pelos organismos. Contudo, elementos químicos como Na e H não foram considerados fixos

no sistema devido às características eletrolíticas (Figura 10). Além disso, grande parte dos

elementos químicos nutrientes como Cu, Mn, Zn, Ni, F, I, Se e Sn, tóxicos como As, Hg, Cd,

Pb e Sb, além de actinóides, também não foram posicionados no SBE (Figura 10).

32

Figura 10 - Sistema biológico dos elementos (SBE).

Fonte: Adaptado de Fränzle; Markert (2000)

A variedade de elementos químicos essenciais utilizados por animais e plantas

concomitantemente é limitada a 17, sendo menores ainda aqueles essenciais apenas para

animais (estanho, flúor, iodo, níquel, selênio e vanádio) e plantas (Boro) separadamente

(FRÄNZLE; MARKERT, 2002).

Dada a quantidade dos elementos químicos nos seres vivos, são classificados em macro e

micro nutrientes. Os macronutrientes, são elementos como cálcio, potássio e magnésio, cuja

quantidade nos organismos está na ordem de miligramas, enquanto os micronutrientes como

cobre, ferro, manganês, molibdênio, selênio e zinco tendem a ser encontrados na ordem de

microgramas (FRÄNZLE; MARKERT, 2000).

2.4.1.3 Moluscos bioindicadores/biomonitores de qualidade ambiental

Os gastrópodes, principalmente os marinhos, estão entre os grupos de animais mais

utilizados em estudos sobre à acumulação de elementos químicos. Pesquisadores utilizam as

espécies desse grupo (DALLINGER, 1994; ARELLANO et al., 1999; KANG et al., 1999;

BUSTAMANTE et al., 2000; KAVUN et al., 2002; GOMOT DE VAUFLEURY;

PIHAN, 2000; SANTOS et al., 2009; BORDEAN et al., 2014; MÉLO, 2014), devido às suas

33

especificidades morfológicas e fisiológicas (DALLINGER et al., 2001). Desse modo, esforços

analíticos para a quantificação de elementos químicos em moluscos terrestres para fins de

biomonitoração (ambientes impactados, como manguezais, são de grande valia para as

ciências ambientais).

Gomot De Vlaufleury e Pihan (2000) utilizaram Helix aspersa para a avaliação de áreas

contaminadas com Cd, Cu, Pb e Zn. Indivíduos da espécie de solos contaminados foram

analisados para estudar as consequências da exposição a diversas concentrações desses

elementos químicos para o desenvolvimento dos espécimes. Os autores observaram alterações

no crescimento e sobrevivência dos indivíduos pela presença dos poluentes.

Kang et al. (1999) estudaram a acumulação de Cd, Cu, Pb e Zn em espécimes de

Littoraria brevicula, coletados em locais sob influência de efluentes industriais na região de

Onsan, Coréia do Sul. Os resultados mostraram altas concentrações dos elementos químicos

Cd e Pb nos animais coletados próximos ao complexo industrial.

Kavun et al. (2002) compararam as concentrações de Cd, Cu, Fe, Pb, Mg, Ni, Zn nas

espécies de mexilhões Mytilus trossulus e Crenomytilus grayanus coletadas nas Ilhas Curilas,

Rússia. Os autores obtiveram altas concentrações de Fe e Zn para ambas as espécies em

região com fonte hidrotermal. Cádmio foi acumulado principalmente na espécie C. grayanus,

o que foi justificado pela longevidade da espécie.

Mélo (2014) utilizou os caramujos Littoraria angulifera e Melampus coffea para detecção

de impactos ambientais em manguezais de Pernambuco, propondo as espécies como

biomonitores de qualidade ambiental. Como resultado, foram observadas altas concentrações

de Cu (259 mg kg-1) e Zn (10300 mg kg-1) no Parque Memorial Arcoverde, Olinda, quando

comparadas com aquelas obtidas nos indivíduos de outros manguezais de Pernambuco. Nesse

trabalho, a autora também observou maior sensibilidade da espécie L. angulifera à

disponibilidade de elementos químicos proveniente de impactos antropogênicos.

2.4.1.4 Bioacumulação de elementos químicos em órgãos de invertebrados

A quantificação de elementos químicos em órgãos específicos pode facilitar a

identificação das principais vias de acumulação para a espécie biomonitora, assim como

permite explicitar a principal fonte de contaminação no ambiente estudado (Tabela 1).

Bordean et al. (2014), por exemplo, identificou absorção via contato ao estudar a espécie

Cantareus aspersus em florestas próximas a regiões industriais. Baseado nesses estudos,

pode-se inferir que o hepatopâncreas/glândula digestiva é o órgão que se destaca na

34

acumulação de elementos químicos. Alterações celulares neste órgão após exposição a

poluentes orgânicos e inorgânicos também foram observadas na literatura (DALLINGER et

al., 2001).

Tabela 1 – Acumulação de elementos químicos em órgãos/tecidos de invertebrados

empregados como biomonitores

Animal Elemento Órgão/ Tecido Referência

Cantareus aspersus

Mn

Concha

Hepatopâncreas*

Pé

Bordean et al. (2014)

Sinopotamon

henanense

Cd Hepatopâncreas*

Ovário Yang et al. (2013)

Crenomytilus

grayanus

Cd Glândula digestiva*

Guelras Kavun et al. (2002)

Nassarius

Reticulatus

Cu

Zn

Glândula digestiva*

Glândula epitelial

Manto

Rim

Trato reprodutivo

Santos et al. (2009)

Nautilus

macromphalus

Cd

Co

Fe

V

Zn

Glândula digestiva*

Sistema pericardial

Sistema renal

Bustamante et al. (2000)

(*) maior bioacumulação

Fonte: A Autora.

Para quantificação das concentrações de elementos químicos nos tecidos, diversas

técnicas analíticas podem ser empregadas, dependendo da matriz e do volume da amostra.

Algumas técnicas analíticas são pormenorizadas a seguir.

35

2.4.2 Técnicas analíticas em matrizes biológicas

As técnicas analíticas de Espectrometria de Fluorescência de Raios-X por Dispersão de

Energia (EDXRF) e de Espectrometria por Absorção Atômica com Chama (FAAS) têm sido

bastante empregadas para quantificar elementos químicos em diferentes tipos de amostras de

origem biológica. A primeira apresenta ampla faixa de elementos químicos identificáveis em

uma mesma análise, sendo assim denominada multielementar. É uma técnica não destrutiva,

considerando que a amostra não necessita de tratamento químico prévio para ser analisada

(MELQUIADES et al., 2008). A segunda, por sua vez, realiza a quantificação monoelementar

e as amostras, para serem lidas, devem estar na forma de solução, sendo previamente tratadas

quimicamente por ácidos (BUSTAMANTE et al., 2000; BORDEAN et al., 2014; YANG et

al., 2013)

2.4.2.1 Espectrometria de Raios-X por Dispersão de Energia (EDXRF)

É uma técnica analítica utilizada para a quantificação de elementos químicos em estudos

com matrizes biológicas e geológicas (MARGUÍ et al., 2005; SOUSA et al., 2013). Possui

facilidades que vão desde a automação da leitura, de troca da amostra e de auto vácuo. Os

limites de detecção alcançam concentrações da ordem de mg kg-1, que pode ser empregado

para quantificar a maioria dos elementos químicos presentes nessas matrizes (BOUMANS;

KLOCKENKÄMPER, 1989; MARGUÍ et al., 2005).

A análise química é possível a partir da geração de raios-X por uma fonte externa, cuja

radiação é absorvida pelos átomos da amostra. Os átomos produzem elétrons excitados que,

ao retornarem ao estado fundamental, pela passagem dos elétrons da camada de valência

superior, resultam na perda de energia na forma de fóton de raios-X como mostrado na

Figura 11 (LEDERER et al., 1967). A energia dos raios-X é característica ao elemento

químico que a originou, permitindo assim, a identificação dos elementos químicos presentes

na amostra (LEDERER, 1967; BOUMANS; KLOCKENKÄMPER, 1989).

36

Figura 11- Excitação de átomo a partir de raios-X

Fonte: Adaptado de Thermo Scientific (2015)

A quantificação dos elementos químicos nas amostras pode ser realizada a partir da

construção de curvas analíticas previamente obtidas pelas leituras das intensidades dos raios-

X característicos dos elementos químicos presentes em materiais de referência certificados

com matriz semelhante às amostras (SOUSA et al., 2013). Ainda, o equipamento de EDXRF

possui diversos colimadores que podem ser ajustados à quantidade disponível de amostras

finamente depositadas em filme de polipropileno (KLEIN; DUTROW, 2012). Essa

característica é bastante interessante para a análise de órgãos de pequenos invertebrados como

Littoraria angulifera, em que massas menores que 0,1 mg podem ser analisadas

(MAGALHÃES, 2015).

2.4.2.2 Espectrômetro de Absorção Atômica por Chama (FAAS)

A Espectrometria de Absorção Atômica (AAS) determina a concentração de elementos

químicos em matrizes biológicas e ambientais a partir da medição de absorbância nos

comprimentos de ondas de cada faixa de concentração de cada analito. Para serem analisadas,

as amostras devem passar por tratamento químico por meio de solubilização ácida dos

elementos químicos presentes na amostra (LAJUNEN, 1992; WELZ; SPERLING, 1999).

37

A Espectrometria de Absorção Atômica com Chama (FAAS) utiliza a atomização por

chama para produzir micropartículas que são irradiadas com comprimentos de ondas

conhecidos e específicos para cada um dos elementos químicos a serem quantificados na

solução (Figura 12). Essa técnica é indicada para a análise de elementos químicos presentes

na amostra em níveis da ordem de mg kg-1 (KRUG et al., 2004).

Figura 12- Funcionamento do FAAS

Fonte: Adaptado de Skoog et al (2002).

No equipamento de FAAS, as medições são realizadas após a obtenção de curvas

analíticas a partir de soluções-padrão dos analitos. O controle da qualidade do procedimento

analítico é realizado por meio de soluções de materiais de referência certificados,

solubilizadas a partir da mesma metodologia aplicada às amostras. Nesse equipamento, as

fontes de radiação responsáveis pela detecção dos elementos químicos nas amostras são

capazes de emitir radiação nas regiões visível e ultravioleta do espectro. Essas fontes de

radiação são constituídas por lâmpadas de cátodo confeccionadas ou revestidas com o próprio

elemento químico de interesse (WELZ; SPERLING, 1999).

As técnicas são capazes de quantificar as diferentes concentrações de elementos químicos

em várias matrizes, porém, em matrizes biológicas, mensurar essas concentrações no

organismo pode ser somente o primeiro passo em compreender as consequências de uma

acumulação. Dessa forma, trabalhos sobre a comparação com testes biológicos devem ser

estimulado.

