คมอปฏบตการ

วชาโภชนศาสตรสตวประยกต รหสวชา AG 174 441 (Applied animal nutrition laboratory)

อาจารยผสอน รศ.ดร.กฤตพล สมมาตย ผศ.ดร.วนย ใจขาน ผศ.ดร.สาวตร วงศตงถนฐาน รศ.ดร.อนสรณ เชดทอง อ.ดร.แวววร บญเทยม ดร.วรณ แกวพลา นายปฐมพงษ หลาค า

ประจ าภาคตน ปการศกษา 2564 ภาควชาสตวศาสตร คณะเกษตรศาสตร มหาวทยาลยขอนแกน

สารบญ

หนา บทปฏบตการท 1 กฎระเบยบการใชหองปฏบตการและอปกรณ 1 บทปฏบตการท 2 การเกบตวอยาง การเตรยมตวอยาง และการตรวจสอบคณภาพ

อาหารและวตถดบอาหารสตวขนตน 5

บทปฏบตการท 3 การวเคราะหหาความชน และเถาทงหมด 14 บทปฏบตการท 4 การวเคราะหเถาทละลายและไมละลายในกรด 22 บทปฏบตการท 5 การวเคราะหแคลเซยมและฟอสฟอรส 24 บทปฏบตการท 6 การวเคราะหหาปรมาณเกลอในอาหารสตว 30 บทปฏบตการท 7 การวเคราะหโปรตนหยาบ 33 บทปฏบตการท 8 การวเคราะหไขมน 38 บทปฏบตการท 9 การวเคราะหเยอใยหยาบ 42 บทปฏบตการท 10 การวเคราะหพลงงานรวม 44 บทปฏบตการท 11 การตรวจสารพษในอาหารสตว 49

1

บทปฏบตการท 1 กฎระเบยบการใชหองปฏบตการและอปกรณ

1.1 ขอควรระวงและการปองกนรกษาความปลอดภยในหองปฏบตการ

เจาหนาท นกศกษา หรอผทท างานในหองปฏบตการตองระมดระวงอยเสมอวาอาจจะเกดอบตเหตและอนตรายตาง ๆ ขนไดอยตลอดเวลาขณะท างานในหองปฏบตการ อนตรายทอาจพบอยเสมอเชน ไฟไหมซงอาจเกดจากสารอนทรย จากกรด-เบส ตลอดทงการระเหยของสารพษ อนตรายตาง ๆ เหลานสามารถปองกนไมใหเกดขนได ถาหากผใชงานในหองปฏบตตามกฎระเบยบของหองปฏบตการ และมความระมดระวงเพมมากยงขน

ขอควรปฏบตในหองปฏบตการ 1. รกษาความสะอาดพนทและบรเวณทปฏบตงานหรอท าการวเคราะห ควรจดพนทใหม

ความเหมาะสมสะดวกตอการท างานและสะอาด เพอปองกนอนตรายจากสารเคมตาง ๆ ทอาจจะเกดขนได

2. ไมเลนหรอหยอกลอเลนกบเพอนรวมงานขณะท างานในหองปฏบตการเพราะอาจจะเกดอบตเหตได

3. การใชเครองแกว เครองแกวทแตกหรอแตกราวไมน ามาใชงานอก บกเกอร (beaker, erlenmeyer หรอ conical flask) และ กระบอกตวง (measuring cylinder) ใหผลในการวดปรมาตรไมแนนอน แตควรใชอปกรณวดปรมาตรทมความแมนย ากวา เชน ขวดวดปรมาณ (volumetric flask), บวเรต (buret) และ ไปเปต (pipet)

การใชบวเรต กอนใชงานควรตรวจสภาพกอนวาสามารถใชงานไดสะดวกหรอไม สามารถหมนกอกตรงกบ ground joint ไดดหรอไม

การเกบสารละลายทมฤทธเปนดางจะตองเกบไวในขวดพลาสตกเสมอ หามเกบไวในเครองแกว เพราะดางมคณสมบตกดแกว ซงมผลท าให จกปดแกวและขวดเชอมตดเปนเนอเดยวกนท าใหการเปดจกไมออกได

หลอดทดลองควรเกบไวในทใสหลอด (rack) ในระหวางท างาน การเผาสารเคมในหลอดทดลองควรเตรยมใหสามารถยกออกหรอเคลอนยาย ไดสะดวกเพอปองกนอนตราย

4. การแตงกายในหองปฏบตการ ควรสวมชดท างานในหองปฏบตการใหเรยบรอย รวบหรอมดผมใหเรยบรอย(กรณผมยาว)และใสแวนตาเพอปองกนอนตรายจากสารพษกระเดนเขาตา เมอเคลอนยายอปกรณทยงรอนใสถงมอ (gloves) ใสรองเทาใหเรยบรอย ไมใส

2

รองเทาแตะเพราะอาจท าใหเกดอนตรายได หากสารเคมเกดการรวไหล 5. สารเคมกระเดนเขาตา หรอถกสารเคมรดบนผวหนง เสอผา ตองรบลางออกดวยน า

จ านวนมาก ๆ โดยเรว ถาสารพวกนหกหรอหยดบนพนโตะหรอเกาอหรอพนหอง จะตองรบเชดออกทนท เพราะอาจท าใหเพอนรวมงานไดรบอนตรายภายหลงได ถาไดรบอนตรายรนแรงจะตองรบไปพบแพทยหรอน าผปวยสงโรงพยาบาล

6. เมอท ากรดหรอดางหกหรอหยดลงพน ถาเปนกรดใหใช sodium bicarbonate (ลกษณะเปนเกรดของแขง) โรยทบดานบนและลางดวยน า แตถาเปนสารทมฤทธเปนดางหยดลงพนใหลางดวยน าแลวตามดวยสารละลายกรดอะซตก (acetic acid) เจอจาง

7. การจดบนทกระบชอสารเคมและความเขมขนของสารเคม สารเคมทเตรยมขนมา ควรมการระบไวขางขวดใหชดเจนวาเปนสารอะไร มความเขมขนเทาไหร เพอใหทราบไดแนนอน ไมใชสารเคมทไมมการระบขางขวดอยางชดเจน เพอเปนการปองกนการปนเปอนของสารอน ๆ และการเกดขอผดพลาดในการใชงาน

8. การเคลอนยายสารเคมและอปกรณ อปกรณทมลกษณะเปนแทงยาว เชน บวเรต ควรถอดวยมอขวาแนบตดกบล าตว ใสถงมอเมอเทสารละลาย ใชกรวยเมอตวงของเหลวและละลาย สารและพยายามปองกนการเกดฟองอากาศ ซงอาจกอใหเกดอนตรายได

9. ใชตดดอากาศ Fume Hood ควรมกระจกมองเหนดานในไดสะดวก เมอท างานกบสารเคมทเปนพษ

สงทตองจดจ าไวตลอดเวลาในระหวางการท างานในหองปฏบตการ

ไมสบบหร ไมดมหรอกนอาหาร ไมวงขณะท างาน ทราบทางออกเมอเกดอบตเหต รกษาความสะอาดทท างาน ดบไฟใหสนทกอนเดนออกจากหอง “ชวยเพอนรวมงานในกรณฉกเฉน”

3

1.2 การตรวจสอบความเชอถอผลการวเคราะห

ขอมลทไดจากการวเคราะหทางหองปฏบตการนน มความจ าเปนอยางยงทจะตองมความถกตองและการยอมรบในทางวชาการ สมมตวาเราวเคราะหหาปรมาณโปรตนจากหญาสด โดยอาศยวธการกลน ค าถามมอยวา คาทไดจากการวเคราะหครงนมคาใกลเคยงกบคาความเปนจรงมากนอยเพยงใด ดงนนการทเราสามารถตรวจสอบความเชอถอ หรอประเมนผลการวเคราะหกจะชวยตอบค าถามนนได นอกจากนนแลว ยงอาจท าใหเรามความมนใจในผลการวเคราะหไดมากยงขนอกดวย ความเทยงตรง (Accuracy) ความถกตองของการวเคราะหขอมลทไดวามคาถกตองใกล เคยงกบความเปนจรงมากนอยเพยงใด เนองจากขอมลทางดานวทยาศาสตรชวภาพ จะมความผนแปรและมการเปลยนแปลงอยตลอดเวลา คาทเราวเคราะหไดกบคาความเปนจรงมการเปลยนแปลงอยตลอดเวลาและผลทเราวเคราะหได กบความเปนจรงมความเปลยนแปลงโดยอสระซงกนและกน สงทเปนค าถาม คอ ความเทยงตรงของผลการวเคราะหไดอยางไร 1. การทดสอบกบสารมาตรฐาน (standard) เพอเปนการตรวจสอบความผดพลาดทอาจจะเกดจากวธการหรอเทคนคในการวเคราะห โดยใชสารมาตราฐานเปนตวเปรยบเทยบ เชน การใชยเรยเพอหาปรมาณไนโตรเจน (หารอยละของ recovery) ในการวเคราะหโปรตนในตวอยางอาหาร 2. เปรยบเทยบผลทไดกบผลการวเคราะหจากแหลงขอมล เอกสารตพมพ หรอผลทไดจากการวเคราะหทผานมา โดยปกตแลวผวเคราะหควรใชเทคนควธการตรวจสอบความเทยงตรงทงสองวธเปนประจ าในหองปฏบตการ ความแมนย า (Precision) เปนค าทนกศกษามกจะมความสบสนกบความเทยงตรง (accuracy) ดงนนเราควรท าความเขาใจถงความแตกตางของทงสองค าดงกลาว คาความแมนย าจากการวเคราะหจะหมายถง คาทมคาใกลเคยงกบขอมลทไดมาจากการวเคราะหหลายครง ดงนนความแมนย าทวเคราะหไดถงแมวาจะใหผลใกลเคยงกนมากเพยงใดแตผลนนอาจจะไมถกตองหรอใกลเคยงกบคา ความเปนจรงกได โดยทวไปเราจะใชคาเบยงเบน (deviation) ของการว เคราะหแตละคร งในการวดความแมนย า ซ งความแมนย าจะสามารถวดความถกตอง (repeatability) ไดโดยแสดงในรปของ คาความเบยงเบนมาตราฐาน (standard deviation) หรอ coefficient of variation (CV) ดงแสดงวธการค านวณ และ ตารางท 1 แสดงชวงปกตของการวเคราะหทางเคมและคา CV

Standard deviation = s = ( xi-x)2/n-1

= (xi2 - ((xi)2 ) / n))/n-1

4

ตวอยางผลการวเคราะหโปรตนในอาหารสตว Replicate %CP xi

2 1 17.0 289.0 2 17.5 306.25 3 18.0 324.0

xI = 17.0 + 17.5 + 18.0 = 52.5

xI /n = 52.5/3 =17.5

xi2 = 289.0 + 306.25 + 324.0 = 919.25

(xi) 2 = (52.5)2 = 2756.25

(xi) 2 /n = 2756.25/3 = 918.75

[xi2 - ((xi) 2 ) / n)/n-1] = (919.25 – 918.75)/(3-1) =0.05/2 = 0.25

ดงนน Standard deviation = 0.25 = 0.50 CV = 0.50x100/17.5 = 2.85 % ตารางท 1 ชวงปกตของการวเคราะหทางเคมและคา CV ทเชอถอได ใชในการเปนแนวทางประเมนความแมนย าของการวเคราะห

การวเคราะห ชวงปกตของการวเคราะห คา CVทยอมรบได, %

DM 80-100 0.5 Ash 0-20 2.0 CP 5-50 2.0 CF 5-50 3.0 NDF 10-80 3.0 ADF 5-70 3.0 ADL 0-20 4.0 Ca 0-3 3.0 P 0-2 3.0 EE 1-20 4.0 IVDMD 20-80 4.0

Galyean (1997)

5

บทปฏบตการท 2 การเกบตวอยาง การเตรยมตวอยาง และการตรวจสอบคณภาพอาหารและวตถดบอาหารสตวขนตน

วธการเกบตวอยางวตถดบอาหารสตว ส าหรบการเกบตรวจสอบคณภาพและงานวเคราะห การใชตวอยางทเปนตวแทนอยางแทจรงของอาหารทตองการวเคราะห เปนสงส าคญทตองค านงในงานวเคราะห เนองจากวาในการวเคราะหแตละครง เราไมสามารถทจะน าอาหารทงหมดซงมจ านวนมากมาท าการวเคราะหได เราจงตองเกบตวอยางเพยงสวนหนง ซงสามารถเปนตวแทนทดของอาหารทงหมดมาใช เพราะหากผวเคราะหขาดความสามารถหรอบกพรองในการเกบตวอยางทเปนตวแทนทแทจรง จะท าใหผลของการวเคราะหนนใชระโยชนไมได ดงนนวธการเกบตวอยาง (Sampling technique) จงนบไดวาเปนหวใจของงานวเคราะห การทเราจะเกบอาหารไดดนนจะตองอาศยหลกตอไปน

1. ตรวจสอบขนตอนแรกกอนทจะน าวตถดบลงจากรถ เมอผขายน าวตถดบอาหารมาสงให กอนทจะอนญาตใหน าลงจากรถ ควรมการสมเกบ

ตวอยางเพอน ามาตรวจสอบวาวตถดบชนดนนมคณภาพดและตรงตามทเราตองการหรอไม ถาไมดหรอไมตรงกบทตองการ จะไดคนกลบไปโดยไมตองเสยเวลาและแรงงานในการน าขนและน าลง

2. ใชเครองมอในการเกบตวอยาง (Sampling instruments) ใหเหมาะสมกบตวอยางทจะเกบ เครองทนยมใชมดงน

2.1 Thief เปนเครองมอทประกอบดวยหลอดยาว ซงมรใหของเหลวเขาไปทปลายสดใชส าหรบเกบตวอยางทเปนของเหลว เชน น ามน เมอตองการใชน าเครองมอใสตวอยางอาหารทตองการเกบตวอยาง เมอของเหลวขนมาในหลอดจนมระดบเทากบภายนอก กปดปลายหลอดแกวน าเอาตวอยางมาถายใสขวด (รปท 1)

2.2 Sampling tube (หลาว) เปนหลอดทองเหลองยาว 2-3 ฟต เสนผาศนยกลาง 1 นว ทปลายดานหนงจะตบเลกลงเปนรปกรวย และมดามจบอกปลายหนง แลวมชองยาวจากปลายจนเกอบถงดามจบเพอใหตวอยางเขา เครองมอชนดนใชกนมากในการเกบตวอยางทเปนของแขงและผง เชน เมลดขาว และนมผง โดยใชเครองน เสยบเขาไปในภาชนะบรรจ เชน ถงหรอกระสอบ เมอตวอยางไหลเขาตามชองไปในหลอดแลวกใหหมนปดชองเสย แลวเอาตวอยางมาใสขวดเกบตวอยาง (รปท 2)

2.3 Trier ใชส าหรบเกบตวอยางทคอนขางขน เชน ไขสตว เนยเหลว หรอเนยเทยม (รปท 3)

2.4 The drill หรอ auger ใชส าหรบเกบตวอยางทคอนขางแขง เชน ตวอยางทแชเยนจนแขง (รปท 4)

6

3. วธการเกบตวอยาง การเกบตวอยางควรเกบจากจดหลายจด โดยเฉพาะจดกลางทมความหนาและน าหนก

กดลงทสด โดยใชหลาว (sampling tube) แทงจากทงดานบนและดานลาง รวมทงการแทงสลบกบระหวางปากและทายกระสอบ การแทงตองแทงใหลกถงกลางกระสอบ โดยเฉพาะอยางยงวตถดบทมกมปญหา เชน ปลาปน กากถวเหลอง และขาวโพด เกบตวอยางใหมากเกนพอ หลงจากนนน าไปรวมกนเพอจะท าการลดขนาดตวอยางในขนตอนตอไป

4. วธการแบง เพอลดขนาดตวอยาง (quartering) เมอการเกบตวอยางจากจดตางๆ จนไดจ านวนตวอยางมากเกนความตองการ ตองมการ

ลดขนาดตวอยางลงใหพอส าหรบใชในการวเคราะห โดยเทตวอยางทงหมดลงบนถาดพนเรยบ หากวตถดบนนมเนอหยาบควรบดใหละเอยดเสยกอน จากนนผสมตวอยางทเกบมาไดให เปนเนอเดยวกน แลวเกลยตวอยางทผสมเขากนแลวใหกระจายทวภาชนะเปนวงกลมหรอสเหลยม ใชไมบรรทดปาดผวหนาใหเรยบเสมอกนแลวแบงตวอยางออกเปน 4 สวนเทาๆ กน เลอกเฉพาะสองสวนทอยตรงขาม จากตวอยางรปท 5 เกบในสวนท 1 กบสวนท 4 (สวนหมายเลข 2 และ 3 ไมใช แยกออกไป) แลวน ากลบมาผสมกน แลวแบง 4 สวนอกครง ท าการสมและแบงตวอยางเชนเดมจนกระทงไดตวอยางตามปรมาณทตองการตรวจสอบ โดยทวไปควรเกบตวอยางไว 200-300 กรม หรอ ½ กก. เปนอยางนอย เกบใสขวดตวอยางทแหง สะอาดและมฝาปดสนท

1

2

3

4

รปท 5 การแบงและต าแหนงในการเกบตวอยางอาหาร

5. การเกบผสมและเกบตวอยางของเหลว ตวอยางทเปนของเหลวจะตองผสมใหเขาเปนเนอเดยวกนโดยการเขยา หรอกวนใหเขา

