CENTRO DE INVESTIGACIÓN Y DE ESTUDIOS

AVANZADOS DEL INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL

UNIDAD ZACATENCO

DEPARTAMENTO DE INFECTÓMICA Y PATOGÉNESIS

MOLECULAR

“Evaluación de la actividad antiviral de los fármacos NDGA,

vitamina D, lovastatina e ivermectina ante infección con Dengue en

células HuH7”

T E S I S

Que presenta

BIÓLOGA ARELY CRUZ PÉREZ

Para obtener el grado de

MAESTRA EN CIENCIAS EN INFECTÓMICA Y PATOGÉNESIS

MOLECULAR

Directora de la Tesis:

Dra. Rosa María del Ángel Nuñez

Ciudad de México Agosto, 2017

Agradecimientos

Agradezco al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología por la beca No.

583442 brindada para la realización de este proyecto, el cual fue

realizado en el laboratorio de Virología del Departamento de

Infectómica y Patogénesis Molecular del Centro de Investigaciones y

Estudios Avanzados del Instituto Politécnico Nacional, bajo la tutoría de

la Dra. Rosa María del Ángel Núñez de Cáceres y la asesoría de la Dra.

Ana Lorena Gutiérrez Escolano y del Dr. Juan Santiago Salas Benito.

ÍNDICE

Resumen…………………..…………………………………………………..1

Abstract…………………...……………………………………………………2

Introducción

Generalidades…………………………….…………………………..3

Antecedentes

Patogenia…………..………………………………………………….3

DENV…………………………….…………………………………….4

Ciclo replicativo viral…………………….…………………………....6

Importancia de los lípidos en la infección de dengue…...…….....8

NDGA…………………………………...…………………………….10

Lovastatina……….…………………………………………………..12

Vitamina D3……..……………………………………………………13

Ivermectina…………....……………………………………………..15

Justificación…………...……………...……………………………………...18

Hipótesis……………………………………………….……………………..19

Objetivo general……………..………………………………………………19

Objetivos particulares……………………………………...…………….....19

Material y Métodos

Células HuH7…………………………………………………….…..20

Stock viral DENV2 y DENV4……………………………………….20

Infección y tratamiento……………………………………………...20

Evaluación de la infección………………………………………….21

Citometría de flujo…………………………………………………...21

Western blot……………………………………………………….....22

Ensayo de focos……………………………………………………..22

Ensayos de viabilidad…………………………………………….…23

Análisis estadísticos………………………………..........……...….23

Resultados

Efecto de los fármacos en el porcentaje de células

infectadas…………………………………………………………….23

Efecto de los fármacos en la cantidad de proteína

viral……………………………………………………………………26

Efecto de los fármacos en la producción de progenie

viral.………….………………………………..………………………29

Viabilidad Ivermectina-Lovastatina.……………………………….31

Tratamiento de ivermectina-lovastatina en

células infectadas con DENV………………………………………31

Discusión……………………………………………………………………..37

Conclusiones………………..……………………………………………….37

Perspectivas…………………………………………………………………43

Referencias…………………………………………..………………………44

1

RESUMEN

El virus del dengue (DENV), perteneciente a la familia Flaviviridae, es el

agente etiológico de la fiebre del dengue y de su principal complicación

el dengue hemorrágico. A pesar de que los brotes de dengue se han

reportado desde hace más de 60 años, aún no se cuenta con un

tratamiento antiviral específico, ni con una vacuna capaz de conferir una

alta protección contra la infección. Sin embargo, en años recientes se

han descrito algunos fármacos, aprobados por la FDA, con actividad

antiviral contra DENV. Tal es el caso del NDGA que inhibe la síntesis de

lípidos y a su vez la replicación viral; la lovastatina que es inhibidor de la

síntesis del colesterol reduciendo la replicación de virus; la vitamina D3,

que regula la repuesta inmune; y la ivermectina que impide el importe

nuclear de la proteína NS5. Dado que todos estos fármacos han sido

evaluados de manera independiente uno del otro, fue de nuestro interés

identificar cuál de estos fármacos ejerce una mayor actividad antiviral y

cuál es el efecto de la combinación ivermectina-lovastatina ante la

infección con DENV2 y DENV4 en células hepáticas HuH7. En este

estudio se observó que vitamina D3 no induce una reducción

significativa de la infección por DENV, mientras que ivermectina es el

fármaco con un mejor efecto antiviral. Finalmente la combinación

ivermectina-lovastatina puede ser una buena opción para tratar

infección por DENV.

Con formato: Español (México)

2

ABSTRACT

Dengue virus belongs to the Flaviviridae family and is the etiologic agent

of dengue fever and its main complication, dengue hemorrhagic fever.

Although dengue disease cases have been reported for over 60 years,

there is no specific antiviral treatment or high protective vaccine to avoid

infection. Nevertheless in recent years it has been described some

drugs approved by FDA, with antiviral activity against DENV. Some of

them are NDGA, which inhibit lipid synthesis and reduces viral

replication; lovastatin, an inhibitor of the cholesterol synthesis, inhibiting

viral replication; vitamin D3, which regulates the immune response; and

ivermectin which blocks the nuclear import of the viral protein NS5.

Since all these drugs have been evaluated independently, it was our

interest to identify which of these drugs has a better antiviral activity and

what is the effect of the combination of ivermectin- lovastatin in the

infection with DENV2 and DENV4 in hepatic cells HuH7. In this study we

observed that vitamin D does not induce any significant viral reduction,

while ivermectin is the drug with the highest antiviral activity. Finally, the

combination ivermectin-lovastatin can be an effective strategy against

DENV because it induced the highest anti-DENV activity.

3

INTRODUCCIÓN

Generalidades

El virus del dengue (DENV) es un virus perteneciente a la familia

Flaviviridae del género Flavivirus, causante de la fiebre del dengue y de

su principal complicación el dengue hemorrágico. Cada año se registran

390 millones de infecciones por este virus, de las cuales únicamente 96

millones son sintomáticas (Gubler et al., 2014). DENV es un virus

envuelto cuyo genoma es una molécula de RNA de cadena positiva y

es transmitido por mosquitos de las especies Aedes aegypti y A.

albopictus (Clyde et al., 2006)

A pesar de que el virus infecta al hombre desde hace más de 60 años,

aún no se cuenta con un tratamiento antiviral específico, así como

tampoco se cuenta con una vacuna capaz de conferir una alta

protección contra la infección. Resultados de nuestro grupo han

permitido identificar algunos fármacos como el ácido

nordihidroguaiarético (NDGA), lovastatina, vitamina D3 y recientemente

a la ivermectina con actividad antiviral contra DENV. Su uso solo o en

combinación constituye una opción prometedora para el tratamiento

viral.

Antecedentes

Patogenia

DENV es el agente causal del dengue clásico, dengue hemorrágico y

síndrome de shock por dengue. El dengue clásico se caracteriza por

síntomas como fiebre que dura de 2 a 5 días, dolor de cabeza, mialgia y

salpullido, mientras que las formas graves como dengue hemorrágico

provocan incremento de la permeabilidad vascular, trombocitopenia y

manifestaciones hemorrágicas. Por último, en el caso del síndrome de

4

choque por dengue el principal síntoma es la fuga de fluido de los

espacios intersticiales que pueden causar la muerte (Clyde et al., 2006).