38

2.4.3 Avaliação da mutagenicidade pelo teste do micronúcleo

A mutagenicidade ocorre por meio da ação de agentes estressores, que alteraram o ácido

desoxirribonucleico - DNA, modificando sua função ou estrutura e transferindo essa alteração

para a geração seguinte de células. Testes citogenéticos são empregados com a finalidade de

determinar nas células as consequências da mutagenicidade. Dentre os testes, tem-se o ensaio

do micronúcleo (MN), que consiste na contagem das células de organismos previamente

expostos a agentes estressores e registro da frequência de micronúcleos gerados durante o

processo mitótico (Figura 13) (HEDDLE et al., 1983; FLORES; YAMAGUSHI, 2009).

Por se tratar de uma análise rápida e de baixo custo (SANTOS, 2004; SILVA, 2010;

PINHEIRO et al., 2013), o ensaio do micronúcleo é frequentemente utilizado para análise da

mutagenicidade “in situ” ou “ex situ” em diversos organismos, incluindo moluscos

(FENECH; MORLEY, 1985; DEPLEDGE, 1998).

Silva (2010) expôs espécimes de Biomphalaria glabrata à radiação gama de 60Co a doses

de 25 Gy, 35 Gy, 45 Gy e 55 Gy, observando um aumento no número de micronúcleos

produzidos nos hemócitos, para as doses de até 45 Gy (frequência relativa de 0,04% de MN),

quando comparados ao grupo controle (0 Gy). Alterações celulares foram observadas nas

doses acima de 35 Gy, porém a apoptose (morte celular) ocorreu apenas nas células dos

espécimes expostos a 55 Gy, podendo justificar a menor frequência de micronúcleo

encontrada neste grupo (0,023%).

Figura 13 – Fotomicrografia de células micronucleadas de Mytilus galloprovincialis.

Fonte: Adaptado de Bolognesi e Fenech, 2012

39

Pinheiro et al. (2013) coletou indivíduos da espécie Ucides cordatus de manguezais de

Cubatão e Juréia em São Paulo. Os autores observaram 59 células micronucleadas das

30.000 células lidas nas lâminas confeccionadas com hemolinfa extraída dos 10 indivíduos

coletados em Juréia (frequência de 0,03% a 0,37% de MN) e 156 células micronucleadas das

30.000 células lidas nas lâminas confeccionadas dos espécimes coletados em Cubatão

(frequência de 0,23 a 0,87% de MN). Nesse trabalho também foi observado caranguejo com o

dedo fixo da própoda semelhante a uma mão, indicando que em ambientes muito impactados

também podem ser observados alterações histológicas e morfológicas.

2.4.4 Alterações histológicas e morfológicas

O excesso de elementos químicos em ambientes pode influenciar na função de alguns

tecidos/órgãos de seres vivos (OEHLMANN; OEHLMANN, 2003; LEVINTON, 2001). A

acumulação de substâncias químicas nos tecidos, modificações na sua estrutura e

funcionalidade podem acarretar, em alguns casos, anomalias irreversíveis (MERTZ, 2012). A

partir de estudos de alterações histológicas e morfológicas de órgãos, obtém-se resultados da

observação das consequências da exposição das espécies a esses elementos químicos

(MINCHIN et al., 1996; ARELLANO et al., 1999; CASTRO et al., 2000; CAETANO;

ABSALÃO, 2002; CASTRO et al., 2005; GARCIA-SANTOS et al., 2007;

COSTA et al., 2013; SANTOS et al., 2015).

O contato de moluscos com compostos orgânicos de estanho (COEs) podem causar uma

anomalia morfológica observada em várias espécies utilizadas para estudos ambientais

chamado de imposex ou pseudo-hermafroditismo. Esse fenômeno é caracterizado pelo

aparecimento de órgãos do aparelho reprodutor masculino em fêmeas, na maioria dos casos

não funcional, resultando na sua infertilidade (SMITH; BLAKEMAN, 1971;

GIBBS et al., 1987). Semelhante a anomalia supracitada, também causada pela exposição aos

COEs, está o intersex. Contudo, nessa alteração histológica, a presença dos caracteres sexuais

masculinos em fêmeas ocorre em fases tão iniciais, que não impedem a reprodução das

fêmeas (BAUER et al., 1997).

Outro fator relevante quanto à análise de alterações histológicas é a observação de

parasitas. Na análise histológica de bivalves de manguezais, Zeidan et al. (2012) observaram

baixa infestação de parasitas, mesmo assim, anomalias foram observadas nos tecidos,

causadas por uma espécie de trematódeo. Por outro lado, Cova et al. (2015) observaram que

40

apenas uma alta incidência de grupos de parasitos em bivalves ocasionaria alterações

histológicas como mostrado na Figura 14.

Figura 14 – Fotomicrografia de tecido digestivo de Crassostrea rhizophorae com setas indicando

parasita da espécie Nematopsis sp.

Fonte: Adaptado de Cova et al. (2015)

Como os danos nos tecidos dos animais estão relacionados a sobrevivência no ambiente,

são extremamente importantes as pesquisas envolvendo avaliações histológicas, uma vez que

há escassez de dados na literatura sobre a histologia de moluscos terrestres como

L. angulifera.

41

3. MATERIAL E MÉTODOS

O delineamento experimental da presente pesquisa científica envolveu diferentes

metodologias de diversas áreas, que foram realizadas para obter a separação dos órgãos para

análises químicas, a extração da hemolinfa, a coloração dos hemócitos para o ensaio de

micronúcleo e a preparação das lâminas histológicas. A amostragem ocorreu nos manguezais

do Espaço Ciência e do Rio Formoso, distintos quanto à influência antropogênica.

3.1 Descrição das áreas de estudo

3.1.1 Manguezal Espaço Ciência

Situado nas coordenadas geográficas de latitude 8°01’33.6”S e longitude 34º51’50.5”W,

o manguezal do Espaço Ciência - EC, chamado de Chico Science (Figura 15), inserido no

Museu Espaço Ciência (FIGUEIREDO et al., 2003), é a maior ilha de manguezal do Parque

Memorial Arcoverde. Nessa área, o clima na escala Köppen caracteriza-se

predominantemente tropical com estação seca no verão, classificado como As (CUNHA;

GUIMARÃES, 2000).

3.1.2 Manguezal Rio Formoso

A porção do manguezal do Rio Formoso - RF (Figura 15) a ser estudada, tem sua

localização às margens do Rio Ariquindá entre as coordenadas de latitude 8º40’05’’ S e

longitude 35º06’40’’W, situado na microrregião geográfica da Mata Meridional de

Pernambuco. O clima também é do tipo As, de acordo com a escala climática de Köppen

(SILVA et al., 2009).

42

Figura 15 – Localização geográfica dos manguezais de estudo

Fonte: Adaptado de SISCOM/IBAMA (2015).

3.2 Amostragem

A amostragem aconteceu entre os meses de agosto e outubro de 2015 durante a maré

baixa, por busca ativa com duração de uma hora, no médio estuário, em árvores de

manguezais, principalmente nas raízes aéreas de R. mangle (KOHLMEYER; BEBOUT, 1986,

MELO et al., 2012). Os animais coletados foram armazenados em recipientes de polietileno e

deixados em repouso para o esvaziamento do trato digestivo e posteriores análises. No

manguezal do Rio Formoso, 10 amostras compostas foram coletadas contendo de nove a 12

espécimes cada. No manguezal do Espaço Ciência, foram coletadas quatro amostras

compostas com cinco a sete indivíduos cada. Vale ressaltar que ambas as coletas possuíram o

mesmo esforço amostral, contudo, no Espaço Ciência, um menor número de espécimes foi

coletado, indicando uma população de L. angulifera já reduzida nessa área.

43

3.3 Procedimentos de laboratório para preparação de amostras

Os indivíduos foram lavados com Extran a 0,1 % (v/v), conforme ilustrado na Figura 16-

1 para remoção de possíveis contaminantes. Posteriormente, os animais foram pesados em

balança analítica (Figura 16-2), com a conseguinte realização da biometria da concha

(Figura 16- 3). Os animais foram mantidos em recipientes de polietileno até limpeza intestinal

durante 4 dias e após esse intervalo, 10 indivíduos do manguezal do Rio Formoso (RF) e 5 do

manguezal do Espaço Ciência (EC) seguiram para extração da hemolinfa (H) (Figura 16–4).

Os demais animais coletados (89 do RF e 17 do EC) foram dissecados (Figura 16–5) para a

retirada da glândula digestiva (GD) e gônada (G). Junto às amostras dos órgãos, os demais

órgãos e tecidos (DOT) de cada animal também foram encaminhados para a análise química

(Seção 3.4).

Figura 16 – Procedimentos para a preparação dos moluscos/amostras

Fonte: A autora

3.3.1 Dissecação dos animais

A concha e a massa visceral dos moluscos foram separadas (Figura 17) por rompimento

do músculo columelar. Para se atingir o músculo fez-se uma pequena incisão na concha

próxima ao lábio interno com uma pinça “dente de rato”. Para o rompimento, utilizou-se de

uma pinça de ponta curva. Após toda a massa visceral ser removida da concha, os espécimes

foram dissecados para separação dos órgãos e submetidos às demais etapas referentes às

análises químicas.

1 2 3 4 5

44

Figura 17 – Remoção da concha de um animal do manguezal do Rio Formoso.

Fonte: O autor

3.4 Análise química

3.4.1 Preparação das amostras

Com a dissecação, a glândula digestiva - GD, a gônada - G e demais órgãos e tecidos -

DOT foram congeladas a -20 ºC durante 24 horas. Em seguida, as amostras foram secas a frio

até peso constante (diferença entre pesagens sucessivas inferior a 1 mg). Os órgãos foram

cominuídos e homogeneizados em almofariz de vidro até tamanho de partículas menores que

0,5 mm. Primeiramente, as amostras homogeneizadas foram analisadas no Espectrômetro de

Fluorescência de Raios-X por Dispersão de Energia – EDXRF, seguido pelo tratamento

químico necessário para a análise de cobre por Espectrometria de Absorção Atômica com

Chama - FAAS. O número das amostras simples, incluindo sua junção para a criação das

amostras compostas, está detalhado na Tabela 2. O arranjo experimental foi modificado de

modo a atender as condições analíticas para cada técnica empregada. Neste caso, para a

análise por EDXRF dos espécimes de Rio Formoso, foram coletados 89 indivíduos,

dissecados em G, GD e DOT, totalizando 8-9 indivíduos para cada amostra simples. Enquanto

para os exemplares de L. angulifera do Espaço Ciência, foram coletados 17 indivíduos,

também dissecados em G, GD e DOT. As amostras simples também foram reunidas para

formar as amostras compostas como mostrado na Tabela 2.