กน หรอเทผสมกลบไปกลบมา โดยใชภาชนะอนชวยในการผสมควรใชตวอยางทนทหลงจากทไดผสมแลว

7

6. การปดฉลากบนภาชนะใสตวอยาง (labeling) ในการเกบตวอยางเพอสงมาวเคราะห ควรจะไดมการบนทกรายละเอยดตางๆ ของ

วตถดบชนดนนๆ ทกครง ซงในการบนทกนอาจเขยนไวทฉลากหรอขวดตวอยางทงหมด หรอเขยนเฉพาะรหสตวอยางไวทฉลาก สวนรายละเอยดอนๆ ใหบนทกแยกไวในระบบจดเกบขอมลหรอสมดบนทกการรบตวอยาง

ขอมลตางๆทควรบนทกไดแก ชนดของตวอยาง แหลงของตวอยาง วนเดอนป ทเกบตวอยาง ความตองการในการวเคราะห วนเดอนป ทตองการวเคราะห วธการวเคราะห ชอผขาย ผสงตวอยาง (ในกรณทรบบรการวเคราะหตวอยาง) ขอตกลงหรอการรบประกนจากผขาย เชน ราคา/เปอรเซนตโปรตน ฯลฯ ดงตวอยางรปท 6

ตวอยาง : ขาวโพด แหลง : โรงอาหารสตว KKU ว/ด/ป : 21 กรกฎาคม 2560 รายการวเคราะห : DM, Ash, CP, EE, Urea วธวเคราะห : Proximate analysis, Kit test ผสงตวอยาง : ฟารมนาดน

รปท 6 ตวอยางฉลากในการเกบตวอยางอาหาร

การเกบรกษาตวอยาง

การเกบรกษาตวอยางส าหรบการตรวจสอบ มความส าคญมาก หากเกบรกษาไมถกตองท าใหตวอยาเปลยนสภาพไปจากเดม อาจท าใหผลการตรวจสอบคลาดเคลอนไปจากความเปนจรงซงจะมผลไปถงการตกลงราคา และการใชค านวณสตรอาหารดวย

การเกบตวอยางทถกตองควรเกบไวในทแหงและเยน ดงนนการเกบตวอยางในหองปรบอากาศหรอเกบไวในตเยน (อณหภมประมาณ 4 องศาเซลเซยส) จงท าใหสามารถเกบตวอยางไวไดนานกวาในอณหภมหองปกต แตในกรณทตวอยางเปนวตถดบทมความชนสง พชหมก พชสด หรอตวอยางทเปนของเหลว ตองเกบไวในชองแชแขงของตเยนโดยเรวทสด หลงจากสมตวอยาง เพราะตวอยางพวกนจะเสอมคณภาพเรวมากในอณหภมปกต

ขอควรระวงในการเกบตวอยาง อยาใหมความชนหรอการปะปนของวตถดบอนมาในตวอยางในระหวางการเกบ และอยาใหใหมการแยกสวนของตวอยางทสมหรอลดขนาดตวอยาง

8

อายการเกบรกษาตวอยาง อายในการเกบรกษา ขนอยกบชนดและสภาพของวตถดบโดยเฉพาะอยางยงคอ ความชน ตวอยางทเกบไวในทแหงและเยนอาจเกบไวไดนานถง 6 เดอน แตถาจะใหไดผลดควรตรวจสอบตวอยางใหเรวทสด หลงจากเกบสวนตวอยางทตรวจสอบแลว ไมควรรบรบน าไปทง ควรเกบไวอกประมาณ 1-2 เดอน หากมปญหาเกดขนจะไดน ามาตรวจสอบไดอก การสงตวอยางไปยงหองปฏบตการเพอวเคราะหหรอตรวจสอบ เมอเกบและลดขนาดตวอยางเรยบรอยแลว ควรบรรจใสถงพลาสตกหนาๆ หรอบรรจ 2 ชน ปดปากถงใหแนนใหมอากาศเหลออยนอยทสดและหอหมดวยกระดาษอกครง เขยนชอตวอยางและรายละเอยดทจ าเปนไวทถง และมส าเนาขอมลนนเกบไวทหนวยงานของผสงตวอยางดวยเพอใชประกอบการพจารณา เมอเตรยมตวอยางและแจงรายละเอยดสงทจะสงตรวจสอบแลว รบน าสงหองหองปฏบตการใหเรวทสดเทาทจะท าได แตหากสงตวอยางทางไปรษณย ควรบรรจตวอยางใหแนนหนาหรอหอหมดวยวสดกนกระแทกเพอปองกนไมใหเกดความเสยหายทอาจเกดขนขณะขนสง วธการตรวจสอบคณภาพวตถดบอาหารสตว

ส าหรบการตรวจสอบคณภาพวตถดบอาหารสตวชนดตางๆ นน มหลายวธดวยกน ซงอาจจะใชวธใดวธหนงหรอหลายๆ วธประกอบกนสดแตเครองมออปกรณ และสารเคมทมหรอพอจะหามาใชได วธการทแนะน าใหใชส าหรบหองปฏบตการวเคราะหและตรวจสอบคณภาพวตถดบทวๆ ไปคอ

1. การตรวจสอบโดยใชประสาทสมผส 2. การตรวจสอบโดยใชกลองก าลงขยายต า (7-14 เทา) 3. การใชสารเคมตรวจสอบอยางงายๆและรวดเรว 4. การวเคราะหโภชนะโดยประมาณ (proximate analysis)

การวเคราะหโดยประมาณ (Proximate analysis) ซงไดแก การวเคราะหหาเปอรเซนต ความชน โปรตน ไขมน เถา เยอใย และคารโบไฮเดรตทยอยงาย รวมทงธาตแคลเซยม และธาตฟอสฟอรส เปนวธการทยอมรบกนทวไป ผลทไดจากการวเคราะหน าไปใชประโยชนตางๆ เชนการก าหนดมาตรฐานคณภาพของวตถดบชนดตางๆ ใชเปนขอมลเพอใชค านวณสตรอาหารสตว และการตกลงราคาในการซอ-ขายวตถดบชนดนนๆ เปนตน อยางไรกตามขอดอยของวธนคอจ าเปนตองอาศยเครองมออปกรณ สารเคมหลายชนด มคาใชจายสงตามจ านวนตวอยาง ดงนน การดดแปลงวธการโดยอาศยหลกการทางเคมมาใชเพอใหสามารถตรวจสอบไดอยางงายและรวดเรวขน แมวาจะใหผลลกษณะคณภาพ (Qualitative) แตกชวยใหสามารถตดสนใจในการเลอกซอหรอใชวตถดบตางๆ ได

9

รวดเรวและดพอสมควร แตขอดอยคอตองมความเชยวชาญมประสบการณและตรวจสอบขอมลททนสมยตลอดเวลา ซงหากตองการผลการวเคราะห เปนตวเลขทแนนอนในลกษณะปรมาณ (Quantitative) เพอประโยชนอยางอน อาท การตอรองราคา หรอการใชในการค านวณสตรอาหาร จงอาศยการวเคราะหโดยประมาณ

ดงนนแนวทางการปฏบตส าหรบการตรวจสอบคณภาพของอาหารและวตถดบอาหารสตวหากมเครองมอ อปกรณ และสารเคมทสามารถท าไดทง 4 วธขางตนกตาม เลอกใชวธตรวจสอบจากงายไปหายาก คอจากวธท 1 ไปจนถง 4 ตามล าดบ เพราะวตถดบบางชนดหรอบางตวอยางนนเพยงแตใชวธงายๆ กสามารถบอกคณภาพไดอยางคราวๆ เชน เมอตรวจพบวามการปลอมปนในวตถดบชนดนนๆ เกนมาตรฐานทก าหนดหรอเปนอนตรายและคาดวาจะเกดความเสยหายหากน ามาใชกไมควรรบวตถดบนนไวแลว และไมจ าเปนตองตรวจสอบตอไป เพราะนอกจากจะชวยประหยดคาใชจาย ยงท าใหสามารถทราบผลการตรวจสอบไดอยางรวดเรวและทนตอเหตการณอกดวย

10

บทปฏบตการท 2.1 การตรวจสอบคณภาพทางกายภาพ ในการตรวจสอบคณภาพวตถดบอาหารสตว สามารถตรวจสอบไดตงแตเรมเกบตวอยางจากกองหรอจากกระสอบวตถดบ โดยตองสงเกตวาตวอยางทสมมาลกษณะดงนหรอไม

1. ตวอยางวตถดบ ภายในกระสอบเดยวกนหรอในแตละกระสอบมความสม าเสมอกนหรอไม ถาวตถดบเสมอกนทงหมดกเกบตวอยางไวตรวจได แตถาไมสม าเสมอตองจดบนทกไวอยางละเอยด

2. ตวอยางวตถดบแตละกระสอบมลกษณะใดผดปกตจนสงเกตได ถามกควรบนทกไวเชนเดยวกน อาท ลกษณะเปยกชน มเชอราขน มส/กลนผดปกต มเมลดพชอนหรอวตถดบชนดอนปนมา ฯลฯ การสงเกตลกษณะตางๆ ใน 2 ขอน สามารถท าไดโดยไมตองใชเครองมอพเศษใดๆ นอกจากประสาทสมผสของผเกบตวอยางซงสามารถเรยนรไดไมยากนก เพยงแตตองเปนคนชางสงเกตและจดจ าลกษณะตางๆ ของวตถดบแตละชนดไว ผทท าเปนประจ าจนมความช านาญจะสามารถบอกผลไดคอนขางถกตองและแมนย าพอสมควร วธการในการตรวจสอบคณภาพโดยใชประสาทสมผส ท าไดโดยการน าตวอยางมาเทใสในฝามอเพอ

1. ใชมอสมผสดความชน ลกษณะของเนอวตถดบ การจบตวเปนกอน ความหนกเบาของวตถดบเปนตน

2. ใชตาพจารณาถงลกษณะรปราง ส ขนาด เนอวตถดบ สงเจอปนอนๆ รวมทงเมลดเสยและเมลดทถกท าลาย

3. ใชจมกดมกลนวาสด (ความเกาใหม) หรอไม มกลนเหมนเนา บด เปรยว ฉน หน อบ ซงมกเกดจากปจจยตางๆเชน สงปลอมปนมา การเกบวตถดบไวนานจนเกดกลนหนของน ามนหรอเกดกลนอบจากเชอรา หรอเกดจากกลนของยาฆาแมลง

4. ใชลนสมผสเพอชมรส ซงสามารถบอกถงคณภาพของวตถดบชนดนนได เชน ร า ละเอยด กากถวเหลอง ฯลฯ แตควรกระท าอยางมวจารณญาณและมความเชยวชาญ วธการตรวจสอบโดยการใชประสาทสมผสตางๆ ดงกลาวนน นบเปนวธทคอยขางงายเพยงแตผตรวจสอบมความรประสบการณมาบาง กสามารถตรวจสอบได อยางไรกตามมนกอาหารสตว และนกเคมอกเปนจ านวนไมนอย ทไมสนบสนนใหใชวธน โดยใหเหตผลวาการตรวจสอบบางอยาง เชน การดมกลน หรอชมรส วตถดบบางชนดเปนการเสยงอนตรายมากเกนไป ทงนเพราะ อาจมสารเคม ยาฆาแมลง ยากนเชอรา สารพษจากเชอรา ฯลฯ หลงเหลอหรอปะปนมาโดยเจตนา หรอไมกตาม สงเหลานลวนเปนอนตรายและบนทอนสขภาพของผทตรวจสอบ

11

การใชกลองจลทรรศนก าลงขยายต า อปกรณ

1. กลองจลทรรศนก าลงขยายต า หรอกลองสเตอรโอไมโครสโคป สวนใหญจะมก าลงขยายตงแตประมาณ 7-40 เทา คอ ประกอบดวยเลนซใกลตว ก าลงขยายต า 10 เทา และเลนซใกลวตถก าลงขยายเปนแบบตอเนองตงแต 0.7-4 เทา

2. หลอดไฟฟาส าหรบสองวตถดบ อาจเปนหลอดไฟทสามารถปรบระดบความเขมของแสงไดหรออาจใชหลอดไฟธรรมดา ซงถาใชหลอดไฟสน าเงน หรอมแผนกรองแสงสน าเงน จะเหนสของตวอยางเปนธรรมชาตมากขน

3. จานแกวส าหรบใสตวอยาง (Petri dish) 4. ตะแกรงส าหรบรอนแปงทวไป หรอกระชอนเลกๆ ส าหรบการกรองกากชา 5. ถาดอลมเนยมส าหรบรองรบตวอยางขณะรอน 6. เขมเขยปลายแหลมส าหรบเขยตวอยาง 7. คมคบปลายแหลมใชส าหรบคบชนตวอยาง ชอนขนาดเลกส าหรบตกตวอยาง

วธการ 1. เรมจากการตกตวอยางทตองการดประมาณ 1 ชอนชาใสลงบนตะแกรงรอนเพอแยกสวน

โดยจะได 2 สวนคอสวนละเอยดทลอดผานตะแกรงและสวนหยาบ (สวนทไมผานตะแกรง) ในขณะทรอนสวนละเอยด ใหรอนลงบนจานแกว โดยพยายามกระจายตวอยาง ซงไมจ าเปนตองใชทงหมดเชนกน เพราะถาตวอยางมากเกนไป จะท าใหดไดไมชดเจน

2. น าจานแกวใสตวอยางทรอนผานตะแกรงและน าจานตวอยางทรอนแลว วางลงทฐานส าหรบวางตวอยางของกลองสงเกตวาจะมแผนวงกลมใหเลอกใชได 2 ดาน ดานสขาวใชเมอตองการดตวอยางวตถดบทสเขม สวนดานสด าใชเมอตองการดตวอยางทมสออน

3. ปรบเลนซใกลวตถไปทก าลงขยายต าสด ควรเรมตนสองดตวอยางสวนหยาบกอนคอยดสวนละเอยด โดยเรมจากมมหนงแลวคอยๆ หมนจานไปรอบๆ จนสามารถดวตถดบไดทงหมด หากสวนไหนเหนไมชด อาจใชเขมเขยหรอคมคบตวอยางนนแยกออกมาจากกลม และอาจหมนเลนสใกลวตถดบก าลงขยายใหสงขน พรอมกบปรบโฟกสเพอใหเหนชนวตถดบไดชดเจนขน ขณะเดยวกนกใชคมคบชนวตถดบ เพอทดสอบความแขง/ออนหรอลกษณะอนๆ ของวตถดบได เมอดตวอยางเสรจไป 1 ครง แลวควรท าซ าอก 2 ครง เปนอยางนอยเพอความแนใจ หมายเหต: เทคนดในการใชกลองจลทรรศนกาลงขยายตาสาหรบผเรมตนการใชกลองจลทรรศแบบ 2 ตา ควรฝกมองดวยตาทง 2 ขางโดยคอยๆปรบระยะหางของเลนสตา (จากทเหนเปน 2 ภาพ) เคลอนเขาหากนจนกระทงสามารถมองเหนเปนภาพเดยวควรเวนระยะหางระหวางดวงตาและเลนส

12

สาหรบมองวตถบางเลกนอยการกดกระบอกตาแบบแนบชดกบเลนสวตถหรอหลบตามองกลองแคขางเดยวจะท าใหปวดศรษะ

13

บทปฏบตการท 2.2 การวดหาความหนาแนนของอาหาร (Bulk density) หลกการ ความหนาแนนของสาร สามารถน ามาใชเปนเครองมอในการตรวจสอบความบรสทธของวตถดบ ขนาดของอาหารและสงปลอมปนได หากผวเคราะหมความช านาญและรสวนประกอบทางโภชนาการของอาหารแตละชนด เชน รปราง ส ขนาด ความนม ความแขง เนอ กลนและอนๆ หากวตถดบอาหารสตวหรออาหารมการปลอมปน ความหนาแนนจะเปลยนไปโดยอาจจะสงขนหรอต าลงกได อปกรณ

1. กระบอกตวง (Cylinder) ขนาด 1,000 มลลลตร 2. เครองชงทศนยม 1 ต าแหนง 3. ชอนตกอาหาร 4. ไมบรรทด 5. ถงพลาสตก 6. ถาดอะลมเนยม

วธวเคราะห 1. เทอาหารลงบนถาด คลกเคลาอาหารใหเขากนไดด 2. ใชชอนตกอาหารใสในกระบอกตวงทสะอาดและแหงจนกระทงถงขดบอกถงปรมาตร

1000 มล. เกลยอาหารใหเสมอกน หามใชชอนกดอาหาร หรอเอยง Cylinder หรอเขยาอาหารโดยเดดขาด จากนนเทอาหารออกจากกระบอกตวงใสถงพลาสตกททราบน าหนกแลว

3. ชงน าหนกของอาหารทหกน าหนกถงพลาสตกและบนทกขอมล 4. ท า 3 ซ า ไมควรใชตวอยางอาหารชดเดมยกเวนในกรณทตวอยางมจ ากดแลวน าไป

ค านวณตามสตร การค านวณ ความหนาแนน (Bulk density) = B A B = น าหนกตวอยาง (กรม) A = ปรมาตรกระบอกตวงทใชวด (เชน 1 ลตร, 0.5 ลตร)

14

บทปฏบตการท 3 การวเคราะหหาความชนและเถาในอาหารสตว (Moisture and Ash)

3.1 การวเคราะหหาความชน หลกการ การวเคราะหหาความชนในอาหารสตว มวธการวเคราะหไดหลายวธ แตละวธมความยากงาย และมขอดและขอเสยแตกตางกนไป บางวธท าการวเคราะหไดรวดเรว แตขาดความแมนย า บางวธแมนย าแตวธการยงยาก และบางวธใชอปกรณมราคาแพง การวเคราะหหาความชนสามารถแบงออกกวางๆ ได 4 วธดวยกน ดงน