Es importante mencionar que la infección con un serotipo de DENV no

provee inmunidad ante los otros serotipos, y de hecho, infecciones

subsecuentes con diferentes serotipos, pueden causar las formas

graves de la enfermedad por un proceso conocido como amplificación

de la infección dependiente de anticuerpos (ADE: del inglés antibody-

dependent enhancement) (Damonte et al., 2004; Acosta EG &

Bartenschlager R, 2016).

A pesar de que aún no se conoce exactamente la causa del por qué se

desarrollan las formas graves de la enfermedad, la teoría más aceptada

es la del ADE, donde se propone que en una segunda infección con

otro serotipo de DENV, ocurre una reacción cruzada de anticuerpos no

neutralizantes contra el nuevo serotipo de DENV, causando que el

complejo partícula viral-anticuerpo no neutralizante se una a los

macrófagos mediante la fracción Fc. Dado que los macrófagos son uno

de los principales blancos del virus, la infección se potencializa, así

como la respuesta inmune y la producción de citocinas proinflamatorias

tales como TNFα, IL6, IL8, IL10 e IL12 (Ahmed S et al., 2009; Guzman

MG & Harris E, 2015). Esta elevación de la respuesta inmune y

sobreproducción de citocinas es la causante del daño en el endotelio

vascular (Damonte EB et al., 2004; Guzman MG & Harris E, 2015).

DENV

DENV es un virus de la familia Flaviviridae del género Flavivirus. El

nombre de la familia Flaviviridae proviene del latín Flavis que significa

amarillo, por el virus de la fiebre amarilla, primer virus identificado

perteneciente a la familia. DENV es un arbovirus y es transmitido al

hombre por la picadura de mosquitos del género Aedes, los cuales se

5

encuentran ampliamente distribuidos en el mundo (Clyde et al., 2006).

Se han identificado cuatro diferentes serotipos (DENV1 a DENV4), y a

pesar de que los cuatro serotipos de DENV poseen una homología en

secuencia de aminoácidos de apenas 60-70% (Guzman & Harris, 205;

Acosta & Bartenchiager, 2016), en cuestiones de epidemiología, éstos

se comportan de manera similar. Los serotipos DENV2 y DENV3 en

general se han asociado con casos severos de la enfermedad

(Balsameda et al.,2006)

La partícula viral madura de DENV es esférica de 500 Å de diámetro y

está compuesta por una sola cadena de RNA de polaridad positiva. La

partícula se encuentra empaquetada por la proteína estructural C que

forma la nucleocápside y ésta a su vez está envuelta por una bicapa

lipídica en la que se encuentran 180 copias de dos glicoproteínas: E y

prM. El genoma de aproximadamente 10.8 kb tiene un único marco de

lectura abierto (ORF) que codifica para una poliproteína, de la cual, a

partir del extremo amino, se traducen las tres proteínas estructurales

que constituyen la partícula viral: cápside (C), membrana (M, expresada

como prM que es el precursor de M) y envoltura (E); y a continuación

las siete proteínas no estructurales que son esenciales para la

replicación viral: NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B y NS5

(Mukhopadhyay et al., 2005) (Figura 1).

6

Figura 1. Estructura del genoma de DENV. Tomada de Clyde et al., 2006.

DENV es capaz de infectar in vitro distintos tipos celulares como células

dendríticas, monocitos, macrófagos, células B, células T, células

endoteliales, hepatocitos y células neuronales; sin embargo, in vivo se

ha visto que las células fagocíticas mononucleares (monocitos,

macrófagos y células dendríticas) son las principales células infectadas

por DENV (Clyde et al., 2006)

Ciclo replicativo viral

DENV es capaz de entrar a las células de mamífero y mosquito por

endocitosis mediada por clatrina después de interaccionar con su

receptor celular. Hasta ahora, se han descrito numerosos receptores

que se unen a DENV en células de mamífero, entre estos se

encuentran el heparán sulfato, Hsp70 y Hsp90, GRP78, el receptor de

laminina, CLEC5B, el receptor de manosa, entre otros, sin embargo, la

interacción mejor estudiada es con el receptor DC-SIGN. DC-SIGN es

una lectina que interacciona con los residuos de manosa de la proteína

E de los cuatro serotipos de DENV. Una vez que el virus interacciona

con el receptor, éste es movilizado a sitios recubiertos por clatrina en

donde el virus es internalizado por medio de vesículas. Eventualmente

7

estas vesículas forman endosomas tempranos y tardíos, y es en los

endosomas tardíos donde la acidificación causa cambios

conformacionales de la proteína E que inducen la fusión de la

membrana viral con la membrana endosomal. Posteriormente, el RNA

de cadena positiva se disocia de la cápside y es liberado al citosol

funcionando como un RNA mensajero que es traducido en ribosomas

presentes en el retículo endoplásmico rugoso. La poliproteína

sintetizada se escinde de manera co y postraduccional en al menos 10

proteínas maduras. El extremo amino codifica a las proteínas

estructurales y el resto a las proteínas no estructurales. Una vez que las

proteínas virales son traducidas y procesadas, el virus induce hipertrofia

en las membranas intracelulares generando los llamados paquetes

vesiculares y complejos de membrana en donde se lleva a cabo la

síntesis del RNA viral que comienza con la síntesis del RNA de cadena

negativa complementaria a la del RNA viral que va a servir como molde

para la amplificación de cadenas positivas de RNA viral, reacción

catalizada por NS5 en asociación con NS3 (Gubler et al., 2014).

El nuevo material genético sintetizado puede seguir tres vías: traducirse

para la producción de proteína, servir de molde para la síntesis de RNA

de polaridad negativa o bien, asociarse a la cápside viral para la

formación de nuevas partículas virales. En la células de mamífero,

éstas partículas virales se distribuyen en el retículo endoplásmico,

núcleo y superficie de gotas lipídicas. Una vez formadas las

nucleocápsides en el lúmen del retículo endoplásmico, éstas adquieren

la bicapa lipídica y las proteínas E y prM de las membranas del retículo

endoplásmico, y son liberadas por la vía secretora. Para la maduración

de las partículas virales es importante la proteólisis de prM mediada por

furina en el trans-Golgi para el rearreglo y la homodimerización de

E(Gubler et al.,2014) (Figura 2).

8

Figura 2. Replicación de DENV. El virus se une a la membrana celular y

entra por endocitosis mediada por receptor. El virus es capaz de fusionar su

membrana con la del endosoma para liberar su genoma en el citoplasma y

poder llevar a cabo su replicación, traducción y ensamblaje en el RE.

Finalmente la maduración del virus se realiza en el trans-Golgi y las nuevas

partículas son liberadas por exocitosis (Tomada de Mukhopadhyay et al.,

2005).