45

Tabela 2- Total de indivíduos por amostra, total de amostras e amostras compostas analisadas

para a quantificação de elementos químicos em L. angulifera. RF = Manguezal do Rio Formoso.

EC = Manguezal do Espaço Ciência.

Técnica /

analito Estrutura

RF EC

Total de

indivíduos/

amostra

Amostras

simples

Amostras

compostas

Total de

indivíduos/

amostra

Amostras

simples Amostras

compostas

EDXRF /

Ca, Cl, Fe, K,

Mg, P, S, Sr,

Zn

G 8-9 10 - 4-7 3 -

GD 8-9 10 - 4-7 3 -

DOT 8-9 10 - 4-7 3 -

FAAS /

Cu

G 8-9 10 1 17 3 1

GD 16-18 10 5 17 3 1

DOT 8-9 10 10 4-7 3 3

Fonte: A autora

Em consequência do cobre estar relacionado no transporte de substâncias na hemolinfa,

houve a necessidade de análise deste elemento químico por FAAS, uma vez que os limites de

detecção de EDXRF com o colimador de 3 mm seriam elevados (maiores que 100 mg kg-1).

Como algumas estruturas analisadas tinham pouca massa, fez-se necessário o rearranjo

amostral para obter massa suficiente das estruturas de G e GD de ambos locais de coleta.

Aquelas amostras contendo 8-9 indivíduos do Rio Formoso, foram agrupados em 1 e em 5

amostras compostas para G e GD, respectivamente (Tabela 2). Enquanto para o Espaço

Ciência, todas as amostras simples das estruturas G e GD perfizeram uma amostra composta.

Assim, a técnica de EDXRF possibilitou a quantificação de Ca, Cl, Fe, K, Mg, P, S, Sr e Zn e

a técnica de FAAS a quantificação de cobre, conforme mostrado na Tabela 2.

3.4.2 Análise química por EDXRF

Previamente, realizou-se a calibração do equipamento EDX-720 da Shimadzu

(Figura 19), a partir dos padrões A-750 (calibração em energia e resolução) e SUS

(verificação da calibração realizada anteriormente). As amostras foram transferidas para

cápsulas de polietileno específicas para a análise por EDXRF e vedadas com filme de

polipropileno na base e no topo (Figura 19). Como as análises aconteceram no vácuo (<30

Pa), pequenos respiradores foram feitos no polipropileno do topo das cápsulas com o auxílio

46

de agulha para evitar o rompimento do filme de polipropileno durante as análises químicas na

atmosfera com pressão do ar menor que 30 Pa.

Figura 18 – Equipamento EDX-720 para análise química por Fluorescência de Raios-X por

Dispersão de Energia.

Fonte: A autora

As medições da radioatividade induzida ocorreram em triplicata com tensão de 15 kV

para a determinação dos elementos químicos de número atômico menor que 22 e tensão de

50 kV para os demais elementos químicos. A determinação dos elementos químicos nas

amostras foi realizada a partir de curvas analíticas obtidas por diversos materiais de referência

conforme procedimento realizado por Sousa et al. (2013). Para o controle da qualidade do

procedimento analítico, porções dos materiais de referência certificados SRM 2976 Mussel

Tissue (Trace Elements & Methylmercury), SRM 1547 Peach Leaves e RM 8415 Whole Egg

Powder do National Institute of Standard and Technology (NIST) foram analisados junto às

amostras. Detalhes sobre as condições analíticas para as determinações de Ca, Cl, Fe, K, Mg,

P, S, Sr e Zn em amostras biológicas podem ser consultados em Mélo (2014),

Magalhães (2015) e Santos et al. (2015).

47

Figura 19-Cápsula de polipropileno específicos para análise química por EDXRF.

Fonte: A autora

Após as análises por EDXRF, as amostras de gônada e glândula digestiva formaram

amostras compostas (Tabela 2) para possibilitar a determinação de cobre por FAAS após

tratamento químico com ácidos para a solubilização dos analitos das amostras.

3.4.3 Tratamentos químicos

As amostras foram submetidas a dois diferentes tipos de tratamentos químicos para serem

analisadas por FAAS. O primeiro tratamento químico foi aplicado para glândula digestiva -

GD e gônada - G, enquanto o segundo foi empregado para a digestão dos demais órgãos e

tecidos – DOT. O procedimento em forno digestor facilitou a solubilização dos analitos em

material de composição mais complexa como é o caso dos demais órgãos e tecidos – DOT.

3.4.3.1 Banho de ultrassom

Aproximadamente 0,5 g das amostras do Rio Formoso foram obtidos após o agrupamento

de 10 amostras de gônadas e 5 de glândulas digestivas (Tabela 2). De acordo com o número

de espécimes coletados no manguezal do Espaço Ciência, foram agrupadas três amostras

individuais de cada estrutura para a obtenção de uma amostra composta de gônada e uma de

glândula digestiva (Tabela 2). As amostras compostas, junto às três amostras de 0,5 g do

material de referência RM 8414 produzido pelo National Institute of Standards and

48

Technology – NIST e do branco analítico foram tratados quimicamente seguindo a

metodologia proposta por Magalhães (2015):

Para cada 50 mg de amostra, 1 mL de HNO3 (ácido nítrico) concentrado (p.a ~65%);

foi depositado em tubos de ensaio;

A mistura foi deixada em repouso na capela de fluxo laminar por 24 horas;

Agitou-se manualmente para evitar a adesão do material nas paredes do tubo;

Após a temperatura da água do banho de ultrassom atingir aproximadamente 80 ºC, os

tubos foram dispostos nesse banho como mostrado na Figura 20 por cerca de 1 hora;

Os tubos seguiram para capela de fluxo laminar e permaneceram em repouso até

atingir a temperatura ambiente;

0,1 mL de H2O2 (peróxido de hidrogênio) foi adicionado para cada 50 mg de amostra;

A mistura foi devolvida para o banho de ultrassom (80 ºC) por mais 1 h;

Após repouso em capela de fluxo laminar até atingir a temperatura ambiente, as

soluções foram filtradas (quantitativo) e acondicionadas em frascos de polietileno

devidamente lavados seguindo o procedimento-padrão do Centro Regional de Ciências

Nucleares do Nordeste – CRCN-NE.

O volume final foi completado até 30 mL para obtenção das amostras e dos materiais

de referência digeridos e diluídos.

Figura 20- Tubos com amostra no equipamento de ultrassom.

Fonte: A autora

49

3.4.3.2 Forno digestor

O segundo tratamento químico, também aplicado às porções do material de referência

NIST RM 8414 e ao branco analítico, foi utilizado para a digestão das amostras referentes aos

demais órgãos e tecidos – DOT, que contém as partes mais fibrosas dos caramujos, como o pé

e o músculo columelar. Nessa metodologia, porções-teste de 0,5 g das amostras foram

transferidas para tubos de Teflon com capacidade para 30 ml. As etapas do procedimento

químico por forno digestor (MÉLO, 2014) foram:

Adição de 6,0 ml de HNO3 (ácido nítrico) concentrado p.a. (~65%);

A mistura permaneceu em repouso na capela de fluxo laminar por 24hs;

Agitou-se manualmente para evitar a adesão do material nas paredes do tubo;

Adicionou-se 1,0 ml de HClO4 (ácido perclórico) concentrado;

Aqueceu-se a solução em forno digestor (Figura 21), conforme programa de ciclos

previamente estabelecidos em Mélo (2014).

Finalmente, as soluções foram filtradas, como mostrado na Figura 22, e

acondicionados em potes de polietileno.

O volume da solução foi completado até 30 ml com água ultra-pura.

Figura 21 - Forno digestor MarsXpress 5 CEM.

Fonte: O Autor.

50

Figura 22 – Procedimento de filtragem da amostra tratada quimicamente em capela de fluxo

laminar.

Fonte: O autor

3.4.4 Análise química por FAAS

As soluções de amostras, branco analítico e de materiais de referência foram analisadas

por Espectrometria de Absorção Atômica com Chama no equipamento AA da Agilent

(Figura 23). A curva analítica foi obtida a partir da análise de soluções com alto grau

metrológico (Merk). O comprimento de onda utilizado foi 324,8 nm com abertura de 0,5 nm

(slit). O tipo de chama foi ar/acetileno com os respectivos fluxos de 13,50 l min-1 e

2,00 l min-1. As análises foram realizadas em triplicatas. Os cálculos das concentrações foram

realizados em planilha Microsoft Excel ®.

51

Figura 23 – Equipamento SpectrAA 220 da Varian/Agilent.

Fonte: O autor

3.5 Extração da hemolinfa para teste do micronúcleo

A extração da hemolinfa para teste do micronúcleo foi realizada no Laboratório de

Radiobiologia do Departamento de Biofísica e Radiobiologia do Centro de Biociências da

Universidade Federal de Pernambuco. A metodologia utilizada foi uma adaptação da técnica

de Gorbushin e Iakovleva (2007). Nessa técnica, o material foi coletado no laboratório com o

animal in vivo, os materiais utilizados na extração foram siliconizados com Sigmacote®,

solução que reduz a fixação dos hemócitos as paredes do material durante sua manipulação.

Foi procedida a punção para coleta de hemolinfa na região denominada sinus bucal utilizando

uma agulha siliconizada de 25 mm de diâmetro (Figura 24).

52

Figura 24 – Punção no molusco L. angulifera (A), com agulha de 25 mm (B), pelo sinus bucal

para extração de hemolinfa.

Fonte: O autor

Para deposição da hemolinfa utilizou-se de duas metodologias (Figura 25), ambas

testadas previamente nos animais do manguezal do Rio Formoso para padronização da

técnica.

A metodologia representada na Figura 25-A seguiu à proposta por Gorbushin e

Iakovleva (2007). Nessa, a hemolinfa foi extraída de cinco animais do manguezal do Rio

Formoso, sendo depositada em tubos de microcentrífuga (eppendorfs) de 2 mL, previamente

siliconizados, contendo 100 μL de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) a 10 mM com

Solução de Ringer na proporção 1:1. A mistura hemolinfa e EDTA foi homogeneizada e

alíquotas de 100 μL transferidas com auxílio de micropipeta variável entre 20 μL e 200 μL e

ponteira siliconizada para a lâmina microscópica.