1. การอบแหง (Indirect Distillation or Drying Methods) วธการนเปนการหาน าหนกของน าทหายไป โดยใชความรอนในการระเหยน าออกไป

ดงนน ความชนทไดโดยการวเคราะหดวยวธนไมใชคาความชนทแทจรงของอาหาร แตเปนคาโดยประมาณเทานน ทงนเนองจากสาเหตหลายประการทท าใหการวเคราะหดวยวธนมคาความคลาดเคลอน ดงน

ก. อาหารทมไขมนอณเลกๆ เชน ไขมนทระเหยได (valentile oils) จะถกระเหยออกไปจากอาหาร ดงนน หากอาหารมไขมนประเภทนเปนสวนประกอบอยมาก กจะท าใหการวเคราะหหาความชนโดยวธนไดคาออกมามากกวาทควรจะเปน จงท าใหผลทไดออกมาคลาดเคลอน

ข. ลกษณะของน าทประกอบอยในอาหาร โดยเฉพาะอาหารพวกเมลดธญพชจะอยในรปของน าอสระ (free water) และน าไมอสระ โดยเกาะกนอยกบสารประกอบอนๆ (bound water) เชน โปรตน โดยปกตน าทอยในรปอสระนนมกจะโดนความรอนท าใหระเหยออกจากอาหารไดงาย เนองจากอตราการระเหยของน าชนดนจะสงขนตามอณหภมทเพมขน ดงนน ในการวเคราะหหาความชน โดยวธนจงมความจ าเปนอยางยงทจะตองใชอณหภมใหคงทตลอดในการวเคราะห สวนน าทไมอสระนน ท าใหระเหยออกดวยความรอนกระท าไดยาก

ค. อาหารทมน าตาลประกอบอยสง ถาใหความรอนเกน 70๐C กจะท าใหน าตาลไหมหรอสญสลายได ดงนน อาหารเหลานจงไมสามารถใชวธการแบบ Direct heating method ในการวเคราะหหาความชนได จะตองใชวธการแบบ vacuum heating method คอ ใชความดนเขามาชวยในการลดอณหภมลงใหเหลอประมาณ 70๐C

ง. อาหารทมผงฟ (Baking powder) ประกอบอย ถาใชความรอนวเคราะหหาความชนกจะท าใหผลทไดออกมาสงกวาความเปนจรง เนองจากความรอนจะท าใหผงฟสญสลายกลายไปเปนกาซคารบอนไดออกไซด ดงนนการวเคราะหหาความชนของอาหารประเภทนจ าเปนจะตองใชการลดความดนเขามาชวย โดยใชอณหภมหองและใชเวลาในการวเคราะหมากขน

15

2. การกลนล าดบสวน (Direct distillation methods) เปนการวเคราะหหาความชนโดยใชสารเคมทมจดเดอดสงกวา แตมความถวงจ าเพาะต า

กวาน า เชน โทลอน (Toluene) เฮบเทน (heptane) และไซเลน (xylene) เปนตน วธนไดผลแมนย า ทงนเนองจากไขมนทระเหยได (volatile oils) จะรวมอยในชนของสารเคมทใช ซงจะแยกออกจากชนของน าอยางชดเจน แตมขอเสยคอ ราคาอปกรณและสารเคมแพง

3. การใชเครองวดความชนไฟฟา (Electric moisture meter) เปนการวเคราะหหาความชนแบบวดความตานทาน (resistance) ความถ (frequency)

และ di-electrics properties ของน าทมอยในอาหาร เครองมอชนดนสามารถวดความชนของตวอยางไดรวดเรวมาก มความคลาดเคลอนเพยง ± 1% เทานน จงเหมาะทจะน ามาใชวดความชนของเมลดธญพชในโรงงาน โรงส และยงฉางใหญๆ เพราะสะดวกไมยงยาก

4. วธการทางเคม (Chemical method) เปนการวเคราะหหาความชนโดยใชสารเคมตางๆ เขามาท าปฏกรยากบน า เชน วธของ

Karl Fischer โดย ใช ห ล กการของ nonstoichiometric reaction ของน าก บ ไอ โอด น และ sulphurdioxide ในสารละลาย pyridinemethanol การวเคราะหวธนเหมาะส าหรบใชหาความชนในตวอยางอาหารทมน าเปนองคประกอบในปรมาณต าๆ หมายเหต : ส าหรบในหองปฏบตการอาหารสตวนใชวธวเคราะหแบบ Drying method

16

วธวเคราะหหาความชน โดยวธ Drying method หลกการ การวเคราะหหาความชนแบบ Drying methods นน เปนทนยมกนมาก เพราะเปนวธการงาย สะดวก คาใชจายถกและไมเสยเวลามาก ในการวเคราะหแตละตวอยางควรท าอยางนอย 2-3 ซ า เพอเปรยบเทยบผลด ถาผลออกมาไมถกตองใกลเคยงกน ควรท าการทดลองใหม อปกรณ

1. เตาอบแหง (Drying oven) 2. จานอลมเนยม (Aluminium dishes) 3. โถอบแหง (Desiccator) 4. คมส าหรบจบจานอลมเนยม (Tong)

วธวเคราะห 1. เตรยมจานอลมเนยมทลางสะอาดแลว น ามาอบทอณหภม 100๐C นาน 2 ชวโมง น า

ออกมาจากเตาอบ ทงใหเยนกอนจะน าไปเกบไวในโถอบแหงจนกระทงตองการใช จงน าออกมา ท าเครองหมาย ชงน าหนกจานเปลา และบนทกขอมล (คา C)

2. บดตวอยางอาหารทใชในการวเคราะหใหมขนาดเลก เทาทจะท าได 3. ชงน าหนกอาหารประมาณ 2-3 กรม ใสในจานอลมเนยมททราบน าหนกแนนอนแลว

บนทกขอมล (คา A) 4. น าจานอลมเนยมไปอบในเตาอบทอณหภม 100๐C ± 0.5๐C นาน 24 ชวโมง 5. น าจานอลมเนยมออกจากเตาอบ แลวทงใหเยนในโถอบแหง 6. เมอเยนแลวน ามาชงน าหนก บนทกขอมล (คา B)

การค านวณ %ความชน = (A – B) x 100 W A = น าหนกจานอลมเนยม + ตวอยางกอนการอบ B = น าหนกจานอลมเนยม + ตวอยางหลงการอบ C = น าหนกจานอะลมเนยมเปลา W = น าหนกของ ตวอยางทใชเรมตนวเคราะห (A-C) % สงแหง (dry matter) = 100 - % ความชน หมายเหต

1. การชงตวอยางอาหารเพอน าไปวเคราะหหาความชน และเพอการวเคราะหอนๆ จะตองชงพรอมๆ กน และเมออณหภมเปลยนไป ความชนของอากาศในหองชงกเปลยนไป เปนเหตให

17

ปรมาณอาหารทจะหาความชนเปลยนแปลงไปดวย การวเคราะหหาความชนควรท าทเดยว 3 ซ า เพอกนความผดพลาด เพราะถาท า 2 ซ า เชน การวเคราะหอนๆ เมอคาทได ระหวาง 2 ซ านแตกตางกนมากจนไมสามารถยอมรบได กไมสามารถน าไปใชในการค านวณคาการวเคราะหอนๆ ได เปนเหตใหตองท าการวเคราะหอนๆ ใหมหมดดวย

2. การอบทอณหภมใดกตาม นบระยะเวลาการอบจากจดทความรอนของตอบขนถงอณหภมดงกลาว

3. ไมควรใสตวอยางทมความชนสงกวา เขาไปในตอบทมตวอยางความชนต า ซงอบไดทแลววางอย

4. เครองชงสมยใหมสามารถปรบคาของน าหนกภาชนะเชนจานอะลมเนยมหรอบกเกอรเปน 0 ได ดงนนคา W จงไมจาเปนตองคานวนจาก (A-C)

18

การใชโถอบแหง โถอบแหง (Desiccator) คอ ภาชนะทjมฝาปด ท าจากแกว, พลาสตก หรอโพลเมอร อนๆ โดยใชสารเคมทเหมาะสมส าหรบการดดความชนวางอยดานลางของแผนตะแกรงเรยบทมชองถายเทอากาศ เพอท าอากาศทอยภายในแหงอยเสมอ เมอน าตวอยางทท าการวเคราะหออกจากเตาเผาหรอตอบแลวมาใสไวในโถอบแหง ปลอยทงไวใหเยน อากาศภายในโถทแหงอยแลวจะปองกนไมใหตวอยางททงใหเยนดดความชนเขาไป ท าใหเราหาน าหนกตวอยางไดถกตองแมนย า ซงถาหากเราทงเอาไวภายนอกโถอบแหง ตวอยางกจะดดความชนเขาไปท าใหคาน าหนกเปลยนแปลงไป สารดดความชน (Desiccant) คอ สารเคมทสามารถดดความชนจากอากาศรอบๆ ไดด และรวดเรว โดยมกจะใสไวขางลางของโถอบแหง สารเคมทใชเปนสารดดความชน มดงน

1. ซลกาเจล (Sillica gel) เปนสารดดความชนทนยมใช โดยอาศยคณสมบตการเปลยนส เปนตวชบอกสภาพการใชงาน กลาวคอ ในขณะแหง sillica gel จะมสน าเงนเขม และเมอมความชนสน าเงนจะจางลง จนกระทงดดความชนจนอมตวเปนสชมพอมมวง ทงนสามารถน ากลบมาใชใหมไดโดยอบไลความชนออกทแณหภม 100๐C เปนเวลา 1 ชวโมง ซงเมอแหงแลวจะเปลยนสกลบเปนสน าเงนเชนเดม

2. Drierite คอ anhydrous calcium sulphate ชนดพเศษทมโครงสรางเปนรพรนจ านวนมาก และมความสามารถในการรวมตวกบน าสง สเปนกลาง (neutral) สามารถท าใหแหงใหมโดยใชความรอน 235๐C - 250๐C

3. Fused calcium chloride ปกตใชขนาด 4-8 mesh มคณสมบตเปนสารดดความชนคอนขางต าจงไมนยมใช

4. Magnesium perchlorate และ phosphorous pentoxide สารดดความชนทง 2 ชนดน มประสทธภาพในการดดความชนดมาก แตมราคาแพง และ phosphorous pentoxide ไมสะดวกในการใชจงไมเปนทนยมใช วธใชโถอบแหง กอนใชโถอบแหงควรทาสารทชวยในการหลอลน และชวยใหฝาปดสนท เชน ขผง silicone หรอ lubriseal (ขผงทใชส าหรบหลอลนโดยเฉพาะ) ทขอบของฝา และตวโถอบเพอสะดวกในการเปดปด และเมอเปดฝาแลว ไมควรวางฝาดานทของทาดวยสารหลอลนคว าลงบนโตะ เพราะจะท าใหตดเศษฝนและสกปรกไดงาย เมอน าตวอยางทรอนเขาโถอบแหงแลว ควรจะหมนวาลลเปดทอดานบนของฝาเพอระบายอากาศทรอนของโถอบแหง ไมใหอากาศทรอนขยายตว และมแรงดน ใหฝาเปดและตวอยางปลวออกจากภาชนะบรรจได

19

โถอบแหงทใชในหองทดลอง ชนดทท าจากพลาสตก หรอโพลเมอร ใชไดผลดเชนกน โถอบแหงบางชนดสามารถท าใหเปนสญญากาศไดโดยใชปมแรงดน (vacuum pump) โถพลาสตกปกตจะมน าหนกเบาและสะดวกในการใช แตมขอพงระวงคอ ไมควรใสถวยกระเบอง (crucible) ทรอนกวา 140๐C ในโถอบแหงชนดน และไมควรลางฝาของโถอบชนดนดวยดางอยางแรง เชน soda หรอ potash ส าหรบโถอบแหงทใชสญญากาศ เวลาตองการเอาตวอยางออกมาตองใชความระมดระวง โดยคอยๆ หมนปม stopcock เพอลดสญญากาศอยางชาๆ เพราะถาหากใหอากาศเขามาโถอบแหงอยางรวดเรว จะท าใหตวอยางหรอเถาทมน าหนกเบาหกกระเดนจากภาชนะทบรรจได

20

3.2 การวเคราะหเถาทงหมด (Total Ash) หลกการ ปรมาณเถาทงหมด (total ash) ในอาหารหรอวตถดบอาหารสตว คอ สวนทเปนสารอนนทรยทคงเหลอภายหลงจากสารอนทรยถกเผาไหมหมดโดยทวไปไดแกแรธาตชนดตางๆ เชนแคลเซยม ฟอยฟอรส ฯลฯ เถาทเหลออยนไมจ าเปนทจะอยในลกษณะเดมเสมอไปหรอในปรมาณเดมทพบในอาหาร เพราะบางสวนอาจระเหยไป และบางสวนอาจแปรสภาพ โดยการท าปฏกรยากบสวนประกอบอนขณะเผาดวยความรอนสง (550-600oC) โดยทวไป ปรมาณเถาทพบในอาหารจะคอนขางคงทส าหรบอาหารชนดนน หากพบวาปรมาณสงกวาปกตกแสดงวามการปลอมแปลงหรอเจอปน อปกรณ

1. เบากระเบอง (Porcelain or silica crucible) 2. โถอบแหง (Desicator) 3. เตาเผา (Muffle furnace) 4. ขวดวดปรมาตรขนาด 250 มลลลตร (Volumetric flask) 5. กระบอกแกวขนาด 250 มลลลตร (Beaker) 6. กรวยกรอง (Filter funnel) 7. กระดาษกรองชนดไมมเถา (Ashless filter paper – Whatman No. 40, 41, 42 or

44) สารเคม

1. กรดเกลอเขมขน (HCl Cone.) 2. กรดเกลอเจอจาง (HCl 10%)

1. วธวเคราะหปรมาณเถาทงหมด 1. เผาเบากระเบองทสะอาดและแหงในเตาเผาทอณหภม 550-600๐C นาน 2 ชม. ปลอย

ใหเยนในโถอบแหง แลวชงน าหนกและบนทกน าหนกทแนนอน (คา C) 2. ตกตวอยางอาหารประมาณ 2 กรม ลงในเบากระเบอง (ปกตจะเปนตวอยางแหงทได

จากการวเคราะหหาความชน) ชงน าหนกและบนทกน าหนกทแนนอน (คา A) 3. น าเบากระเบองพรอมดวยตวอยางอาหารเขาไปเผาในเตาเผาทอณหภม 550-600๐C ใช

เวลาประมาณ 2 ชวโมง จนเถาเปนสขาว หรอสเทาออน หมายเหต : ในกรณทเถาไมเปนสขาว ซงแสดงวายงมสารคารบอนคงเหลออยบางใหรอจนตวอยางและเบากระเบองเยนลงแลว ใหหยดน ายาแอมโมเนยมคารบอเนท (10%) (หรอน ากลน) 2-3 หยด ลงบนเถา ระเหยใหแหงโดยเกบในโถดดความชน แลวน าเขาไปเผาตอไปในเตาเผาจนไดเถาสขาว

21

4. ใชคมคบเบากระเบองจากเตาเผาไปทงใหเยนในโถอบแหง แลวชงน าหนกโดยใชเครองชงทศนยม 4 ต าแหนง แลวบนทก (คา B)

5. น าตวอยางทเสรจแลวไปวเคราะหหาเถาทละลายในกรดและไมละลายในกรดตามขนตอนตอไป การค านวณปรมาณเถาทงหมด

% เถาทงหมดในตวอยางแหง = (A – B) x 100 W

เมอ A = น าหนกเบากระเบองทเยน + น าหนกตวอยางอาหาร B = น าหนกเบากระเบองทเยน + น าหนกเถาหลงเผา C = น าหนกเบากระเบองเปลา W = น าหนกตวอยางแหงทใชในการวเคราะห % เถาทงหมดในตวอยาง (Total ash) = % เถาทงหมดในตวอยางแหง x % สงแหง

22

บทปฏบตการท 4 การวเคราะหเถาทละลายและไมละลายในกรด (Soluble ash; Acid insoluble ash)

วธวเคราะห 1. หยดน ากลน 2-3 หยด ลงในเบากระเบองทมเถาทไดจากการวเคราะหขางตนหาเถา

ทงหมด เพอใหเถาชน ไมปลว 2. ถายเถาจากเบากระเบองลงในบกเกอรขนาด 250 มล. ดวยกรดเกลอเจอจาง 15 ml.

แลวใชน ากลนรอนลางเถาทตกคางจากเบากระเบอง 2 ครง โดยการลางทกครงใหเทน าลงในบกเกอร

3. เตมน ากลนลงในบกเกอร ประมาณ 2/3 ของบกเกอรเตมกรดเกลอเขมขนลงไป 5 มล. โดยใชกระบอกตวง (graduate or measuring cylinder)

4. น าสารละลายไปตมใหเดอดชาๆ โดยใชไฟออน ระเหยน าใหเหลอประมาณ 50 มล. ซงจะใชเวลาประมาณ 2-3 ชม.

