CALLE DOMINGUEZ MARIA ELIZABETH.pdf - UNIVERSIDAD ...
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UNIVERSIDAD AGRARIA DEL ECUADOR FACULTAD DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA CARATULA TESIS DE GRADO PRESENCIA DE Mycobacterium bovis EN GANADO FAENADO EN EL MATADERO MUNICIPAL DEL CANTÒN EL TRIUNFO AUTORA CALLE DOMINGUEZ MARÍA ELIZABETH TUTOR MVZ. ARCOS ALCIVAR FABRIZIO, M.Sc. GUAYAQUIL – ECUADOR 2020
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UNIVERSIDAD AGRARIA DEL ECUADOR
FACULTAD DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA
MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA
CARATULA
TESIS DE GRADO
PRESENCIA DE Mycobacterium bovis EN GANADO FAENADO
EN EL MATADERO MUNICIPAL DEL CANTÒN EL TRIUNFO
AUTORA
CALLE DOMINGUEZ MARÍA ELIZABETH
TUTOR
MVZ. ARCOS ALCIVAR FABRIZIO, M.Sc.
GUAYAQUIL – ECUADOR
2020
2
UNIVERSIDAD AGRARIA DEL ECUADOR
FACULTAD DE MEDICINA VETERIN ARIA Y ZOOTECNIA
MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA
PRESENCIA DE Mycobacterium bovis EN GANADO FAENADO
EN EL MATADERO MUNICIPAL DEL CANTÒN EL TRIUNFO
Trabajo de titulación presentado como requisito para la
Obtención del título de
MEDICA VETERINARIA Y ZOOTECNISTA
AUTORA
CALLE DOMINGUEZ MARÍA ELIZABETH
TUTOR
MVZ ARCOS ALCIVAR FABRIZIO MSc.
GUAYAQUIL – ECUADOR
2020
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UNIVERSIDAD AGRARIA DEL ECUADOR
FACULTAD DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA
MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA
APROBACIÓN DEL TUTOR
Yo, MVZ, Arcos Alcívar Fabrizio MSc, docente de la Universidad Agraria del
Ecuador, en mi calidad de Tutor, certifico que el presente trabajo de titulación:
PRESENCIA DE Mycobacterium bovis EN GANADO FAENADO
EN EL MATADERO MUNICIPAL DEL CANTÒN EL TRIUNFO,
realizado por la egresada CALLE DOMINGUEZ MARÍA ELIZABETH; con
cédula de identidad N° 0925447393 de la carrera MEDICINA VETERINARIA
Y ZOOTECNIA de la UNIVERSIDAD AGRARIA DEL ECUADOR, ha sido
orientado y revisado durante su ejecución; y cumple con los requisitos técnicos
exigidos por la Universidad Agraria del Ecuador; por lo tanto se aprueba la
presentación del mismo.
Atentamente;
MVZ, Fabrizio Arcos Alcìvar MS,c.
Guayaquil, 23 diciembre del 2019.
4
UNIVERSIDAD AGRARIA DEL ECUADOR
FACULTAD DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA
MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA
APROBACIÓN DEL TRIBUNAL DE SUSTENTACIÓN
Los abajo firmantes, docentes designados por el H. Consejo Directivo como
miembros del Tribunal de Sustentación, aprobamos la defensa del trabajo de
titulación: “PRESENCIA DE Mycobacterium bovis EN GANADO
FAENADO EN EL MATADERO MUNICIPAL DEL CANTÒN EL
TRIUNFO”, realizado por la egresada CALLE DOMINGUEZ MARÍA
ELIZABETH, el mismo que cumple con los requisitos exigidos por la Universidad
Agraria del Ecuador.
Atentamente;
------------------------
MVZ, Washington Yoong Kuffò, M.Sc
PRESIDENTE
------------------------------------ ------------------------------------
MVZ, Fabrizio Arcos Alcívar, M.Sc Dr, Alberto Orlando Narváez, .MSc
EXAMINADOR SUPLENTE EXAMINADOR PRINCIPAL
-------------------------------------
Q.F Andrea Chávez Colcha M .Sc
EXAMINADOR PRINCIPAL
Guayaquil, 23 de Diciembre del 2019
5
Dedicatoria
A Dios porque sin él no sería nadie.
A mi familia que es el motivo de mi esfuerzo
toda la vida.
A mi madre la Sra. Ana Domínguez, a mi
esposo Marlon Armendáriz, a mis hermosas
hijas Maily y Daphne Armendáriz Calle a
mis hnos.
6
Agradecimientos
A la Universidad Agraria Del Ecuador pioneros agrario en
la formación de profesionales.
Al rector vitalicio Dr. PhD Jacobo Bucaram Ortiz MSc.
A la rectora de la universidad Ing. Martha Leverone MSc.
A todos los docentes que impartieron sus conocimientos
con mucha paciencia y fervor.
A mi tutor el Dr. Fabrizio Arcos MSc. Y al MVZ Alberto
Orlando MSc.
Muchas gracias infinitas por el apoyo brindado.
A mis compañeros de estudios
A mi familia por la paciencia y el apoyo incondicional.
7
Autorización de autoría intelectual
Yo, CALLE DOMINGUEZ MARÍA ELIZABETH, en calidad de autora del proyecto
realizado, sobre “PRESENCIA DE Mycobacterium bovis EN
GANADO FAENADO EN EL MATADERO MUNICIPAL DEL
CANTÒN EL TRIUNFO.” para optar el título de MEDICA VETERINARIA Y
ZOOTECNISTA, por la presente autorizo a la UNIVERSIDAD AGRARIA DEL
ECUADOR, hacer uso de todos los contenidos que me pertenecen o parte de
los que contienen esta obra, con fines estrictamente académicos o de
investigación.
Los derechos que como autora me correspondan, con excepción de la
presente autorización, seguirán vigentes a mi favor, de conformidad con lo
establecido en los artículos 5, 6, 8; 19 y demás pertinentes de la Ley de
Propiedad Intelectual y su Reglamento.
CALLE DOMINGUEZ MARÍA ELIZABETH
C.I. 0925447393
Guayaquil, 23 de Diciembre del 2019.
8
Índice general
CARATULA 1
APROBACIÓN DEL TUTOR 3
APROBACIÓN DEL TRIBUNAL DE SUSTENTACIÓN 4
Dedicatoria 5
Agradecimientos 6
Autorización de autoría intelectual 7
Resumen 13
Summary 14
APROBACIÓN DEL ABSTRACT 15
1. Introducción 16
1.1 Antecedente del problema 16
1.2 Planteamiento y formulación del problema 18
1.2.1 Planteamiento del problema 18
1.2.2 Formulación del problema 18
1.3 Justificación de la investigación 18
1.4 Delimitación de la investigación 20
1.5 Objetivo general 20
1.6 Hipótesis 21
2. Marco teórico 22
9
2.1 Estado de arte 22
2.2 Bases teóricas 23
2.2.1 Definición 23
2.2.2 Importancia de la tuberculosis bovina en Ecuador 25
2.2.3 Etiología 27
2.2.4 Epidemiologia 28
2.2.5 Lesiones post morten 29
2.2.6 Tuberculosis bovina en salud publica 31
2.3 Marco legal 32
3. Materiales y métodos 34
3.1 Enfoque de la investigación 34
3.1.1 Tipo de investigación 34
3.1.2 Diseño de la investigación 34
3.2 Metodología 34
3.2.1 Variables 34
3.2.1.1 Variables independientes 34
3.2.1.2 variables dependientes 35
3.2.2 Recolección de datos 35
3.2.3 Recolección de datos 36
3.2.3.1 Recursos 36
3.2.3.2 Materiales de laboratorio 36
10
3.2.4 Las técnicas para la detección microbiológica de las bacterias
fueron: 37
3.3.4.1 Técnica para la siembra de los cultivos de Stonebrink 37
3.2.4.2 Técnica de siembra de los cultivos de Ogawa. 38
4.2.4.3 Método del PCR – LAMP 42
4. Resultados 44
4.1 Frecuencia de las lesiones compatibles con tuberculosis. 44
4.2 Presencia de Mycobacterium bovis mediante cultivo bacteriológico y
prueba de PCR – LAMP 48
4.3 Hallazgos anatopatológicos con los casos positivos 51
5 Discusión 53
6 Conclusiones 59
7 Recomendaciones 60
8 Bibliografías 61
9 Anexos 66
11
Índice de tablas
Tabla 1: Porcentaje de bovinos muestreados según las lesiones post morten. 45
Tabla 2: Porcentaje y frecuencia de los bovinos muestreados según el sexo. 45
Tabla 3: Porcentaje y frecuencia de los bovinos muestreados según la
categoría zootécnica. 46
Tabla 4: Porcentaje y frecuencia de los bovinos según el propósito. 47
Tabla 5: Porcentaje y frecuencia de los bovinos muestreados según la
procedencia. 47
Tabla 6: Aislamiento positivo por medio de cultivos. 49
Tabla 7: Crecimiento de las colonias según los medios de cultivos utilizados. 50
Tabla 8: Aislamientos positivos y negativos de los medios de cultivos
Stonebrink y Okawa, y el método microbiológico PCR – LAMP. 51
Tabla 9: Características de las lesiones macroscópicas positivas. 52
12
Índice de anexos
Anexo 1: Inspección post morten de las canales para localizar lesiones
macroscópicas compatibles a la tuberculosis bovina. 64
Anexo 2: Lesión macroscópica de los ganglios a la incisión se observo tubérculos
caseosos de color amarillento. 64
Anexo 3: Recolección de muestras de los ganglios y tejidos pulmonares con
lesiones macroscópicas con su respectiva rotulación. 65
Anexo 4: Aislamiento en los medios de cultivos Stonebrink y Okawa 65
Anexo 5: Crecimiento de las colonias en los medios de cultivos 66
Anexo 6: Preparación de las placas de los aislamientos positivos 66
Anexo 7: Fijación de las placas. 67
13
Resumen
La presente investigación tuvo como principal objetivo la identificación del
Mycobacterium bovis en los bovinos faenados en el camal municipal del cantón
El Triunfo, se trató de la inspección directa de los ganglios y tejidos pulmonares
se consideraron las lesiones macroscópicas con patrón compatible a tubeculosis
como presencia de granulomas, tubérculos, abscesos, tejidos exudados,
caseosos y de coloración grisácea. Se inspeccionaron 133 bovinos de los cuales
33 fueron positivos, se llevó el registro de la procedencia, propósito, categoría
zootécnica, y sexo esto con la finalidad de encontrar asociación de la
enfermedad. Los métodos de aislamiento utilizados en el estudio fueron el cultivo
Stonebrink y okawa se cultivaron las 33/133 muestras de las cuales solo 7
crecieron colonias entre las 1 y 3 semana siendo el método Stonebrink con
mayor proporción de 5/33 muestras de desarrollo a diferencia de 2/33 en el
medio Okawa estas 7/33 muestras fueron analizados mediante el método
molecular PCR – LAMP obteniendo un resultado negativo a Mycobacterium bovis
llegando a la conclusión que las lesiones macroscópicas presentes fueron por
consecuencia a Mycobacterium atípicas presente.