Importancia de los lípidos en la infección de dengue

Los lípidos son moléculas importantes en diversos pasos del ciclo

replicativo de los virus de la familia Flaviviridae, debido a que participan

en la formación de la envoltura del virus y a que son componentes de la

plataforma celular a través de la cual el virus entra y lleva a cabo la

9

replicación, traducción y ensamble viral. En diversos tipos celulares se

ha demostrado que los receptores virales se encuentran en balsas

lipídicas (ricas en colesterol) o son translocadas a ellas para la

internalización viral (Martinez-Gutierrez et al., 2011). La presencia de

colesterol en las balsas lípidicas es indispensable para la entrada viral,

ya que se ha observado que la eliminación del colesterol con

compuestos como metilciclodextrina, inhibe la infección por DENV

(Reyes-del Valle et al, 2005; Puerta-Guardoet al., 2012). Posterior a la

unión y entrada, un paso importante en la internalización viral es la

fusión entre la membrana viral y endosomal, proceso que requiere que

la membrana celular contenga lípidos aniónicos como bis

(monoacilglicerol) fosfato y fosfatidil serina, resaltando nuevamente la

participación de los lípidos (Soto-Acosta et al., 2017). Una vez en el

citoplasma, el virus necesita una buena cantidad de lípidos y colesterol

para formar las invaginaciones del retículo endoplásmico (RE) y realizar

la remodelación del retículo endoplásmico rugoso (RER), eventos

necesarios para la replicación y síntesis de la proteína viral(Peña J

Harris, 2012). De hecho, es la proteína NS3 quien secuestra a la

sintasa de ácidos grasos (FAS) y la lleva al RE manteniéndola activa y

por lo tanto causando un aumento de ácidos grasos tras la infección por

DENV (Acosta EG & Bartenschlager R, 2016). En estas invaginaciones

formadas a partir del RE, se encuentran las proteínas necesarias para

la replicación como la NS5 que es la RNA polimerasa dependiente de

RNA, las proteínas NS2B, NS3, NS4A, NS4B y el RNA de doble cadena

(Villareal et al., 2015). Es importante resaltar que dichas vesículas están

compuestas principalmente de esfingolípidos y esteroles por lo que la

participación de ácidos grasos y colesterol es importante. Finalmente

para la morfogénesis se ha descrito que la proteína C se acumula

alrededor de las gotas de lípidos (LD), ricas en lípidos y esteres de

10

colesterol para la formación de la partícula viral (Samsa et al., 2009).

Así que la inhibición de la síntesis del colesterol mediante estatinas, o a

través del bloqueo de la vía de biosíntesis del colesterol usando siRNA

reduce entrada y replicación viral (Martinez-Gutierrez et al., 2011;

Rothwell et al., 2009). Acorde a la necesidad de colesterol, se ha

descrito que hay un aumento en la cantidad de colesterol en las células

infectadas con DENV. Este aumento se debe a un incremento en la

captación de partículas de lipoproteínas de baja densidad a través del

aumento del receptor de lipoproteínas de baja densidad (LDLr) y a un

aumento en la síntesis de colesterol debido a la activación de la

reductasa 3-hidroxi-3-metil-glutaril-CoA (HMGRC) (enzima limitante en

la síntesis de colesterol) por su defosforilación (Soto-Acosta et al.,

2014). Dada la importancia de los lípidos en la replicación viral, estos

constituyen un blanco interesante para el desarrollo de antivirales.

NDGA (Ácido nordihidroguaiarético)

El NDGA (Figura 3) es el lignano principal de la planta gobernadora

(Larrea tridentata) a la cual se le han atribuido una amplia variedad de

actividades farmacológicas, su principal y mayormente descrita función

es la de ser inhibidorade la 5-lipoxigenasa de ácido araquidónico, sin

embargo la propiedad antioxidante, hipolipemiante, anti-inflamatoria,

potenciadora del sistema inmune (Lü et al., 2010) e inhibitoria de

algunos virus como VIH, HPV, virus del Herpes simple (Hwu et al.,

2008), así como de DENV (Soto et al., 2014) también ha sido descrita

(Arteaga et al., 2005).

11

Figura3 Estructura ácido nordihidroguaiarético (NDGA). Tomada de

Arteaga et al., 2005.

La planta Larrea tridentata es usada de manera tradicional en

infusiones o en tabletas para una variedad de padecimientos, aunque la

mayoría de estos usos no son respaldados clínica o experimentalmente.

Lo que si se ha descrito es su toxicidad, en donde se indica que el alto

consumo de la planta, por sus altos contenidos de NDGA, puede causar

daño a riñón e hígado. Debido a que el NDGA es metabolizado por la

COMT (Catecol-O-metiltransferasa) y posteriormente oxidado, produce

como metabolitos secundarios o-quinonas y/o p-quinonas, que pueden

ser los responsables de la toxicidad del fármaco (Billinsky et al., 2007;

Grice et al., 1968; Jeong et al., 2017; Lambert et al., 2002). La

farmacocinética y farmacodinámica del NDGA no han sido muy

explorados, sin embargo Lambert y colaboradores (2001) describen que

en ratones inyectados de manera intravenosa con 50 mg/kg del

fármaco, éste alcanza un pico en la concentración plasmática de

14.7mg/ml, con una vida media de 135 min y una eliminación del

torrente sanguíneo de 201.9 ml/mi/kg.

El NDGA causa un efecto hipolipemiante primero, debido a la

importancia que el ácido araquidónico tiene en la regulación de la

homeostasis del colesterol (Demetz et al., 2014) y segundo por su

capacidad de aumentar la actividad de la AMPK y por lo tanto disminuir

la activación de SREBPs (proteína de unión a elementos de respuesta a

esterol). Las proteínas SREBPs son factores transcripcionales que

12

actúan sobre genes que están relacionados con la síntesis de ácidos

grasos y colesterol. Además NDGA actúa sobre la acetil-CoA

carboxilasa y la ácido graso sintasa, causando la expresión de genes

implicados en el catabolismo de ácidos grasos libres y el efecto

hipolipidémico in vivo e in vitro (Lee et al., 2010; Syed & Siddiqui.,

2011). Este efecto hipolipidémico es capaz de inhibir la infección por

DENV en células HuH7 a través de la reducción de la replicación del

genoma viral y la inhibición del ensamblaje del virión (Soto-Acosta et al.

2014).

Lovastatina

Otros compuestos inhibidores de la síntesis de colesterol son las

estatinas. La lovastatina es una estatina lipofílica perteneciente al grupo

de las estatinas naturales extraídas del hongo Aspergillus terreus, y es

un inhibidor competitivo reversible que actúa de forma dosis-

dependiente de la HMGR (3-hidroxi-3-metilglutaril-coenzima A

reductasa) la cual es la enzima limitante en la síntesis de colesterol

(Gazerro et al., 2012).

Sobre la farmacología del fármaco, la dosis empleada en pacientes es

de 40mg, su absorción es de 31%, tiene una biodisponibilidad menor a

5%, el tiempo en que alcanza su pico máximo de concentración

plasmática es de 2 a 4 horas, la unión a proteínas plasmáticas es de

96%, es metabolizado de manera hepática mediante CYP3A4, la Ic50 es

de 2.7-11.1 nM y la vida media es de 2.5- 3 h (Gazerro et al., 2012).