Para a metodologia ilustrada na Figura 25-B, o volume de EDTA nas lâminas variou de

45 a 50 μL, depositados diretamente na lâmina, seguindo do gotejamento da hemolinfa para

homogeneização com o EDTA na própria lâmina de microscopia. O processo de montagem

das lâminas foi igual para ambas as metodologias, em que, as lâminas foram acondicionadas

em câmara úmida por 30 minutos para a fixação das células por EDTA (SILVA, 2010). Em

A B

53

seguida, foram adicionados 90 μL a 100 μL da solução de Gluteraldeido com Ringer a 1%

com tempo de repouso de 10 minutos. Ao final dessa etapa, as lâminas foram lavadas com

água destilada, para retirar o excesso de solução e seguiram para a etapa de coloração. As

lâminas foram imersas em solução do corante Giemsa a 10%, durante 7 minutos.

Posteriormente, as lâminas foram lavadas com Ringer, e posicionadas inclinadas, na bancada,

para secarem em temperatura ambiente (25ºC). As lâminas foram observadas em microscópio

óptico com objetiva de 40x para a verificação da presença de hemócitos nas duas

metodologias empregadas. A metodologia mais eficiente, para o teste do micronúcleo, foi

aquela que permitiu a contagem de 1000 células. A contagem aconteceu por meio de

microscópio óptico com objetiva de 100x e, com isso, registraram-se as frequências das

diferentes morfologias dos hemócitos analisados. As imagens das células foram capturadas

em microscópio óptico Leica DM1000, acoplado com uma câmera DMC 2900, e analisadas

por meio do software LAS Core.

Figura 25 - Representação das metodologias do preparo da hemolinfa para deposição na

lâmina. A. Metodologia adaptada por Gorbushin e Iakovleva (2007). B. Hemolinfa depositada

diretamente na lâmina contendo a solução de EDTA.

Fonte: O autor

54

3.6 Preparo das lâminas histológicas

Os espécimes utilizados para a extração da hemolinfa seguiram em recipiente de vidro

com formol a 10 % para o Laboratório de citologia no Departamento de Histologia do Centro

de Biociência da UFPE. Os espécimes foram retirados do formol, desidratados com álcool e

clareados com xilol. Esta substância removeu lipídios, preparando os animais para serem

impregnados com parafina a partir da emblocação (Figura 26-A). Em seguida, esperou-se o

tempo necessário (24 horas) para a secagem da parafina, para a realização dos cortes

longitudinais em micrótomo com lâmina de aço (Figura 26-B). Os cortes foram feitos com

5 μm de espessura e seguiram para o banho-maria (45º por 2 minutos) para serem

posicionados nas lâminas. Posteriormente, para finalização da lâmina histológica (Figura 26-

C) foi adicionado xilol na lâmina de microscopia para remoção da parafina, hidratado em

álcool, de maior para menor concentração, lavados em água corrente e imersos em

Hematoxilina (corante básico), por 5 minutos, lavados novamente em água corrente e imersos

em Eosina (corante ácido) por cerca de 30 segundos. A análise histológica foi realizada em

microscópio óptico com aumento de até 40x para a obtenção das fotomicrografias.

Figura 26 – Cortes histológicos de peças de moluscos. Peças emblocadas (A), micrótomo (B) e

lâminas histológicas (C).

Fonte: O autor

A B C

55

3.7 Análise dos resultados

A análise dos resultados compreendeu técnicas estatísticas para a expressão dos

resultados das concentrações dos elementos químicos determinadas por EDXRF e FAAS e

para a comparação dos dados de frequência de micronúcleos, binucleação e apoptose. Análise

comparativa e descritiva foi utilizada para os estudos histológicos, baseada principalmente em

dados de outros moluscos, uma vez que não foram encontrados resultados de histologia para

L. angulifera.

3.7.1 Análises químicas

A garantia da comparabilidade dos resultados das análises químicas realizadas por

EDXRF e FAAS foi baseada na análise de materiais de referências certificados, cujas

porções-teste foram analisadas concomitantemente às amostras. A incerteza analítica foi

estimada (Seção 3.5.1.1), permitindo os cálculos do Número En para a avaliação da qualidade

do procedimento analítico (Seção 3.5.1.2).

3.7.1.1 Incerteza Analítica

A estimativa de incerteza analítica das técnicas espectrométricas, EDXRF e FAAS, foi

obtida a partir da soma quadrática das incertezas individuais referentes à precisão e à exatidão

segundo o EURACHEM/CITAC Guide CG (ELLISON; WILLIAMS, 2012). Esses valores de

incertezas foram expandidos em nível de 95% de confiança.

3.7.1.2 Qualidade do procedimento analítico

Para validação do procedimento analítico, foi utilizado o Número En (Equação 1). Para

alcançar o nível de confiança de 95%, a faixa adequada para os resultados do Número En é

entre -1 e 1, conforme recomendação da ISO 13528/2005.

En =

𝑋𝑜𝑏𝑠 − 𝑋𝑟𝑒𝑓

√𝑈𝑜𝑏𝑠2 + 𝑈𝑟𝑒𝑓

2

(1)

56

na qual,

𝑋𝑜𝑏𝑠 = valor observado na análise do material de referência;

𝑋𝑟𝑒𝑓 = valor do certificado de análise para o material de referência;

𝑈𝑜𝑏𝑠 = incerteza analítica expandida em nível de 95% de confiança do valor obtido do

material de referência;

𝑈𝑟𝑒𝑓 = incerteza analítica expandida em nível de 95% de confiança do valor certificado

para o material de referência.

3.7.2 Análise de hemócitos

O procedimento adotado para a análise dos hemócitos envolveu os critérios para a

identificação das células micronucleadas e a obtenção dos intervalos de confiança das

frequências de micronúcleos, binucleação e apoptose dos hemócitos de L. angulifera

coletados nos manguezais do Espaço Ciência e Rio Formoso.

3.7.2.1. Critérios para identificação de células micronucleadas

As células foram contadas individualmente utilizando-se de um contador de células

manual. De cada lâmina escolhida aleatoriamente, o mesmo número de células foi

quantificado e classificado quanto à presença de micronúcleos, resultando na frequência de

células afetadas do total de células contadas. Desse modo, realizou-se a verificação de

possíveis riscos de malformação celulares nos animais (FLORES; YAMAGUCHI, 2009). As

células micronucleadas obedeceram ao critério estabelecido por Chequer (2008), no qual

micronúcleos - MN tiveram, no mínimo, 1/16 e, no máximo, 1/3 do tamanho dos núcleos

(Figura 27-A). Também foram considerados micronúcleos aqueles com a mesma coloração e

formato oval (Figura 27-B). Não foram consideradas como micronucleadas as células em que

os micronúcleos estiveram em contato direto com o núcleo, sobreposto e sem limite

distinguível (Figura 27-C).

57

Figura 27 – Critérios de identificação de MN. A = Núcleo e micronúcleo bem definidos. B =

Núcleo e micronúcleo com a mesma coloração. C = Célula não micronucleada.

Fonte: Adaptado de Silva (2010).

3.7.2.2 Intervalos de confiança para a frequência de variáveis relacionadas com a

mutagenicidade em L. angulifera

Para a determinação do intervalo de confiança dos resultados das variáveis relacionadas

com a mutagenicidade, assumindo-se distribuição de Poisson com proporção 𝑝 para 𝑛

amostras com estimativa de desvio-padrão 𝑠 = 𝑝(1 − 𝑝)/𝑛1/2, optou-se pelos cálculos dos

intervalos de confiança de Wald e Wilson em nível de 95% de confiança (𝑧𝛼

2= 1,96).

Para o método de Wald, assumiu-se a aproximação da distribuição de 𝑝 como sendo

distribuição normal (WALD, 1943) segundo a Equação 2.

(𝑒−𝑒+) ≡ (𝑝 − 𝑧𝛼2

. 𝑠, 𝑝 + 𝑧𝛼2

. 𝑠) (2)

No caso do intervalo de confiança de Wilson, aplicou-se uma correção para a obtenção

dos limites superiores e inferiores em nível de 95% de confiança, uma vez que a suposição de

distribuição normal pode não ser realista para a proporção 𝑝 (WILSON, 1927). Para isso,

aplicou-se a seguinte equação (3):

58

(𝑤−, 𝑤+) ≡

(𝑝 +𝑧𝛼

2

2

2𝑛 ± √𝑝(1 − 𝑝)𝑛 +

𝑧𝛼2

2

4𝑛2)

(1 +𝑧𝛼

2

2

𝑛 )

(3)

Os resultados de intervalo de confiança foram comparados diretamente para as variáveis

Proporção de Micronúcleo – MN, Proporção de Células Binucleadas e Proporção de Apoptose

para os animais coletados nos Manguezais de Rio Formoso e do Espaço Ciência.

3.7.2.3 Tamanho mínimo de amostra ou suficiência amostral

A partir da estimativa da proporção média 𝑝 e do desvio-padrão 𝑠, testou-se a quantidade

mínima de lâminas necessárias para garantir um erro de 20% ou 40% para as variáveis

medidas (Proporção de Micronúcleo – MN, Proporção de Células Binucleadas e Proporção de

Apoptose) de acordo com a Equação 4:

𝑛 = ( 𝑍𝛼

2× 𝑠

𝐸)

2

(4)

na qual,

𝑛 = número de amostras

𝑍𝛼2 = valor crítico de 95% de confiança = 1,96

𝑠 = desvio padrão da variável em questão

𝐸 = margem de erro considerada aceitável para os ensaios de micronúcleo

59

3.7.3 Alterações histológicas

A avaliação das alterações histológicas foi realizada em microscópio óptico com aumento

de 10x e 40x para descrição da diferenciação sexual e das alterações celulares nos tecidos dos

diferentes animais analisados com relação a:

Células em estágios degenerativos, que apresentam como característica principal a

vacuolização e a atrofia;

Células em estágio destrutivo, caracterizado pela redução da camada epitelial,

necroses e descamação de células digestivas basófilas;

Células em estágios inflamatórios, ocorrendo à infiltração de hemócitos no tecido

conjuntivo, encapsulação e formação de granulócitos (USHEVA et al., 2006),

Células infestadas com parasitas (ZEIDAN et al., 2012).

60

4. RESULTADOS E DISCUSSÃO

A acumulação de elementos químicos foi diferenciada para os órgãos de L. angulifera

dos manguezais estudados em que os resultados tiveram de nível metrológico garantido e com

comparabilidade demonstrada. De acordo com o ensaio de mutagenicidade, a principal

diferença encontrada foi com relação às células apoptóticas. Os resultados do estudo

histológico foram expressivos, indicando grande pressão ambiental para os espécimes de

L. angulifera do manguezal do Espaço Ciência.

4.1 Elementos químicos em órgãos de L. angulifera

A aplicação das técnicas EDXRF e FAAS permitiu a quantificação dos elementos

químicos essenciais Ca, Cl, Cu, Fe, K, Mg, P, S, Zn e o elemento traço Sr na glândula

digestiva – GD, na gônada – G e nos demais órgãos e tecidos – DOT. Inicialmente, garantiu-

se a qualidade do procedimento analítico, seguida pela quantificação dos elementos químicos

para a comparação entre os órgãos dos animais coletados nos manguezais do Espaço Ciência

e do Rio Formoso. A obtenção das impressões digitais (fingerprints) facilitou o entendimento

da acumulação dos elementos químicos pelos organismos, identificando as principais vias de

circulação de Ca, Cu, Fe e Zn nos animais sujeitos a impactos antropogênicos.