5. กรองใสขวดวดปรมาตรขนาด 250 มล. โดยใชกระดาษกรองทไมมเถา ใชน ากลนรอนลางตะกอนจากบกเกอรลงบนกระดาษกรอง โดยใชแทงแกวคนทมยางหมชวยในการเขยตะกอนทตดขางบกเกอร

หมายเหต: เกบกระดาษกรองพบลงในเบากระเบองใบเดมเพอน าไปหาเถาทไมละลายในกรดตามขนตอนตอไป 6. เตมน ากลนลงในขวดวดปรมาตรจนไดปรมาตร 250 มล. เกบตวอยางสารละลายในขวด

ทปดฝาสนทไวในตเยน หรอในทมดและเยนส าหรบทจะน าไปวเคราะหหาแคลเซยมและฟอสฟอรสในบทปฏบตการตอไป

วธวเคราะหหาเถาทไมละลายในกรด (Acid insoluble ash) 1. น าตะกอนและกระดาษกรองไปใสในเบากระเบองอนเดมแลวน าไปอบทอณหภม 100oC

นาน 12 ชวโมง ชงน าหนกและบนทก (คา D) 2. น าเบากระเบองไปเผาทอณหภม 550-600oC นาน 2 ชวโมง ด าเนนการเชนเดยวกบขอ

3 ถง 4 ในปฏบตการวเคราะหเถาทงหมด

การค านวณ % เถาทไมละลายในกรด = (D - E) x 100

W เมอ D = น าหนกเบากระเบองทเยน + น าหนกตะกอนกอนเผา

23

E = น าหนกเบากระเบองทเยน + น าหนกตะกอนหลงเผา W = น าหนกตวอยาง (กระดาษกรอง+ตะกอน) ทใชในการวเคราะห % เถาทละลายในกรด = % เถาทงหมดในตวอยางแหง - % เถาทไมละลายในกรด

24

บทปฏบตการท 5 การวเคราะหแคลเซยมและฟอสฟอรส 5.1 การวเคราะหแคลเซยมโดยวธไตเตรท (Titration method) หลกการ การวเคราะหหาแคลเซยมหาไดโดยท าใหแคลเซยมตกตะกอนในรปของเกลอออกซาเลต (Oxalate) ดวยการเตมแอมโมเนยมออกซาเลต (Ammonium oxalate) ลงในตวอยางทละลายในกรดเกลอทเจอจาง แลวท าใหเปนกลางโดยการเตมแอมโมเนย (NH4OH) ทเจอจาง จากนนน าตะกอนทไดหลงการลางแลวมาละลายในกรดก ามะถนทเจอจาง น ากรดออกซาเลตทเกดขนไป (titrate) ดวยน ายาดางทบทมมาตรฐาน (Standard permanganate solution) ดงสมการ CaC2O4 + H2SO4 CaSO4 + H2C2O4 2MnO4 + 5H2C2O4 2Mn++ + 10CO2 + 8H2O สารเคม

1. กรดเจอจาง, HCl (1:3) : น ากรดเกลอ (36.5 – 38%) 50 ml. ผสมกบน ากลน 150 ml. 2. สารละลายแอมโมเนย NH4OH (1:1) : น า NH4OH (28 – 30%) 100 ml. ผสมกบน า

กลน 100 ml. 3. แอมโมเนยเจอจาง NH4OH (1:50) : น า NH4OH (28 – 30%) 10 ml. ผสมกบน ากลน

500 ml. 4. กรดก ามะถนเจอจาง (1:3) : H2SO4 20 ml. ผสมกบน ากลน 60 ml. 5. สารละลายอนด เคเตอร Methyl red indicator : ละลาย Methyl red 0.5 g ใน

ethanol 100 ml. 6. สารละลายดางทบทมมาตรฐาน (0.01N KMnO4) ตองเกบไวในขวดสน าตาลในทมด 7. สารละลายแอมโมเนยมออกซาเลตทอมตว (Saturated (NH2)2C2O2 solution 4.2%)

อปกรณ 1. ปเปต (Pipet) ขนาด 25 มล. 2. บกเกอร (Beaker) ขนาด 250 มล. 3. บวเรต (Burette) ขนาด 50 มล. หรอ ไมโครบวเรต (Micro Burette) (เปนสชา เพอ

ปองกนแสงไมใหท าปฏกรยาออกซเดชน) 4. กระดาษกรอง Whatman No. 40 หรอ 540 5. แทงแกวส าหรบคน 6. กระดาษอนดเคเตอร ชวง pH 5-6 และ 2-4

25

7. เตาไฟฟา วธวเคราะห

1. น าตวอยางสารละลายทไดจากการเตรยมในบทปฏบตการเรองเถาทละลายในกรด 2. เขยาสารละลายตวอยางอยใน Volumetric flask หรอขวดพลาสตกเกบตวอยางขนาด 250

ml. ใหเขากนแลวไปเปตตวอยาง มา 25 ml. ใสลงในบกเกอรขนาด 250 ml. 3. เตมน ากลน เพอท าใหเจอจางจนไดปรมาตร 100 ml. แลวหยด Methyl red 2 หยด (เตรยม

blank ไปพรอมกนดวย) 4. หยด NH4OH (1+1) ทละหยด จนกระทง pH 5.6 (สามารถสงเกตไดจากส จะมสสมปนน าตาล

(brownish-orange colour) หรอใชกระดาษอนดเคเตอรวด pH) ถา pH สงเกนไป ใหหยด HCl (1+3) ลงไป จนกระทงเปลยนเปนสสมปนน าตาล

5. หยด HCl (1+3) 2 หยด สสมจะเปลยนเปนสชมพ (pH 2.5-3.0) 6. เตมน ากลนลงในบกเกอรจนไดปรมาตร 150 ml. น าไปตมใหรอน แลวคอยๆ เตมสารละลายท

อมตวของแอมโมเนยมออกซาเลต (Ammonium oxalate) 4.2% ทรอน 10 ml. คนใหทวอยเสมอ ขณะทก าลงเตมอย

7. ถาสชมพเปลยนเปนสสมหรอสเหลอง หยด HCl (1+3) ทละหยด จนกระทงเปลยนเปนสชมพอกครงหนง

8. ตงทงไว 1 คน เพอใหตกตะกอน แลวปดฝาดวยจานแกว (Watch glass) 9. น ามากรองดวยกระดาษกรอง Whatman No. 40 แลวลางตะกอนดวย NH4OH (1:50) 10. แทงกระดาษกรองใหเปนรดวยแทงแกว จากนนละลายดวยน ากลนทรอนใหตะกอนทงหมด

ผานกรวยลงในบกเกอรใบเดม 11. ลางกระดาษกรองดวย H2SO4 ทเจอจาง ใหผานลงในบกเกอรจากนนใชน ากลนทรอนลาง

กระดาษกรองอกครงหนง 12. เตมน ากลนลงในบกเกอรใหไดปรมาตร 120 ml. แลวเตมกรด H2SO4 เขมขน 5 ml. 13. น าไปตมใหรอนทอณหภม 70๐C แลวน ามาไตรเตรทกบสารละลายดางทบทมมาตรฐาน

(Std. 0.01N KMnO4) ทละหยด จนถง end point ซงจะมสชมพออน การค านวณ 1 ml. ของ 1N KMnO4 = 0.02004 กรม Ca %Ca ในตวอยางแหง = (S – B) x N x 0.02004 x DF x 100 W เมอ S = ปรมาณของสารละลายดางทบทมมาตรฐานทใชไตรเตรทตวอยาง (มล.)

26

B = ปรมาณของสารละลายดางทบทมมาตรฐานทใชไตรเตรท blank (มล.) N = ความเขมขน เปนนอรมอล (Normality) ของสารละลายดางทบทมมาตรฐาน (KMnO4) DF = คาเจอจาง (dilution factor) (ในบทปฏบตการนเทากบ 10) W = น าหนกตวอยาง (น าหนกของตวอยางแหงทใชส าหรบหาเถา Ash)

27

5.2 การวเคราะหฟอสฟอรส โดยวธการวดคาการดดกลนแสง (Spectrophotometry method) หลกการ จากการเผา ฟอสฟอรสจะถกเปลยนใหอยในรปของสารออโซฟอสเฟตหรอเรยกวาฟอสเฟตละลายน า (orthophosphate) ซงจะจบกบวานาโดโมลปเดท (vanado molybdate) เกดเปนสารประกอบเชงซอน (complex form) สเหลอง สามารถวดปรมาณได โดยอาศยความเขมขนของส อปกรณ

1. Graduated test tube ขนาด 15 ml. พรอมฝาปด จ านวน 6 หลอด หรอขวดวดปรมาตร (volumetric flask) ขนาด 15 ml.

2. ขวดวดปรมาตร ขนาด 1 ลตร และขนาด 100 ml. 3. ปเปต ขนาด 25 ml. 4. Graduated Pipette ขนาด 10 ml. 5. เครอง Spectrophotometer

สารเคม 1. การเตรยมสารละลายโมลบโดวานาเดท (Molybdovanadate reagents) เตรยมโดย

ก. น าแอมโมเนยมโมลบเดท ((NH4)6Mo7O4.4H2O) 20 กรม ละลายในน ากลนรอน 200 ml. (solution A)

ข. น าแอมโมเนยมเมทตาวานาเดท (NH3VO3) 1 กรม ละลายในน ากลนรอน 125 ml. ตงทงไวใหเยน แลวเตมกรดเปอรคลอรค (HClO4) 70% 225 ml. (solution B)

ค. คอยๆ เท solution A ลงใน solution B อยางชาๆ พรอมกบคนใหเขากน แลวปรบใหไดปรมาตร 1 ลตร ดวยน ากลน

2. การเตรยมสารละลายมาตรฐานฟอสฟอรส (Phosphorus standard stock solution) ท าเชนเดยวกบการเตรยมสารละลายมาตรฐานของโปตสเซยมไดไฮโดรเจนฟอสเฟต (Standard solution potassium dihydrogen phosphate) เตรยมโดย ก. ละลายโปตสเซยมไดไฮโดรเจนฟอสเฟต (KH2PO4) ทบรสทธ และแหง หนก 0.4394

กรม ในน ากลน แลวท าใหไดปรมาตร 1 ลตร ข. จากนน pipet มา 25 ml. ของสารละลายในขอ ก. มาท าใหเจอจางลงอก โดยเตม

น ากลนใหไดปรมาตร 1 ลตร ฉะนน 1 ml. ของ KH2PO4 จะม P = 0.0025 มลลกรม 2 ml. ของ KH2PO4 จะม P = 0.0050 มลลกรม 3 ml. ของ KH2PO4 จะม P = 0.0075 มลลกรม

28

4 ml. ของ KH2PO4 จะม P = 0.0100 มลลกรม วธวเคราะห เตรยมกราฟมาตรฐานของฟอสฟอรส (Standard curve for phosphorus) โดยมขนตอนดงตารางตอไปน

No. Test tube Std. Solution

(ml.) Molybdo.

(ml.) น ากลน รวม

1, 1 2, 2 3, 3 4, 4 5, 5 6, 6 7, 7 8, 8

blank

1 2 3 4 5 6 7 8 -

2 2 2 2 2 2 2 2 2

7 6 5 4 3 2 1 - 8

10 10 10 10 10 10 10 10 10

การเตรยมตวอยาง (สารละลายตวอยางเถาทละลายในกรดจากบทปฏบตการท 4) 1. pipet soluble ash จาก Volumetric flask ท ได จากการเผา และใชละลายเถ า

(ปรมาณแลวแตชนดของตวอยาง) ใสลงใน test tube ขนาด 15 ml. 2. pipet ammonium molybdovanadate ใสใน test tube 2 ml. 3. pipet น ากลน ใสใน test tube เมอรวมกบ standard solution และ ammonium

molybdovanadate แลวจะไดปรมาตร 10 ml. 4. เขยา test tube ใหตวอยางเขากนด ตงทงไวประมาณ 10 นาท เพอใหเกดสเหลอง แลว

น าไปอานคา การดดกลนแสงจากเครอง spectrophotometer ท 400 m โดยใช blank เปนตวเปรยบเทยบมาตรฐาน บนทกคาการดดกลนแสง (Abs)

5. ถาตวอยางมฟอสฟอรสอยสงหรอต าเกนไป (จะตองใหอยในชวงของ standard curve) เราสามารถปรบความเขมขนของฟอสฟอรสใหเหมาะสมได โดยการท าใหเจอจางหรอเขมขนขนกได ซงสามารถประเมนคาอยางงายและรวดเรวโดยการเปรยบเทยบสของตวอยางทตองการกบสของสารละลายมาตรฐานหมายเลข 1 - 8 หากมสทจางกวาหมายเลข 1 หรอเขมกวาหมายเลข 8 ควรเตรยมใหม

29

การค านวณ mg. P = b(Abs.sample) – b(Abs.std.) + mg.P std. % P in sample = mg. P x 10-3 x 250 x 100

W x dilution factor

30

บทปฏบตการท 6 การวเคราะหหาปรมาณเกลอในอาหารสตว หลกการ

การวเคราะหเกลอหรอโซเดยมคลอไรดนไดดดแปลงมาจากวธ Mohr Method ซงมหลกการดงน คอ ใชซลเวอรไนเตรท (AgNO3) ท าปฏกรยากบโซเดยมคลอไรด (NaCl) โดยใชโปตสเซยมไดโครเมท (K2CrO4) เปนอนดเคเตอร

ปฏกรยาการตกตะกอน AgNO3 + NaCl AgCl + NaNO3

อปกรณ 1. Erlemeyer flask ขนาด 250 ml. 2. Beaker ขนาด 250 ml. 3. Burette และขาตง 4. Pipette 2 ml., 10 ml., 20 ml. 5. กรวยกรองและกระดาษกรอง Whatman No.4

สารเคม 1. สารละลายโปตสเซยมไดโครเมท 10% (indicator) : ชงโปตสเซยมไดโครเมท 10 กรม

ละลายในน ากลนใหไดปรมาตร 100 ml. 2. สารละลายมาตรฐานซลเวอรไนเตรท (AgNO3) 0.1 N

2.1 ชงซลเวอรไนเตรท 1.7 กรม (หลงอบแหงแลว 2 ชม.) ละลายในน ากลน 100 ml. ใน Volumetric flask แลวเกบในขวดสชาเพอท าการ standardize

2.2 ชงเกลอ (AR grade) 0.15 กรม ลงใน flask ขนาด 125 ml. เตมน ากลน 100 ml. เขยาใหละลายเตม 10% โปตสเซยมไดโครเมท ประมาณ 2 ml. แลวน าไปไตเตรทกบซลเวอรไนเตรททเตรยมไวใน 2.2.1 ท าการไตเตรทจนกระทงสของอนดเคเตอรเปลยนสจากสเหลองเปนสแสด แสดงวาคอ จด End point (ท าการวเคราะหอยางนอย 3 ครง)

การค านวณ Normality ของ AgNO3 = (g) NaCl x (% ความบรสทธของเกลอ) x 10 58.44 x (ml.)AgNO3 หมายเหต : 1 ml. 0.1 N AgNO3 ประมาณ 0.05844 กรม

31

การตรวจสอบความแมนย าของวธวเคราะหเกลอท าดงน 1. ท า standard เกลอ 2 ชด

ชดท 1 มเกลอ 2.3 และ 4% ส าหรบตรวจปลาปน ชดท 2 มเกลอ 0.2, 0.3, 0.4 และ 0.5% ส าหรบตรวจอาหารทวไป

2. ดดสารละลาย 4.1 มาอยางละ 1 ml. สารละลายอนดเคเตอร K2CrO4 10% 2 ml. เตมน ากลนใหไดประมาณ 100 ml. แลวน าไปไตเตรท ท า blank ดวย โดยไมตองใสสารละลายมาตรฐานเกลอโดยใชน ากลนแทน

3. ผลการวเคราะห Std. เกลอ % ml. ทใช

วเคราะห ml. standard AgNO3 ทใช

% เกลอทวเคราะหได

% Recovery

Blank 2 3 4

0.2 0.3 0.4 0.5

- 1 1 1 1 1 1 1

0.15 3.50 5.10 6.80 0.40 0.60 0.75 0.90

- 2.00 2.96 3.99 0.149 0.269 0.358 0.448

- 100

98.566 99.31 74.50 89.60 89.60 89.60

AgNO3 standard = 0.1022 N หมายเหต จากผลการตรวจสอบครงนพบวาคาวเคราะหทแมนย ามเกลออยประมาณ

0.001-0.005 กรม ซงจะท าใหการวเคราะหไดผลด การวเคราะหเกลอในอาหาร

1. ชงปลาปน 0.5 กรม อาหาร 2-3 กรม แลวถายลงในบคเกอรขนาด 250 ml. (ใหท า Blank ดวย โดยไมมตวอยาง)

2. เตมน ารอน 50 ml. คนใหเกลอละลาย 1 นาท แลวน าไปกรองดวยกระดาษกรอง Whatman No. 4 หมายเหต : ตวอยางทเปนแปงควรหลกเลยงการใชนารอนใหใชนาอณหภมหองแทน

3. ลางบกเกอรและตะกอนดวยน ารอนครงละ 20 ml. (10-15 ml.) อยางนอย 3 ครง แลวปรบใหไดปรมาตร 100 ml.

