Volume 6 Nomor 1, April 2006

ITUBUNGAI\I ANTARA KA}IDT]NGAN IAA DENGAN PERTUMBUHANDAI\[ KAI\II}UNGAI{ KATARANTIN KULTUR AGREGAT SELCatharanthus roseus YANG DIBERI PERLAKUAI\I TRIPTOFAN

DALAM LABU ERLENMEYER

Dingse Pandianganr)

lDrogram Studi Biologi F'MIPA Universitas Sam Ratulangi Manado,95115e-mail: dingsepan@yahoo.com

ialah satu cara untuk meningkatkan #frHetabolit sekunder dalam kultur jaringanumbuhan adalah dengan penambahan prazat (prekursor). Oleh karena itu telah dilakukanrcnelitizn hubungan antara kandungan IAA dengan pertumbuhan dan kandungan katarantin kultur[regat sel tapak dara yang diberi perlakuan triptofan dalam erlenmeyer. Penelitian ini bertujuanmtuk meningkatkan kandungan katarantin dalam kultur agregat sel Catharanthus roseus (L)i.Don yang didukung dengan pertumbuhan yang optimum. Penelitian dilakukan secara:ksperimental di laboratorium. Konsentrasi prekursor triptofan yang digunakan ialah G250 mglL.)ertumbuhan ditentukan dengan penimbangan berat basah dan berat kering serta pengamatanrcrubahan secara morfologis. Analisis kandungan katarantin dilakukan dengan Kromatografi Cair(nerja Tinggi (KCKT) menggunakan kolom VP-ODS C-18. Hasil penelitian menunjukkantahwa kandungan.IAA meningkat dengan bertambahnya konsentrasi triptofan sampai 150 mg/L.(andungan IAA tertinggi sebesar (214,7910,90 pglg.bk) diamati pada perlakuan 150 mg/Lriptofan dengan peningkatan 50,60yo. Peningkatan IAA berhubungan erat dengan pertumbuhangregat sel dengan r = 0,931. Hubungan IAA dan Katarantin yang diberi perlakuan triptofan jugarcsitif dengan r = 0,83. Pertumbuhan yang optimum pada kandungan katarantin dan IAA yangebih tinggi dari kontrol merupakan dasar untuk kultur dalam skala besar yang dapat bekelanjutanlalam bioreaktor.

(ata kunci: agregat sel, Catharanthus roseus,IAA, katarantin, triptofan.

THE CORRELATION OF IAA CONCENTRATION WITH GROWTH AI\IDCATHARANTHINE CONCENTRATION OF Cathoranthus roseus TIIAT WAYS

TREATED WITH TRYPTOPHAN IN ERLEI\IMEYER FLASKS

ABSTRACT

\ddition of the precursor is one ways to increase the concentration of secondary metabolites inrlant tissue culture. Thercfore, the correlation of IAA concentration with growth and:atharanthine concentration Catharonthus roseus that treated with tryptophan precursor waslxamined in this research. This experimental research aimed to enhance the catharanthine:oncelrtration under optimum growth and was conducted in the laboratory. Tryptophan with:oncentation of 0-250 mg/L was used for the culture of cell aggregates. Growth was determinedry measuring fresh weight as well as dry weight and observing morphotogical change.lhataranthine concentration was atalyzed using High Performance Liquid Chiomatography'HPLC) in VP-ODS C-18 column. The rezult showed that IAA concentration increased withncrement of tryptophan concentration as high as 150 mg/L. The highest concentration of LAA'214,79*A,90 pglg.bk) was observed in the treatment of 150 mg/L tryptophan and the increaseNas 50,6004. The increase of IAA concentation positively correlated with the growth of cellrygregates ( F0.931). In the beatment of typtophan, the correlation between concentration ofAA and catharanthine was positive (r:0.83). The optimum growth of cell aggregates at higher:oncentration of catharanthine and IAA than control would be applied in the iargei scale cuiturelfcell aggregates in a bioreactor.

Keywords: cell aggregate, Cathoranthus rosew,IAA, catharanthine, tryptophan.