4.1.1 Qualidade dos procedimentos analíticos

Os resultados dos materiais de referências analisados por EDXRF e FAAS estão

apresentados na Tabela 5. As concentrações dos elementos químicos estiveram em

concordância com os valores certificados, principalmente ao considerarem-se as incertezas

analíticas expandidas em nível de 95% de confiança. A qualidade dos procedimentos

analíticos foi comprovada a partir dos valores do Número En, que estiveram entre -1 e 1, para

os elementos químicos quantificados nos materiais de referência (Tabela 3). Com isso,

assume-se que os procedimentos analíticos empregados corroboraram para a determinação de

Ca, Cl, Cu, Fe, K, Mg, P, S, Sr e Zn nos órgãos de L. angulifera.

61

Tabela 3 - Valores obtidos e certificados (mg kg-1), incertezas analíticas

expandidas para 95% de confiança e valores de Número En para os

materiais de referência analisados por EDXRF e FAAS.

Fluorescência de Raios-X por Dispersão de Energia

SRM 2976 Mussel tissue

Analito Valor Obtido Valor Certificado

Número En M Inc. M Inc.

Cl 58000 ± 1800 57000 ± 5000 0,1

Fe 169 ± 54 171 ± 4,9 -0,0

K 9500 ± 1000 9700 ± 500 -0,2

Mg 4700 ± 1200 5300 ± 500 -0,3

P 9600 ± 500 8300 ± 1700 0,7

Sr 101 ± 10 93 ± 2 0,7

Zn 157 ± 25 137 ± 13 0,6

SRM 1547 Peach leaves

Ca 14800 ± 800 15600 ± 2000 -0,3

RM 8415 Whole egg powder

S 4570 ± 530 5120 ± 500 -0,7

Espectrometria de Absorção Atômica com Chama

RM 8414 Bovine muscle powder

Cu1 2,59 ± 0,6 2,84 ± 0,45 -0,3

Cu2 2,65 ± 0,6 2,84 ± 0,45 -0,3

M = média

Inc. = incerteza expandida em nível de 95% de confiança 1tratamento químico com banho de ultrassom 2tratamento químico com forno digestor

Fonte: O autor

4.1.2 Variabilidade das concentrações de elementos químicos determinados nos órgãos

de L. angulifera

As concentrações médias (M) dos elementos químicos em mg kg-1, desvio padrão (DP),

número de amostras (n) e incerteza analítica expandida em nível de 95% de confiança para as

amostras de gônada - G, glândula digestiva – GD e demais órgãos e tecidos – DOT dos

animais dos manguezais do Rio Formoso – RF e do Espaço Ciência – EC estão na Tabela 4.

Para os resultados de Cu das amostras compostas, optou-se em mostrar a incerteza analítica

62

para possibilitar alguma inferência sobre a “variabilidade esperada” para os resultados de

gônada de RF e de EC, assim como para GD de EC. As concentrações foram bastante

variáveis para Ca nos demais órgãos e tecidos – DOT, assim como Cl para a glândula

digestiva dos animais do manguezal de Rio Formoso. Altíssimos valores de concentração de

Cu e Zn foram observados na gônada e na glândula digestiva (Zn 12.300 mg kg-1 e

20.600 mg kg-1 e Cu 1.200 mg kg-1 e 393 mg kg-1, respectivamente), nos animais do Espaço

Ciência.

Tabela 4 – Concentrações médias (M) dos elementos químicos em mg kg-1, desvio padrão (DP), número de

amostras (n) e incerteza analítica expandida em nível de 95% de confiança (em %) para as amostras de

gônada - G, glândula digestiva – GD e demais órgãos e tecidos – DOT dos animais dos manguezais

do Rio Formoso – RF e do Espaço Ciência – EC.

Local Amostra

Ca Cl Cu** Fe K Mg P S Sr Zn

RF

G

M <1400*

14100 97 1830 7951 21600 8520 8520 200 1710

DP 1924 22 440 423 4163 798 904 27 371

n 10 10 1 10 10 10 10 10 10 10

GD

M <1400*

1700 70 1940 6940 19200 6940 8110 220 1000

DP 2427 15 292 198 3638 435 726 27 243

n 10 10 5 10 10 10 10 10 10 10

DOT

M 15100 33500 75 243 10700 8740 6270 10400 186 134

DP 10900 2690 6 55 657 852 532 1130 17 25

n 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10

EC

G

M <1400*

21600 1200 3780 5890 10100 15800 8620 118 12300

DP 6422 270 1902 202 1377 1329 935 61 4482

n 3 3 1 3 3 3 3 3 3 3

GD

M <1400*

20000 393 5920 6250 9600 13400 8560 211 20600

DP 4189 89 885 325 1765 158 665 22 3126

n 3 3 1 3 3 3 3 3 3 3

DOT

M 8130 35700 161 940 11200 7650 6800 9620 179 850

DP 1760 8700 71 200 1650 405 1010 620 14 310

n 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3

*valores menores que a concentração mínima detectável.

**análise realizada em FAAS com amostras compostas para G e GD

Fonte: O autor

63

A glândula digestiva é conhecida como órgão responsável por acumular elementos

químicos tóxicos (BUSTAMANTE et al., 2000; KAVUN et al., 2002; SANTOS et al., 2009;

YANG et al., 2013; BORDEAN et al., 2014). Com relação à gônada, deve ser levado em

consideração o papel desse órgão na perpetuação da espécie. Estudos ressaltam a importância

desse órgão devido à reserva energética, possivelmente associada à produção de gametas.

Deste modo, destaca-se a sensibilidade desse órgão para estudos de contaminação ambiental

(ANSALDO et al., 2006).

Os resultados médios de Cu (70 mg kg-1) para as glândulas digestivas dos animais do

manguezal do Rio Formoso foram compatíveis com os resultados do cefalópode Nautilus

macromphalus (106 mg kg-1). Já para os animais do Espaço Ciência, os valores médios

atingiram cerca de 390 mg kg-1, o que provavelmente está relacionado com o impacto

antropogênico. Contudo, moluscos destacam-se pela alta variabilidade na concentração desse

elemento químico na glândula digestiva, atingindo até 8.400 mg kg-1 no cefalópode Loligo

opalescens (MARTIN; FLEGAL, 1975; BUSTAMANTE et al., 2000). Dessa maneira, as

demais avaliações relacionadas à mutagenicidade e às alterações histológicas podem

fundamentar a pressão ambiental sofrida por L. angulifera no Espaço Ciência.

As concentrações médias de Fe para as glândulas digestivas de L. angulifera do

manguezal Rio Formoso (1.940 mg kg-1) e do Espaço Ciência (5.920 mg kg-1) foram muito

mais elevadas do que aquelas observadas (cerca de 670 mg kg-1) em N. macromphalus

(BUSTAMANTE et al., 2000). Concentrações de Fe de até 2.330 mg kg-1 foram encontradas

em ambientes impactados para o gastrópode Patella vulgata (BRYAN;

HUMMERSTONE, 1977). Nesse caso, provavelmente a análise da glândula digestiva

resultaria em valores mais elevados do que aqueles encontrados nos organismos.

Para Zn, a concentração média (1.000 mg kg-1) das glândulas digestivas dos animais do

manguezal do Rio Formoso foi similar quando comparada com aquela encontrada (valores

médios de 560 mg kg-1) para cefalópodes (BUSTAMANTE et al., 2000). Todavia, relato

sobre a concentração altíssima de Zn (20.600 mg kg-1) da glândula digestiva dos animais do

Espaço Ciência não foi encontrada na literatura, sendo o valor máximo obtido de 830 mg kg-1

± 355 mg kg-1 por Bryan e Hummerstone (1977) na glândula digestiva do cefalópode

Nototodarus gouldi. Valor máximo de 2.940 mg kg-1 foi encontrado nos tecidos do bivalve

Scrobicularia plana, o que poderia levar à mais alta concentração desse elemento químico na

glândula digestiva, porém possivelmente menor que 20.600 mg kg-1 (BRYAN;

HUMMERSTONE, 1977).

64

4.1.3 Impressões digitais (fingerprints) dos órgãos estudados de L. angulifera

Para melhor observação da relação de acumulação dos elementos químicos com os

órgãos dos espécimes e dos manguezais estudados, os resultados das concentrações químicas

foram utilizados para a obtenção de impressões digitais dos órgãos dos animais (fingerprints).

Na Figura 28, é possível observar a tendência dos animais em concentrar Cu, P, Mg e Zn na

gônada – G. Apenas Cl foi acumulado nos demais órgãos e tecidos – DOT. Desse modo, foi

possível confirmar que a glândula digestiva e a gônada não apresentaram tendência de

acumulação de elementos químicos ao menos para os elementos químicos avaliados nos

animais do manguezal do Rio Formoso.

Figura 28 – Gráfico de impressão digital dos órgãos dos animais coletados no Rio Formoso

Fonte: O autor

Técnica semelhante à utilizada para quantificar elementos químicos nesses espécimes foi

aplicado a órgãos do cefalópode Nautilus macromphalus encontraram resultados um pouco

discrepantes aos obtidos para L. angulifera, uma vez que a glândula digestiva do cefalópode

apresentou a maior acumulação de elementos químicos (BUSTAMANTE et al., 2000).

Segundo Martin e Flegal (1975), essa espécie de cefalópode pode acumular substâncias

químicas devido as suas características fisiológicas mais primitivas.

A distribuição dos elementos químicos nos órgãos de L. angulifera do manguezal do

Espaço Ciência pode ser observada no gráfico de impressão digital apresentada na Figura 29.

Nesse ambiente, diferentes composições químicas foram identificadas para os elementos

0%

20%

40%

60%

80%

100%

Cl Cu Fe K Mg P S Sr Zn

G GD DOT

65

químicos nos órgãos analisados, em que Cu foi principalmente acumulado na gônada – G; Fe

e Zn na glândula digestiva, Ca, Cl e K nos demais órgãos e tecidos - DOT.