32

4. น าน ากรองไปไตเตรทดวยสารละลายมาตรฐาน AgNO3 โดยเตมอนดเคเตอร K2CrO4 2 ml. (โดยใชปเปต) แลวสงเกตสารละลายเปลยนส จากสเหลองเปนสแสด

การค านวณ %เกลอ = (A-B) x N x 5.845 W A = ml. ของ AgNO3 ทใชไตเตรทตวอยาง B = ml. ของ AgNO3 ทใชไตเตรท blank N = Normality ของ AgNO3

W = น าหนกของตวอยางทวเคราะห

33

บทปฏบตการท 7 การวเคราะหโปรตนหยาบ (โดยวธ Kjeldahl Method) โดย ดร. แววร บญเทยม และ ดร.วรณ แกวพลา

1. หลกการ (Principle) การวเคราะหโปรตนในหองปฏบตการถกคนพบโดย Dane Johan Kjeldahl ชาวเดนมารก ในชวงป ค.ศ. 1880จงเรยกวธการวเคราะหดงกลาววา Kjeldahl Method ซงเปนการหาปรมาณไนโตรเจนทงหมดทมอยในตวอยางทตองการทดสอบทงสวนทเปนไนโตรเจนทมาจากกรดอะมโน รวมกบสวนของไนโตรเจนทไมไดมาจากกรดอะมโน (non protein nitrogen) ดงนน คาทไดจากการวเคราะหจงตองน าไปค านวณกลบเปนปรมาณโปรตน โดยการน าไปคณกบคาแฟคเตอรของโปรตน ซงในอาหารสตวจะมคาแฟคเตอรของโปรตนเทากบ 6.25 โดยทวไปการวเคราะหหาปรมาณโปรตนโดยวธการดงกลาวตองท าการยอยโปรตนในตวอยางดวยกรดซลฟวรกเขมขน (H2SO4) เพอเปลยนไนโตรเจนทมในอาหารใหกลายเปนเกลอแอมโมเนยมซลเฟต กอนน าไปท าปฏกรยากบดางดวยโซเดยมไฮดรอกไซด (NaOH) เพอกลนกาซแอมโมเนย (NH3) ออกมา ซงกาซดงกลาวจะเขาท าปฏกรยากบกรด บอรก (H3BO3) ทมจ านวนมากเกนพอเพอใหเกดเปนแอมโมเนยมบอเรต จากนนจงไทเตรทดวยกรดไฮโดรคลอรก และค านวณหาปรมาณโปรตน ซงเมอคณกบคาแฟคเตอรของโปรตนแลว จะท าใหทราบคาโปรตนโดยประมาณในตวอยางทท าการทดสอบ วธนสามารถแบงขนตอนการวเคราะหได 3 ขนตอน คอ การยอย (digestion) การกลน (distillation) และการไทเตรท (titration) โดยมรายละเอยดดงน 1.1 การยอย (digestion) เปนการน าตวอยางทตองการทดสอบมาท าการยอยดวยกรดซลฟรกเขมขน (Conc. H2SO4) ภายใตสภาวะทมอณหภมสงทอณหภม 350 องศาเซลเซยส และเตมสารเรงปฏกรยา (catalyst) เชน คอปเปอรซลเฟต (CuSO4) โซเดยมซลเฟต (Na2SO4) และเฟอรสซลเฟต (FeSO4) เปนตน เพอเรงการเปลยนไนโตรเจนทมอยในอาหารทงหมดใหเปนเกลอแอมโมเนยมซลเฟต (NH4)2SO4 ดงสมการ โปรตน + Conc. H2SO4 (NH4)2SO4

1.2 การกลน (distillation) เปนการไลกาซแอมโมเนยออกจากแอมโมเนยมซลเฟตโดยใชโซเดยมไฮดรอกไซด (NaOH) ทมฤทธเปนดาง โดยกาซแอมโมเนยทกลนออกมาจะท าปฏกรยากบกรดมาตรฐานทมจ านวนมากเกนพอ (บทปฏบตการนใชกรดบอรก) ดงสมการ (NH4)2SO4 + NaOH NH3 + H2O + Na2SO4 (ก) NH3 + H2O NH4OH (ข) NH4OH + H3BO3 NH4

+ + H2O + H2BO3+ (ค)

สารเรงปฏกรยา + ความรอน

34

1.3 การไทเตรท (titration) เปนการน าสารละลายบอรก ซงจบกบกาซแอมโมเนยไวมาท าการไทเตรทกบสารละลายมาตรฐาน (บทปฏบตการนใชกรดไฮโดรคลอรก) เพอน าไปค านวณหาคาไนโตรเจนทงหมดในอาหาร H2BO3

+ + H+ H3BO3 จากนนน าปรมาณสารละลายมาตรฐานกรดไฮโดรคลอรกทใชในการไทเตรท ไปค านวณหาปรมาณไนโตรเจน แลวน าไปคณกบคาแฟคเตอรของโปรตนซงมคาเทากบ 6.25 จะท าใหทราบปรมาณโปรตนรวม (crude protein) ในตวอยางทท าการทดสอบ 2. วตถประสงค (Objective) 1. เพอใหนกศกษาทราบวธการและฝกปฏบตวเคราะหโปรตนในตวอยางอาหารสตวหรอวตถดบอาหารสตวได 2. นกศกษาทราบปรมาณโปรตนในตวอยางอาหาร และน าขอมลไปพจารณาคณภาพของตวอยางอาหารได 3. เครองมอและอปกรณ (Apparatus) 3.1 เครองชง (analytical balance) ทมความละเอยด 0.0001 กรม 3.2 Kjeldahl digestion flasks ขนาด 800 มลลลตร 3.3 เครองยอย (digestion apparatus) 3.4 เครองกลน (distillation apparatus) 3.5 ขวดรปชมพ (erlenmeyer flask) ขนาด 250 มลลลตร 3.6 ปเปตต (pipette) ขนาด 25 มลลลตร 3.7 บวเรตต (burette) พรอมขาตง (retort stand) ส าหรบไทเตรทสารละลาย 3.8 ขวดฉดน ากลน (wash bottle) ซงภายในบรรจน ากลน 4. สารเคม (Reagent) 4.1 สารเรงปฏกรยาผสม (catalyst mixture) ทมสวนประกอบของ anhydrous sodium sulfate 20 สวน และ anhydrous copper sulfate 1 สวน 4.2 กรดซลฟรกเขมขน (รอยละ 95-98 สดสวนโดยมวล) 4.3 สารละลายอนดเคเตอรผสม โดยน า methyl red 0.2 กรม และ methylene blue 0.1 กรม ละลายใน 95% เอทานอล ปรบปรมาตรดวย 95% เอทานอล จนครบ 100 มลลลตร ผสมสารละลายใหเขากน 4.4 สารละลายโซเดยมไฮดรอกไซด (รอยละ 45 โดยน าหนก) โดยเตรยมสารละลาย NaOH 450 กรม ดวยน ากลนในบกเกอรขนาดใหญ (ควรแชในน าเยนเพอลดความรอนทเกดขนจากการ

สเขยวเปนสมวงแดง

HCl

35

ละลาย NaOH) โดยใชแทงแกวคนเพอใหการละลายเกดเรวขน เมอละลายหมดแลวใหท าการเจอจางจนไดปรมาตร 1 ลตร ใน flask ทมขดบอกปรมาตรและน าสารละลายบรรจในภาชนะทมฝาปดมดชด 4.5 สารละลาย 4% Boric acid เตรยมโดยการตมน ากลน 50 มลลลตร ใหรอน แลวใสกรดบอรก 4 กรม ตมตอจนละลายหมด จากนนจงทงไวจนสารละลายเยนลงกอนเตมน ากลนใหครบ 100 มลลลตร 4.6 Standard 0.1 N HCl 4.7 ลกแกว (glass beads) 5. ขนตอนการวเคราะห (Procedure) 5.1 ชงน าหนกตวอยางอาหารทบดละเอยดแลว หากเปนวตถดบจากปลาปนและกากถวชนดตางๆ ใหใชปรมาณ 1-2 กรม หากเปนธญพชอนใหใชปรมาณ 2-4 กรม ลงบนกระดาษกรองทปราศจากไนโตรเจน (อาจใชกระดาษกรอง Whatman 541TM) พบกระดาษปดตวอยางใหมดชด กอนน าไปใสใน Kjeldahl digestion flasks 5.2 เตมสารเรงปฏกรยาผสม 2 กรม และใสลกแกว 2-3 เมด เพอปองกนการกระเดนอยางแรง (bumping) 5.3 คอยๆ เตมกรดซลฟวรกเขมขน 25 มลลลตร ลงใน Kjeldahl digestion flasks เขยาขวดดวยความระมดระวงจนกระทงผสมเขากนด 5.4 น า Kjeldahl digestion flasks วางในลกษณะเอยงบนเครองมอยอย โดยในชวงแรกใหใชความรอนต ากอนประมาณ 200 องศาเซลเซยส จนกระทงเดอด เมอหยดกระเดนจงเพมความรอน 350 องศาเซลเซยส ท าการยอยสารละลายตอไปจนกระทงสารละลายในหลอดยอยโปรตนมลกษณะใส ใหความรอนตอไปอก 1 ชวโมง เพอใหกระบวนการออกซเดชนสมบรณ รวมทงชวยท าลายกรดซลฟวรกทเกดขนดวย 5.5 หยดใหความรอน ทงใหเยนในเครองมอยอย น า Kjeldahl digestion flasks ออกจากเครองยอย ในกรณทคอของหลอดยอยมจดสด าใหลางดวยน ากลน แลวใหความรอนตอจนหมดควน กอนหยดใหความรอน 5.6 เตมน ากลน 300 มลลลตร ลงใน Kjeldahl digestion flasks 5.7 เตมสารละลาย 4% Boric acid 75 มลลลตร ลงในขวดรปชมพขนาด 250 มลลลตร และเตมสารละลายอนดเคเตอรผสม 4 หยด น าไปวางทต าแหนงรองรบของเครองกลน โดยใหสวนปลายของอปกรณควบแนนจมอยในกรดบอรค จากนนจงเปดน าใหไหลผานอปกรณควบแนน 5.8 ตวงสารละลายโซเดยมไฮดรอกไซด (รอยละ 45 โดยน าหนก) 80 มลลลตร คอยๆ เทลงใน Kjeldahl digestion flasks ซงตงอยในลกษณะเอยงใหไหลตามขาง flask แลวรบน าไปตอเขากบ

36

อปกรณควบแนนของเครองกลน จากนนจงหมน Kjeldahl digestion flasks เพอใหสารผสมเขากนไดดขน 5.9 ใหความรอนจนแอมโมเนยถกกลนออกมาอยางนอย 150 มลลลตร ในขวดรปชมพเมอสงเกตเหนสารละลายเปลยนเปนสเขยว ใหหยดใหความรอน 5.10 น าขวดรปชมพออกในขณะททอกลนยงอยใน flask เหนอของเหลว แลวใชน ากลนลางปลายทอน ากลนใหไหลลงใน flask 5.11 น าขวดรปชมพซงมกรดบอรกมากเกนพอมาไทเตรทกบสารละลายละลายมาตรฐาน 0.10 N HCl จนกระทงสของสารละลายเปลยนจากสเขยวเปนสมวงแดงหรอสมวงอมชมพ (ท าตวอยางละ 3 ซ า) บนทกปรมาณของสารละลาย 0.1 N HCl ทใชในการไทเตรท 5.12 ท า sample blank เชนเดยวกบวธการขางตน โดยไมตองใสตวอยางทดสอบ โดยหลงการกลน sample blank ตองไม เปลยนส หาก sample blank เปลยนส ใหท าการไทเตรทเชนเดยวกบตวอยางททดสอบ หมายเหต 1. ในการวเคราะหโปรตนแตละครง ควรท าตวอยางทใชตรวจสอบ (sample blank) ดวย โดยมขนตอนปฏบตเชนเดยวกน แตไมใสตวอยางทตองการทดสอบ 2. ขนตอนท 5.2-5.6, 5.7-5.10 และ 5.11 คอ ขนตอนการยอยโปรตน การกลน และการไทเตรท ตามล าดบ 6. การค านวณและการรายงานผล (Calculation and Expression of results) ปรมาณไนโตรเจน (รอยละ) = (A - B) x 0.014 x N x 100 W เมอ A คอ ปรมาณสารละลายกรดไฮโดรคลอรคทใชในการไทเตรทตวอยาง (มลลลตร) B คอ ปรมาณสารละลายกรดไฮโดรคลอรคทใชในการไทเตรท blank (มลลลตร) N คอ ความเขมขนของสารละลายกรดไฮโดรคลอรค (นอรมอล) W คอ น าหนกของตวอยางแหงบดละเอยด (กรม) 0.014 คอ 1 มลลลตร ของความเขมขนสารละลายกรดไฮโดรคลอรค 1 นอรมอล ปรมาณโปรตนรวม (รอยละ) = รอยละของไนโตรเจนทงหมดในอาหาร x 6.25 7. ขอเสนอแนะ และขอควรระวง 1. การเตมกรดซลฟวรกเขมขนใหเตมในตดดควน โดยการน าหลอดยอยใสใน insert rack

37

2. การใชอนดเคเตอรผสมในการไทเตรท จะสงเกตเหนจดยต (end point) ของการเปลยนสไดชดเจน 3. หลงกลนตวอยางเสรจ ใหลางสวนปลายของอปกรณควบแนนดวยน ากลน และกลนลางระบบโดยการใสน ากลนในหลอดยอยแลวท าการกลนโดยไมตองเตมดาง นานประมาณ 5-10 นาท 8. เอกสารอางอง (Reference) พชรตน แสนไชยสรยา วโรจน ภทรจนดา ฉลอง วชราภากร วนย ใจขาน กฤตพล สมมาตย

สาวตร วงตงถนฐาน และวรณ โคตะ. 2560. คมอบทปฏบตการ 137441 ปฏบตการโภชนศาสตรสตวประยกต. ภาควชาสตวศาสตร, คณะเกษตรศาสตร มหาวทยาลยขอนแกน.

38

บทปฏบตการท 8 การวเคราะหไขมน (Ether extract)

โดย ดร. แววร บญเทยม และ ดร.วรณ แกวพลา

1. หลกการ (Principle) ไขมนเปนสารประกอบอนทรยทเปนสวนประกอบของพชและสตว โดยทวไปสารประกอบไขมนเมออยในสภาพของเหลวท อณหภมหองมกเรยกวา “น ามน (oil)” กงแขงกงเหลวทอณหภมหองวา “ไขมน (fat)” และของแขงทอณหภมหองวา “ไข (wax)” โดยมคณสมบตไมละลายในน าแตละลายไดดในตวท าละลายอนทรย (organic solvents) ดงนน จงนยมใช petroleum ether, ethyl ether, diethyl ether, benzene, acetone, dichloromethane, hexane และ cholroform เปนตวสกด โดยตวท าละลายเหลานมความสามารถสงในการละลายไขมนแตมความสามารถต าในการละลายโปรตน กรดอะมโนและคารโบไฮเดรต เปนสารทระเหยงาย ไมมสารพษตกคาง มจดเดอดต า ไมมควน ไมเปนพษทงในรปของเหลวและไอระเหย รวมทงมราคาไมสงเกนไป ไขมนทอยในอาหารสตวเมอผานขนตอนการสกดและการระเหยสารเคมออกหมดจะเรยกวา ether extract หรอ crude fat ซงมทงสวนทเปนไขมน (กลเซอไรดของกรดไขมน กรดไขมนอสระ สเตอรอล เลซตน) และสารคลายไขมนซงตวท าละลายสามารถสกดออกมาได (รงควตถ ไข สารประกอบอลคาไลน และไวตามนทละลายในไขมน) ซงสวนทคลายไขมนนนมจ านวนนอยมากเมอเทยบกบสวนไขมน จงไมมผลตอการวเคราะหหาปรมาณไขมน ในการวเคราะหหาปรมาณไขมนในอาหารสตวโดยการวเคราะหแบบประมาณ (proximate analysis) นยมใชการสกดรอนโดยเครองมอ Soxhlet apparatus (ภาพท 1) และเครอง Goldfish apparatus ซงในบทปฏบตการจะฝกปฏบตวเคราะหไขมนในตวอยางวตถดบอาหารสตวและอาหารสตว โดยเครองมอ Soxhlet เทานน 2. หลกการท างานของเครอง Soxhlet apparatus การสกดรอนโดยใชเครอง Soxhlet นยมใชวเคราะหไขมนในตวอยางทเปนของแขง ซงตองใชการสกดแบบตอเนอง (continuous extractor) โดยเมอตวท าละลายทมจดเดอดต าคอ petroleum ether ไดรบความรอนจากเตาหลมใหความรอนหรอหมอองไอน าแลว จะท าให petroleum ether เกดการระเหยแลวกลนตวลงมาผานหลอดใสตวอยาง (thimble) ทบรรจตวอยางวตถดบอาหารหรออาหารสตวไว และเมอตวท าละลายมระดบสงเกนความดนจะท าใหตวท าละลายนนไหลกลบลงสขวดบรเวณดานลาง กลาวคอ ตวท าละลายจะสามารถผานตวอยางทตองการทดสอบหมนเวยนตอเนองไปเรอยๆ จนกระทงการสกดเกดขนอยางสมบรณ ซงวธการสกดแบบนจะชวยประหยดตวท าละลาย ไดสารทมความเขมขนสง และตวอยางทตองการทดสอบไมสมผสความรอนโดยตรง

39

ภาพท 1 สวนประกอบของเครอง Soxhlet apparatus 3. วตถประสงค (Objective) 1. เพอใหนกศกษาทราบวธการและฝกปฏบตวเคราะหไขมนในตวอยางอาหารสตวหรอวตถดบอาหารสตวได 2. นกศกษาสามารถน าขอมลทไดจากการวเคราะห เพอพจารณาคณภาพของตวอยางอาหารสตว 4. วธการวเคราะหไขมนโดยใชเครอง Soxhlet apparatus 4.1 เครองมอและอปกรณ (Apparatus) 1.1 ชดสกดแบบ Soxhlet ซงประกอบเตาหลมใหความรอน เครองควบแนน และเครองท าความเยน 1.2 เครองชง (analytical balance) ทมความละเอยด 0.0001 กรม 1.3 ตอบรอน (hot air oven) ทสามารถควบคมอณหภมได 100±2 องศาเซลเซยส

เตาหลมใหความรอน (heating mantle)

เครองควบแนน (condenser)

หลอดใสตวอยาง (thimble)

ตวท าละลาย (petroleum ether)

()

ทอรฟลกซ (extractor reflux tube)

ทอไซฟอน (extractor syphon tube)

สวนหลกของการสกด (extractor main body)