Palabras Claves: Mycobacterium spp, Mycobacterium Tuberculosis,
Mycobacterium Bovis, Stonebrink, Okawa, PCR – LAMP.
14
Summary
The main objective of this research was the identification of the Mycobacterium
bovis in cattle slaughtered in the municipal road of the El Triunfo canton, it was a
direct inspection of the ganglia and lung tissues to identify the post mortem
macroscopic lesions compatible with the Mycobacterium, they were inspected
133 cattle of which 33 were positive, the record of the origin, purpose,
zootechnical category, and sex was kept in order to find an association of the
disease. The isolation methods used in the study were the Stonebrink culture and
okawa, 33/133 samples were grown, of which only 7 grew, developed colonies
between 1 and 3 weeks some until the fifth but were discarded due to
contamination, the Stonebrink method being Higher proportion of 5/33
developmental samples, unlike 2/33 in the Okawa medium, these 7/33 samples
were analyzed using the molecular method PCR - LAMP obtaining a result of 0%
negative a Mycobacterium bovis, concluding that the lesions Macroscopic
presents were consequently atypical Mycobacterium present in the medium.
Gross lesions were considered due to the characteristic of the disease, such as
the presence of granulomas, tubers, abscesses, exudates, caseous and gray-
colored tissues, which then confirmed the negative results to Mycobacterium
bovis by means of the PCR-LAMP.
Keywords: Mycobacterium spp, Mycobacterium Tuberculosis, Mycobacterium
Bovis, Stonebrink, Okawa, PCR - LAMP.
15
UNIVERSIDAD AGRARIA DEL ECUADOR
FACULTAD DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA
MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA
APROBACIÓN DEL ABSTRACT
Yo, Ing. WASHINGTON EVANGELISTA MSc, docente de la Universidad
Agraria del Ecuador, en mi calidad de ENGLISH TEACHER, CERTIFICO que he
procedido a la REVISIÓN DEL ABSTRACT del presente trabajo de titulación:
“PRESENCIA DE Mycobacterium bovis EN GANADO FAENADO
EN EL MATADERO MUNICIPAL DEL CANTÒN EL TRIUNFO”,
realizado por la egresada CALLE DOMINGUEZ MARÍA ELIZABETH; con
cédula de identidad N° 0925447393 de la carrera MEDICINA VETERINARIA Y
ZOOTECNIA, de la UNIVERSIDAD AGRARIA DEL ECUADOR, el mismo que
cumple con los requisitos técnicos exigidos por la Universidad Agraria del
Ecuador; por lo tanto se aprueba la presentación del mismo.
Atentamente;
Ing. WASHINGTON EVANGELISTA MSc,
Docente de ingles
Guayaquil, 23 de Diciembre del 2019
16
1. Introducción
1.1 Antecedente del problema
La tuberculosis bovina es denominada como una infección zoonótica muy
conocida con cierta variedad de hospedadores incluyendo el ser humano, puede
infectar a los humanos y animales en países de gran desarrollo y no
industrializados. Existen dos principales especies patógenas como son las del
complejo Mycobacterium tuberculosis es agente causal en humanos y ganado
se ha reportado casos en animales domésticos y silvestres con mayor frecuencia
en animales que viven en contacto directo con los animales y Mycobacterium
bovis este agente es zoonótico es responsable de caso entre el 5 a 1’0% de
todos los casos reportados y un 30 % de epidemias de tuberculosis bovina en
humanos. Es importante realizar el análisis apropiado para determinar la
tuberculosis bovina para el control y prevención de la transmisión de la cepa del
Mycobacterium tuberculosis, (Bhembe, y otros, 2018).
Es esencial conocer el tipo, familias y la cantidad de cepas prevalentes que
están sobrerrepresentadas, (Bhembe, y otros, 2018), la OIE organización
mundial de sanidad animal, considera que la tuberculosis bovina tiene gran
impacto socioeconómico y de salud pública, al ser considerada enfermedad
zoonotica, afectando el comercio exterior del ganado y subproductos de origen
animal; la prevalencia de la tuberculosis bovina en los países subdesarrollados
aún sigue siendo desconocida; según estudios realizados en Ecuador en el año
2006 la prevalencia es relativamente alta de tuberculosis bovina, pero la falta de
informes y las fallas de sistemas de trazabilidad generan datos erróneos
17
causando contradicciones. En otros países como Argentina, Chile, Bolivia,
Guyana, Brasil, Guatemala, Perú y Haití. En los años de 1998 se estimó ciertas
medidas de control para la tuberculosis bovina las mismas fueron incompletas e
inexistentes con un 24% de la población de la población bovina en todo
Latinoamérica, representando un alto riesgo la falta de control principalmente
para los habitante rurales que están en contacto directo con los animales; 374
millones de bovinos aproximadamente en Latinoamérica y todo el Caribe, más
del 70 % están en áreas donde la tasa de infección del Mycobacterium bovis
supera el 1%, (Proaño, y otros, 2006).
El ganado bovino se infecta por vía respiratoria y suele permanecer
asintomático durante los primeros meses post infección, aunque los síntomas
suelen aparecer cuando se pierde el equilibrio delicado entre el hospedero y el
agente causal etiológico, debido al estrés como la inmunosupresión o
desnutrición. Luego de la infección los granulomas nodulares también llamados
tubérculos, se desarrollan esta puede ocurrir en cualquier tejido pero se observa
con más frecuencia en los ganglios linfáticos, los intestinos, hígado, la pleura,
pulmones, bazo y peritoneo; por lo general no existe evidencia clínica de
tuberculosis bovina aunque existen síntomas no son tan específicos por ejemplo:
tos, fatiga, temperaturas sub febriles, perdida de pesos, pérdida del apetito, y
baja producción de leche, (Proaño, Benítez, Portaels, & Rigouts, 2011).
Una herramienta importante para el control, prevención y erradicación de la
tuberculosis bovina es la inspección veterinaria en los mataderos que se basan
en la observación directa de las canales incluyendo muestras de lesiones
compatibles a la enfermedad aplicando cultivos con la confirmación final de la
presencia de Mycobacterium bovis, determinado por el crecimiento bacteriano el
18
proceso puede tardar varias semanas sin embargo la prueba molecular del PCR
es utilizada directamente en las muestras biológicas de tejidos pulmonares,
ganglios linfáticos sospechosos de esta patología ofrece otra alternativa de
diagnóstico mucho más eficiente a comparación de los cultivos in vitro, (César,
2015); (Echeverria, y otros, 2014).
1.2 Planteamiento y formulación del problema
1.2.1 Planteamiento del problema
En el Ecuador el estado de la tuberculosis bovina no ha sido documentada
por la falta de registros de casos positivos, también debido al uso de pruebas de
diagnósticos y a la ineficiente inspección de los médicos veterinarias en la
mayoría de los camales; según encuestas sobre la tuberculosis bovina se han
reportado 3,9% de prevalencia en la parte norte del Ecuador datos no publicados.
El ganado se infecta principalmente por vía respiratoria o por contacto directo de
animales infectados, pueden ser asintomáticos durante los primeros meses de
incubación de la enfermedad aunque puede desarrollas sintomatología cuando
los animales están con inmunosupresión, la mayoría de lesiones se presentan
en los tejidos como hígado, pleura pulmones, bazo, peritoneo entre otros,
(Proaño, y otros, 2006).