Las estatinas, además de reducir los niveles de colesterol, son capaces

de inhibir a las lipoproteínas de baja densidad (LDL) y triglicéridos

(Malhotra & Goa, 2001) y tienen un efecto en la función endotelial que

resulta en una reducción en la expresión de citocinas proinflamatorias

(Greenwood J & Mason JC, 2007). Esto último controla la migración

13

leucocitaria en áreas de inflamación endotelial. Igualmente, las

estatinas pueden mejorar la función endotelial modulando la producción

de especies reactivas del oxígeno (Greenwood J & Mason JC, 2007).

Así, el tratamiento con estatinas como lovastatina no solo sería capaz

de inhibir el ciclo replicativo viral debido a la reducción de los niveles de

colesterol (Whitehorn et al., 2016) sino que también podría modular la

respuesta inflamatoria endotelial tan importante durante las formas

graves de la infección por DENV.

Vitamina D3

Como se mencionó anteriormente, los casos de Dengue grave están

asociados a una segunda infección por DENV y a un incremento

exacerbado de la producción de citocinas proinflamatorias por células T,

macrófagos y células endoteliales causando disfunción endotelial, que

genera extravasación sanguínea (Arboleda & Urcuqui., 2016). Es por

eso, que en el combate de la infección por Dengue, una alternativa es

encontrar fármacos que controlen la respuesta inmune, y tal es el caso

de la vitamina D3 que además de ser importante en el metabolismo del

calcio y de fosfato, tiene una función inmunoreguladora (Di Rosa et al.,

2011).

La 1,25-dihidroxivitamina D3 [1,25(OH)2D3], es la forma

hormonalmente activa de la vitamina D que genera respuestas celulares

como diferenciación y proliferación celular, además de potenciamiento

de la respuesta inmune ante cáncer y enfermedades autoinmunes (Di

Rosa et al., 2011), Esta vitamina se forma de manera natural por

irradiación solar en la piel a partir de 7-dehidrocolesterol, forma de

síntesis más abundante en el cuerpo, aunque también se puede adquirir

mediante la dieta, donde en adultos sanos la concentración plasmática

puede alcanzar los 20ng/mL con 600-800 IU por día (Christakos et al.,

14

2016; Jetter et al., 2014). La vitamina D3 es producida principalmente

en el riñón por la acción de la enzima CYP27B1, pero también se puede

producir en células del sistema inmune, ya que el reconocimiento de

PAMPs por los TLRs presentes en la células del sistema inmune

estimula la activación de CYP27B1 y por tanto, la producción de 1, 25-

dihidroxivitamina D3 (Borella et al., 2014).

Dentro de las funciones inmunomoduladoras descritas para la vitamina

D3 están la supresión de la proliferación celular de tipo Th-1 que

conduce a la producción reducida de interferón gamma e interleucina 2;

conduciendo a una menor presentación de antígeno por parte de las

células dendríticas, menor reclutamiento de linfocitos T y proliferación.

De manera general, la vitamina D3 polariza el sistema inmune hacia

una respuesta Th2, por lo que las citocinas asociadas aumentan (Beard

et al., 2011; Chun et al., 2014). De igual manera existen muchos

estudios que reportan la importancia de la vitamina D3 en la inducción

de autofagia, como un mecanismo de protección ante patógenos (Chun

et al., 2014)

Estudios con vitamina D3 (metabolito activo de la vitamina D)

demuestran también que esta hormona es capaz de inhibir la respuesta

inmune adaptativa y la proliferación celular, y por otro lado, es capaz de

promover la diferenciación celular y la respuesta inmune innata

(Arboleda & Urcuqui., 2016). Tratamientos en cultivo con monocitos han

demostrado que la Vitamina D3 es capaz de disminuir la expresión de

algunos TLRs como lo son TLR2 y TLR4 de una manera dosis-

dependiente, además de ser capaces de disminuir la producción de

citocinas proinflamatorias ante una infección con DENV (Puerta-Guardo

et al., 2012)

A pesar de que una vez que entra DENV a la célula, los principales TLR

que lo reconocen son TLR3, TL7 y TLR8 (Green et al., 2014), se ha

15

descrito que la proteína NS1 de DENV, es reconocida por los

TLR2,TLR4 Y TLR6 promoviendo la producción de citocinas

proinflamatorias, por lo que vitamina D3, al disminuir la expresión de

TLR2 y TLR4 y por lo tanto de citocinas proinflamatorias, puede ser un

fármaco ideal para tratar la enfermedad de Dengue, en especial de las

formas graves (Arboleda& Urcuqui., 2016).

Ivermectina

DENV durante su ciclo replicativo emplea diferentes componentes y

proteínas celulares. Entre ellas, utiliza diversas proteínas nucleares, las

cuales en la mayoría de los casos son translocadas del núcleo al

citoplasma (Pryor et al., 2007). Este exporte/importe nuclear incluye

también a algunas proteínas virales como NS5 y C, las cuales en

distintos momentos de la infección pueden estar presentes en el núcleo

de la célula infectada (Bhuvanakantham et al;2009; Pryor et al., 2007).

Es difícil entender el motivo por el cual las proteínas virales son

importadas al núcleo, cuando el ciclo replicativo de DENV es

citoplásmático, sin embargo, este proceso es indispensable ya que se

ha demostrado que la infección por DENV se inhibe de manera drástica

al tratar con ivermectina, un fármaco capaz de evitar el importe nuclear

de proteínas como NS5 y NS3.

La ivermectina es un fármaco antihelmíntico de amplio espectro que

proviene del compuesto activo avermectina aislado en Japón en 1974 a

partir de la bacteria Streptomycetes avermetilis. Inicialmente, la

ivermectina fue lanzada al mercado en 1981 únicamente para uso en

animales, sin embargo, 6 años después se empezó a emplear también

en humanos. El fármaco es capaz de bloquear la neurotransmisión,

interfiriendo con la sinapsis neuromuscular, actúa en los canales de

cloro y entradas de glutamato causando parálisis en invertebrados. En

16

humanos, la ivermectina actúa estimulando la salida de GABA en las

neuronas, sin embargo, la barrera hemato-encefálica impide la entrada

del fármaco hacia el cerebro (Omura, 2008).

Sobre la farmacología de ivermectina, la única vía de administración

aprobada es la oral, y es efectivo a dosis bajas de 0.15 mg/kg

alcanzando su Cmax a las 4h y una concentración plasmática de

100ng/mL (Kitzman D et al., 2006). Dada la alta solubilidad lipídica de

ivermectina, ésta se distribuye ampliamente en el cuerpo y tiene una

afinidad a proteínas plasmáticas mayor a 90% (González Canga et al.,

2008; Klotz et al., 1990). El citocromo P-4503A4 es el encargado del

metabolismo de ivermectina en el hígado, convirtiéndolo en al menos 10

metabolitos, y el compuesto es excretado principalmente en las heces

(González Canga et al., 2008), siendo la vida media de absorción de

0.5-2.5h, mientras que su vida media en plasma es de

aproximadamente 18h (Chaccour et al., 2017).