-

230 Jurnal llmiah Sairu Vol. l0 No. 2, Otdober 2010

PENDAI{T]LUAN

Berdasarkan database NAPRALERT,dari 250.000 spesies tumbuhan sebagaisubjek studi fitokimia, diperkirakan lS%mengandung metabolit sekunder (Verpoorteet al.ZOAA). Metabolit sekunder merupakanproduk yang dihasilkan dalam prosesmetabolisme sekunder tumbuhan. MenurutFiehn (2002) bahwa tumbuhan menghasilkan200.000 lebih metabolit. Sekitar 120.000metabolit sekunder telah diidentifikasi, danterdapat 16.000 tergolong alkaloid. Semuaalkaloid tersebut mempunyai pengaruh aktifterhadap tubuh manusia (Verpoorte et al.2000), Salah satu tumbuhan yang telahdiidentifikasi adalah tapak dara.

Tapak dara (Catharanthus roseus)adalah semak tahunan yang banyakdibudidayakan sebagai tumbuhan hias danobat. Alsxandrova et al- (2000) menyatakanbahwa tumbuhan ini berguna untukmengobati hipertensi, diabetes, pendarahanakibat penurunan junnlah trombosit, chorionicepthelioma, leukemia limfositik akut,leukemia monositik aku! lirnfosarkoma dansarkoma sel retikulum. Tapak dara ini dapatmengobati berbagai penyakit menunjukkantumbuhan tersebut mengandung beberapasenyawa aktif yang berperan sebagai obat.Sekitar 130 macarn alkaloid telahdiidentifikasi pada tumbuhan ini (Mccoy andConnor 2006; Dutta et a1.,2005). diantaranyaadalah alkaloid anti kanker seperti vinblastirLvinkristin, katarantin, leurosidin dan leurosin.Senyawa antikanker yang dikomersialkankebanyakan berasal dari tumbuhan ini,terutama yang berbunga putih (Sutarno andRudjiman, 2003; W[iayakusuma e, a1.,1992;Dalimartha, 2002).

Penelitian tentang prekursor sudahdilakukan semenjak tahun 1970an. Sepertipenambahan prekurscr asam amino padaSalvia officialis dapat merangsangpembenfukan 500 mM asam rosmarinat(Misawa, 1994). Demikian jugaTabataet ol.(1971) melaporkan bahwa penambahan asamtropat ke dalam medium kultur Scopoliajaponica dapat meningkatkan jumlah alkaloidhingga 14 kali lipat. Penambahan t}l pelLprekursor farnesol pada kultur sel T. wilfurdiidapat meningkatkan hipdiolida danpenambahan fenilalanin ke dalam kultur selTmus cupsidata dapat menstimulasibiosintesis taxol (Dicosmo, 1992 dalam

Misawg 1994). Penambahan 50 mglLtripofan pada kultur kalus Rouvolfiatetraplrylla dapat memproduksi reserpinsebesar 2,1 mglg bk (Anita and Kuma{2006). Ltriptofan merupakan prekursor yangpaling tepat untuk meningkatkan produksialkaloid pada kultur jaringan kina (Noli,2004; Diana, 1995) dan tapak dara(Pandiangan dan Nainggolaa 2006a). Selainbelpengaruh terhadap produksi alkaloid, L-triptofan juga mempengaruhi pertumbuhankultur suspensi sel Cinchona succirubra(Schmauder et a1.,1985). Pertumbuhan selterkait juga dengan hormon tumbuh sepertiauksin. Ltriptofan juga merupakan prekursordalam sintesis IAA (Taiz and Zeiger,2003).

Pemberian beberapa konsentrasipekursor tripofan berpengaruh terhadapkandungan metabolit sekunder dari kulturagl;egat *l C.roseus. Pengaruh pemberianprekursor triptofan tersebut dalamErlenmeyer dapat diketahui denganmelakukan pengamatan terhadap kandunganIAA. Pengamatan dan analisis lam penelitianini masih dalam kultur di Erlenmeyer sebagaipercobaan laboratorium. Keluarannya akandigunakan pada kultur dalam Bioreaktor padaskala besar.

METODOLOGI PEI\IELITIAN

Bahan dan MetodaTumbuhan yang digunakan sebagai

sumber eksplan di dalam penelitian ini adalahCatharonthw roseus (L.) G. Don yangberbunga putih. Sebagai eksplan digun:akandaun yang masih aktif mengadakanpertumbuhan yaitu daun ke-3 sampai 4 dariapeks pucuk. Penelitian ini dilaksanakanselama 17 bulan mulai Februari 2008 sampaiSempember 2009 bertempat di LaboratoriumFisiologi Tumbuhan dan Anaiisis BahanAlam SffH ITB Bandung LaboratoriumKimia Analitik LIPI Bandung, Laboratoriumfisik dan analitik Farmasi ITB Bandung.