1.2.2 Formulación del problema
1.3 Justificación de la investigación
En países de desarrollo la frecuencia y la presencia del Mycobacterium bovis
en la tuberculosis bovina no pulmonar es desconocida debido a las instalación
es de laboratorios que están limitados para el cultivo y la identificación de bacilos
tuberculosos. El método estándar que se utiliza para el diagnóstico que
19
habitualmente se utiliza para determinarla tuberculosis bovina es la prueba de la
tuberculina.
La prueba de tuberculina sin embargo puede provocar sensibilidad
provocando resultados falsos positivos, ocasionando el sacrificio del bovino libre
de esta enfermedad conllevando pérdidas económicas; o también puede dar
resultados falso negativo lo que hace que el animal infectado permanezca en el
rebaño infectando a los bovinos sanos causando una rápida diseminación de la
enfermedad, (César, 2015). La diferenciación de las diferentes especies
existentes causantes del Mycobacterium crecen in vitro en el organismo
normalmente esta reacción en cadena de la polimerasa PCR ha sido
exitosamente considerable que ha reducido drásticamente el tiempo de
confirmación del agente causal, (Proaño, y otros, 2006).
Los humanos que están infectados con tuberculosis bovina activa, son
portadores más probables de Mycobacterium tuberculosis en animales, con esta
infección se transmiten del esputo aunque rara vez de heces y orina; los informes
de tuberculosis de ganados bovinos son de países desarrollados con alta
prevalencia de tuberculosis humana,
Existe una gran variación de la calidad de estudios metodológicos que se han
evaluado con precisión las pruebas de diagnóstico de la tuberculosis bovina, a
pesar de la importancia de estas pruebas ante la super vigilancia nacional y el
esquema del control de enfermedades. Los están dares de referencias son
pruebas consideradas por los investigadores como uno de los mejores para
establecer la presencia o ausencia de la infección. El sesgo epidemiológico en
la medición de las pruebas de referencia o sesgo de selección de a población en
estudio lleva a la inexactitud del rendimiento de la prueba, la sobre estimación
20
de la prueba puede conllevar a una estrategia ineficaz del control ya que la
misma da como resultado una falsa confianza en el número de animales o
infectados, (Downs, y otros, 2018).
La tuberculosis bovina se considera en muchas partes del mundo como una
infección endémica causada al ganado bovino lo que se traduce en costos
económicos y sociales. La tuberculosis bovina es difícil de erradicar
principalmente si tiene vuelo endémico mediante animales silvestres, según
modelos matemáticos sugieren que se puede lograr un impacto sustancial
utilizando estrategia y control nacional de erradicación de la epidemia
localizando rebaños infectados por lo con siguiente disminución de la infección,
el desarrollo de nuevos casos y la mejora de las pruebas de diagnóstico, la
elección de la prueba de diagnóstico y el valor del corte a utilizar para determinar
un animal infectado y su compromiso entre la sensibilidad y la especificidad
dentro del cuadro epidemiológico local, (Nuñez, y otros, 2018).
1.4 Delimitación de la investigación
1.5 Objetivo general
● Diagnosticar Mycobacterium bovis en ganado faenado en el
matadero municipal del Cantón El Triunfo.
1.1 Objetivos específicos
● Estimar la frecuencia de las lesiones compatibles con
tuberculosis.
● Diferenciar la presencia de Mycobacterium bovis mediante
cultivo bacteriológico y prueba de PCR LAMP.
21
● Caracterizar los hallazgos anatopatológicos con los casos
positivos.
1.6 Hipótesis
Existe una alta frecuencia de bovinos infectados con Mycobacterium bovis,
faenados en el camal municipal del Cantón El Triunfo.
22
2. Marco teórico
2.1 Estado de arte
Según, (Echeverría, 2011); (A. Parra, 2008), Argumentan que una de las
principales herramientas que son utilizadas para el control y erradicación de la
tuberculosis bovina es la inspección minuciosa del médico veterinario la misma
que es aplicada en los camales o mataderos, que se basa en la observación
estricta y toma de muestras de lesiones que pueden ser compatibles con la
enfermedad, que es utilizada para la identificación de la presencia de
Mycobacterium bovis, mediante el cultivo in vitro, regularmente con la
confirmación posterior por medio de la reacción de polimerasa PCR de los
crecimientos bacterianos, cabe mencionar que los resultados son tardíos es decir
entre 6 a 8 semanas.
Según (Proaño, Benítez, Portaels, & Rigouts, 2011), mencionan que existen
numerosos reportes publicados en estudios realizados en el cantón Mejía con
una prevalencia existente de tuberculosis bovina de 7,95% en hatos grandes,
mientras que u 4,24% en hatos medianos y un 0,3% en hatos pequeños.
Posteriormente se realizó otra investigación mucho más detallada en la misma
región durante los años 2007 y 2008, donde los resultados de prevalencia de los
hatos grandes fue de un 8,63% y una incidencia de 1,70% a nivel de mataderos.
23
2.2 Bases teóricas
2.2.1 Definición
La tuberculosis bovina es considerada una de las enfermedades
remotamente antiguas a nivel mundial, la misma que ha evolucionado a tener un
reservorio habitual de origen animal; por lo que se ha demostrado que su origen
depende a la especie de Mycobacterium tuberculosis ancestral así lo indica,
(Gutierrez, y otros, 2005). Se caracteriza por sus lesiones macroscópicas
conocidas como granulomas o tubérculos así lo detalla, (Ashford, Voelker, &
Steele, 2006). Se considera de origen crónica y debilitante aunque en ocasiones
puede ser aguda y de muy rápido desarrollo con infecciones asintomáticas,
(Cardoso, y otros, 2009). Puede afectarse cualquier tejido pero las principales
lesiones se pueden observar en los ganglios linfáticos del área torácica, (Whipple
& Miller, 1996). También se pueden observar en los intestinos, peritoneo, bazo y
pulmones, (OIE, Annual animal disease status bovine tuberculosis , 2004).
Según (Gutierrez, Vallecillo, & Diaz, 2006), mencionan que una de la
enfermedades de mayor importancia en la ganadería es la tuberculosis bovina,
la misma que es causantes de pérdidas en el sector ganadero así también es un
riesgo para salud pública. La presencia de esta infección en el hato ganadero
representa un gran obstáculo en el crecimiento de la ganadería dificultando el
transporte del ganado y productos del mismo.
Según (OIE, 2011), argumenta que la tuberculosis bovina es provocada por
el Mycobacterium bovis, relacionada entre sí con otras bacterias que causan la
tuberculosis humana y aviar, provocando daños progresivamente en el animal y
por ende en la salud humana; causan perdidas en los productores. El nombre
24
tuberculosis proviene de los nódulos llamados tubérculos estos se desarrollan
en los ganglios linfáticos del animal enfermo o infectado siendo los órganos más
afectados las ubres, pulmones tracto digestivo entre otros.
Según (CRESA, 2012), Detalla que la Mycobacterium bovis se encuentra con
mayor frecuencia en el ganado bovino y en otros animales como los venados,
alces y búfalos, en los humanos la Mycobacterium bovis es causante de la
tuberculosis que afecta órganos como los pulmón es y ganglios linfáticos y en
otras partes del cuerpo. Tal como ocurre con la Mycobacterium tuberculosis no
todas las personas infectadas con Mycobacterium bovis se enferman o muestran
sintomatología. Los humanos infectados desarrollan una enfermedad
denominada infección tuberculosis latente LTBI en sus siglas en inglés; existen
personas que tienen LTBI pero no contagian la enfermedad a otras personas ni
tampoco padecen de síntomas aunque más adelante pueden desarrollar la
enfermedad.
Según (Prat, Domínguez, & Ausina, 2012), indican que el nombre especifico
de Mycobacterium tuberculosis fue atribuido por Zopf en el año 1883 y en el año
1896 Lehman y Neumann fueron quienes asignaron las especies al Género
Mycobacterium, es así que después de la observación de la pequeña diferencia
entre microorganismos aislados en humanos y el ganado se distinguió la M.
tuberculosis bovis y M. tuberculosis hominis; las cepas de hominis eran las
causantes de la enfermedad pulmonar en los humanos y la cepa bovis
responsable de la tuberculosis en el ganado bovino pudiendo desarrollar una
enfermedad extra pulmonar en el hombre como consecuencia del consumo de
leche de vacas infectadas. Uno de los primeros casos bacteriológicamente
confirmado de tuberculosis pulmonar bovina esto fue descrito en los años de
25
1909 y luego las investigaciones concluyeron que el 1 y el 3% de los casos de
tuberculosis pulmonar era consecuencia del Mycobacterium bovis este nombre
fue legalmente asignado en los años de 1970 por Karson y Lessel.
2.2.2 Importancia de la tuberculosis bovina en Ecuador
Según (Proaño, Benítez, Portaels, & Rigouts, 2011), detallan que en el
Ecuador así como en otros países la tuberculosis bovina es causada por el
Mycobacterium bovis siendo no reportada debido a los intereses ganaderos, los
mismos que n o denuncian los casos verdaderos positivos por miedo a la falta
de confidencialidad. Es por eso que los únicos reportes de la enfermedad se
detallan de investigadores aislados aun estudio que se realizó en los cantones
Otavalo, El Ángel, Espejo y Cayambe revelando una prevalencia de un 3,91%.
Según (Paillacho, 2015), Manifiesta que las expansiones de las industrias
lecheras en el Ecuador durante los últimos años ha causado una gran demanda
de leche y subproductos, a consecuencia del aumento de la población debido a
esto se ha intensificado la aparición de nuevas fincas lecheras y por consiguiente
ingreso de nuevos animales en contacto directo con otros animales de fincas
grandes siendo as susceptibles en contagiarse de tuberculosis bovinas.