น าเขา

น าออก

น าเขา

น าออก

40

1.4 ขวดแกวกนแบน (flat bottom flask) ขนาด 250 มลลลตร 1.5 หลอดใสตวอยาง (thimble) หรอถงผา ทมขนาดเสนผาศนยกลาง 28 - 30 มลลเมตร 1.6 ล าล 1.7 โถดดความชน (desicator) 1.8 คมคบ (tong) 4.2 สารเคม (Reagent) Petroleum ether ทมจดเดอดระหวาง 40 - 60 องศาเซลเซยส 5. ขนตอนการวเคราะห (Procedure) 1. น าขวดกนแบนทสะอาดไปอบในตอบความรอนทอณหภม 100 องศาเซลเซยส เปนเวลา 2 ชงโมง แลวทงใหเยนจนถงอณหภมหองในโถดดความชน ประมาณ 1 ชวโมง จากนนจงน ามาชงน าหนก (A) 2. ชงตวอยางอาหารหรอวตถดบอาหารสตวทแหง (จากการวเคราะหหาความชน) ประมาณ 3 -5 กรม ลงบนกระดาษกรอง จากนนจงน าตวอยางใสลงใน thimble บนทกน าหนก (W) แลวปดดวยล าสสะอาด 3. เตม petroleum ether 180 มลลลตร ลงในขวดกนแบน จากนนใหน า thimble ทบรรจตวอยางถายลงใน Soxhlet extractor เพอตอกบเขากบเครองสกดแบบ Soxhlet 4. ใหความรอน 40 - 60 องศาเซลเซยส และเปดน าใหไหลผาน condensor ตลอดเวลาทท าการสกด 6 ชวโมง หากพบวายงม petroleum ether เหลออย ท าการใหความรอนตอไปจนกระทงเหลอ ether เพยงเลกนอย 5. น าขวดกนแบนออกจากเครอง แลวน าไปอบในตอบความรอนทอณหภม 100 องศาเซลเซยส นาน 4 ชงโมง 6. ทงใหเยนในโถดดความชน ประมาณ 1 ชวโมง แลวน าไปชงน าหนก (B) กอนน าไปค านวณหาปรมาณไขมนในวตถดบอาหารสตวหรอตวอยางอาหารสตว

41

6. การค านวณและการรายงานผล (Calculation and Expression of results) รอยละของไขมนในตวอยาง = (B - A) x 100 W เมอ A คอ น าหนก flat bottom flask ทแหงและสะอาด B คอ น าหนก flat bottom flask รวมไขมนหลงอบ W คอ น าหนกของตวอยางแหงทใสใน thimble 7. ขอเสนอแนะ และขอควรระวง 1. ควรใชคมคบในการคบอปกรณส าหรบวเคราะหไขมนทกครง 2. Petroleum ether เปนของเหลวทไอของสารตดไฟงาย ดงนน จงควรเกบใหหางจากความรอน ประกายไฟ พนผวทรอน และหามสบบหรขณะท าการวเคราะหตวอยาง 3. หากกลนกน petroleum ether ใหบวนปาก และหามท าใหอาเจยน 4. สารเคมทใชเสรจแลว ใหเกบในขวดเกบสารเคม ตดปายแสดงชอสารเคม กอนน าไปเกบทหองเกบสารเคม เพอรอก าจดตอไป 5. การท าความสะอาด thimber หลงจากทมการระเหย petroleum ether ออกหมด จะได thimber ทมลกษณะแหง ใหท าความสะอาดโดยใชแปรงปดแทนการใชน า 8. เอกสารอางอง (Reference) พชรตน แสนไชยสรยา วโรจน ภทรจนดา ฉลอง วชราภากร วนย ใจขาน กฤตพล สมมาตย

สาวตร วงตงถนฐาน และวรณ โคตะ. 2560. คมอบทปฏบตการ 137441 ปฏบตการโภชนศาสตรสตวประยกต. ภาควชาสตวศาสตร, คณะเกษตรศาสตร มหาวทยาลยขอนแกน.

42

บทปฏบตการท 9 การวเคราะหเยอใยหยาบ (Crude fiber)

หลกการ Crude fiber ในอาหารสตว วเคราะหไดโดยน าอาหารมาตมกบกรดและดางอยางออน พวกอนทรยสารตางๆ เชน โปรตน แปง น าตาล และคารโบไฮเดรทบางอยาง กจะละลายในกรดและดาง สวนสารอนทรยทเหลอจากการสกด เรยกวา Crude fiber ซงสวนใหญประกอบดวย Cellulose นอกจากนยงม hemicellulose และ lignin รวมอยดวยเลกนอย อปกรณ

1. เครองยอยหาเยอใย หรอ Hot plate 2. Berzelius beaker 3. Round bottom flask 4. Crucible 5. Oklahoma State Filtering Screen หรอ ผาลนนทมเสนดาย 45 เสนตอนว 6. Spatula

สารเคม

1. Sodium hydroxide 1.25% 2. Sulfuric acid 1.25% 3. Acetone 4. Amylase

วธวเคราะห

1. ชงตวอยางอาหารประมาณ 1-2 กรม ใสใน Berzelius beaker 5. เตม H2SO4 1.25% ลงใน Berzelius beaker 200 ml. (ถาอาหารม %แปงสง ใหใส

Amylase 1 กรม กอนเตมกรด) 2. น า Berzelius beaker ตงบน hot plate โดยม condenser เพอควบคมความเขมขน

ของสารละลายใหคงท เปนเวลา 30 นาท

43

3. รบน าสารละลายออกจากเครองแลวกรองตะกอนดวยเครองบนผาลนนบน Buchner funnel ทตอกบ filtering flask โดยอาศย suction pump ชวย แลวลางตะกอนดวยน ากลนรอน

4. ขดตะกอนออกจากผาลนนใหหมด ใสลงใน Berzelius beaker ใบเดม 5. เตมดาง NaOH 1.25% 200 ml. ลงใน Berzelius beaker น าไปท าเชนเดยวกบขอ 4 6. ลางตะกอนดวยน ารอน จนกระทงหมดดาง และลางดวย acetone ประมาณ 20-25

ml. 7. ขดตะกอนออกจากผาลนนใหหมดดวย spatula แลวใสใน Crucible ทเผาไวเรยบรอย

แลว (ระวงอยาใหตกหลน) 8. น า Crucible พรอมตะกอนไปอบทเตาอบอณหภม 100๐C ทงไว 1 คน 9. น า Crucible ออกมาทงใหเยนใน desiccator แลวชงน าหนก 10. น า Crucible พรอมตะกอนไปเผาทอณหภม 550 -600๐C ประมาณ 2-3 ชวโมง จน

ตะกอนถกเผาไปจนเปนเถา 11. น า Crucible ออกมาทงใหเยนใน desiccator แลวชงน าหนก

การค านวณ % Crude fiber = (A – B) x 100 W A = น าหนก crucible + น าหนกกากทยอยแลวหลงอบ B = น าหนก crucible + น าหนกเถาหลงจากเผา W = น าหนกของอาหารเรมตน

44

บทปฏบตการท 10 การวเคราะหพลงงานรวมในอาหารสตว โดย Bomb Calorimeter

ค าน า

การวเคราะหหาพลงงาน (gross energy) ของอาหารสตวโดยวธ Bomb Calorimeter นน เปนการวดความรอนของอาหารทเกดขนจากการเผาไหมอาหารใน bomb ซงมออกซเจนบรรจอยประมาณ 25-30 atmospheres ความรอนทเกดขนจากการเผาไหมอาหารนนสามารถทจะวดไดจาก bomb calorimeter 2 แบบดวยกน คอ

1 Adiabatic bomb calorimeter bomb ชนดนมระบบการวดความรอนทเกดขนจากการเผาไหมอาหารโดยการเพมอณหภมของน าแบบ adiabatic condition ดงนนในการวเคราะหวธนจะตองชงน าหนกของน าทใช (2,000 กรม) ทกครง และวดอณหภมของ bomb บวกน ากอนการเผา และเผาแลวทกครงเปนระยะๆ ทกนาท เพอบนทกอณหภมเรมตนกอนทดลอง และอณหภมสงสดหลงเผาไหมแลว นอกจากนนแลวยงตองค านวณกรดทเกดขนและ incidental oxidation ข องส ารพ วก nitrogen แล ะ sulfur compounds เพ อ ท จ ะค านวณหาคาพลงงานของอาหารไดถกองและแมนย า

2 Ballistic bomb calorimeter bomb ชนดนมระบบการวดความรอนทเกดขนจากการเผาไหมอาหาร โดย galvanometer ดงนน การวเคราะหหาพลงงานโดยวธนจงท าไดรวดเรว และไมย งย ากมากน ก แต ผ ลท ได อ อกมา ไม แ ม น ย า (less accurate) เท าก บ Adiabatic bomb calorimeter แตถาท าการวเคราะหหลายๆ ซ า แลวน ามาหาคาเฉลยผลทไดออกมากไดผลดพอๆ กบ Adiabatic bomb calorimeter เชนกน 1. การวเคราะหหา Gross energy โดนใช Adiabatic bomb calormeter

สารเคม

1 สารละลาย Sodium Carbonate มาตรฐาน ช ง Sodium Carbonate ท อบ ไลความชนออกแลวหนก 3.658 กรม ละลายในน ากลนใหมปรมาตรทงหมด 1 ลตร สารละลายชนดน 1 ml. จะใหคาเทากบ 1 แคลอร

2 Methyl orange indicator

3 Benzoic acid ชนด Primary grade ส าหรบใชเปน sample standard วธวเคราะห

1 บดตวอยางทตองการวเคราะหใหละเอยดผานตะแกรงขนาด 2.0 mesh

2 ชงตวอยางทจะท าการวเคราะหอยางคราวๆ 1.1 กรม แลวน าเขาเครองอดเมดเมออดเมดเสรจแลวน าไปชงอกครงหนงเพอบนทกน าหนกของตวอยางทใชในการวเคราะห

45

3 วางตวอยางอาหารทชงแลวลงใน crucible หรอ cup ทวางไวใน bomb แลวตด fuse wire ยาวประมาณ 10 ซม.ส าหรบเกยวเปนสะพานระหวาง electrode ของ bomb มาสมผสกบเมดตวอยางอาหาร

4 ถา bomb แหงควรเตมน าใน bomb ประมาณ 1 ml. แลวหมน bomb ไปรอบๆ เพอใหตว bomb เปยก (ท าเฉพาะกบ bomb ครงแรก ถาเปน bomb ทวเคราะหมาแลวและยงเปยกอยกไมตองท า)

5 หมน bomb เขากบเครองใหแนนและปด pressure release valve

6 ปล อยออกซ เจน เข า ไป ใน bomb โดยด gauge pressure ให ได ป ระมาณ 25 atmospheres

7 น า bomb ไปตอกบ bucket ชงน ากลน 2,000 กรม แลวคอยถายลงใน bucket

8 ปดฝาครอบ bucket ให แน น แล วจดระดบของ thermometer ให ต าลงเป ดสวทซcirculating motor เพอใหใบพดใน bucket หมน

9 เปดฝาครอบออกจาก calorimeter jacket cover แลวเตมน าจนกระทงน าไหลออกทาง drain hose

10 ปรบอณหภมของน าทอยทงหมด และขางใน jacket ใหเทากน (equilibrium) โดยใชน ารอนหรอน าเยน อานอณหภมทกๆ นาท เปนเวลา 3 นาท แลวบนทก initial temperature คาทอานไดแตละครงควรไมคลาดเคลอนไปจากเดม เกน 0.002๐C

11 กดปม ignite แลวออน thermometer ทกๆ 1 นาท จนกระทงอณหภมขนสงสดแลวบนทกผลไวเปนคา Final temperature

12 ดงระดบของ thermometer ขน แลวเปดฝาครอบ bomb เอา bomb ออกมาจาก bucket จากนนคอยๆ ปลอยออกซเจนออกจากตว bomb แลวจงเปด bomb ออก

13 คลาย fuse wire ออกจาก electrode ดงใหเปนเสนตรง แลววดสวนทเหลอจากการเผาไหม

14 ลางภายใน bomb ดวย stream of nuetral distilled water ครงละ 10 ml. 3 ครง แล วรวบรวมน ากล นท ล าง bomb ท งหมดไปไตเตรทกบสารละลาย sodium carbonate มาตรฐาน โดยใช methyl oragnge เปนอนดเคเตอร

การค านวณ

GE (cal/g.), as fed basis = (A-B) C – (D-F)

46

GE = Gross energy A = final temperature เปนอณหภมทอานคาไดสงสดเมออาหารเผา

ไหมหมด B = initial temperature เปนอณหภมท อานไดกอนการเผาอาหาร

ทดลองเมออยใน equilibrium condition C = Hydrothermol equivalent ของ bomb D = ความยาวของ fuse wire ทเผาไหมคณดวย 2.3 (ความยาว Fuse

wire 1 ซม. จะใหพลงงานเทากบ 2.3 แคลอร) F = ml. ของสารละลาย sodium carbonate มาตรฐานทใชในการ

ไตเตรทน าทลางภายใน bomb

15 การวเคราะหหาคา Hydrothermol equivalent ของ bomb 1) ใชสารเคมทกอยางเชนเดยวกบการวเคราะหอาหาร 2) น า benzoic acid ไปอบท 105 ๐C ประมาณ 2 ชวโมง ทงใหเยนในโถอบแกว

แลวน าออกมาอดเมด และชงน าหนกทแนนอน 3) ท าการทดลองตอตามขอ 2.2.3 – 2.2.13 เหมอนการวเคราะหหวอยางอาหาร

ทกประการ แตการวเคราะห Hydrothermol equivalent นตองท าซ าอยางนอยทสด 4 ซ า เพอน าผลทไดออกมาแตละครงมาหาคาเฉลย

4) การค านวณหาคา Hydrothermol equivalent Hydrothermol equivalent per degree (cal) = (M x H) + (D – F)

(A – B) M = น าหนกของ benzoic acid ทใชในการวเคราะห H = heat of combustion of benzoic acid = 6,319 cal/กรม A = Final temperature B = Initial temperature D = ความยาวของ fuse wire ทเผาไหมคณดวย 2.3 F = ml. ของสารละลาย sodium carbonate มาตรฐานทใชในการ

ไตเตรทน าทลางภายใน bomb

47

2. การวเคราะหหา Gross energy โดยใช Ballistic bomb calormeter หลกการ

การวเคราะหหาพลงงานของอาหารดวยเครองมอน โดยชงน าหนกตวอยางทวเคราะหใหทราบน าหนกทแนนอน น าไปเผาใน bomb ทมออกซเจนอยประมาณ 25 atmosphere แลววดความรอนทเกดขนดวย Thermocouple และ galvanometer system แลวเปรยบเทยบความรอนทอานไดจากการเผาตวอยางมาตรฐาน เชน benzoic acid ททราบคาของพลงงานทเกดจากการเผาไหมดวยเครองชนดน

สารเคม

1 Benzoic acid (Thermochemical grade) ; 1 g. ใหพลงงาน 6.32 kcal.

2 Firing cotton วธวเคราะห

1 บดตวอยางอาหารทจะท าการวเคราะหใหละเอยดผานตะแกรง 20 mesh

2 ชงตวอยางอาหารทบดแลวอยางคราวๆ ประมาณ 0.7 – 1 กรม แลวน าไปอดเมด ถาเปนตวอยางของอาหารหยาบ เชน พวกหญาแหงซงอดเมดไมได ตองใชเครองอดตวอยางเขาไป crucible อดใหอาหารเกาะตด crucible ใหแนน เพอลด surface area และ springiness ของตวอยางทวเคราะห ชงน าหนกอาหารทอดเมดแลว เพอใหทราบน าหนกทแนนอน

3 น าตวอยางอาหารไปวางบน support pillar ของฐาน bomb

4 ใช firing cotton ยาว 5 ซม. ผกเกยวระหวาง coil ของ firing wire และสมผสตรงกลางของเมดอาหาร

5 ตรวจด sealing ring ใหอยในสภาพเรยบรอย แลวจงน า bomb body เขาสวม และหมนใหเขากนสนท

6 เสยบ Thermocouple wire ตรงรสวนบนตว bomb

7 ปด pressure release valve แลวจงเปดออกซเจนเขาเครอง bomb โดยหมนปม control box ประมาณ 1/4 ของปม จนกระทงความดนสงถง 25 atmosphere ภายใน 20 วนาท จงปดปมแกสเขาเครอง

8 ปรบเครอง galvanometer ใหอยทศนย แลวทงใหอยทศนยประมาณ 30 วนาท เพอปรบใหอณหภมคงท และ galvanometer อยทศนย

9 ถอยออกจากเครอง bomb แลวจงกดปม firing button

10 อานคาของ galvanometer ทชบอกคาสงสด (ใชเวลาประมาณ 10-15 วนาท)

48

11 ปลอยออกซเจนทเหลอออกจาก bomb แลวจงถอด bomb body ออกจากเครองจม bomb body ในน าเยน แลวลางดวยน าเยน 2-3 ครง เชดใหแหง โดยเฉพาะตรงรส าหรบเสยบ Thermocouple wire จะตองแหงเสมอ

วธ standardise เครองมอ การ Standardise เครองมอน ท าเพอแกความผดพลาดของความรอนทเกดขนจาก firing

current และ firing cotton วธการท านน ทกอยางคลายการวเคราะหตวอยาง เพยงแตไมใสตวอยางเทานน แลวอานคาของ galvanometer ทขนสงสด ซงใชเวลาประมาณ 40 วนาท หลงจากกดปม firing button แลว

วธวเคราะห standard sample การวเคราะห standard sample นน ท าทกอยางเหมอนกบการวเคราะหอาหาร เพยงแตใช

benzoic acid ใสแทนตวอยางทวเคราะหเทานน และใช benzoic acid ในการวเคราะหแตละครงประมาณ 0.7 กรม ท าการวเคราะหอยางนอยทสด 5 ซ า เพอน ามาหาคาเฉลย

การค านวณคาพลงงาน น.น. ของ benzoic acid ทใชในการวเคราะห = W1 กรม Calorific value of benzoic acid = 6.32 kcal/g.