Existen estudios que han demostrado que ivermectina tiene una alta

afinidad de unión a NS3, funcionando como inhibidor de la actividad

helicasa de la proteína NS3 de varios flavivirus, incluido DENV

(Mastrangelo et al., 2012). También se ha descrito que la ivermectina es

un inhibidor del transporte mediado por el heterodímero importina α/β

utilizado por DENV para una eficiente producción viral

(Bhuvanakantham et al., 2009) mediante el transporte nuclear de NS5

y NS3 (Wagstaff et al. 2012). En infecciones con DENV se ha

observado que en la replicación, la proteína NS5 se encuentra en el

núcleo en diferentes etapas del ciclo celular, haciendo notar que la

localización nuclear de NS5 es diferencial en los cuatro serotipos de

DENV, mientras que la proteína de DENV2 y DENV3 se encuentra

predominantemente en el núcleo, en los otros dos serotipos, NS3 se

17

encuentra fundamentalmente en el citoplasma (Hannemann et al.,

2012).

La proteína NS5 está compuesta por 900 a.a y tiene un peso molecular

de 105kDa. Es la más conservada de las proteínas virales entre los

cuatro serotipos de DENV con un 70% de identidad (El Sahili & Lescar

J., 2017, Pryor M et al., 2007) y tiene función de metiltransferasa y

deRNA polimerasa dependiente de RNA viral. Su transporte nuclear es

mediado por importina Impα/β1 que son capaces de unirse a NS5, a

partir de sus dos secuencias de localicación nuclear (NLS) la primera,

reconocida por IMPα/β y la segunda, una bNLS reconocida únicamente

por IMPβ (Fraser et al., 2014). Se ha observado que al mutar los

residuos de Impα/β1 que reconocen NLS, se ve afectada la

translocación a núcleo de NS5 y con ello la producción viral. Así, la

ivermectina, al poder inhibir la unión de la IMPa/b a su sustrato (Tay, et

al., 2013), puede ser usada para inhibir la infección por DENV (Wagstaff

et al. 2012).

18

Justificación

DENV es el arbovirus más importante a nivel mundial. El secuestro de

la maquinaria celular para la eficiente replicación del virus permite

identificar pasos críticos en el ciclo viral, entre los que se encuentra el

aumento en la síntesis de colesterol y ácidos grasos y el importe

nuclear de la proteína NS5. Debido a que no hay tratamiento específico

para DENVsepropuso evaluar de manera conjunta el efecto antiviral de

fármacos ya aprobados por FDA que inhibieran algunos de los pasos

críticos del ciclo replicativo de DENV. Los fármacos evaluados fueron

NDGA que inhibe la síntesis de lípidos, la vitamina D3 que regula la

repuesta inmune, las estatinas que son inhibidores de la síntesis del

colesterol y la Ivermectina que inhibe el transporte nuclear de la

proteína NS5. La evaluación del efecto antiviral se realizó en células

HuH7. De igual manera, se propuso evaluar el efecto sinérgico de la

combinación de ivermectina y lovastatina en la actividad antiviral contra

DENV.

19

Hipótesis

Los fármacos NDGA, lovastatina, ivermectina y vitamina D3,

disminuirán la infección por DENV2 y DENV4 en células HuH7. La

combinación ivermectina y lovastatina tendrá un efecto sinérgico en la

inhibición de la infección por DENV.

Objetivo general

Evaluar efecto antiviral de los fármacos NDGA, lovastatina, ivermectina,

vitamina D3 y de la combinación ivermectina-lovastatina ante infección

con DENV2 y DENV4 en células HuH7.

Objetivos particulares

Evaluar el efecto de los fármacos NDGA, lovastatina, ivermectina y

vitamina D3 en la infección de DENV2 y DENV4 en células HuH7.

Evaluar el efecto antiviral de la combinación ivermectina-lovastatina.

20

MATERIALES Y MÉTODOS

Células HuH7

La línea celular Huh7, proveniente de un carcinoma hepato celular se

obtuvo de un tumor de hígado de un paciente de 57 años de edad en

Japón. La línea celular fue establecida por Nakabayshi y Sato en 1982.

Las células se cultivaron en medio DMEM Advanced (Thermo Fisher

Scientific®) suplementado con 10% de suero fetal bovino (SBS), 2mM

de glutamina y 1% de penicilina/estreptomicina a 37ºC en una

atmósfera de 5% de CO2.

Stock viral DENV2 y DENV4

La propagación de los serotipos 2 y 4 de DENV se realizó a partir de la

inoculación en cerebro de ratón y los títulos virales se evaluaron a partir

de un ensayo de focos. Cerebros de ratones lactante no infectados se

usaron para extracción de extracto Mock.

Infección y tratamiento

Las células HuH7 se infectaron con DENV2 o DENV4 por dos horas a

una MOI de 3. A continuación, las células se lavaron con HBSS (1X) de

(Gibco® by life technologies TM) y se incubaron con los diferentes

fármacos por 24 y 48 horas.

Las concentraciones de los fármacos utilizados fueron: NDGA a 50 µM,

la lovastatina a 50 µM, la vitamina D3 a 10 µM y la ivermectina fue

utilizada primero como pretratamiento de 50 µM por 4 horas y posterior

a la infección se volvió a tratar con 20µM de acuerdo a los estudios de

viabilidad realizados previamente en el laboratorio.

21

Evaluación de la infección

Para evaluar el efecto de los distintos fármacos en la replicación viral se

determinó:

a) La cantidad de células infectadas mediante citometría de flujo.

b) La cantidad de proteína viral mediante Western blot.

c) La cantidad de virus producidos mediante ensayos de focos.

Citometría de flujo.

Para determinar el nivel de infección con las diferentes dosis de los

fármacos, se realizaron ensayos de citometría de flujo. Para ello, las

células previamente infectadas con DENV2 o DENV4 a una MOI de 3,

fueron despegadas con tripsina EDTA 0.1%, y posteriormente

centrifugadasa 800 rpm durante 8 min a 4ºC, para ser fijadas con

formaldehído al 1% por 20 minutos. Posteriormente, las células se

lavaron con PBS1X. Una vez lavadas, se les colocó solución

permeabilizadora (Saponina 0.2%, SBF 1% diluido en PBS1X), se

incubaron por 20 min a temperatura ambiente, se centrifugaron por 7

minutos a 2000 rpm y se inició el inmunomarcaje con el anticuerpo

primario anti prM a una dilución 1:100 incubando una hora a 37ºC.

Pasado el tiempo de incubación, las células se lavaron con PBS1X

para eliminar el resto de anticuerpo y se realizóla incubación con el

segundo anticuerpo secundario Alexa 488 a una dilución 1:200, por 1

hora a temperatura ambiente en oscuridad, y por último se realizaron

los lavados con PBS1X. Las células fueron suspendidas en PBS1X

para la lectura en el citómetro. Los datos fueron analizados mediante el

programa Cytobank software.

22

Western blot.