En Ecuador el encargado del control de la tuberculosis bovina es la Agencia
Ecuatoriana de Aseguramiento de la Calidad del Agro AGROCALIDAD, entidad
que realiza protocolos de verificación mediante la declaración obligatoria de la
sospecha de la enfermedad, los cuales se dirigen con personal capacitado al
predio para el respectivo seguimiento de la enfermedad, si existe evidencia se
realiza el diagnóstico de la tuberculosis bovina mediante dos pruebas de
tuberculina ano caudal en los bovinos a partir de los 6 meses de edad, al reportar
26
positivo la presencia del agente causal se activara el sistema de vigilancia
sanitaria terminando con el sacrificio de los animales y control de la enfermedad,
aunque a pesar de tener un programa de control, el carácter voluntario hace que
no sea posible el cumplimiento de los objetivos y no se lleve a cabo el control
total para erradicar la enfermedad, (AGROCALIDAD, 2016).
En Ecuador para el año 2011, según el Ministerio de Salud Pública verifico
los datos de tuberculosis bovina total por cada región del Ecuador, pero por la
falta de identificación y estudios del patógeno se estimó una incidencia
relacionada con los países de la zona. Se vio un mayor crecimiento en los años
1998 al 2005 aislando dos cepas de M. bovis en dos niños con tuberculosis
bovina extra pulmonar se sospechó las rutas de infección por ingestión de los
microorganismos posiblemente en la leche, (Kantor, Lobue, & Thoen, 2010).
Existen reportes realizados mediante pruebas de tuberculina comparativa y
simple asi los describe (Proaño, y otros, 2006). En la provincia de Tunguragua
se encontró una prevalencia baja de 0,33%, mientras que en un estudio realizado
en el año 2003en la misma zona se notó un incremento de 1,2%, (Alemán,
Cajilema, & Jaramillo, 2003). Mientras que en la provincia de Pichincha en el
cantón Cayambe reportan una prevalencia de un 2,81%, (Acosta & Parreño,
1977) y posteriormente en otro estudio hubo una variación de un 0,47%, (Salazar
& C.Cevallos, 2002).
27
2.2.3 Etiología
Según (Goyena, 2016) menciona que el género de Mycobacterium
establecido dentro de la familia Mycobacterfiaceae, se dice que esta constituidos
por varias especies cuyas caracteristicas generales se determinan como bacilos
delgados Gram positivos aerobios estrictos e inmóviles, pertenecen incluidos en
el orden de Actinomycetales, con los géneros Norcardia y Corynebacterium,
entre otras, compartiendo ciertas caracteristicas como un alto contenido de
genómico de guanina y citosina en su ADN y por ser capaz de producir ácidos
micolicos siendo el componente primordial de la pared celular, son no
espurulados con un tamaño entre 0,2 a 0,6 x 1 a 10 mcm, no son capaces de
producir endosporas ni capsula, son bacilos con capacidad de formar filamentos
ramificados, aunque pueden romperse con facilidad otra característica es que la
pared tiene la capacidad hidrofóbica por ser rica en lípidos la superficie posee
micobacterias muy resistentes al medio y a algunos desinfectantes solubles e
inclusive a las tinciones que usan en los laboratorios siendo susceptibles a
desinfectantes a base de fenoles.
Según (Ward, 2005), indica que estas micobacterias son bacilos de ácidos
resistentes al alcohol acidificado decolorantes con carbol-fuscina. Este género
está dividido en dos grupos como el complejo Mycobacterfium tuberculosis y
micobacterias no tuberculosis Mycobacteriun bovis incluida M. microti,
africanum; todas estas bacterias son patógenas y agentes etiológicos en
mamíferos, la Mycobacterium tuberculosis afecta al humano y el M. bovis este
agente afecta a los bovinos. Existe otro complejo de micobacterias atípicas
teniendo más de 80 representantes aunque la mayoría no son patógenas;
28
aunque existe en este grupo una micobacteria de consideración como o es M.
paratuberculosis el cual es agente causal de la paratuberculosis.
2.2.4 Epidemiologia
Según (Roa, 2015), detalla que en el Ecuador la prevalencia de tuberculosis
bovina sigue siendo desconocida, aunque se han reportado casos en ciertos
países de Latinoamérica con prevalencia relativamente altas, los datos no están
bien documentados ni cuantificados Por falta de registros de animales positivos,
el uso de pruebas de diagnósticos y una de las más importantes la falta la no
declaración obligatoria de la enfermedad.
Según (Prat, Domínguez, & Ausina, 2012), indican que la tuberculosis bovina
M. tuberculosis es el único agente causal de la mayoría de muertes de adultos
mayores en el mundo, aún existen casos desconocidos con el M. bovis. Se
estipulan casos de tuberculosis de un 3% aproximadamente en todo el mundo.
Existe una correlación entre erradicación de tuberculosis en ganado bovino y
prevalencia en humanos; en los países subdesarrollados el control de la
pasteurización de la leche se ha reducido significativamente la incidencia de
infección por Mycobacterium bovis, la tuberculosis zoonotica sigue existente en
países en vías de desarrollo muy presente en animales en donde los controles y
la vigilancia es inadecuada al ganado domesticado y salvaje.
El Mycobacterium bovis es el segundo agente causal de la tuberculosis
bovina más común en personas, (Pérez, Milián, Arriaga, Romero, & M., 2008).
Aunque los datos son incompletos y muy dispersos a la importancia de la
tuberculosis bovina humana, (Abalos & Retamal, 2004); (Alemán, Cajilema, &
29
Jaramillo, 2003). Se conoce que la incidencia de la tuberculosis bovina es
heterogénea en todo el mundo, (Etchechoury, y otros, 2010).
En todo el mundo durante el año 2009, se estimó 9,4 millones de incidentes
de tuberculosis, con un 14 millones de prevalencia; además se manifestó que
existieron 1,7 millones de muertes por tuberculosis bovina de la cuales 456.000
eran portadores de VIH positivo así lo indica la, (OMS, 2010) se estimó
aproximadamente 3,1% de casos de tuberculosis bovina en humanos a nivel
mundial 2,1% pulmonar, y un 9,4% extrapulmonar provocadas por el
Mycobacterium bovis, (Cosivi, y otros, 1998). Mientras que otros autores
mencionan que dependen de la zona va a variar la incidencia. En los países
desarrollados representa el 1% de la mayoría de los casos, aunque la
reactivación en adultos mayores, puede depender a la emigración de zonas de
donde sea erradicado la enfermedad, (Domenech, 2006). En los países en
desarrollo tiene un 10% de causa de los casos con tuberculosis bovina,
(Bastidas, y otros, 2003).
2.2.5 Lesiones post morten
Según (Cassidy, 2006); (Nuñez, y otros, 2018), mencionan que la tuberculosis
bovina se caracteriza por la formación de tubérculos o granulomas en los que se
alojan las bacterias, estos granulomas son amarillentos, caseosos, calcificados
o calcáreos están siempre encapsulados. En algunas ciertas especies como los
alces o ciervos las lesiones a veces tienen aspecto de grandes abscesos típicos
tubérculos que se encuentran en los ganglios linfáticos aunque otros tubérculos
son más pequeños y otros pasan desapercibidos a la vista.
30
Las formas de presentación de la tuberculosis bovina se pueden caracterizar
con la presencia y formación de granulomas, un diagnostico especifico se puede
realizar mediante la búsqueda de lesiones macroscópicas a nivel de los camales,
en los países subdesarrollados es un procedimiento rutinario, (Corner, 1994).
En el ganado bovino también los granulomas se encuentran en los ganglios
linfáticos principalmente en los ganglios de la cabeza y el tórax aunque
frecuentemente en el pulmón, hígado, bazo, y en las cavidades corporales, en
casos particulares se pueden encontrar granulomas muy pequeños en otros
órganos, se han dado casos que estos granulomas aparecen en la vulva de la
hembra bovina siendo muy poco frecuente en los genitales del macho. En países
desarrollados existen programas de control los animales infectados
generalmente presentan lesiones durante la necropsia, siendo los más comunes
los ganglios linfáticos relacionados con el sistema respiratorio existen pequeñas
lesiones en los pulmones de estos animales infectados y asintomáticos
encontrados durante la sección de los tejidos. En los ciervos los tubérculos se
los encuentra particularmente en la cabeza y el tórax en los ganglios retro
faríngeos mediales; en algunas especies se pueden observar tractos fistulosos
con supuración con supuración de los ganglios craneales también se pueden
observar abscesos en los ganglios mesentéricos. En los ciervos de cola blanca
se observan tubérculos en los ganglios retrofaríngeos mediales y en las
amígdalas por lo general suelen verse comprometidos y muy poco frecuente en
los tractos fistulosos. Los granulomas del M. bovis no son calcificados en perros
y gatos, en los primeros se pueden encontrar en ganglios linfáticos, pulmones y
en otros órganos con presencia de pleuritis, pericarditis y peritonitis. En el caso
de los perros los granulomas se presentan en los ganglios linfáticos, hígados,
31
riñones, pleura y pulmones se puede observar líquido rojizo en el tórax. Existen
algunos casos de tejones infectados que han sido portadores de la enfermedad
presentando lesiones mínimas con tubérculos localizados siendo frecuentes en
los ganglios linfáticos y algunos órganos viscerales; los oposums de cola de
escoba presentan caseificación y necrosis en los pulmones.