Teknik induksi kalus mengikutitetnit<aseptik atau in vitro (Pandiangan danNainggolan, 2006c; Pandiangan et al, 20M).Kultur kalus dan subkulturnya dilakukan kemedium baru dengan komposisi yang samadengan medium produksi kalus yaitu padamedium MS padat yang ditambahkan zpt 2mg/L NAA dan 0,2 mg& kinetin. Subkulturini dilakukan secara terus-menerus untukmemperbanyak kalus sebagai sumber eksplan

rada kultur agregat sel dalam Erlenmeyer.

iubkultur kalus dilakukan setiap 21 hari.(alus yang digunakan sudah disubkulturielama I tahun2bulan.

Kultur agregat sel digunakan labu

irlenmeyer 250 mL. Setiap Erlenmeyerrcrisi 50 mL medium cair MS dengan

iombinasi zpt yang sama dengan mediumrroduksi kalus. Kalus yang digunakan sudah

rcrusia sekitar 1 tahun lebih disubkultur.(alus sebanyak 5 g dipindahkan ke mediumvIS cair 50 mL (Son e/ a1.,2000), Yanglitambahkan 2 mdL NAA dan 0,2 mg[Ldnetin (medium NK atau T0) (Pandiangan

lan Nainggolaq 2006c). Kultur agregat sel

tiinkubasi pada suhu kamar dan diagitasirada kecepatan 120 rpm. Subkulturlilakukan setelah L4 hari dengan cara

nengganti medium cair yang lama dengan

nedium cair yang baru dengan komposisirutrisi yang sama dengan medium;ebelumnya.

Agregat sel hasil kultur dipisahkan

lari mediq kemudian media sisa pada

gregat sel dikeringkan menggunakan kertas

risap dalam pretridish steril, kemudian

litimbang kemudian disubkultur. Wadah

rultur yang digunakan adalah labu

irlenmeyer 100 mL. Setiap Erlenmeyer

Erisi 25 mL medium cair MS dengan

iombinasi zpt yang sama dengan mediumrroduksi kalus tapi tanpa agar. Subkulturlalam Erlenmeyer dengan perlakuan triptofan), 50, 100, 150, 200, 250 mglL dilakukanangsung pada saat subkultur kedua. Beratnokulum yang digunakan dalarn kulturlalam Erlenmeyer adalah 2 g agregat sel.

\gregat sel ditimbang secara aseptik dalam

',aminor airflow ketika sedang subkultur.Kandungan metabolit sekunder

lalam kultur agregat sel C. roseus diperolehnenggunakan FIPLC dengan menggunakanrolom Shimpack VP-OS, 18, 150x4,6 mm.(ondisi running menggunakan eluen MeOh :

\CTN : 5mM DIIF (3:4:3) dengan

iecepatan lmVmiru atenuasi 6, speed 5

nm/min, isokratik pada UV Vis 254 nm.

ilASIL DAI\[ PEMBAHASAI\I

Pengamatan lAA Perlu dilakukanlalam penelitian ini. Prekursor triptofanrcrlaku juga terhadap IAA, selain sebagai

rekursor alkaloid dan katarantin. Oleh

mrena itu sangat penting diamati sebagai

Pandiangan: Hubungan Antara Kandungan UA dengan ...-. 231

salah satu parameter dalam penelitian ini.Disamping itu supaya dapat dikaitkan antara

peranan triptofan terbadap produksi metabolitdengan peftmnya terhadap pertumbuhannya

akibat adanya IAA.Rata-rata kandungan IAA dalam

kultur agegat sel C.roseas yang dib€riperlakuan triptofan dalam labu erlenmeyerdapat dilihat pada Tabel l. Kandungan LAA

mengalami peningkatan sampai pada T4 dari

kontrolnya. Peningkatannya mencapai

50,60y, terjadi pada T3. Tetapi berbeda

dengan T5, justru mengalami p€nurunan

kandungan IAA sebesar 25,77yo. Penurunan

ini mungkin disebabkan pH yang semakin

tinggi pada perlakuan tersebut. Berdasarkan

hasil uji korelasi antara perlakuan triptofandan pH (Taiz and Zeiger,2003). Perlakuan

triptofan meningkatkan pH pada mediasetelah steril dan setelah kultur 14 hari.Agregat sol membutuhkan pH optimum(Lehniger, 1990) agar dapat menginduksiaktivitas Enzim sintesis IAA.