Las células HuH7 o U937 DC-SIGN fueron infectadas con DENV2 o

DENV4 y tratadas con los diferentes fármacos. A las 24 y 48 horas

post-infección las células fueron lisadas con buffer de lisis (1.5 mM

MgCl2, Tris– HCl pH 7.5 10 mM, 10 mM NaCl, 1% IGEPAL) y las

proteínas separadas mediante electroforesis en SDS-PAGE al 10%. Las

proteínas fueron transferidas a membranas de nitrocelulosa mediante

una cámara semiseca e incubadas con los anticuerpos anti NS3

(GENETEX) y anti-GAPDH como control de carga. Las bandas se

revelaron mediante quimioluminiscencia y se analizaron por

densitometría en el programa ImageJ.

Ensayo de focos.

La cantidad de partículas virales liberadas al medio se analizó después

de cada tratamiento, mediante ensayos de focos. Para ello, se

realizaron diluciones de los sobrenadantes recuperados y con ellos se

infectaron las células HuH7 sembradas en placas de 96 pozos a una

confluencia de 70%. La infección se mantuvo por 2 horas y

posteriormente se agregó medio DMEM Advanced. Las células fueron

incubadas por 24 horas, y terminando el tiempo de incubación se

procedió a fijar las células con formaldehído al 1% por 20 min. Una vez

fijadas, se lavaron con PBS1X y se colocó la solución permeabilizadora

por 20 min para después incubar con el anticuerpo primario anti prM a

una dilución de 1:100, incubando dos horas a temperatura ambiente.

Las células fueron lavadas con solución permeabilizadora para después

colocar el anticuerpo secundario Alexa 488 (1:200) por una hora. Las

células se lavaron PBS 1X. El conteo de focos se realizó mediante

microscopía de epifluorescencia.

23

Ensayos de viabilidad

Para analizar la viabilidad celular después del tratamiento con las

distintas dosis de la combinación de lovastatina con ivermectina se

realizaron ensayos de viabilidad de incorporación de yoduro de propidio

utilizando la técnica de citometría de flujo.

Análisis estadísticos

Los datos fueron analizados por una t test múltiple para analizar el

efecto de cada fármaco con respecto a su vehículo considerándose un

intervalo de confianza de 95%, además, se realizó una ANOVA de dos

vías con un test de comparación múltiple de Tukey, para verificar el

efecto antiviral entre cada tratamiento. El programa utilizado fue

GraphPad Software.

RESULTADOS

Efecto de los fármacos en el porcentaje de células infectadas

Las células Huh7 fueron infectadas con DENV2 y DENV4 y tratadas con

los fámacos en las dosis que se describen en la tabla 1.

Tabla 1 Estrategia experimental

De

manera

general,

las

células

fueron infectadas por dos horas y posteriormente fueron tratadas con

Tipo Celular Serotipo Fármacos Tiempo

HuH7 DENV2

DENV4

NDGA 50µM

Lovastatina 50 µM

Vitamina D3 10 µM

Ivermectina 50/20 µM

24 Horas

48 Horas

24

NDGA 50µM, lovastatina 50µM o vitamina D3 10µM. En el caso de

ivermectina se realizó un pretratamiento con 50µM del fármaco 4 horas

antes de la infección, y posterior a ésta se trató con 20 µM del fármaco.

El efecto del fármaco en la infección viral fue evaluado a las 24 y 48

horas.

Para analizar de qué manera afectaba cada tratamiento en el número

de células infectadas, se realizaron ensayos de citometría de flujo.

En DENV2, se observó que a 24h y 48h hubo una reducción

significativa en la cantidad de células infectadas y tratadas con los

fármacos con respecto a las células control incubadas solo con el

vehículo (Figura 4). Los niveles de inhibición fueron desde un 15% para

el caso de vitamina D3 hasta el 60% para ivermectina. La reducción en

la cantidad de células infectadas fue más evidente a las 48h en todos

los tratamientos, excepto para ivermectina donde el efecto es menor

(Figura 4). Al momento de comprar el efecto entre los fármacos,

ivermectina resultó ser el que disminuyó de manera más eficiente el

número de células infectadas (hasta 75% de inhibición).

Con respecto a DENV4, se observó un efecto similar al de DENV2 en

donde todos los tratamientos disminuyeron la cantidad de células

infectadas desde un 15% de inhibición (vitamina D3) hasta un 50%

(ivermectina). Al igual que con DENV2, el mayor efecto inhibitorio fue

con ivermectina (Figura 4).

25

Figura 4. Efecto del tratamiento con NDGA, ivermectina, lovastatina y

vitamina D en la infección por Dengue. Se muestra tanto en DENV2, como

en DENV4, a 24 y 48h, el efecto que tiene cada fármaco en relación al

porcentaje de células infectadas. Las barras de error indican la desviación

estándar. Simbología: (*) muestra el grado de significancia p<0.05 en los

ensayos de t student de cada fármaco con su respectivo control; (.) muestra el

grado de significancia de la annova para comparar las diferencias entre los

fármacos.

26

Efecto de los fármacos en la cantidad de proteína viral

Otra manera de evaluar el efecto inhibitorio de la infección de los

distintos fármacos fue analizar la cantidad de proteína viral sintetizada

mediante ensayos de Western blot. A diferencia de lo observado en los

ensayos de citometría, en donde el efecto de los fármacos sobre la

inhibición de la infección se observó claramente, el método de Western-

blot fue menos sensible en detectar cambios en la cantidad de proteína

producida (Figura 5), sin embargo, para DENV2 fue evidente que hubo

una reducción significativa de la cantidad de la proteína viral después

del tratamiento con ivermectina a las 24 y 48 hpi. También pudimos

detectar una reducción en la cantidad de proteína viral en los

tratamientos con NDGA y lovastatina sin embargo no fueron

significativos a las 24 hpi. A las 48 hpi la inhibición en la cantidad de

proteína tanto con NDGA como con ivermectina fue significativa (Figura

5). Mediante esta metodología, no pudimos detectar una reducción

significativa de la cantidad de proteína viral después del tratamiento con

lovastatina ni con vitamina D3 (Figura 5).

Cuando se realizó la comparación entre tratamientos, se observó que a

24 H, ivermectina tiene un mejor efecto ante vitamina D3, mientras que

a 48 H Ivermectina tiene un mejor efecto ante vitamina D3 y lovastatina,

además también se muestra cómo NDGA tiene un mejor efecto antiviral

ante vitamina D3 (Figura 5).

En el caso de DENV4, se observó que a 24 horas sólo ivermectina

causó una reducción estadísticamente significativa en la cantidad de

proteína viral sintetizada (70% de reducción).Sin embargo, a las 48 hpi,

todos los fármacos probados, excepto vitamina D3, indujeron una

reducción significativa de la cantidad de proteína viral (40% de

inhibición para NDGA, 55% para lovastatina y 90% para ivermectina).

Como ocurrió con DENV2, el mayor efecto inhibitorio de la infección fue

27

causado por el tratamiento con ivermectina (de hasta 90% de inhibición

a las 48 hpi) (Figura 6).

Efecto de los fármacos en la producción de progenie viral.

Si bien los distintos tratamientos tenían un efecto inhibitorio en la

cantidad de células infectadas y en la cantidad de proteína viral

producida, decidimos evaluar el efecto de los fármacos en la cantidad

de virus producidos. La reducción de virus liberados de las células

infectadas y tratadas nos permite evaluar de manera directa la manera

en que los fármacos podrían reducir la diseminación viral, el cual es un

parámetro muy importante en la evaluación de antivirales. La cantidad

de virus liberado fue evaluado mediante ensayo de focos.