2.2.6 Tuberculosis bovina en salud publica
Según (Cousins, 2001), menciona que la tuberculosis en humanos
ocasionada por la Mycobacterium bovis es poco frecuente en países donde se
produce leche pasteurizada en los cuales se programan la erradicación bovina;
aunque la enfermedad persiste en zonas donde los controles son muy precarios;
esta incidencia sigue siendo mayor entre los empleados, agricultores, y personas
que trabajan directamente con el ganado aunque pueden contagiarse mediante
otras especies portadoras de la infección; se han mencionado casos en ciervos,
cabras, rinocerontes y focas, la fauna silvestres puede ser fuente de infección
principalmente en países donde es legal la caza de animales para el consumo
cabe mencionar que algunas infecciones en los humanos son asintomáticas en
otros casos la infección fluye a pesar del tiempo poco después de la infección o
puede pasar años en desarrollarse, la enfermedad es localizada afectan do
articulaciones, ganglios, huesos, piel, sistema urogenitales, vías respiratorias y
meninges. La escrófula o linfopatía cervical afecta a los ganglios linfáticos de los
pre auriculares y amígdalas suelen ser de forma tuberculosa en niños que toman
leche con infectada se han dado casos que los ganglios se abren hacia la piel y
supuran lo que ocasiona la enfermedad llamada lupus vulgaris. Los humanos
que son infectados a través de la piel desarrollan la enfermedad localizada
32
denominada verruga del carnicero de forma benigna y autolimitante. Esta
enfermedad pulmonar es propia de pacientes con infecciones reactivas, entre
presencia de síntomas como tos, fiebre, dolor de espalda y pecho hemoptisis en
otros casos infecciones genitourinarias por fallo renal. La tuberculosis se puede
tratar con anti microbianos pero las infecciones no tratadas a tiempo pueden
provocar la muerte.
Según (CRESA, 2012), indica que la tuberculosis bovina es una enfermedad
zoonotica que puede transmitirse del humano mediante el consumo de productos
de los animales infectados o por contacto directo con los mismos es una
enfermedad de notificación obligatoria a las entidades pertinentes.
2.3 Marco legal
El director de la agencia Ecuatoriana de aseguramiento de la calidad del agro
- AGROCALIDAD
Según (Vizcaino, 2016), indica que, el artículo 4 de la Ley de Sanidad Animal,
publicada en el Registro Oficial Suplemento Nro. 315, de 16 de abril del 2004,
establece que el Ministerio de Agricultura y Ganadería, ejercerá el control
sanitario de las explotaciones ganaderas, establecimientos de preparación de
alimentos para el consumo animal, fábricas de productos químicos y biológicos
de uso veterinario y de su almacenamiento, transporte y comercialización.
Reglamento zoosanitario de centros de concentración de animales
Según (Vizcaino, Reglamento zoosanitario de centros de concentración de
animales, 2016), menciona que, el artículo 281 numeral 13 de la Constitución de
la República, establece que la soberanía alimentaria constituye un objetivo
33
estratégico y una obligación del Estado para garantizar que las personas,
comunidades, pueblos y nacionalidades alcancen la autosuficiencia de alimentos
sanos y culturalmente apropiado de forma permanente. Para ello, será
responsabilidad del Estado: Prevenir y proteger a la población del consumo de
alimentos contaminados o que pongan en riesgo su salud o que la ciencia tenga
incertidumbre sobre sus efectos
El artículo 1 de la ley de sanidad animal codificado y publicado en el
suplemento del registro oficial N° 315 del 16 de abril del 2004, establece que le
corresponde al ministerio de agricultura y ganadería realizar investigaciones
relativas a las diferentes enfermedades, plagas y flagelos de la población
ganadera del país y diagnosticar el estado sanitario de la misma. Estas tareas
las emprenderán planificadamente con la participación de las unidades
administrativas y técnicas, entidades dependientes y adscritas y en estrecha
coordinación con las instituciones públicas o privadas, nacionales o
internacionales vinculadas al sector.
34
3. Materiales y métodos
3.1 Enfoque de la investigación
3.1.1 Tipo de investigación
Esta investigación fue de tipo descriptiva ya que se representó las
caracteristicas de la población a los procesos del faenamiento en el matadero
municipal del cantón El Triunfo.
3.1.2 Diseño de la investigación
Esta investigación tuvo un diseño de tipo descriptiva, obteniendo información
en un tiempo determinado de la población a través de los procesos de
faenamiento en el matadero del Cantón El Triunfo. Los diferentes análisis se
obtuvieron en la población de estudio y sirvió para determinar la presencia de
Mycobacterium bovis en los linfonódulos y tejidos pulmonares, al ser un estudio
observacionales se contempló dentro de los estudios transversales el cual
pretendió a través de un único levantamiento de datos para medir frecuencias de
distribución
3.2 Metodología
La modalidad fue de campo y de laboratorio, porque se determinó la
presencia de micobacterias mediante la observación directa o macroscópica
concernientes a los tubérculos y posterior confirmación en el laboratorio a través
de la técnica del PCR.
3.2.1 Variables
3.2.1.1 Variables independientes
● Sexo
● Edad
35
● Raza
● Tipo de ganado
● Procedencia
● Condición corporal
● Lesiones post morten
3.2.1.2 variables dependientes
⮚ Presencia de Mycobacterium bovis
3.2.2 Recolección de datos
El faenamiento lo realizaban en los horarios de 5 am de lunes a sábado, con
un promedio de animales entre 45 y un máximo de 50 animales por semana en
el camal municipal del cantón El Triunfo, el tiempo de recolección de muestras
fue de un mes con 256 animales faenados con una referencia de 132 muestras.
N= Tamaño de población 200
Z= Nivel de confianza 95% = 1,96%
P= Probabilidad exitosa 0,50
Q= probabilidad esperada 0,5
E= probabilidad de fracaso 0,50
n°= muestra 132
El universo de las muestras son los bovinos faenados en el camal municipal
del cantón El Triunfo.
36
Para el tamaño de la muestra se obtuvo todos los bovinos que fueron
faenados y en quienes se pudo encontrar lesiones relacionadas con la
tuberculosis bovina sin importar edad del animal, este trabajo se realizó en el
camal municipal del Cantón El Triunfo durante 4 semanas de recolección de
muestras y posteriormente el análisis en el laboratorio.
Criterios de inclusión
Que la procedencia fue de la costa y sierra ecuatoriana según las guías de
movilización.
Criterios de exclusión
Animales de otra especie
3.2.3 Recolección de datos
3.2.3.1 Recursos
El análisis se realizó en el Instituto Nacional de Investigación en salud pública
INSPI Dr. Leopoldo Izquieta Pérez.
3.2.3.2 Materiales de laboratorio
⮚ Equipos de laboratorio
● Tubos con tapa enroscable
● Centrifuga
● Microscopio
⮚ Medios de cultivo
● Placas
● Gradillas
● Pipetas
37
⮚ Agares
● Agar Ogawa Kudoh
● Agar Stonebrink
● Mycobacterias
⮚ Otros suministros
● Papel de despacho
● Hisopos estériles
● Marcadores permanentes punta fina
● Guantes
● Mascarillas
● Cofia
● Reloj
3.2.4 Las técnicas para la detección microbiológica de las bacterias
fueron:
Toma y manejo de muestras
Se recolectaron las muestras en el camal municipal del cantón El Triunfo y
posteriormente fueron almacenadas y transportadas adecuadamente al
laboratorio del Instituto Nacional de Investigación de Salud Pública INSPI para el
respectivo análisis.
3.3.4.1 Técnica para la siembra de los cultivos de Stonebrink
Protocolo a seguir:
● Se utilizó un tubo estéril de 16 x 150 mm aproximadamente, se adicionó
5 ml de NaOH al 4%, con la misma cantidad de la muestra, luego se
colocó 5 gotas de solución precipitante de BaCl2 y CaCl2.
38
● Se procedió a tapar y agitar fuertemente por un término de
aproximadamente 20 segundos.
o Se llevó a incubación a la estufa a una temperatura de 35 a 37°c
luego de 5 a 10 minutos se agitó el tubo durante 20 segundos, se
volvió a colocar a la estufa a la misma temperatura durante 50
minutos tiempo total de incubación de 1 hora.
● Se retiró el tubo de la estufa la misma que contiene la muestra
descontaminada y concentrada.
Proceso de siembra:
● Se rotulo las muestras de medio Stonebrink acidificado y enriquecido que
se utilizó para la siembra de la muestra con el nombre, fecha y número de
ingreso al laboratorio.
● Se extrajo del fondo de los tubos, esto con la finalidad de evitar la
contaminación y precipitación de la muestra unos 2 ml del precipitado e
inoculado de 0,5 ml de cada tubo del medio Stonebrink acidificado y
enriquecido.
● Se realizó la rotación de los tubos para una mejor distribución homogénea
de la muestra, la incubación en aerobiosis a 35 – 37 °C.