คาของ galvanometer ทอานสงสดของถวยเปลา = 1 divs

คาของ galvanometer ทอานสงสดเนองมาจากถวยเปลา = 2 divs

คาของ galvanometer ทอานสงสดเนองมาจาก benzoic acid = 2 - 1 divs Calibration constant = 6.32 W1 kcal/div

2 - 1 = Y1

เฉลยคาจากการวเคราะห standard sample 5 ซ า ดงนน คาเฉลยของการ standardising sample คอ

Y = y1 + y2 + y3 + y4 + y5 kcal/div 5 น.น.ของตวอยางทใชในการวเคราะห = Z กรม

คาของ galvanometer ทอานสงสดเมอมตวอยาง = 3 divs

คาของ galvanometer ทอานสงสดเนองจากตวอยาง = 3 - 1 divs

ความรอนทไดมาจากตวอยาง = (3 - 1)Y kcal

คาพลงงานของตวอยาง = (3 - 1) YZ kcal/g.

49

บทปฏบตการท 11 การวเคราะหหาสารพษในอาหารสตว

11.1 การตรวจสารพษอะฟลาทอกซนในอาหารสตว สารพษอะฟลาทอกซนเปนกลมของสารพษของสารอนทรยเคมพวกไดฟราโนควมารน (Difranocoumarin) ทมโครงสรางคลายกน มหลายชนด ทพบในอาหารคนและอาหารสตวทวไป คอ อะฟลาทอกซน B1, B2, G1, G2 นอกจากนยงพบสารพวก M หรอ Milk toxin ซงไดแก M1, M2 ซงพบในน านม และปสสาวะของสตว ซงกนอาหารทมการปนเปอนสารอะฟลาทอกซน B1 และ B2 เขาไปในขณะท B2a และ G2a พบไดในอาหารทวไป อะฟลาทอกซน B1 จดวามความส าคญมากทสด เนองจาก พบในธรรมชาตในปรมาณสง จดเปนสารพษทมความรนแรงมากทสด รองลงมา คอ G1, B2 และ G2 ตามล าดบ คณสมบตของสารอะฟลาทอกซน สารอะฟลาทอกซนสามารถเรองแสงไดภายใตอลตราไวโอเลต ขนาดความยาวคลน 365-366 nm อะฟลาทอกวนกลม B สามารถใหแสงเรองน าเงน (Blue fluorescence) อะฟลาทอกซนกลม G ใหแสงเรองสเขยวปนเหลอง (Yellowish Green fluorescence) สารอะฟลาทอกซนสามารถละลายไดในสารละลายอนทรยเคมหลายชนด ไดแก Methanol, Ethanol, Chloroform, Acetone Acetonitrile, N-Hexane, Benzene เปนตน จดหลอมตวของอะฟลาทอกซนอยท 250 ๐C ดงนน การใชความรอนโดยการหง ตม อบ นง คว ทวไป ไมสามารถท าลายสารพษได แตการใชความดนรวมกบการใหความรอนรปแบบตางๆ จะชวยท าลายไดบาง หรอการใชแสง Ultraviolet รวมกบความรอนจะชวยท าลายได ทงนขนอยกบระยะเวลา และอณหภม หรอการใชรงสไอออนไนซ (Ionizing radiation) เชน รงสเอกซ รงสแกรมมา ซงก าลงอยระหวางการศกษา เพราะใหทงผลบวกและผลลบ สารเคมทสามารถท าลายอะฟลาทอกซนได ได แก โซ เด ยม ไฮโปคลอไรด (Sodiumhypochlolite) และไฮ โดรค เจน เปอรออกไซด (Hydrogenperoxide) จากคณสมบตดงกลาวท าใหเราสามารถตรวจสอบ และสกดสารอะฟลาทอก ซนจากอาหารได การวเคราะหอะฟลาทอกซนในอาหารสตว สามารถท าได 2 วธ คอ

1. วธ Biological assay เปนการทดลองกบสตวโดยตรง ซงนกวเคราะหสวนใหญไมนยม เนองจากตองใชสตวเปนตวทดลอง

2. วธ Chemical assay เปนวธทนยมกนมาก การตรวจสอบปรมาณสารอะฟลาทอกซน การตรวจสอบสารอะฟลาทอกซนมหลายวธ และสามารถจ าแนกตรวจสอบได 3 ระดบ คอ

50

1. การสนนษฐานในขนตน (Presumptive test) นยมใชกบวตถดบ เชน ขาวโพด สามารถบอกไดอกวา ขาวโพดนนมสารอะฟลาทอกซนหรอไม และมมากหรอมนอย โดยอาศยการนบจดเรองแสง ทเรยกวา บจวายเอฟ (BGYF test หรอ Black light test) เปนวธการทปฏบตไดงายรวดเรว เสยคาใชจายต า ใชไดตงแตระดบไร ผคาทองถน และโรงงานอตสาหกรรมตางๆ

BGYF ใชหลกการตรวจจดสเหลองปนเขยวใสสะทอนแสง (Bright Greenish Yellow Fluorescence) ภายใต UV ความยาวคลน 365-366 nm. ซงการเกดจเรองแสงนจะมความสมพนธกบการมเชอรา สาเหต และปรมาณทพบกอาจจะสมพนธกบสารอะฟลาทอกซน

2. วธตรวจสอบขนตอนอยางรวดเรว (rapid screening method) เปนวธทตรวจสอบวา ตวอยางมสารอะฟลาทอกซนหรอไม และมในปรมาณเทาใด โดยประมาณ วธทดสอบแบบนอาจแบงไดเปนการทดสอบทางเคม (chemical method) และวธ Immunological method วธทดสอบทางเคมแบบนมหลายวธ แตทนยมใชกนแพรหลายและไดผลดคอ วธมนคอลมน (minicolumn) ซงในวธมนคอลมนเองมรายละเอยดยอยแตกตางกนออกไป จนเกดเปนวธมนคอลมนหลายวธ แตอาศยหลกปฏบตเหมอนกน คอ การสกดสารอะฟลาทอกซนจากตวอยาง แลวมาท าใหบรสทธ จากนนน าไปผานในหลอดมนคอลมน เพอรวบรวมปรมาณสารกอนน าไปอานคาภายใตแสง UV ทความยาวคลน 365-366 nm. โดยอานเทยบกบมนคอลมนมาตรฐาน (standard มนคอลมน) ทเรารความเขมขนระดบตางๆ ซงคาทอานไดเมอเทยบกบ standard แลว สามารถประมาณคาไดวาอยในระดบใด

ซงวธการตรวจสอบโดยใชมนคอลมน เปนวธทไมยงยากนก อปกรณเครองมอไมซบซอน คาใชจายต าเมอเทยบกบวธตรวจสอบปรมาณโดยวธอนๆ และผทดสอบไมจ าเปนตองมความร ความเชยวชาญสง หากไดรบการฝกฝน และตาไมบอดสกสามารถปฏบตได

วธ Immunological Method เปนวธการทอาศยหลกการปฏกรยาเฉพาะเจาะจง ระหวางสารพษจากเชอรา (antigent) และ antibody ทเจาะจงกบสารพษนน ทนยมกนขณะน ไดแก วธ ELISA (Enzyme Immunosorbent Assay) เพราะเปนวธท งาย สะดวก และรวดเรว สามารถตรวจสอบไดพรอมกนหลายๆ ตวอยาง การเตรยมตวอยางกไมยงยาก แตจะมขอจ ากดในเรองของอาย antigent

3. วธตรวจสอบปรมาณโดยละเอยด (Quantitative Method) วธการนสามารถบอกชนดและปรมาณของอะฟลาทอกซนไดอยางละเอยดและถกตอง ผล

การวเคราะหเปนทยอมรบโดยทวไป เทคนคทใชในการตรวจสอบปรมาณทนยมและยอมรบกนทวไป ไดแก TLC (Thin Layer

Chromatography), HPLC (High Performance Liquid Chromatography), HPTLC (High Performance Thin Layer Chromatography), MA (Mass spectrometry)

51

ซงวธการนสามารถอานคาไดแมในปรมาณทต ามากๆ การทจะเลอกใชวธการวเคราะห หรอเทคนคการวเคราะหอะฟลาทอกซนแบบใดนน ขนอยกบความพรอมทงดานอปกรณ เครองมอ และบคลากรของหนวยงานนนๆ อยางไรกตาม ควรทจะค านงถงความถกตอง หรอผลของการวเคราะหดวย 1. การวเคราะหหาอะฟลาทอกซน โดยวธการกรอง (Filter Method) สารเคม :

1. สารท าละลาย (Organic solvent) : ทสามารถใชไดด ไดแก Methanol, Acetone, Chloroform, Benzene, Isopropanal ชนด AR เกรด หรอเกรดเพอการวเคราะห

2. สารละลายส าหรบการสกด (Extracting solvent) : ใชสารละลายผสมระหวาง Methanol : 4% KCl หรอ 1% NaCl ในอตราสวน 60 : 40 โดยปรมาตร (สารละลาย A)

3. สารละลายทใชในการตกตะกอน (Precipitation solution) ไดแก

1) สารละลาย Zinc Acetate Solution : ชง 125 g. Zn (OAC)2 และ 62.5 g. (NH4)2SO4 ละลายดวยน ากลนเลกนอย เตม 1 CC. glacial acetic acid จนสารละลายดแลว เตมน ากลนปรบปรมาตรใหได 1,000 CC. (สารละลาย B)

2) สารละลาย 0 .1M H3PO4 : เต รยม โดยไป เปต 5 .6 CC. H3PO4 ลงใน volummetric flask ทมน าอยในปรมาณมากพอสมควร จากนนปรบปรมาตรโดยการเตมน าจนครบ 1,000 CC. (สารละลาย C)

4. สารทชวยในการกรอง Diatomaceous earth : Clite 545 หรอ Highly-Super cell 5.

วธวเคราะห 1. เตมตวอยางทบดละเอยด 5 กรม ลงใน สารละลาย A 20 ml. และเขยาดวยมอ 5 นาท 2. กรองสารละลายดวยกระดาษกรองเบอร 4 ใสใน flask ขนาด 125 ml. และเตม

สารละลาย B จ านวน 2 ml. และสารละลาย C จ านวน 4 ml. เขยาใหเขากน และเตม 0.5 กรม celite เขยาใหเขากนอกครงแลวกรอง

3. เกบสวนทกรองได 4 ml. ใส ในกรวยแยกชน (separate funnel flask) และเตม benzene จ านวน 2 ml. เขยาใหเขากนอยางเรว และแรง นาน 1 นาท หลงจากนนรอใหแยกชน

หมายเหต : 1 ml. ของตวอยางทเกบ = 0.5 g. ตวอยาง 4. เทหรอปลอยสารชนลางทง และเกบสารชนบนเพอน าไปทดสอบ

52

5. เตรยมกระดาษกรองวดคามาตรฐาน : เตรยมสารมาตรฐาน aflatoxin (Blue = B หรอ

Green = G) มความเขมขน 1 g./ml. และหยดบนกระดาษกรอง ดงน Aflatoxin level (ppb)

20 30 100

Stock std. 1 g.B/ml. 10 l 25 l 50 l Sample 10 l 10 l 10 l

Stock std. 1 g.G/ml. 10 l 25 l 50 l 2. การตรวจสอบปรมาณสารพษอะฟลาทอกซนในอาหารสตว โดยใชมนคอลมน สารเคม

1. ส ารพ วก Organic solvent : ท ส าม ารถ ใช ได ด ได แ ก Methanol, Acetone, Chloroform, Benzene, Acetronitrile, Isopropanal ชนด AR เกรด หรอเกรดเพอการวเคราะห

2. สารละลายส าหรบการสกด (Extracting solvent) : ใชสารละลายผสมระหวาง Methanol : 4% KCl หรอ 1% NaCl ในอตราสวน 60 : 40 โดยปรมาตร (สารละลาย A)

3. สารละลายทใชในการตกตะกอน (Precipitation solution) ไดแก

1) สารละลาย Zinc Acetate Solution : ช ง 125 g. Zn (OAC)2 และ 62.5 g. (NH4)2SO4 ละลายดวยน ากลนเลกนอย เตม 1 CC. glacial acetic acid จนสารละลายดแลว เตมน ากลนปรบปรมาตรใหได 1,000 CC. (สารละลาย B)

2) ส า รล ะล าย 0 .1 M H3PO4 : เต ร ย ม โด ย ไป เป ต 5 .6 CC. H3PO4 ล ง ใน volummetric flask ทมน าอยในปรมาณมากพอสมควร จากนนปรบปรมาตรโดยการเตมน าจนครบ 1,000 CC. (สารละลาย C)

4. สารทชวยในการกรอง Diatomaceous earth : Clite 545 หรอ Highly-Super cell 5. สารละลายทใชในการสราง Eluting solution : Chloroform : Acetone : 90 : 10

(สารละลาย E) 6. สารเคมทใชในการบรรจในหลอดมนคอลมน Packing material : ไดแก Alumina

Neutral, Brockman activity I (80-200 mesh), Calcium Sulfate anhydrous หรอ Drierite nonindicating (20-40 mesh), Florisil ของ Fisher Scientific Co.

53

No. F-101 (60-100 mesh), Silica gel 60-E Merck No. 7734 (100-200 mesh) Sodium Sulfate anhydrous

7. ส าลชนดปราศจากไขมนและไมเรองแสง การเตรยมมนคอลมน ใชแทงแกวใส เสนผาศนยกลาง 5 มม. ยาว 15 ซม. ไมเรองแสงภายใต UV. บรรจส าลชนดไมเรองแสง และปราศจากไขมนไวสวนลางของหลอด จากนนบรรจสารเคมตามล าดบ ดงรป

1. บรรจส าล ทปลายหลอดดานลาง ใหสงจากสวนปลายสดประมาณ 0.5 ซม. โดยอดใหส าลสง 0.5 ซม.

2. Calcium sulfate anhydrous สง 1 ซม. 3. Florisil สง 1.5 ซม. 4. Silica gel สง 4 ซม. 5. Alumina nertral สง 1.5 ซม. 6. Calcium sulfate anhydrous 1 ซม. 7. ส าล สง 0.5 ซม. 8. ปดปลายหลอดทง 2 ดานกนความชนโดยใชเทปใสปด

มนคอลมนทบรรจแลว ถายงไมไดใชทนทใหน าเขาตอบ 2 ชวโมง กอนน ามาเกบในโถอบแหง สารเคมในรายการท 2, 4, 5 ตองน าเขาอบในตอบเพอไลความชน และเปนการ activate สาร ในการบรรจสารแตละชนใชหลอดดดนมเปรยวเปนตวดดสารและบรรจ และท าการเคาะข างหลอดมน

ส ำล 0.5 ซม. Cal. Sulphate Anhy 1 ซม. Alumina neutral 1.5 ซม. Silica gel 4 ซม. Florisil 1.5 ซม. Cal. Sulphate Anhy 1 ซม. ส ำล 0.5 ซม.

15 ซม.