28

Figura 5. Evaluación de la expresión de la proteína viral NS3 en células

tratadas con NDGA, lovastatina, Vitamina D3 e ivermectina e infectadas

con DENV2. Las células Huh7 fueron infectadas con DENV2 y tratadas con

NDGA, LOV, VIT D o IVER por 24 o 48 h. La cantidad de la proteína NS3 fue

evaluada mediante Western-blot. Como control de carga se usó la proteína

GAPDH. Se muestra un Western blot representativo y el análisis

densitométrico de tres experimentos independientes realizados por duplicado.

Las barras de error indican la desviación estándar. Simbología: (*) muestra el

grado de significancia p<0.05 en los ensayos de t student de cada fármaco

con su respectivo control; (.) muestra el grado de significancia de la annova

para comparar las diferencias entre los fármacos.

29

Figura 6. Evaluación de la expresión de la proteína viral NS3 en células

HuH7 infectadas con DENV4 y tratadas con NDGA, lovastatina, vitamina

D3 e ivermectina. Las células Huh7 fueron infectadas con DENV4 y tratadas

con NDGA, LOV, VIT D o IVER por 24 o 48 h. La cantidad de la proteína NS3

fue evaluada mediante Western-blot. Como control de carga se usó la proteína

GAPDH. Se muestra un Western blot representativo y el análisis

densitométrico de tres experimentos independientes realizados por duplicado.

Las barras de error indican la desviación estándar. Simbología: (*) muestra el

grado de significancia p<0.05 en los ensayos de t student de cada fármaco

con su respectivo control; (.) muestra el grado de significancia de la annova

para comparar las diferencias entre los fármacos.

Con formato: Fuente: (Predeterminada) +Cuerpo

(Cambria), 12 pto, Sin Cursiva

Con formato: Normal, Izquierda, Interlineado: sencillo

30

Efecto de los fármacos en la producción de progenie viral.

Si bien los distintos tratamientos tenían un efecto inhibitorio en la

cantidad de células infectadas y en la cantidad de proteína viral

producida, decidimos evaluar el efecto de los fármacos en la cantidad

de virus producidos. La reducción de virus liberados de las células

infectadas y tratadas nos permite evaluar de manera directa la manera

en que los fármacos podrían reducir la diseminación viral, el cual es un

parámetro muy importante en la evaluación de antivirales. La cantidad

de virus liberado fue evaluado mediante ensayo de focos.

Con DENV2, se observó que todos los fármacos a 24 y 48 horas

afectaban el número de partículas virales liberadas (desde medio

logaritmo hasta tres logaritmos y medio), excepto vitamina D3 a las 48

horas donde no se observó diferencia con el vehículo (Figura 7).

Cuando se realizó el análisis comparativo entre tratamientos, se

observó que a 24 horas todos los tratamientos tienen un mayor efecto

antiviral y como en ensayos anteriores, el mayor efecto inhibitorio se

observó con ivermectina (Figura 7A).

En cuanto DENV4, a las 24 horas solo se mostró diferencia significativa

en reducción de virus producido con lovastatina e ivermectiva (un

logaritmo y medio y dos logaritmos y medio de inhibición

respectivamente). Sin embargo, a las 48 horas se observó una

diferencia significativa en el virus producido también con NDGA (un

logaritmo de inhibición). El tratamiento con vitamina D3 no indujo una

reducción de la cantidad de virus liberado (Figura 7B). Esto contrasta

con la inhibición observada con DENV2 (Figura 7A).

31

Figura 7. Efecto de los tratamientos con NDGA, lovastatina, vitamina D3 e

ivermectina en la liberación de partículas infecciosas. Las células Huh7

fueron infectadas con DENV2 (A) y DENV4 (B) y tratadas con NDGA, LOV,

VITD e IVER por 24 y 48 hrs y la cantidad de virus liberado fue evaluado por

ensayo de focos. Las gráficas incluyen los resultados de tres experimentos

independientes realizados por duplicado de la cantidad de unidades

formadoras de focos por mililitro en cada tratamiento. Las barras de error

indican la desviación estándar. Simbología: (*) muestra el grado de

significancia p<0.05 en los ensayos de t student de cada fármaco con su

Con formato: Fuente: (Predeterminada) Arial, 11 pto,

Color de fuente: Automático

Con formato: Fuente: 11 pto

32

respectivo control; (.) muestra el grado de significancia de la ANNOVA p<0.05

para comparar las diferencias entre los fármacos.

Viabilidad Ivermectina-Lovastatina.

Una vez evaluado el efecto independientemente de cada uno de los

fármacos, se decidió evaluar el efecto de algunos de ellos en

combinación. La vitamina D3 no fue contemplada pues fue el fármaco

con el menor efecto antiviral. Por otro lado, debido a que NDGA y

lovastatina actúan en la misma vía de reducción de colesterol, se

seleccionó solo uno de ellos que fue la lovastatina. Este fármaco se

combinó con ivermectina que actúa en la entrada de NS5 al núcleo, una

ruta diferente de inhibición de la infección por DENV.

Inicialmente, determinamos la viabilidad de las células con la

combinación de fármacos: 1) ivermectina 5µM-lovastatina 5µM, 2)

ivermectina 10µM-lovastatina 30µM, 3) ivermectina 10µM-lovastatina

40µM, y 4) ivermectina 15µM-lovastatina 35µM, y ninguna de ellas

afectó la viabilidad celular (Figura 8).

Tratamiento de ivermectina-lovastatina en células infectadas con DENV

Una vez corroborado que la viabilidad celular no era afectada con las

combinaciones de fármacos, evaluamos su efecto, para lo cual se

eligieron las dosis de ivermectina 10µM-lovastatina 40µM e ivermectina

15µM-lovastatina 35µM, ya que son las dosis a las cuáles cada fármaco

aún podría estar realizando su función antiviral. Para esto, las células

fueron infectadas con DENV2 o DENV4 y posteriormente fueron

tratadas con las dos diferentes dosis por 24-48 h. El medio se retiró y

en él se evaluó la cantidad de virus liberado por ensayo de focos.

33

Figura8 Viabilidad celular de la combinación ivermectina-lovastatina. Las

células Huh7 se trataron con diferentes combinaciones de IVER y LOV y la

cantidad de células vivas se evaluó por incorporación de yoduro de propidio

mediante citometría de flujo. La gráfica muestra el porcentaje de células vivas

en cada tratamiento y en presencia del vehículo (DMSO).Las barras indican el

error estándar de tres experimentos independientes.

Tanto para DENV2 como para DENV4 la dosis de Ivermectina 10µM-

Lovastatina 40µM fue capaz de disminuir la progenie viral en hasta tres

logaritmos (99.9% de inhibición) a las 48 hpi, esta disminución fue más

evidente más con la dosis de Ivermectina 15µM-Lovastatina 35µMpues

fue de hasta tres logaritmos (99.5% de inhibición) desde las 24 hpi

(Figura 9). El uso de ambos fármacos en combinación generó un efecto

Con formato: Fuente: 11 pto, Sin Negrita, Color de

fuente: Automático

Con formato: Fuente: 11 pto

Con formato: Fuente: 11 pto

34

inhibitorio de la infección por ambos virus mayor que lovastatina e

ivermectina por separado como se esperaba.