3.2.4.2 Técnica de siembra de los cultivos de Ogawa.
Este medio está conformado por sales como: fosfato monopotásico, fosfato
disódico anhidro, citrato de Magnesio, sulfato de Magnesio, glutamato de Sodio,
glicerol, verde de malaquita, homogenizado de huevo; el pH fue de 6.4, se
necesitó de inclinación para la coagulación a una temperatura de 78 °C, más o
39
menos 2 °C, durante 45 a 60 minutos aproximadamente. Este medio es el más
usado a nivel clínico ara el aislamiento del Mycobacterium tuberculosis.
Protocolo 1 a seguir:
● Se preparó la campana de flujo utilizando el papel de despacho en la base
de la lámpara.
● Dentro de la campana de flujo se colocó todas las muestras.
● Se adiciono agua destilada estéril a todas las muestras mientras se
procedía a macerar.
● Con la ayuda de un hisopo estéril se tomó la muestra evitando la
formación de grumos envolviéndolos en puntos diferentes del tubo para
abarcar toda la muestra
● Se colocó el hisopo con la muestra extraída del tubo de soda al 4 %
durante unos 5 minutos, aunque inicialmente se utilizó soda al 3% durante
3 minutos sin obtener éxito.
● Se procedió a retirar el hisopo con la muestra tomada del tubo de soda y
se introdujo en el fondo del medio del cultivo sin tocar el agar, luego se
procedió a la realización de la siembra hacia arriba y en formas de estrías.
● Se retiró los hisopos siendo descartados en un envase con cloro.
● Se colocó los envases en la estufa a una temperatura de 37°C de forma
horizontal semi tapados.
● Estos tubos permanecieron en la estufa durante 24 horas de forma
horizontal, transcurrido el tiempo se procedió a levantar los tubos y
cerrarlos definitivamente permaneciendo en la estufa a la mismo a
temperatura durante dos días más hasta que presenten crecimiento.
40
Protocolo de tinción.
● Se rotulo las placas utilizadas.
● Se colocó con la ayuda de una pipeta Pasteur una gota de agua destilada
estéril en cada placa portaobjeto.
● Se tomaron los hisopos estériles con la arte a maderada se procedió a
coger las colonias para la observación.
● Siendo colocadas la colonias en placas y se homogenizo.
● Se esperó que las placas se sequen completamente para colocar el papel
filtro cortado previamente.
● Se colocó las placas en el soporte, debajo del grifo.
● Se procedió a colocar fucsina con la ayuda de la pipeta Pasteur hasta la
completa cubrición de las placas durante 5 minutos durante este tiempo
se realizó el flameados con la ayuda del mechero hasta la observación de
las 3 emisiones del vapor hasta la culminación del tiempo.
● Durante la culminación con la ayuda de una pinza se procedió a retirar el
papel filtro de las placas y se enjuago con un chorro de agua débil, sin
que el agua caiga directamente para evitar dañar la tinción.
● Las placas se colocaron nuevamente en el soporte de las placas y se
adiciono alcohol con la pipeta Pasteur durante 2 minutos, transcurrido el
tiempo se enjuago.
● Nuevamente se coloca las placas en el soporte y con la ayuda de la pipeta
se adiciono azul de metileno trascurrido el tiempo se enjuaga.
● Se dejó secar las placas.
● Una vez secas las placas se colocó una gota de azul de metileno en el
centro y se procedió a observar en el microscopio en lente 100x.
41
Protocolo de siembra
● Se procedió a preparar la cabina colocando en el piso papel de despacho.
● Se colocó los tubos a resiembra y los tubos donde se cogieron las
colonias.
● Se procedió a rotular los tubos de resiembra.
● Con la parte algodonada del hisopo se tomó nuevamente las colonias que
se deseó resembrar para evitar tocar otras colonias ya que se pudo
contaminar la muestra.
● Se colocó el hisopo con las colonias en hidróxido de Sodio al 4% durante
5 minutos.
● Se retiró el hisopo tratando de escurrir por unos minutos evitando
derramar la soda para no dañar el nuevo cultivo se introdujo en el fondo
del agar y se realizó la siembra de arriba hacia abajo en forma de estrías.
● Se retiró el hisopo y de descarta en un envase de alcohol al 5%.
● Se colocó en la estufa los tubos sembrados a una temperatura de 37°C,
de forma horizontal y semi tapados.
● Los tubos sembrados permanecieron durante 24 horas de forma
horizontal durante este tiempo se levantaron los tubos tapándolos
completamente revisándolos cada 2 días hasta observar cambios o
crecimiento.
Materiales
● Tubo de vidrio con rosca
● Matraz
● Asa de plásticos
● Mascarilla 3 M
42
● Microscopio
● Gradillas
● Guantes
● Equipo de disección
4.2.4.3 Método del PCR – LAMP
Obtención de resultados
● Una vez confirmada la presencia del Mycobacterium spp, mediante frotis
del cultivo, se procedió a recoger el material genético de las colonias con
la ayuda de la aza y almacenarlo en viales, uno con TE buffer tris y EDTA
y la otra con crio tubo para preservarlos a -8°C, siendo alma cenados para
la posterior ampliación y determinación de Mycobacterium.
Muestras
● Parte de las muestras recolectadas en el camal para la realización del
cultivo, aproximadamente 1cm3, se colocó en un contenedor con 9 ml de
la solución alcohólica para la preservación e inactivación con agentes
caotrópicos, quelantes y reguladores del pH, permitió reducir el riesgo de
exposición de las micobacterias viables y se mantuvo estable el material
genético. Una porción de 50 mg aproximadamente se con servo para
luego ser procesada para obtención del material gen ético total
Amplificación
● Para la evaluación la calidad del material genético obtenido y la factibilidad
de ser amplificado se incluyó el control del proceso que considero la
identificación del material genético del bovino mediante el ensayo del PCR
43
LAMP. Para la detección del material genético del Mycobacterium bovis y
su distinción de otros miembros del complejo M. tuberculosis en particular
este agente se amplifico regiones de su genoma común a los del complejo
M. tuberculosis correspondiente a la secuencia de inserción IS6110.
Detección
● Para la observación de los 4 ensayos de amplificación mediante el PCR
LAMP, se realizó una resolución de todas las reacciones en geles de
agarosa teñidos con SYBR, y la adición directa de SYBR Green al tubo
con la reacción, lo observado se documentó mediante las imágenes para
la evaluación e interpretación.
2.2.3 Análisis estadístico
Para la evaluación de este trabajo investigativo se consideró toda la
información de cada muestra de los animales con el respectivo número de
identificación en una hoja de Excel para la incorporación de los datos. Se calculó
la mediadas de frecuencia absoluta y relativa con los respectivos gráficos
estadisticos lo cual constato según la hipótesis se realizó la prueba del Chi-
cuadrado considerando el nivel de confianza de 95%.
44
4. Resultados
4.1 Frecuencia de las lesiones compatibles con tuberculosis.
Tabla 1: Porcentaje de bovinos muestreados según las lesiones post morten.
FRECUENCIA PORCENTAJE
SIN LESIONES 100 75.19%
CON LESIONES 33 24.81%
TOTAL 133 100%
(Calle, 2019
En la tabla Nº1, se detalla el porcentaje de las frecuencias de los bovinos
inspeccionados que presentaron o no lesiones post morten de uno o varios
ganglios de los cuales se obtuvo un 75.19% de ganglios sin lesiones
correspondiente a 100/133 y un 24.81% de ganglios con lesiones
correspondientes a 33/133.
Tabla 2: Porcentaje y frecuencia de los bovinos muestreados según el sexo.
FRECUENCIA PORCENTAJE
HEMBRAS 21 63.64%
MACHOS 12 36.36%
TOTAL 33 100%
(Calle, 2019)
45
En la tabla Nº2, se detalla el porcentaje y la
frecuencia de la población bovina según en sexo, en
donde 21/33 bovinos hembra obtuvieron el 63.64% y 12/33 bovinos machos
correspondientes a un 36.36%, siendo el sexo hembra quien obtuvo el mayor
porcentaje en el estudio.
Tabla 3: Porcentaje y frecuencia de los bovinos muestreados según la categoría zootécnica.
FRECUENCIA
PORCENTAJE
TERNERO 0 0%
VACONA 4 12.12%
TORETE 7 21.21%
VACA 13 39.39%
TORO 9 27.28%
TOTAL 33 100%
(Calle, 2019)
En la tabla número 3, se describe la frecuencia y el porcentaje del muestreo
según la categoría zootécnica, obteniendo el menor porcentaje según la
frecuencia la categoría de los terneros con un 0.0%, seguido de las vaconas con
4/33 Frecuencias correspondiente a un 12.12%, categoría de los toretes con
7/33 frecuencias correspondientes al 21.21%, categoría de los toros con 9/33
frecuencias correspondientes al 27.27%, y con mayor porcentaje según el
46
estudio lo obtuvo la categoría de las vacas con una frecuencia del 13/33
correspondiente a un 39.39%.
Tabla 4: Porcentaje y frecuencia de los bovinos según el propósito.
FRECUENCIA
PORCENTAJE
LECHE 9 27.28%
DOBLE PROPÓSITO 12 36.36%
CARNE 12 36.36%
TOTAL 33 100%
(Calle, 2019)
En la tabla Nº4, se detalla la frecuencia y el porcentaje que se obtuvo según
el propósito de los animales utilizados en el estudio, obteniendo el menor
resultado los bovinos de leche con una frecuencia de 9/33, correspondiente a
un 27.28%, mientras que los animales de doble propósito y de carne obtuvieron
similitud en los resultado con frecuencias de 12/33 correspondiente al 36.36%.