Figura 29 – Gráfico de impressão digital dos órgãos dos animais coletados no Espaço Ciência

quanto à distribuição dos elementos químicos

Fonte: O autor

Para uma melhor visualização das diferenças entre os animais quanto às concentrações de

elementos químicos determinados nos órgãos, foram propostas impressões digitais

comparando os resultados para os manguezais estudados. Na Figura 30, foram apresentadas as

impressões digitais das gônadas, em que as concentrações de Cu, Fe, P e Zn foram maiores no

manguezal do Espaço Ciência. Em ambos os ecossistemas não houve grande variação quanto

ao acúmulo dos elementos químicos Cl e Sr nas gônadas. Para K, Mg e S, as concentrações

foram levemente superiores para os animais do Rio Formoso. É evidente que, considerando o

aspecto nutricional, os indivíduos do Rio Formoso possuem maiores concentrações de

nutrientes nesse órgão do que os animais do Espaço Ciência (Figura 30).

0%

20%

40%

60%

80%

100%


G GD DOT

66

Figura 30 – Gráfico de impressões digitais dos resultados de gônadas de L. angulifera dos

manguezais do Espaço Ciência (EC) e do Rio Formoso (RF)

Fonte: O autor

Comportamento semelhante foi notado para a acumulação dos elementos químicos nas

glândulas digestivas dos animais do Espaço Ciência (EC) e do Rio Formoso (RF) conforme

mostra a Figura 31. Vale ressaltar que as impressões digitais são bastante interessantes para a

comparação entre locais e podem ser bastante características dos processos a serem

monitorados como mostrado por Ricardo et al. (2015).

Figura 31 – Gráfico de impressões digitais de glândulas digestivas das amostras do Espaço

Ciência (EC) e Rio Formoso (RF)

Fonte: O autor

0%

20%

40%

60%

80%

100%


RF EC

0%

20%

40%

60%

80%

100%


RF EC

67

O reflexo da acumulação nos órgãos gônada e glândula digestiva nos animais do

manguezal do Espaço Ciência resultou em um gráfico de impressão digital muito semelhante

para os demais órgãos e tecidos – DOT da Figura 32, em que Cu, Fe e Zn foram acumulados

nos animais do Espaço Ciência.

Figura 32-Gráfico de impressões digitais de elementos químicos nos demais órgãos e tecidos das

amostras do Espaço Ciência (EC) e Rio Formoso (RF)

Fonte: O autor

A acumulação diferenciada de Cu, Fe e Zn nos órgãos de L. angulifera do Espaço Ciência

pode estar associada (1) à disponibilidade ambiental desses elementos químicos no

ecossistema devido a fontes antropogênicas, (2) ao mecanismo de defesa do animal, uma vez

que, principalmente, alguns elementos químicos nutrientes podem auxiliar nos processos de

desintoxicação, (3) à característica genética da população, que estão habituadas às altas

concentrações dos elementos químicos, (4) a outras fontes poluidoras, que indiretamente

afetam a acumulação desses elementos químicos e (5) à presença de parasitas que alteram a

distribuição e demandam mais elementos químicos aos hospedeiros. Esses distúrbios

poderiam proporcionar alterações drásticas em biomarcadores como aqueles de ensaios de

mutagenicidade nos hemócitos.

4.2 Mutagenicidade em L. angulifera de diferentes manguezais

Os resultados dos ensaios de mutagenicidade aplicados aos hemócitos de L. angulifera

permitiram otimizar a obtenção das lâminas com hemócitos, além de possibilitar a

0%

20%

40%

60%

80%

100%


RF EC

68

comparação pareada, utilizando-se de estatística descritiva, das frequências de micronúcleos,

binucleação e apoptose para os animais coletados nos manguezais do Espaço Ciência e do Rio

Formoso.

4.2.1 Otimização da obtenção das lâminas com hemócitos

Comparando as duas metodologias testadas para a extração de hemolinfa e obtenção das

lâminas com hemócitos, observaram-se diferenças na obtenção de células para a análise da

frequência de micronúcleos. A metodologia sugerida por Gorbushin e Yakovleva (2007), na

qual a hemolinfa é homogeneizada em tubo de microcentrífuga (ependorff) com EDTA,

seguida da disposição da solução na lâmina de microscopia, não permitiu a realização da

contagem das células, uma vez que dificultou a observação dos hemócitos após coloração. No

entanto, a metodologia adaptada, na qual a hemolinfa e o EDTA foram depositados

diretamente na lâmina de microscopia, possibilitou a visualização de quantidade suficiente de

células para a realização dos ensaios de micronúcleos.

Avaliando os possíveis interferentes físicos envolvidos na manipulação do

experimentador para realização das duas metodologias, pôde-se inferir que a técnica de

deposição da hemolinfa na lâmina, previamente acrescida da solução de EDTA, evitou a

perda de células para as paredes do tubo de microcentrífuga (PAMPANIN, et al., 2012). Essa

explicação justificaria a ausência de células nas lâminas confeccionadas após prévia

homogeneização de hemolinfa com EDTA no tubo ependorff.

Comparando com trabalhos disponíveis na literatura para avaliação da frequência de

micronúcleos em espécimes coletados diretamente do ambiente, observou-se que, em muitas

das metodologias empregadas, a disposição direta do sangue/hemolinfa na lâmina de

microscopia proporcionou um quantitativo de células adequado para contagem de

micronúcleos (SILVA, 2010; SILVA; NEPOMUCENO, 2010; ARAUJO-FILHO, 2013).

Por outro lado, Villela et al. (2006) e Geremia (2015) utilizaram a fixação dos

micronúcleos em seringa durante um curto período de tempo (não superior a 7 minutos),

também obtendo bom rendimento celular para contagem de micronúcleos. Villela et al. (2006)

centrifugou a solução contendo as células, enquanto Geremia (2015) previamente injetou no

tecido do molusco solução de Carnoy [ácido metílico e ácido acético glacial (1:1 v/v)],

utilizada para fixação e removeu a hemolinfa, deixando-a em repouso na seringa por

7 minutos antes de depositá-la na lâmina.

69

A frequência das variáveis obtida pela metodologia de deposição da hemolinfa na lâmina,

previamente acrescida da solução de EDTA, foi contabilizada em 1000 células. Na hemolinfa

de L. angulifera, observou-se células redondas (Figura 33-A), hialinócitos (Figura 33-B) e

granulócitos (Figura 33-C), demonstrando, inclusive, o grande potencial da técnica para

outros estudos de mutagenicidade.

Figura 33 – Fotomicrografia de tipos de hemócitos encontrados em hemolinfa de L.

angulifera. A = célula redonda; B= hialinócito; C= Granulócito (c = citoplasma; n = núcleo;

ps = pseudópode; gr = grânulos). Coloração: Giemsa. Magnitude: 1000x.

Fonte: O autor

A metodologia adotada possibilitou a observações de diversas alterações celulares como

micronúcleos (Figura 34-A), binucleação (Figura 34-B) e apoptose (Figura 34-C),

dependendo do local de coleta do animal. Todas essas alterações morfológicas observadas nos

hemócitos são recorrentes em moluscos que sofrem alguma pressão ambiental (SILVA, 2010;

ARAÚJO-FILHO, 2013).

Figura 34 – Fotomicrografia de alterações celulares observadas durante ensaio de

micronúcleo realizado em hemolinfa de L. angulifera. A = Micronúcleo; B=

Binucleação; C= Apoptose (c = citoplasma; n = núcleo; m = micronúcleo; v = vacúolo).

Coloração: Giemsa. Magnitude: 1000x.

Fonte: O autor

Todos os moluscos coletados no Espaço Ciência, em Olinda, apresentaram granulações

(Figura 35-B) semelhantes aquelas encontradas em granulócitos (Figura 33-C), porém com

n

c

ps

gr

c

n

n

c

A

n

m

c

B C

c n

n

A B C

c

v

n

70

grânulos muito mais evidentes. Os hemócitos dos espécimes do Espaço Ciência puderam ser

facilmente identificados ao serem comparados com as preparações confeccionadas dos

animais do manguezal do Rio Formoso (Figura 35-A). A diferente relação de

hialinócitos/granulócitos em hemolinfa de moluscos é indicativo de pressão ambiental, afinal

essas células são responsáveis por fagocitar o que é estranho ao corpo (ATAEV et al., 2016).

Figura 35 – Comparação entre a morfologia dos hemócitos de L. angulifera coletados nos

manguezais do Rio Formoso (A) e do Espaço Ciência (B). c = citoplasma; n = núcleo; gr =

grânulos. Coloração: Giemsa. Magnitude: 1000x.

Fonte: O autor

Como a padronização da quantidade de células escolhidas para realização desse trabalho

está de acordo com a metodologia executada por outros autores, foram avaliadas as

frequências de micronúcleos, binucleação e apoptose nos hemócitos dos animais dos

manguezais do Espaço Ciência e do Rio Formoso (VILLELA et a., 2006; ARAUJO-

FILHO, 2013; GEREMIA, 2015).

4.2.2. Resultados de mutagenicidade

As diferentes alterações celulares encontradas nos animais dos manguezais do Rio

Formoso (RF) e do Espaço Ciência (EC) estão descritas na Tabela 5, em que é possível

observar a frequência das variáveis, micronúcleo, binucleação e apoptose celular, bem como o

número de lâminas analisadas para cada local de coleta. Cinco lâminas foram confeccionadas

da hemolinfa coletada dos espécimes presentes em RF e 4 lâminas confeccionadas dos

espécimes do EC. O número menor de lâminas atribuído ao EC ocorreu em razão da quinta

lâmina preparada não possuir número suficiente de células para contabilização da frequência

de micronúcleos.

A B

n gr

c

n

c

71

Tabela 5 - Frequência de alterações encontradas nos hemócitos de L. angulifera dos espécimes

do Rio Formoso (RF) e do Espaço Ciência (EC)

Local Amostra Total de hemócitos Frequência (%)

Micronúcleo Binucleação Apoptose

RF

1 1000 0,5 0,2 0

2 1000 0,3 0 0

3 1000 0,2 0 0

4 1000 0,3 0 0

5 1000 0 0 0

EC

1 1000 0,3 0,2 0,1

2 1000 0 0 1

3 1000 0,4 0,1 0,2

4 1000 0,7 0,6 0,1

Fonte: O autor

Os resultados apresentados na Tabela 5 revelaram frequência de micronúcleos maior em

alguns animais coletados no manguezal do Espaço Ciência, principalmente considerando os

resultados da lâmina 4, com relação àqueles coletado em Rio Formoso. Também a

binucleação foi maior para esse grupo, embora também tenha sido observada binucleação em

células dos indivíduos do Rio Formoso. A apoptose ocorreu apenas nas células dos indivíduos

do manguezal do Espaço Ciência.