Berdasarkan padl hasil analisisANAVA pada perlakuan triptofan dari 0, 50,

100, 150, 200 dan 250 mglL berPengaruhsangat nyata terhadap kandungan IAA dalamagregat sel. Kandungan IAA maksimumterdapat pada perlakuan T3 yaitu sebesar

213,73 pde bk (Gambar I dan Tabel 1).

Hasil analisis ANAVA kemudian selanjutnyadiuji perlakuan yang paling berpenganrh

melalui uji Duncan (DNRT). Hasil uiiDuncan menunjullkan bahwa umumnyaperlakuan triptofan memimbulkan pengaruh

yang berbeda terhadap kandungan [AA dalamagregat sel pada hari ke-14 Cfabel 1).

Perlakuan yang paling berpengaruh adalahperlakuan T3 (150 mglL triptofan).Berdasarkan analisis tersebut disimpulkanbahwa penambahan triptofan terhadap kulturagregat sel mulai dari 0-250 mg& dapat

meningkatkan kandungan LAA dalam agegatsel C.roseus.

Kandungan IAA dalam agregat sel

yang diberi perlakuan tiptofan mempunyaipola seperti kurva pertumbuhan agregat selpada percobaan tahap 4 sebelumnya. Hasilanalisis korelasi antara pertumbuhan atau

berat basah dan kandungan IAA sangat

berkorelasi positif. Besarnya korelasi tersobut

0,931 atau 93,1Yo. Hubungan ini j,rga

dinyatakan dengan r = 0,931 dan persamaan

sebagai berikut: Berat basah (g):0,59075 +

0,01455 IAA (pg/g bk) atau Gambar 2. Hal

t3

lrutr!IA

Tr

Ka

Gamagrelerlen0 cr((T5),perla

terhryanePerftmenlBerdd.patidakkons

2

1l

I!r{

p€ngkandrtumb

232 Jurnal llmiah Sains Vol. l0 No. 2, Oktober 2010

ini menunjukkan bahwa perlakuan prekursor sebesar 5A,6Oya. Peningkatan tertinggi initriptofan dapat meningkatkan kandungan terjadi pada T3 (150 mg/L triptofan).

--IAA dalam kultur agregat sel C.roseus

Tabel 1. Rata-rata kandungan IAA (pglg bk) dan peningkatan dari kontrolnya padaagregat sel c. roseus yang diberi perlakuan triptofan (mdl) 0 (T0), 50 (Tl), 100(T2), 150 (T3), 200 (T4),25A (T5), pada hari ke-14 setelatr kultur pada mediumperlakuan.

PerlakuanTriptofan

Kandungan IAA(m/e bk) Peningkatan

IAA (%)Notasi

DuncanRata-rata *SDTO 142,63 *2,76 0,00 bT1 1,44,92 +1,05 1.61 bT2 164,23 *0,90 15.15 dT3 214,79 +0,90 50.60 e

T4 759,6A *0,90 l1.90 cT5 105,86 *1,10 -25-77 u

Ketetangan: Rata-rata dari 3 kali pengukuran. Huruf yang sama dalam notasi Duncan dalam tabelinenunjukkan tidak berbeda nyata pBda tarafsignifikansi u-0.05.

sel tumbuhan. IAA menurun pada perlakuankiptofan yang tinggl mungkin suatumekanisme penghambatan feedbackTriptofan yang berlebihan akan menghambatkerja enzim antranilat sintase untukmenkatalisis korismat meqiadi antranilat padajalur sintesis IAA (Taiz and 7,eige9,2002).Disamping itu dapat juga disebabkanbiodegradasi IAA oleh peroksidase menjadi3-metilenoksindol (Gambar 4). Aktivitas POlebih tinggi pada agregat sel yangmempunyai pertumbuhan rendah juga padapercobaan tahap sebelumnya.

fBi

Gambar 1. Grafik kandungan IAA (pglg bk) dariagregat sel tapak dara(C.rosew) dalamerlenmeyer yang diberi perlakuan triptofan (mg/L)0 (T0),50 crl), 100 (T2), 150 (T3),200 (T4),2s0(T5), pada hari ke-14 setelah kultur pada mediumperlakuan.