47
Tabla 5: Porcentaje y frecuencia de los bovinos muestreados según la procedencia.
FRECUENCIA
PORCENTAJE
CAÑAR 10 30.30%
BUCAY 2 6.06%
RCTO EL PIEDRERO
(EL TRIUNFO)
17 51.52%
ALAUSÍ 4 12.12%
Total 33 100%
(Calle, 2019)
Según los resultados de frecuencia y porcentaje de los bovinos muestreados
por procedencia detallados en la tabla 5, se obtuvo mayor frecuencia procedente
del recinto el Piedrero perteneciente al cantón El Triunfo con 17/33 casos
correspondiente al 51.52%, seguido de la provincia de Cañar con10/33 animales
correspondiente al 30.30%, y con menor porcentaje de procedencia tenemos al
cantón Alausi con 4/33 bovinos correspondiente al 12.12% y cantón Bucay con
2/33 frecuencias correspondiente al 6.06%.
48
4.2 Presencia de Mycobacterium bovis mediante cultivo
bacteriológico y prueba de PCR – LAMP
Tabla 6: Aislamiento positivo por medio de cultivos.
+ / - FRECUENCIA PORCENTAJE
Medio de cultivo Stonebrink ST(A) Positivo 2 6.06%
Negativo 31 93.94%
Total 33 100%
Medio de cultivo Stonebrink ST(B) Positivo 3 9.09%
Negativo 30 90.91%
Total 33 100%
Medio de cultivo Okawa Kudoh OK (A) Positivo 2 6.06%
Negativo 31 93.94%
Total 33 100%
Medio de cultivo Okawa Kudoh OK (B) Positivo 0 0.00%
Negativo 33 100%
Total 33 100%
TOTAL 132 100%
(Calle, 2019)
49
En la tabla Nº 6 se detalla el aislamiento según los medios de cultivos
duplicados en A y B con la finalidad de evitar errores por contaminación de la
muestra; en donde se identifica que el medio Stonebrink B presento mayor
número de proporción de los aislamientos positivos en mención con un 9.09%
3/33, seguido del medio de cultivo Stonebrink A y el medio Okawa A con similitud
de resultados positivos de 2/33 correspondiente al 6.06%, y el de menor número
de positivo lo encontramos en el medio Okawa B con 0.0%.
Tabla 7: Crecimiento de las colonias según los medios de cultivos utilizados.
MEDIO DE CULTIVO
SEM COLONIAS FRECUENCIA
% TOTAL
M1 M2 M10 M17 M18 M19
SL 126
STONEBRINK ST (A) N: 133
1 1 10
8.27%
2 2 1.50%
3 1 0.75%
4
5
STONEBRINK ST (B) N: 133
1 1 1 2 3%
2 5 3.80%
3
4
5
OKAWA OK (A) N: 133
1 3 3 4.51%
2 3 2.26%
3 2 1 2.26%
4
5
Total 4 6 10 7 1 7 0
Porcentaje %
3 4.51 7.51 5.26 0.75 5.26 94.74
(Calle, 2019)
50
En la tabla Nº 7 se describe el tiempo de aislamiento de las colonias según
las semanas de desarrollo, identificando la mayor proporción en menor tiempo,
en la semana 1 del medio Stonebrink A con 8.27%, seguido de la proporción de
la semana 1 del medio Okawa A con 4.51%, seguido de la semana 2 del medio
Stonebrink B con 3.80% de proporción, seguido del medio Okawa A en la
semana 2 y 3 con similitud de proporción de 2.26%, seguido del medio
Stonebrink de la semana 2 con 1.50% de proporción y la de menor proporción
fue el medio Staonebrik A con 0.75%.
Tabla 8: Aislamientos positivos y negativos de los medios de cultivos Stonebrink y Okawa, y el método microbiológico PCR – LAMP.
FRECUENCIA
PORCENTAJE
CULTIVO STONEBRINK
ST (A/B)
Positivos 5 15.15%
Negativos 28 84.85.%
Total De Muestras 33 100%
CULTIVO
OKAWA
OK
Positivos 2 6.06%
Negativos 31 93.94%
Total De Muestras 33 100%
PCR – LAMP Positivos
Negativos
(Mycobacterium atípicas)
7/33
100%
Total De Muestras 33 100%
(Calle, 2019)
51
En la tabla Nº8 se destalla que se obtuvieron mediante el método Stonebrink
5/33 que equivale al 15.15% muestras positivas y 2 /33 equivalente al 6.06%
muestras del medio Okawa positivas, realizándose el PCR – LAMP a las 7/33
correspondiente al 21.22% muestras positivas específicas para el desarrollo del
Mycobacterium bovis de las cuales dio como resultado 0.0% positivas y
confirmando que de los 7 aislados son Mycobacterium atípicas.
4.3 Hallazgos anatopatológicos con los casos positivos
Tabla 9: Características de las lesiones macroscópicas positivas.
Ganglios Hallazgos Anatopatológicos
N=7/133 Lesiones
pulmonares
G. Cervicales G. Retrofaringeos G. Mediastinos
M1
X
Ganglios con aumento de tamaño y pequeños tuberculos de tipo caseoso
M2
X
Nodos de color grisáceo o amarillento
M10
X
Se encontraron abscesos generalizados en todo el parénquima pulmonar
M
17
X
Superficie serosa, se observaron nódulos firmes de 2 – 10 cm de diámetro.
M18
X
Ganglios con aumento de tamaño y pequeños tuberculos de tipo caseoso
M19
X
Ganglios con aumento de tamaño y pequeños
(Calle, 2019)
52
En la tabla Nº 9 se detallan las lesiones macroscópicas de las 7/133 muestras
positivas o sospechosas a Mycobacterium bovis de las cuales fueron extraídas
de los ganglios cervicales, retrofaríngeos, mediastinos y tejido pulmonar con los
hallazgos anatopatológicos de cada tejido característicos de la enfermedad
como tubérculo o granulomas entre otros.
53
5 Discusión
La tuberculosis bovina es una enfermedad crónica infecciosa causada por
Mycobacterium bovis. Esta enfermedad tiene repercusión socioeconómicas
y para la salud pública, y de principal preocupación en las comunidades
rurales. Además de la reducción de la productividad del ganado infectado y
la posibilidad de decomiso de la canal en el momento del sacrificio, el
consumo de carne cruda infectada o leche no pasteurizada,) aumenta el
riesgo de transmisión zoonótica de M. bovis a humanos en estas
comunidades. No existe un control oficial eficiente de la tuberculosis bovina
a nivel nacional, por lo tanto, la inspección rutinaria de la carne en los
mataderos municipales representa el primer punto de detección de esta
enfermedad. Es de destacar que no todos los animales son sacrificados en
los mataderos municipales; por lo tanto, hay una proporción desconocida de
animales sacrificados que no se someten a inspección de carne; en el estudio
transversal de Pakasi y colaboradores realizado en el matadero municipal del
distrito de Mubende, Uganda entre agosto de 2013 y enero de 2014, para
determinar la prevalencia de Mycobacterium, realizaron un examen físico de
todos los animales antes del sacrificio para obtener datos sobre la edad, sexo
y cruzas (Ankole-Sanga, cebú africano oriental, cruz frisona) se recogieron
ganglios que mostraban características patológicas generales: aumento de
tamaño, cambios de color y textura de granulación, calcificación y / o
caseación. 153 animales presentaron lesiones similares a la tuberculosis
bovina, observaron que la mayoría de las lesiones similares a la tuberculosis
bovina estaban localizadas anatómicamente en la región torácica. Éstos eran
principalmente de los ganglios linfáticos bronquiales y mediastínicos. La
54
mayoría de estas lesiones eran partículas caseosas calcáreas y de grano
incrustadas dentro de las lesiones de color amarillo intenso a marrón. Esta
textura similar a un grano se sintió particularmente al deslizarse a través de
la lesión. En general, se encontraron 153 (9,7%, IC 95% 8,3–11,3) lesiones
similares a la tuberculosis entre las 1.576 canales inspeccionadas (Nalapa,
Muwonge, Kankya, & Olea-Popelka, 2017), en cambio en este trabajo
realizado en el matadero municipal del cantón El Triunfo se muestreo 133
animales y 33 tuvieron el patrón compatible a tuberculosis. Continuando con
el trabajo de Nalapa se aislaron bacterias del género Mycobacterium de 13
lesiones similares a la tuberculosis bovina. Dada esta muestra relativamente
pequeña. El análisis de laboratorio muestra que en 13 (8,4%) de 153 lesiones
similares a la tuberculosis bovina pertenecían al género Mycobacterium
º1según la prueba de resistencia al ácido y el cultivo de MGIT. Doce (7,8%)
de los 13 fueron confirmados como parte de Complejo Mycobacterium
tuberculosis utilizando el Capillia TB Neo. Dos (1.3%) de los 12 se identifican
tentativamente como Mycobacterium bovis en función de su crecimiento en
MGIT, LJ piruvato y resultado positivo en Capillia TB Neo. Se registró una
tasa de contaminación del 8,5 y del 20% en los sistemas de cultivo líquido
Piruvato LJ y MGIT, respectivamente. En contraste con el trabajo del cantón
El Triunfo de las 33 muestras con patrón de lesión a tuberculosis, siete fueron
positivos a Mycobacterium atípicas. En el trabajo realizado en Uganda por
Nalapa y colaboradores aproximadamente, uno de cada diez bovinos
sacrificados tenía una lesión similar a la tuberculosis bovina identificada
durante la inspección de carne de rutina. Esta prevalencia observada de
patología macroscópica sugestiva de Tuberculosis bovina es más alta que la
55
reportada previamente en otros distritos como Kampala y Masaka. Esta
diferencia en la prevalencia entre Kampala, la capital de Uganda y este
distrito de corredores de ganado, es probablemente un reflejo de un "proceso
de filtración" donde el ganado se traslada a los mataderos urbanos a través
de los mercados de ganado rural (Kampala y Masaka), este proceso
garantiza que solo el ganado con una buena condición corporal son enviados
a mercados donde obtendrán un precio más alto por kilogramo unitario de
carne de res seleccionando indirectamente animales más saludables. Este
fenómeno también se ha observado en Camerún y Etiopía. Aunque la
prevalencia de lesiones similares a la tuberculosis bovina aquí es comparable
a Etiopía, la prevalencia actualmente observada es mayor que el 7,3, 6,7 y
6,4% reportado en Chad, Burkina Faso y Nigeria, respectivamente. Este
escenario en Mubende podría estar contribuyendo al escenario observado
con un contagio a los cerdos, un fenómeno asociado con la alta presión de
transmisión que se ha informado anteriormente en el distrito de Mubende
(Nalapa et al., 2017)
Comparando los resultados del trabajo realizado en Camerún por Egbe y
colaboradores en el 2015, para obtener la prevalencia de lesiones similares a
tuberculosis bovina en el sacrificio de ganado en 4 mataderos municipales de
Camerún. Se recolectaron un total de 316 lesiones similares a tuberculosis
bovina (principalmente de ganglios linfáticos) 201 de los 2,346 animales
inspeccionados. Se recolectó al menos una muestra de tejido de cada animal
que presentaba el patrón de lesión en diferentes sitios anatómicos de la canal.