Figura 9 Efecto de combinación del lovastatina-ivermectina en la

producción de progenie viral. Las células Huh7 fueron infectadas con

DENV2 (A) y DENV4 (B) y tratadas con ivermectina 10µM-lovastatina

40µM y con ivermectina 15µM-lovastatina 35µM por 24 y 48 hrs y la

cantidad de virus liberado fue evaluado por ensayo de focos. Las

gráficas incluyen los resultados de tres experimentos independientes

realizados por duplicado de la cantidad de unidades formadoras de

focos por mililitro en cada tratamiento. Las barras de error indican la

desviación estándar.

35

DISCUSIÓN

Existen diversos estudios en los que se ha evaluado la actividad anti-

DENV de diferentes fármacos. Esto se ha logrado empleando diferentes

ensayos, serotipos virales y a diferentes multiplicidades de infección

(MOI). En este estudio quisimos evaluar el efecto de algunos de los

fármacos ya caracterizados usando dos serotipos virales DENV2 y

DENV4 en las mismas condiciones experimentales. Decidimos evaluar

la capacidad inhibitoria de la infección de los fármacos empleando tres

parámetros. Por un lado, analizamos i) la cantidad de células infectadas

mediante citometría de flujo, ii) la eficiencia de replicación viral mediante

la cuantificación de la proteína viral producida mediante Western-blot y

iii) la cantidad de virus producido mediante ensayo de focos. Los dos

ensayos que mostraron mayor sensibilidad para poder evaluar el efecto

inhibitorio de los fármacos fueron la citometría de flujo y el ensayo de

focos. El Western-blot fue poco sensible para poder seguir la inhibición

de la infección. Sin embargo de manera global consideramos que la

cuantificación de virus liberado mediante ensayo de focos es un

excelente parámetro para evaluar el efecto de un fármaco en la

diseminación viral.

Los fármacos estudiados en este trabajo actúan en tres vías diferentes:

i) síntesis de lípidos y colesterol (NDGA y lovastatina), ii) respuesta

inmune (vitamina D3) y iii) transporte citoplasma-núcleo. Si bien, los

fármacos que actúan a nivel de síntesis de lípidos fueron capaces de

inhibir la infección, medida por los tres métodos diferentes, con ambos

serotipos de DENV, el fármaco con mejor actividad anti-DENV fue

ivermectina. Estos resultados son consistentes con los estudios

realizados por Tay y colaboradores (2013) donde se observa que

ivermectina disminuye la infección con DENV. Si bien la replicación de

36

DENV y de los flavivirus en general es citoplasmática, la presencia de

proteínas virales en el núcleo parece ser indispensable (Pryor et al.,

2007) así como la relocalización de proteínas celulares nucleares en el

citoplasma de las células infectadas (Wagstaff et al., 2012). Resultados

de nuestro laboratorio sugieren que el transporte núcleo-citoplasma

está siendo alterado por la infección por DENV y ZIKV. Esto abre la

posibilidad de que esta vía pueda ser usada como un blanco contra la

infección por flavivirus. En el caso específico de ivermectina, se ha

demostrado que éste fármaco tiene también actividad anti-ZIKV en

células en cultivo al igual que en cultivos primarios (Barrows et al.,

2016). Este hecho apoya la actividad anti-flavivirus de ivermectina.

A pesar de lo esperado, nuestros experimentos fueron consistentes con

el hecho de que vitamina D3 tuvo un pobre efecto anti-DENV. Estudios

previos realizados en el laboratorio, habían mostrado el efecto antiviral

en células HuH7 por citometría de flujo (Puerta Guardo et al., 2012).

Estos datos fueron consistentes con nuestros resultados en donde se

observó una reducción de la cantidad de células infectadas por

citometría de flujo, sin embargo, ésta reducción no se reflejó en una

inhibición significativa de la cantidad de proteína viral y de progenie

viral. El efecto inhibitorio más importante generado por vitamina D3 fue

reportado en células de sistema inmune como los monocitos U937 DC-

SIGN (Puerta Guardo et al., 2012). Este hecho es consistente con el

hecho de que muchas de las funciones que tiene vitamina D3 son

principalmente inmuno-reguladoras, realizadas en el caso de DENV por

macrófagos y células dendríticas. Existen diversos reportes que indican

que Vitamina D3 es capaz de inducir autofagia (Chun R et al., 2014). Si

bien la autofagia en células diferentes a macrófagos puede potenciar la

infección por DENV (Guzman MG & Harris E et al., 2015), la autofagia

inhibe la infección en macrófagos (Puerta-Guardo et al., 2012). Se ha

37

descrito que en células diferentes a macrófagos, DENV es capaz de

inducir autofagia con el fin de incrementar la degradación de las gotas

lipídicas (Heaton & Randal., 2011) y así aprovechar los ácidos grasos

en la remodelación del retículo endoplásmico, lugar donde se realiza la

replicación viral la inducción de éste proceso en macrófagos parece

actuar de manera contraria (Green et al., 2014).

Con base en nuestros resultados decidimos evaluar si el uso de una

combinación de dos fármacos podría darnos mejores resultados. Para

ello, decidimos emplear lovastatina e ivermectina. La elección se realizó

con base en el hecho de que las estatinas al igual que el NDGA tienen

como blanco los lípidos y el colesterol pero son menos tóxicas y mejor

aceptadas en el uso en humanos y que ivermectina había tenido el

mejor efecto inhibitorio. Usando la combinación logramos tener una

inhibición mayor que con cualquiera de los fármacos por separado y en

24 hpi (99.9% de inhibición). De la misma manera, no se requería de un

pretratamiento como se realizó con ivermectina sola. Uno de los

próximos pasos será probar la combinación en cultivos primarios, que

constituyen modelos más sensibles a los fármacos, además de

probarse contra otros flavivirus como ZIKV, YFV o WNV. El empleo de

un modelo animal sería un segundo paso en el proceso y podría

también dar pistas importantes de la relevancia del tratamiento

combinado en la actividad anti-flavivirus y de su posible aplicación en

humanos.

38

CONCLUSIONES

Ivermectina es el fármaco con el mejor efecto antiviral.

La combinación ivermectina-lovastatina puede constituir una estrategia

antiviral efectiva para DENV y tal vez para otros flavivirus.

PERSPECTIVAS

• Probar otras posibles combinaciones entre los fármacos

• Evaluar si a las concentraciones utilizadas en la combinación

ivermectina-lovastatina, los fármacos siguen teniendo el mismo

efecto propuesto.

• Emplear la combinación en cultivos primarios.

• Evaluar el efecto de los fármacos en la infección de células U937

DC-SIGN y en los niveles de citocinas proinflamatorias

producidas durante infección.

• Evaluar el efecto de los fármacos y sus posibles combinaciones

en otros flavivirus como ZIKV, YFV y WNV.

39

REFERENCIAS

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