54

คอลมนเบาๆ เพอใหสารอดตวกน และปรบใหผวหนาแตละชนเรยบ และหลงจากบรรจสารแลว ควรเหลอความยาวส าหรบใสสารละลายได 1 ml. พอด การสกดสารพษอะฟลาทอกซนออกจากตวอยาง

1. ช งต วอย างหน ก 50 กรม ใส ใน erlenmeyer flask ขนาด 500 ml. เตมน ายาสารละลาย A (Extracting solvent) 200 ml. ปดปากฟลาสดวยจกด าทหอดวยฟลอย เขยาฟลาสดวยมออยางแรง และตอเนองเปนเวลา 30 นาท หรอใสตวอยางในเครองปน ปนดวยความเรวสงเปนเวลา 3 นาท

2. กรองสารละลายดวยกระดาษกรองเบอร 4 ใสในฟลาสขนาด 250 ml. เกบน ายาทสกดไดจ านวน 40 ml. ใสบกเกอรขนาด 250 ml. เตมสารละลาย B (Zinc acetate solution) 20 ml. คนใหเขากน 1 นาท

3. เตมสารละลาย C (H3PO4 solution) 40 ml. คนใหเขากน ตงทง 5 นาท ระหวางนนใหคนเปนครงคราว จนครบก าหนด ถาตะกอนขนขาว เตมสาร celite 5 กรม คนใหเขากน แลวน าไปกรอง โดยใชกระดาษกรองเบอร 1 หรอ เบอร 4

4. เกบน ายาทกรองได 50 ml. ใสกรวยแยกชน เตมสาร Benzene 4 ml. ปดจกเขยาอยางแรง และตอเนองเปนเวลา 1 นาท เพอใหเบนซนไปท าละลายสารอะฟลาทอกซนในสารละลายตวอยาง ทงไวใหแยกชน โดยสารละลายชนบนจะเปน Benzene ในขนตอนน อะฟลาทอกซนจะถกเกบไวในชนของสารละลายเบนซน

5. ไขน ายาชนลางทง เกบน ายาชนบน ส าหรบตรวจสอบใน minicolumn ในขนตอนน ถาน ายา Benzene ข น ห รอ เป น Emulsion ให เต ม sodium sulfate anhydrous จ านวน 2-5 กรม เขยาเบาๆ ทงให Benzene ใสกอน เกบน ายาใสในขวดเกบ (vial) ชนดท าดวยแกว Borosilicate ปดฝาใหสนท ปดทบดวยแผนพาราฟลมเพอปองกนการระเหย และหอดวยกระดาษฟอยล กอนน าไปเกบในตเยน รอการวเคราะห หรอถายลงในหลอด minicolumn ด าเนนการวเคราะหเลย

การตรวจ Chromatogram

1. เปดปลายปดทง 2 ดาน ของหลอด minicolumn 2. ปเปตน ายาสกด Benzene ทเตรยมได ในขนตอนการสกดจ านวน 1 ml. ใสในหลอด

คอลมน ปลอยใหน ายาไหลออกมาดวยแรงดงดดของโลก 3. เตมสารละลาย E (eluting) ครงละ 1 ml. 4 ครง ปลอยใหน ายาไหลออกมาจนหมด

หากน ายาไหลชา ใชลกยางบบชวยไล จะท าใหสารละลายไหลเรวขน

55

หมายเหต 1. การใสน ายาในหลอดมนคอลมนแตละครง อยาปลอยใหน ายาแหงสนท เพราะสารอะ

ฟลาทอกซนจะจบตดกบหลอด จะท าใหการชะลางออกไดไมหมด และจะท าใหการอานคาผดได

2. น ายาสกด Benzene 1 ml. ไดมาจากตวอยาง = 1.25 g. = 1 g. (อก 0.25 g. ใหเผอส าหรบความผดพลาดทจะเกดในการทดลอง หรอ 25% นนเอง)

ซงมหลกการคด ดงน การคด dilution factor หรอ การคดค านวณตวแทนของตวอยาง มขนตอนการคดดงน

1) ขนตอนสกดครงแรก ตวอยาง 50 กรม + สารละลายสกด 200 ml. ในสารผสม 200 ml. มตวอยางอาหาร 50 กรม ในสารผสม 1 ml. มตวอยางอาหาร 50 กรม = 0.25 กรม

200 2) ขนตอนตกตะกอนแยกสรเคมอน โดยใชน ากรองในขอ 1 จ านวน 40 ml. ซงเปน

ตวแทนของอาหาร = 40 ml. X 0.25 กรม = 10 กรม น ากรอง 40 ml. (10 กรมตอตวอย าง) + 20 ml. สารละลาย B + 40 ml.

สารละลาย C รวมสารละลายทงหมด 100 ml. นนคอ สารละลายทงหมด 100 ml. เปนตวแทนตวอยาง 10 กรม ถาสารละลายทงหมด 1 ml. เปนตวแทนตวอยาง 1 0 ก ร ม = 0.1 กรม 100

3) การแยกสารอะฟลาทอกซนดวย Benzene น าน ากรองในขอ 2 จ านวน 50 ml. มาใสในกรวยแยกชน น าน ากรอง 1 ml. เปนตวแทนของอาหาร 0.1 กรม น ากรอง 50 ml. เปนตวแทนของอาหาร 0.1 x 50 = 5 กรม สารอะฟลาทอกซนทงหมดของตวอยาง 5 กรม ถกรวมเขาไปเกบใน Benzene 4 ml.

Benzene 4 ml. เปนตวแทนอาหาร 5 กรม Benzene 1 ml. เปนตวแทนอาหาร 5 กรม = 1.25 กรม 4

นนคอ ถาเราใช Benzene 1 ml. จงเปนตวแทนของตวอยางอาหาร 1.25 กรม ซงเทยบเทากบ ตวอยาง 1 กรม ดงกลาว

56

การอานผล น าหลอด minicolumn ทเสรจแลว ไปอาน Chromatogram ทได ไปเทยบกบความเขมของการเรองแสงสน าเงน-มวง ของหลอดมาตรฐาน ภายใตแสง UV light ทความยาวคลน 365-366 nm. คาทอานได เมอเทยบกบหลอดมาตรฐานหลอดใดแลว สามารถอานคาออกมาเปนคานนๆ ไดเลย หรออาจจะอานคาออกมาเปนชวงๆ ในกรณทความเขมของแสงอยก ากงระหวาง std. 2 หลอด เชน อยระหวางหลอดมาตรฐานทมความเขม 20 ppb และ 40 ppb จะรายงานผลการอานออกมาเปนชวง คอ มอะฟลาทอกซนในชวง 20-40 ppb การยนยนผล

1. ควรมการก าหนดหลอดมนคอลมน control คอ ไมใสตวอยาง ใสเฉพาะสาร Benzene เพยงอยางเดยว

2. โดยการใชน ายาเบนซนของตวอยางใสในมนคอลมน และใสสาร std. AFB, ทเราทราบความเขมขนทแนนอนแลว ลงไปในหลอดดงกลาว แลวด าเนนการเหมอนเดม

3. น าทง 2 หลอดนไปอานผล ซงรวมกบหลอดตวอยาง และเปรยบเทยบกบหลอดมาตรฐานอกครง

57

11.2 การวเคราะหกรดไฮโดรไซยานค (Hydrozyanic acid, HCN) Hydrocyanic acid ในพชตางๆ เกดอยในรปของสารพวก Cyanogenetic glycosides สารพวกน โดยมากมกจะพบในถว ขาวฟาง มนส าปะหลง และพชอน glycosides พวกน เมอท าปฏกรยากบเอนไซม หรอสภาพเปนกรด กจะปลอย hydrocyanic acid ออกมา การวเคราะหสารพษพวกน วเคราะหไดหลายวธ ขนอยกบชนดของอาหาร วาเปนประเภทอาหารแหงหรออาหารสด อยางไรกตาม แตละวธมทงขอดและขอเสยแตกตางกนไป ขนอยกบผวเคราะหจะนยมใชวธไหนทเหมาะสมกบอปกรณในหองปฏบตการของตวเอง เพอความสะดวก รวดเรว ทนคาใชจาย และไดผลออกมาเชอถอได จากการทดลองใชวธวเคราะหจากหองปฏบตการอาหารสตว พบวาการวเคราะหหา hydrocyanic acid นน สามารถทจะวเคราะห 4 วธดวยกน คอ 1 การวเคราะหหากรดไฮโดรไซยานค โดยวธ Acid Titration Method

สารเคม 1 สารละลาย silver nitrate มาตรฐาน 0.02 N 2 สารละลาย potassium thiocyanate มาตรฐาน 0.02 N 3 Iron alum indicator : ละลาย FeNH4(SO)2.12H2O (Ferous ammonium sulfate

hydrate) ในน ากลน 100 ml. จนกระทงมผลกของ FeNH4 (SO4).12H2O เหลอในสารละลาย

4 กรดดนประสว (A.R.) อปกรณ

1 Kjeldahl flask ขนาด 800 ml. 2 เครองกลนส าหรบหาไนโตรเจนชนด Macro Kjeldahl 3 Flask ขนาด 250 ml. 4 Filtering crucible หรอ gooch crucible

วธวเคราะห 1 บดตวอยางทตองการวเคราะหใหผานตะแกรงขนาด 20 mesh แลวชงตวอยางประมาณ

10-20 กรม ใสลงใน Kjeldahl flask 2 เตมน ากลนประมาณ 100 ml. พรอมกบปดจกยางทปลาย flask แลวตงทงไว ประมาณ

2 ชวโมง พรอมกบเขยา flask เปนครงคราว ขณะทตงทงไว 3 เตมน ากลน 100 ml. แลวรบน าไปเขาเครองกลน ไอน า (Steam distil) โดยใช

สารละลาย AgNO3 มาตรฐาน 0.02 N. ปรมาณ 20 ml. และกรดดนประสว 1 ml. เปนตวจบไฮโดรไซยานคทปลายของเครองกลน ตองระวงใหปลายของเครองกลนอยใตระดบ

58

สารละลายมาตรฐาน AgNO3 ท าการกลนจนไดสารละลายประมาณ 150 ml. (ใชไฟออนๆ ขณะทท าการกลน)

4 น าสารละลายทไดมากรองดวย Filtering crucible หรอ gooch crucible เมอกรองหมด ใหลาง crucible ดวยน ากลนเลกนอยประมาณ 5-10 ml.

5 น าสารละลายทกรองรวบรวมทงหมดไปไตเตรทดวยสารละลาย KSCN (Potassium thiocyanate) มาตรฐาน 0.02 N โดยใช Iron alum เปนอนดเคเตอร

การค านวณ 1 ml. 0.02 N AgNO3 = 0.54 mg. HCN HCN (ppm.) = 540 x (ml. 0.02 N AgNO3) น.น. (กรม) ของตวอยางอาหาร

2 การวเคราะหหากรดไฮโดรไซยานค โดยวธ Alkaline Titration Method สารเคม

1 สารละลาย NH4OH 6 N : ละลาย NH4OH 840 ml. ในน ากลน 160 ml. 2 สารละลาย KI 5% : ละลาย K 5 กรม ในน ากลน 100 ml. 3 สารละลาย AgNO3 มาตรฐาน 0.02 N 4 สารละลาย NaOH 2.5% : ชง NaOH 2.5 กรม ละลายในน ากลน 100 ml.

อปกรณ 1 ใชอปกรณเชนเดยวกบการท าโดยวธ Acid Titration Method

วธวเคราะห 1 บดตวอยางอาหารทตองการวเคราะหใหผานตะแกรงขนาด 20 mesh แลวชงตวอยาง

ประมาณ 10-20 กรมลงใน Kjeldahl flask แลวเตมน ากลนประมาณ 200 ml. พรอมปดจกยางทปลาย flask

2 ตงทงไวประมาณ 2-4 ชวโมง พรอมทงเขยา flask เปนครงคราว 3 น าไปเขาเครองกลน โดยใช 2.5% NaOH จ านวน 20 ml. เปนตวจบไฮโดรไซยานค ท

ปลายของเครองกลน ท าการกลนจนไดสารละลาย 150-160 ml. 4 น าสารละลายทไดมาถายลงใน volumetric flask ขนาด 250 ml. แลวปรบปรมาตร

ของสารละลายใหได 250 ml. ดวยน ากลน 5 ดดสารละลายมาครงละ 100 ml. เตมดวย 6 N NH4OH 8 ml. และ 5% KI 2 ml.

เขยาใหผสมกน แลวน าไปไตเตรทกบสารละลาย AgNO3 มาตรฐาน 0.02 N จนกระทง

59

ไดตะกอนขนขาวเกดขน ถาจะใหเหน end point ชดเจน ใชกระดาษสด าปรองพน flask ขณะทท าการไตเตรท

การค านวณ 1 ml. 0.02 N AgNO3 = 1.08 mg. HCN HCN (ppm.) = 1080 x (ml. 0.02 N AgNO3) น.น. (กรม) ของตวอยางอาหาร

3 การวเคราะหหากรดไฮโดรไซยานค โดยวธของ A.A.C.C

หลกการ การวเคราะหหากรดไฮโดรไซยานค โดยวธน เปนการหากรดไฮโดรไซยานคโดยการกลน

ตวอยางทจะวเคราะหหา ในสารละลายทเปนกรด (Tartaric acid) เพอใหกรดไฮโดรไซยานคปลอยออกมา แลวใชดางโซเดยมไฮดรอกไซดเปนตวจบกรดไฮโดรไซยานค แลวน าสารละลายทไดไปท าการไตเตรทกบสารละลายมาตรฐาน silver nitrate ในการไตเตรทดงกลาวน ขนอยกบการเกดสารละลายของ silver cyanide sodium cyanide complexes น ดงสมการทจะเกดขน ตอไปน 2 NaCN + AgNO3 AgCN.NaCN + NaNO3

(สารละลายสใส) เมอใดทเตมสารละลายมาตรฐาน silver nitrate ทมากเกนพอเพยงเลกนอยเทานน กจะท า

ใหเกดตะกอนขนขาวขนทนท ทงน เนองจากการเกด insoluble silver cyanide หรอ ถาหากม potassium iodide ท าใหเหนตะกอนเดนชดขน ตะกอนขนขาวนจะมองเหนไดชดเมอท าการไตเตรทใน back ground ทเปนสด า ทมแสงสวางสองมาจากดานขางๆ

จากสมการขางบนน จะเหนไดวา 1 molecular fraction ของ silver nitrate จะท าปฏกรยาพอด (equivalent) เทากบ 2 moleculs ของ sodium cyanide วธวเคราะหวธนเหมาะทจะใชวเคราะหหากบอาหารแหง และพวกเมลดธญพช

สารเคม 1. สารละลาย NaCH 25% 2. สารละลาย AgNO3 มาตรฐาน 0.02 N 3. Soda-lead mixture : ละลาย sodium carbonate 200 กรม ในน ากลนประมาณ

400 ml. และละลาย lead acetate 20 กรม ในน ากลน 450 ml. น าสารละลายทง 2 อนน มาผสมกน แลวท าใหไดปรมาตร 1 ลตร

4. สารละลาย Tartaric acid 10% 5. ดาง Ammonium hydroxide เขมขน (A.R.)

60

วธวเคราะห 1. ชงอาหารประมาณ 50-100 กรม (ถาเปนแหงใช 25 กรม) ใสใน flask ทใชส าหรบกลน

ขนาด 1,000 ml. เตมน ากลน 250 ml. และ 10% Tartaric acid 50 ml. แลวรบน าไปตอเขาเครองกลนทนท

2. ทปลายอกดานของเครองกลนใหจมทอกลนลงใน 2.5% NaOH 50 ml. ส าหรบเปนตวจบกรด HCN

3. ท าการกลนจนไดสารละลายประมาณ 400-500 ml. 4. ถาสารละลายทไดมตะกอนสเขา (dark precipitation) ใหเตม soda-lead mixture 5

ml. แลวกรองดวย gooch crucible ทป ดวย asbestos หรออาจจะใช filtering crucible กได แลวลางตะกอนดวยน ากลน 2-3 ครง ถาสารละลายทไดมสเขม คอไมม sulfide เกดขน กไมจ าเปนตองกรอง

5. เตม NH4OH เขมขน 10 ml. และ 2% KI 10 ml. ลงในสารละลายทไดจากขอ 3.3.4 แลวเขยาใหผสมกนแลวน าไปไตเตรทกบ 0.02 N AgNO3 จนกระทง ไดตะกอนขนขาวเกดขน

6. ท า blank ในท านองเดยวกน การค านวณ

Cyanide, HCN (ppm.) = (A-B) x N AgNO3 x 5.4 x 104 น.น. (กรม) ของตวอยางอาหาร A = ml. AgNO3 required by sample B = ml. AgNO3 required by blank N = Normality of AgNO3

4 การวเคราะหหากรดไฮโดรไซยานคโดย Colorimetric Method

สารเคม 1. สารละลาย Alkaline picrate ละลาย Na2CO3 จ านวน 25 กรม และ picric acid 5

กรม ในน ากลน 1 ลตร 2. สารละลาย stock cyanide น า KCN ชนด AR grade (98% purity) ไปอบทอณหภม

100๐C เปนเวลา 30 นาท แลวน าไปทงใหเยนในโถอบความชน แลวชง KCN 0.255 กรม ละลายน า 1 ลตร สารละลายทไดจะม HCN 0.1 mg/ml. หรอ 1 ml. จะม HCN =

100 g.

61

3. สารละลายกรดเกลอ 3 N ละลายกรดเกลอเขมขน 129.45 ml. แลวท าใหไดปรมาตร 500 ml. ดวยน ากลน

4. การท า Alkaline picrate filter paper โดยตดกระดาษกรอง Whatman No. 1 ใหไดขนาด 10 x 2 ซม. แลวชบใน Alkaline picrate soln. ใหเปยกแลวผงใหแหง แลวแขวนกระดาษทชบ alkaline picrate จ านวน 2-3 แผน (ขนอยกบปรมาณ HCN) แลวผกแขวนไวกบจกยางทใชส าหรบปด flask ขนาด 500 ml.

5. การสราง std. Curve โดยน า stock soln. จากขอ 4.1.2 มา 10 ml. แลวท าใหไดปรมาตร 100 ml. แลวไปเปตสารละลายทเจอจางแลวน ตามตารางขางลางน ใสใน flask 500 ml. เตม 3 N HCl 1 ml. รบแขวนกระดาษทชบ alkaline picrate จ านวน 2 แผนไวกบจกยางของ flask แลวรบปดจกยาง พรอมกนนน เขยา flask ใหสารละลายผสมกนด เสรจแลวน าไปอบทอณหภม 25๐C เปนเวลา 24 ชวโมง เมอครบแลวน ากระดาษ picrate ออกมาละลายในน ากลน 10 ml. แลวน าไปวด optical density 515

m. Diluted stock cyanide

soln. น ากลน Conc. HCN, m

0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0

10 9.5 9.0 8.5 8.0 7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50

การวเคราะหตวอยาง

ก. ถาเปนตวอยางสด ชงตวอยางสด 1 กรม แลวน ามาบดใหละเอยด

ข. ถาเปนตวอยางแหง ชงตวอยางแหงทบดละเอยด 1 กรม น าตวอยางทชงแลว เตมน า 25 ml. แลวน ากระดาษ picrate 2 แผน มาผกตดกบ

จก แลวปด flask ทนท ตงทงไวประมาณ 18 ชวโมง ทอณหภมหอง จงน าไปอบทอณหภม 60๐C

62

เปนเวลา 30 นาท (กรณอาหารสตวม HCN กระดาษ picrate จะเปลยนจากสเหลองเปนสน าตาล)

แลวจงน ากระดาษ picrate ออกมาละลายในน ากลน 20 ml. และน าไปวดท 515 m และเปรยบเทยบคาความเขมขนของ HCN กบ std. Curve วธวเคราะหนเหมาะทจะใชกบอาหารสด