Um resultado interessante desse trabalho foi a frequência elevada para micronúcleos nos

espécimes de L. angulifera coletados em ambos os manguezais, mesmo o manguezal do Rio

Formoso sendo considerado uma área de baixo impacto antropogênico. A frequência de

micronúcleos encontrada por outros autores em moluscos coletados em diversos ecossistemas

também foram mais elevadas com média de 4,5 micronúcleos em 1000 células

(VILLELA et al., 2006; GERIMA, 2015). Estudos futuros, ampliando as áreas de amostragem

e o número de espécies, podem elucidar o real impacto antropogênico à que os animais estão

sendo submetidos.

A estatística descritiva dos resultados de micronúcleo, binucleação e apoptose são

encontrados na Tabela 6, referente às proporções médias, desvios-padrão e número de células

analisadas. Foram também apresentados os intervalos de confiança (IC95%) de Wald e

72

Wilson em nível de 5% de significância, os coeficientes de variação em porcentagem (CV%)

e o tamanho mínimo de amostra para margens de erro de 40% e 20% (Tabela 4).

Fonte: O autor

Para o elevado valor de CV de 150% da variável binucleação dos animais de

Rio Formoso, observou-se claramente a necessidade de aumento no número de células

avaliadas para garantir margem de erro de 40% nos ensaios de micronúcleo. Nesse caso, o

número mínimo de células avaliadas deveria ser 54.000, o que parece bastante elevado para

trabalhos dessa categoria. Tipicamente, estudos envolvendo micronúcleos apontam para

coeficientes de variação de cerca de 40% (KISSLING et al., 2007), indicando que os ensaios

realizados neste trabalho foram adequados quanto à esse parâmetro. Para a margem de erro de

20%, o número de cerca de 36.000 células seria necessário, o que poderia inviabilizar a

análise devido ao tempo necessário e quantidade de hemolinfa para a obtenção das lâminas.

Os resultados de intervalo de confiança de Wald da Tabela 6 são representados na

Figura 36. Não houve indícios estatísticos de que as proporções de micronúcleo, binucleação

e apoptose diferissem entre si em nível de 95% de confiança para os animais analisados nos

manguezais do Espaço Ciência e do Rio Formoso. Todavia, o intervalo de confiança de

Tabela 6 – Resultados do intervalo de confiança em nível de 95% de confiança (IC95%),

coeficiente de variação (CV%) e tamanho mínimo de amostra (n*) para as variáveis micronúcleo –

MN, bionucleação – BN e apoptose – AP.

Variável Local

Estatística descritiva IC95% Wald IC95%Wilson

CV%

n*

n p s e- e+ w- w+ Erro

40%

Erro

20%

MN RF 5000 0,0026 0,0016 -0,0005 0,0057 0,0016 0,0044 62 9093 36370

EC 4000 0,0035 0,0019 -0,0002 0,0072 0,0021 0,0058 53 6854 27416

BN RF 5000 0,0004 0,0006 -0,0008 0,0016 0,0002 0,0013 150 54023 216090

EC 4000 0,0025 0,0015 -0,0004 0,0054 0,0014 0,0045 60 8644 34574

AP RF 5000 0,0000 0,0000 - - - - - - -

EC 4000 0,0035 0,0019 -0,0002 0,0072 0,0021 0,0058 53 6854 27416

n = tamanho da amostra

p = proporção média

s = desvio padrão da proporção p

73

Wilson permitiu comprovar que, ao menos, para células apoptóticas, houve indícios

estatísticos de diferenças entre os animais dos manguezais estudados em nível de 95% de

confiança (Figura 37). De fato, dentre todas as variáveis estudadas, apenas a frequência de

apoptose dos animais de Rio Formoso foi igual a zero. Como os limites inferiores dos

intervalos de Wald são negativos (Tabela 6; Figura 36), as médias das variáveis poderiam ser

nulas, tornando os resultados não significativamente diferentes em nível de 95% de confiança.

Figura 36 - Intervalos de confiança de Wald em nível de 95% de confiança

Fonte: O autor

74

Figura 37 - Intervalo de confiança de Wilson em nível de 95% de confiança

Fonte: O autor

A apoptose é um fenômeno natural de morte celular programada, porém o número

elevado de apoptose, presente na hemolinfa dos espécimes do Espaço Ciência, pode estar

relacionado com a remoção de células danificadas por parasitas como sugere Romero et al.

(2011). Segundo o autor, a apoptose de hemócitos em bivalves pode estar relacionada com o

mecanismo de defesas contra parasitas e patógenos virais e bacterianos. Por outro lado,

poluentes também possuem os mais variados efeitos sobre o sistema imunológico de

moluscos, induzindo imunossupressão e ativando diferentes mecanismos celulares como a

apoptose (GAGNAIRE et al., 2004; ROMERO et al., 2011). No caso do trabalho

desenvolvido por Gagnaire et al. (2004), cloreto de mercúrio na concentração de 0,5 mg l-1 em

exposição crônica (24 horas) foi capaz de aumentar em praticamente 40% a mortalidade dos

hemócitos de Crassostrea gigas.

Considerando que os resultados de frequência das células apoptóticas estejam alteradas

para a hemolinfa dos animais do manguezal do Espaço Ciência, houve necessidade de

avaliação das alterações histológicas nos tecidos dos animais.

75

4.3 Resultados da análise histológica

Quanto às alterações morfológicas observadas entre os animais dos diferentes locais

estuados, é possível identificar na Figura 38–A a estrutura da gônada feminina de um

indivíduo do Rio Formoso, comparada com a gônada de um indivíduo do Espaço Ciência

(Figura 38 – B). Ambas as estruturas apresentam ovócitos morfologicamente semelhantes e

inseridos em folículos com paredes bem definidas. Contudo, é possível observar uma menor

espessura na membrana do folículo, em que estão inseridos os óvulos maduros do espécime

do manguezal do Espaço Ciência. A disposição dos ovócitos no lúmen dos folículos acontece

de acordo com o grau de maturação, sendo que aqueles não fecundados são reabsorvidos pelo

organismo (SILVA et al., 2012).

Figura 38 – Fotomicrografia da gônada feminina de L. angulifera coletado em

manguezal do Rio Formoso (A) e Espaço Ciência (B). Coloração: Hematoxilina e Eosina.

Magnitude de 400x (Ovo = ovócito; Seta f.= membrana do folículo).

Fonte: O autor

Diferentemente do observado para gônada feminina, o compartimento gametogênico de

indivíduo do Espaço Ciência (Figura 39–B) apresentou morfologia distinta com epitélio

pouco denso e mal estruturado, quando comparado à mesma estrutura do Rio Formoso

(Figura 39–A), principalmente quanto ao número de células da linhagem gametogênica

masculina. Os efeitos de contaminantes ambientais sobre o potencial reprodutivo de

invertebrados já foi demonstrado por meio da diminuição na contagem de esperma do

anfípoda Echinogammarus marinus (YANG et al., 2008). Embora os autores não tenham

A B

76

elucidado as consequências desta diminuição de gametas para a fertilidade dos animais,

correlacionaram este fato ao impacto ambiental sofrido pelos animais na área de estudo.

Observaram, ainda, o aparecimento de intersexualidade nos machos da espécie, o que foi

comprovado por Costa et al (2013) em moluscos da família Littorinadae a partir da

contaminação ambiental com derivados do estanho utilizados na indústria de tintas anti-

incrustantes.

Figura 39 – Fotomicrografia do compartimento gametogênico de L. angulifera coletado

em manguezal do Rio Formoso (A) e Espaço Ciência (B). Coloração: Hematoxilina e

Eosina. Magnitude de 400x (sp = Esperma; CLMG = Células da linhagem gametogênica

masculina; Seta m.= Paraesperma).

Fonte: O autor

Os tecidos com maior diferenciação morfológica e estrutural foram aqueles do sistema

digestivo. Quando comparados os mesmos tecidos nos espécimes do Espaço Ciência

(Figuras 40–A e 40-B) e do Rio Formoso (Figuras 40–C e 40-D), foram observadas alterações

nos tecidos da glândula digestiva e células digestivas degeneradas nos animais do Espaço

Ciência. Malformações semelhantes foram observadas por Hemed et al. (2007) ao expor a

espécie Eobania vermiculata a moluscicida a base de carbamato. Nesses mesmos animais, foi

observado número excessivo de parasitas alojados no intestino. Segundo Zeidan et al. (2012),

esses parasitas são comuns a organismos de manguezais, contudo, somente em baixas

quantidades, diferentemente do encontrado nesse trabalho.

A B

77

Figura 40 – Fotomicrografia do sistema digestivo de L. angulifera coletado em

manguezal do Rio Formoso (Imagens A e B) e Espaço Ciência (Imagens C e D). A =

Glândula digestiva não parasitada. B = Intestino não parasitado. C = Glândula digestiva de

macho com excesso de parasitas. D = Intestino de fêmea com colônia de parasita. Coloração:

Hematoxilina e Eosina. Magnitude de 400x (TDG = Túbulo da glândula digestiva; Cdg =

Célula digestiva; L = Lúmen; P = Conjunto de parasitas; cei = Célula do epitélio intestinal).

Fonte: O autor

Por apresentarem excesso de parasitas, é esperado aumento dos basófilos para a defesa do

organismo. Rudell e Rains (1975) obtiveram relação diretamente proporcional entre número

A B

C D

78

de basófilos e o aumento nos níveis de cobre e zinco nos tecidos de ostras Crassostrea gigas e

Crassostrea virginica (RUDELL; RAINS, 1975). Esses autores sugeriram correlação

significativa entre a resposta fisiológica dos moluscos relativa ao número de basófilos e os

níveis de cobre e zinco no ambiente, indicando que alterações histológicas podem ser

provenientes de processos de combate aos parasitas. De acordo com esses autores, os

basófilos estão relacionados com o processo de defesa dos moluscos às agressões físicas e

químicas.

4.4 Comparação entre as concentrações dos elementos químicos

quantificados em L. angulifera de manguezais de Pernambuco

Dados de concentração dos elementos químicos Cu, K, P e Zn quantificados em

L. angulifera obtidos do Espaço Ciência e Rio Formoso foram comparados com os resultados

encontrados nos manguezais do Espaço Ciência, do Parque Memorial Arcoverde e do Rio

Formoso para a mesma espécie de gastrópode. O estudo realizado por Mélo (2014) foi

baseado na composição dos animais sem a dessecação dos órgãos. Assim, para a composição

do valor para o organismo inteiro, como utilizado por Mélo (2014), foi atribuído o percentual

de cada órgão em peso seco para obter-se o valor da concentração dos elementos químicos,

cujas concentrações máximas podem ser vistas na Tabela 7.

Tabela 7 - Concentrações máximas de elementos químicos (mg kg-1) em

manguezais de Pernambuco.