Pengaruh prekursor triptofanterhadap kandungan IAA merupakan faktoryang mendukung pertumbuhan agregat sel.Pertumbuhan sel dengan kandungan IAAmenuqiukkan pola yang sama (Gambar 3).Berdasarkan pada analisis kandungan IAAdapat terjawab bahwa pertumbuhan sel yangtidak selalu meningkat dengan meningkatnyakonsentrasi hiptofan disebabkan oleh adanyapengaruh prekursor triptofan terhadapkandungan LAA. IAA merupakan hormontumbuh yang secara alami disintesis dalam

{,-"lO 120 t{) :,t60 'l& N :@tt : ztfi. M{ryltl) l *'l

Gambar 2. Korelasi kandungan IAA (pgll,medium) dan berat basah dari medium kulturagegat sel tapak dara(C.roseus) dalamerlenmeyer yang diberi perlakuan tiptofan (mg/L)0 (T0),50 (Tl), 100 cr2), 150 (T3),200 (T4),250(T5), pada hari ke- 14 setelah kultur pada mediumperlakuan.

6

iEo

L8

a6

u2.0

3T

13

Tl 12 T3 r rT4

r P€d(6 irtrtjtan l

TO T1 T2 T3 T4 T5

Pandiangan: Hubungan Antara Kandungan IAA dengan ..... 233

Gambar 3. Pengaruh triptofan terhadap

perumbuhau (pengamatan berat basah dan IAA)agregat sel tapak dara (C.roseus'1 dalam

erlenmeyer yang diberi perlakuan triptofan (mg/L)

0 (T0), 50 (T1), 100 (T2), 150 (T3), 200 (T4),250(T5), pada hari ke- 14 setelah kultur pada mediumperlakuan.

Peroxidase- --{' >

{CO:

KESIMP{'LAI{

1. Pedakuan triptofan dapat meningkatkankandungan IAA dalam kulturFrlenmeyer.

a.XKandunlan IAA meningkat sampaiperlakuan triptoftn 150 mglL Yaitusebesar 214j9+0,90 pdg bk denganpeningkatan 50,60Yo.

3. Peningkatan IAA berhubungan erat denganpertumbuhan agregat sel yaitu dengan r =0,931.

4. Hubungan IAA dan Katarantin yang diberiperlauan triptofan juga positif dengan r =0,83.

5. Kandungan IAA dan katarantin serta

pertumbuhan mempunyai Perlakuantriptofan optimum Pada Perlakuantriptofan 150 mg/L pada agregat sel

C.rosetn dalam ErlenmeYer.

Ucapan trimakasih:Ucapan trimakasih disamPaikan

kepada Satuan Kerja Universitas Sam

Ratulangi Kementerian Pendidikan Nasionalmelalui DP2M-Dil(i atas bantuan penelitianMulti tahun melalui DIPA Unsrat dengan no0147.0/023-04.0D(XVIV20I0 Tanggal 3lDesember 20A9 Tahun Anggaran 2010.Demikian juga dengan LaboratoriumFisiologi Tumbuhan SITH ITB atas fasilitasyang diberikan dalam penyelesaian penelitianini diucapkan trimakasih.

DAFTARPUSTAKA

Alexandrovq R., I. Alexandrov4M.Velcheva" T. Varadinova. 2000.Phytoproduct and Cancer.Experimental Pathologt ondParasitologt Bulgarian Academy ofSciences.

Anita S., and B.D.R. Kumari. 2006.Stimulation of reserpine biosynthesisin the callus of Rauvolfia tefiaphyllaL. by precursor feeding. ,lfricanJournal of Biotechnolg YoL 5(8):659461.

Dianq S. 1995. Pengaruh L-TriptofanTerhadap Pertumbuhan dan ProduksiAlkaloid Kultur Akar Kina Cirrchonaledgeriana (Howard) Moens [Tesis]Jurusan Biologi ITB Bandung.

bo:,

lndoleil'acetlc add '

Asu setat krdol (IAA)

Gambar 4. Degradasi IAA(Deka6oksilasi IAA) menjaCi(Taiz and ZeigYr,2002)