Además, se recogieron muestras de ganglios linfáticos retrofaríngeos de una
muestra aleatoria de 179 animales aparentemente sanos sin lesiones visibles
56
en los mataderos de Bamenda y Ngaoundere. En general, las lesiones tipo
tuberculosa se observaron principalmente en los ganglios linfáticos
retrofaríngeos, mediastínicos y bronquiales en todos los mataderos. Sin
embargo, cuando se comparan las proporciones relativas, existe una clara
diferencia entre los mataderos con una proporción mucho mayor de lesiones
en los ganglios linfáticos retrofaríngeos en Bamenda (0.376) y Ngaoundere
(0.343), mientras que las lesiones mediastínicas predominan en Garoua
(0.277) y Maroua (0.370). Además, curiosamente, Ngaoundere y Garoua
también tuvieron niveles más altos de lesiones hepáticas (aunque los números
son pequeños) y también fueron mataderos con altas cargas de duelas.
También registraron las cuatro medidas de cambios patológicos y la
comparación de la distribución de las lesiones, el tipo y el tamaño. Esto
sugiere que el patrón y la gravedad de las lesiones fueron diferentes en los
diferentes mataderos y en ambos y los segundos componentes principales
fueron estadísticamente significativamente diferentes (p <0.01) entre
mataderos La mayoría de los animales con lesiones similares a tuberculosis
tenían M. bovis aislado de al menos un ganglio linfático cultivado (150/201) en
comparación con solo 3/179 animales seleccionados al azar sin lesiones
similares a tuberculosis donde se cultivó un solo ganglio linfático retrofaríngeo.
Además, una serie de otras micobacterias también se aislaron de estos
animales incluyendo un animal con M. tuberculosis y 35 con micobacterias no
tuberculosas y 4 animales con infecciones mixtas de M. bovis y no
tuberculosas. El aislado de M. tuberculosis provino de un ganglio linfático
retrofaríngeo no lesionado de un toro, por lo tanto, de los 35 aislamientos
seleccionados con los kits Hain Genotype CM o AS, 32 fueron identificados
57
como Micobacterium no tuberculosos con la especie de 18 de los 32
deducidos, mientras que la especie de 14 no pudo deducirse probablemente
son Micobacterium no tuberculosos. También hubo tres bacilos Grampositivos
que no pertenecían al género Mycobacterium, Los 4 / 2,346 animales que
tenían infecciones mixtas representan una posible prevalencia de ∼ 0.17%
(0.05-0.44) en general. Las cuatro coinfecciones fueron con M. bovis y una de
Mycobacterium no tuberculoso, dos de ellos pertenecían a especies
desconocidas de micobacterias cultivadas en mataderos municipales de
Garoua y Maroua. Los otros 2 fueron coinfecciones con M. phlei y M. fortuitum
en ganado sacrificado en los mataderos municipales de Ngaoundere y
Garoua, respectivamente. (Egbe et al., 2016)
La importancia clínico-epidemiológica de las micobacterias se basa
principalmente en la patogenicidad de algunas especies que causan
enfermedades, como la tuberculosis. Esta infección se transmite a través de
aerosoles que contienen el complejo Mycobacterium tuberculosis, que consta
de las especies M. tuberculosis, M. africanum, M. bovis, M. microti y M. canetti.
En aproximadamente el 11% de los casos, la tuberculosis está relacionada
con la infección con el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH). Aunque la
tuberculosis afecta predominantemente a los pulmones, la inmunodeficiencia
aumenta sustancialmente el riesgo de enfermedad y favoreciendo la
diseminación de tuberculosis extrapulmonar. Las micobacterias no
tuberculosas también causan graves infecciones que son difíciles de tratar.
Su potencial patogénico se destacó por la aparición del VIH y el desarrollo de
técnicas de detección más sensibles y específicas utilizadas en los
laboratorios. Las micobacterias no tuberculosas están ampliamente
58
distribuidas en la naturaleza y pueden aislarse de muestras de agua y suelo.
Las diferentes especies presentan distintos niveles de virulencia y patrones
de susceptibilidad a los medicamentos, y se asocian con diferentes aspectos
clínicos. El complejo Mycobacterium avium está compuesto por bacterias
aeróbicas de crecimiento lento. Se estima que más del 50% de los pacientes
con síndrome de inmunodeficiencia adquirida desarrollan una infección
durante su vida. Por lo tanto, la detección de micobacteremia es una prioridad,
especialmente en pacientes inmunocomprometidos. Se recomienda el
hemocultivo semiautomático en medios líquidos porque favorece el
crecimiento del complejo mycobacterium y M. no tuberculosos. A pesar de los
avances en las metodologías de diagnóstico de mycobacterias, su costo y
accesibilidad siguen siendo factores limitantes. Uso de cultivos líquidos debe
considerarse cuidadosamente, porque son caros y propensos a la
contaminación, a pesar de ser semiautomatizados y altamente sensibles. El
cultivo sólido en Löwenstein – Jensen es una metodología bien establecida y
confiable; por lo tanto, es conveniente probar los beneficios de la
automatización. Analizar los resultados obtenidos en un laboratorio de salud
pública podría ayudar a identificar y definir las metodologías con el mejor
rendimiento.(Costa et al., 2019)
59
6 Conclusiones
Se concluye según los resultados en lo siguiente:
Se rechaza la hipótesis en la cual afirma la prevalencia alta de Mycobacterium
bovis.
Las lesiones que más se presentaron fueron en los ganglios mediastinos y
pulmonares.
El diagnóstico molecular PCR – LAMP dio como resultado Mycobacterium
atípicas y negativo para Mycobacterium bovis.
No creció Mycobacterium en todos los ganglios con patrón de lesión a
tuberculosis.
60
7 Recomendaciones
El Mycobacterium bovis fue el principal objetivo de estudio, basándome en
los protocolos establecidos por el INSPI, se procedió a la realización del estudio
molecular de todas las colonias que se desarrollaron en los cultivos tanto del
medio Okawa y Stonebrink, pero se recomienda realizar las pruebas moleculares
a todas las colonias positivas analizadas en la baciloscopía con la finalidad de
obtener especificidad y sensibilidad de las mismas.
Se recomienda la utilización de la prueba molecular PCR – LAMP, como una
de las principales herramientas para el control de los sistemas de vigilancia
epidemiológica de la enfermedad en cuestión.
Realizar estudios en esta zona de investigación sobre la prevalencia de esta
enfermedad zoonótica considerando que los animales y los humanos se
encuentran en contacto estrecho, y por ende identificar y controlas los factores
de riesgo.
61
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66
9 Anexos
Anexo 1: Inspección post morten de las canales para localizar lesiones macroscópicas compatibles a la tuberculosis bovina.
(Calle,2019)
Anexo 2: Lesión macroscópica de los ganglios a la incisión se observo tubérculos caseosos de color amarillento.
(Calle,2019)
67
Anexo 3: Recolección de muestras de los ganglios y tejidos pulmonares con lesiones macroscópicas con su respectiva rotulación.
(Calle,2019)
Anexo 4: Aislamiento en los medios de cultivos Stonebrink y Okawa
(Calle,2019)
68
Anexo 5: Crecimiento de las colonias en los medios de cultivos
(Calle,2019)
Anexo 6: Preparación de las placas de los aislamientos positivos
(Calle,2019)
69
Anexo 7: Fijación de las placas.
(Calle,2019)