Local Cu K P Zn Referência

Espaço Ciência 537 8100 11500 10500 Este estudo

Rio Formoso 80 8500 7139 867

Memorial Arcoverde 259 10500 15300 10300 Mélo (2014)

Rio Formoso 60 10000 7400 534

Fonte: O autor

O manguezal descrito como Memorial Arcoverde está no mesmo complexo de ilhas de

manguezal que o do Espaço Ciência, ambos localizados no Complexo de Salgadinho, o que

permitir inferir que a semelhança nas concentrações de Zn para os animais desses manguezais

pode estar relacionada com a disponibilidade de elementos químicos ou com a predisposição

de indivíduos de L. angulifera em acumular esses elementos químicos. A pressão ambiental

79

sofrida pelo molusco torna-se evidente com base nos resultados de Zn, uma vez que se trata

de manguezais urbanos com grande influência de atividades antropogênicas. Zn, em

concentrações fisiológicas (abaixo de 1.000 mg kg-1), demonstra propriedades protetoras e

antioxidativas em moluscos, entretanto, essas funções não são desempenhadas em moderadas

e altas concentrações (TREVISAN et al., 2014). Desse modo, as altas concentrações de Zn

podem estar relacionadas com a maior frequência de morte celular encontradas para os

animais do manguezal do Espaço Ciência.

Para as concentrações de P, os resultados entre Espaço Ciência e Memorial Arcoverde

também foram semelhantes, contudo foram apenas duas vezes superiores aos valores

encontrados em Rio Formoso, em ambos os estudos. Por ser um nutriente e também alterador

da dinâmica populacional de microalgas, estando relacionado com a eutrofização

(CARPENTER, 2008), indicou-se um limiar bastante estreito entre ambientes poluídos e não

poluídos. Esse tipo de comportamento pode ser bastante interessante para o uso da espécie

como biomonitora de elementos químicos.

De acordo com os resultados de K, não foram observadas grandes diferenças entre os

manguezais, indicando que, de certo modo, os indivíduos do Espaço Ciência e do Parque

Memorial Arcoverde estão mantendo as concentrações de alguns nutrientes nos tecidos,

refletindo pouco impacto antropogênico para os animais.

Para Cu, os animais do Espaço Ciência apresentaram o dobro da concentração observada

nos animais do Memorial Arcoverde. O alto valor de Cu quantificado nesse manguezal pode

ser explicado devido às diferentes épocas de coleta dos estudos ou, ainda, ser consequência da

influência direta do canal da Rodovia Agamenon Magalhães. Por ser o principal componente

da hemocianina, esse elemento químico é bastante importante para os animais, porém, sua

toxicidade também é considerada elevada, causando diversos danos celulares

(XIAO et al., 2016).

Indivíduos de L. angulifera coletados em mesmo manguezal de Rio Formoso foram

utilizados como valor de base em ambos os trabalhos. De acordo com Mélo (2014), para P é

possível observar as mesmas concentrações entre os estudos, enquanto para Cu e Zn, as

concentrações maiores foram obtidas no presente estudo. O nutriente K foi quantificado em

maior valor para as amostras de Rio Formoso no trabalho de Mélo (2014). Mesmo

considerando a variação temporal das concentrações entre os estudos, é possível observar a

clara tendência da espécie L. angulifera em acumular Cu e Zn.

80

4.5 Efeitos biológicos da acumulação de Cu, Fe e Zn sobre L. angulifera

Por meio das técnicas analíticas EDXRF e FAAS foram quantificadas concentrações

elevadas dos elementos químicos Cu, Fe e Zn na espécie L. angulifera. A Figura 41 ilustra a

acumulação de Cu, Fe e Zn nos compartimentos biológicos de L. angulifera a partir da análise

de órgãos importantes para alimentação e reprodução. O esquema indica o caminho

preferencial da acumulação desses elementos químicos, quando comparados com os

resultados obtidos para os animais do manguezal do Rio Formoso. As setas seguidas pelos

números representam o número de vezes que as concentrações foram superiores àquelas dos

espécimes do Rio Formoso, considerado valor de base para o estudo. Como a glândula

digestiva apresentou as maiores concentrações de Fe e Zn, a ingestão de alimentos foi

avaliada como sendo a principal entrada de elementos químicos nos animais. Contudo, o

contato do alimento com elementos químicos não podem ser menosprezados nesse tipo de

avaliação (BORDEAN et al., 2014).

Figura 41 – Comparação entre a acumulação de Cu, Fe e Zn nos compartimentos

biológicos de Littoraria angulifera do Espaço Ciência.

Fonte: O autor

81

Observou-se, na glândula digestiva (GD), a acumulação de Cu em quantidades seis vezes

maiores do que o valor de referência. Para o Fe, a concentração foi 3 vezes maior e quanto ao

Zn o valor foi 20 vezes maior, indicando que a glândula digestiva é a estrutura do

L. angulifera com maior acumulação de Zn. Altas concentrações desse elemento químico

também foram observado por Bordon et al. (2016) em estudo realizado com espécie de siri

Callinectes danae em estuário antropizado. Para o gônada (G), a concentração de Cu foi 12

vezes maior que o valor de referência, enquanto para Fe, o valor quantificado foi o dobro do

valor de referência. Zn apresentou 7 vezes mais no Espaço Ciência que no Rio Formoso.

Desse modo, conclui-se que a gônada tende a acumular Cu. Os demais órgãos e tecidos

(DOT), apresentaram, para Cu, a acumulação 2 vezes maior do que o valor de base, 4 vezes

maior para Fe, enquanto, para Zn, a concentração foi 6 vezes maior que os valores de

referência. (Figura 41).

Com isso, assume-se que a principal fonte de absorção dos elementos químicos foi a

alimentação, característica observada pela alta concentração de Cu, Fe e Zn na glândula

digestiva, fato corroborado pelos trabalhos de Green e Walmsley (2013) e Conti (2016). Esses

autores observaram mesma via de acumulação para espécimes de invertebrados. Contudo, a

acumulação de Cu na gônada extrapolou os níveis do elemento químico para o organismo,

indicando possível atividade de desintoxicação, seguida de possíveis prejuízos para a

atividade reprodutiva dos animais.

Baseado em estudos anteriores sobre altas concentrações de elementos químicos na parte

mole da espécie estudada, o ensaio do micronúcleo foi realizado com a hemolinfa de alguns

animais de EC e RF. Das alterações celulares observadas, a apoptose foi a única com

resultados significativos, observando maior frequência nos hemócitos dos animais do Espaço

Ciência, indicando mecanismos de defesa do animal a agentes estressores. Inclusive,

observou-se, durante o ensaio de micronúcleo, uma grande quantidade de grânulos nos

hemócitos dos espécimes do manguezal do Espaço Ciência, que, segundo Rohr e Amato

(2014), é uma característica comumente encontrada para animais sujeitos a estresse ambiental.

Os resultados, até o momento, demonstraram grande capacidade de acumulação de Zn

por L. angulifera na região antropizada, sendo a alimentação a principal responsável.

Contudo, em estudos de monitoração da qualidade ambiental realizados no manguezal do

Espaço Ciência, foram encontradas concentrações máximas de 117 mg kg-1 para Zn nos solos

(SOUZA et al., 2015). Já no manguezal do Parque Memorial Arcoverde, local próximo ao

Espaço Ciência, foram observadas concentrações para esse elemento químico de, no máximo,

82

318 mg kg-1 nos sedimentos em suspensão (LYRA, 2016), enquanto a biomonitoração ativa

utilizando o líquen Cladonia verticillaris na região indicou quantidades não expressivas

(máximo de 63 mg kg-1) de Zn na atmosfera (SANTOS, 2016). Como L. angulifera alimenta-

se principalmente de fungos e liquens dos troncos das espécies arbóreas de mangue, é difícil

comprovar que a principal razão da acumulação de Zn seria a disponibilidade do elemento

químico. Com as alterações histológicas comprovadas e o aumento da frequência de células

apoptóticas na hemolinfa, assume-se que a acumulação de Zn e, também, outros elementos

químicos possam estar associados a processos bioquímicos relevantes para os mecanismos de

defesa do organismo, sendo possivelmente transferido para as gerações futuras.

83

5. CONCLUSÕES

Ao envolver diferentes disciplinas como Biofísica, Genética, Química e Zoologia, este

trabalho foi considerado inovador por dimensionar a problemática de conservação da

biodiversidade de manguezais urbanos devido à pressão ambiental contínua sobre,

principalmente, as espécies de gastrópodes terrestres. Desse modo, conclui-se que a presente

pesquisa:

Otimizou a técnica de coleta de hemolinfa para realização do teste do micronúcleo em

L. angulifera;

Confirmou a aplicabilidade do teste do micronúcleo para avaliação de impactos

ambientais, utilizando biomarcadores;

Realizou a primeira descrição e diferenciação morfológica das células de hemolinfa do

gastrópode L. angulifera;

O manguezal do Espaço Ciência está submetido aos efeitos do impacto antropogênico,

em função do resultado observado no teste citotóxico aplicado;

Os impactos de origem antropogênica ainda não ocasionaram mutações em níveis

significativos nas células do gastrópode L. angulifera;

Demonstrou a aplicabilidade da técnica de EDXRF para avaliação da acumulação de

elementos químicos mesmo em amostras com pouca massa;

Apresentou a primeira descrição na literatura da constituição química de órgãos de

L. angulifera, evidenciando sua importância para a monitoração ambiental;

Comprovou o potencial, já apontado previamente na literatura, de acumulação da

espécie L. angulifera para Cu e Zn;

Sugeriu um possível efeito do impacto ambiental sobre a morfologia dos tecidos dos

moluscos;

Indicou um aumento no parasitismo dos tecidos dos animais de áreas impactadas pela

poluição;

Confirmou a espécie de caramujo L. angulifera como um potencial biomonitor de

impactos ambientais.

84

6. PERSPECTIVAS

Embora este trabalho tenha incrementado o conhecimento sobre o molusco Littoraria

angulifera de manguezais conservados e com grande impacto antropogênico e apontado seu

emprego como biomonitor em manguezais, estimula-se o desenvolvimento de trabalhos mais

direcionados à compreensão da relação entre a acumulação dos elementos químicos e seus

efeitos biológicos sobre os animais. Dentre eles, ressaltam-se a importância da avaliação da

acumulação dos elementos químicos presentes na hemolinfa do molusco e os efeitos desses

elementos químicos sobre os hemócitos, a análise dos efeitos genotóxicos da acumulação

destes elementos químicos e a avaliação das vias preferenciais de acumulação dos elementos

químicos por este caramujo.

85

7. REFERÊNCIAS

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