3-Meihyleneoxtndole

3-metilmokSindol

oleh peroksidase3-metilenoksindol

Hubungan variabelpengamatan dengan kandungan katarantindapat diketahui melalui analisis korelasimelalui program Statistica. Besar koefisienkorelasi dari setiap parameter yang diamatipada agregat sel C.roseus yang diberiperlakuan triptofan dalam Erlenmeyersetelah kultur 14 hari. Hal ini penting untukmenjelaskan keterkaitan antara setiapparameter dalam mendukung peningkatankandungan katarantin pada kultur agregat sel

tapak dara. Hubungan dengan IAAmernpunyai korelasi positif dengan besar

koefisien korelasi 0,83. Hasil analisiskorelasi ini menunjukkan bahwa hubunganyang meningkatkan kandungan katarantinkultur Erlenmeyer adalah kandungan IAA.Tipe sel dan subkultur juga tidak kalahpefltingnya mempengaruhi kandungankatarantin yang diberi perlakuan fiiptofan(Rijhwani and Shanks, 2008). Sel kalus dan

suspensi telah diteliti dan dibandingkan olehWilkens et al., (2005) dan menyatakankedua tipe sel tersebut mengandungmetabolit sekunder berbeda.

-

234 Jurnal Ilmiah Sains yot. l0 No. 2, Ofuober 2010

Dutta {.,_J. Batra., S. pandey-Rai, D. Singh.,S. Kumar., J.!9n. 2005. Expression ofterpenoid indol alkaloid biosyntlpticpatlway genes corresponds tuaccumulation of related alkaloid inCatharanthus toseas (t ) G. Don.Plantq. Spinger-Verlag. New Delhi.220:376-383.

Fiehn, O. 2002. Metabolomics: the linkbetween genotypes and phenotypes.Plant Mol Biol4g: lS5_171'.

Irhninger, A.L. 1990. principles ofBiochemistry 4h Mition. O.t. Netsonand M.M.. Cox (Eds). pp.?B-90, 147-,67 I -680, Worth publisher, Inc.

Misawq M. 1994. plan Tissue Cultwe: AnItleryative for production of UsefulMetaboliteson of Usefut Meiabolites.Bio International Inc. Canada.

Pandiangan D, N. Nainggolan. 2A06a.Produksi alkaloid dari kilus tapak dara.Jurnal llmiah Sains 6:4g_54.

Pandiangaq D. 4an N. Nainggolan. 2006b.Peningkatan produksi tatarantin paAakultur kalus C roseus yang diberiNAA. Jurnal Hayati tl::l p.OO-Sl

Pandiangan, D., D. Rompas, H. AritonangR. Esyanti, E. Marwani. 20}6.Pengaruh triptofan terhadappertumbuhan dan kandungankatarantin pada kultur kalus C ,ori*.Jurnal Matematika dan Sains11:4,1 1t-118.

Rijhwani, S. K. and J. V. Shanks. 2008.Effect of subculture cycle on erowthand indole alkaloid productiin byCatharanthus toseus hairy rootcultures. Enzyme and MicrobiotTechnologt 22: 606411.

Son, S.H., S.M.Choi, y.H.[,ee, K.B. Choi,S.RYun, J.K.Kim, H.J.par(O.\M.Noh, J.H.Seon, y.G.Fark. 2000.Large-scale growth and taxaneproduction in cell cultures of Toxuscuspidae (Japanese yew) using anovel bioreactor. plutt Cell Re)ortst9:628-633.

Sutarno H., and Rudjiman. ZAfR. plantResources of South East Asia No l.Medicinal snd poisonous plants,Baclihuys publisherds, Leiden.

Taiz L. and Zniger, E. 2003. plantPlrysiologt, 3rd ed. publisher: SinauerAssociates. p 423460

Verpoorte, R., R. van der Heijden and J.Memelink. 2000. Engineering the plantcell factory for secondary metaboliteproduction. Transgenic Research 9:323143.

W{iayakusuma, H.M.H., S. Dalihmarta A.S.Winar. 1992. Tanaman Berkasiat Obatdi Indonesia. Jilid I. pustaka Kartini,Ikapi Jaya

Wilken, D E.J.Gonzalez, A. Hohe, M.Jordan, R* G Kosky, G. S, Hirschmannand A. Gerth. 2005. Corrparison ofsecondary plant metabolite productionin cell suspension, callus eulfure and

1:mporary immersion system. In: A.K. Hvoslef-Eide and W. preil (Eds)Liquid Culture SJtstems For In WtroPlont Propagation.Springer Netherlands.

pp.525-538.