Tiirk Ndro§inirji Dergisi 11: 27 - 31, 2001 UIl/ii: Vernpamil ile LTyanlllll§ Dorsal Kdk Gallglioll Hiicresi RejellernsyolIl/

Verapamil ile UyarI1ml~ Dorsal KokHiicresi Rejenerasyonu

Ganglion

Verapamil Induced Dorsal Root Ganglion Cell Regeneration

ACAHAN UNLU, GOKALP SiLA V, AY$E KARA TA$, BERMANS ISKANDAR

Ankara Universitesi TIp Fakultesi Noro~iriirji Anabilimdah (AU, CS, AK), Ankara

Wisconsin Universitesi TIp Fakultesi Noro~irurji Anabilimdah (BD, Madison, Wisconsin, ABD

Celi~ Tarihi: 01.11.2000 ~ Kabul Tarihi: 11.12.2000

Ozet: Gunumuzde travma, inme, dejeneratif hastahklarnedeniyle olu~an noronal kaYlplann azaltJlmasl yadayeniden kazandmaSlnl ama<;layan bir <;ok <;ah~mayapJlmaktadlr. Hucrede bir <;ok olaym duzenlenmesindeyer alan ikincil mesajcl sistemi i<;inde yer alan kalsiyumunetkileride bu ara~tIrmalara konu olmu~tur. Bu ama<;la,

bir kalsiyum kanal engelleyicisi olan Verapamil'inSantral Sinir Sistemi rejenerasyonu'na olan etkileriara~tInlml~tIr. Dorsal kolonlan hasarlandlnlml~ ve

siyatik sinirleri kesildikten soma C2 seviyesinde dorsalkolonu uzerine eklenmi~ olan sl<;anlarda periton i<;ineverilen 0.1 mg/kg dozundaki Verapamil'in etkileri,plasebo kullamlan ve sham gruplan ile kar~lla~tmlml~tlr.Sonu<;ta, bu dozda verilen Verapamil ile 75±16 hucrederejenerasyon oldugu saptanml~ ve plasebo (33.5±9.7) vesham (33±4.2) gruplan arasmda istatistiksel olarak farkbulunmu~tur (t-testi, p=0.004 ve p=0.002). Elde edilen birdiger sonu<; ise siyatik siniri kesilen taraftaki dorsal kokhiicre rejenerasyonunun kesilmeyen kar~l taraftakirejenerasyon oranmdan fazla oldugudur. Sham grubunda19.3±5.4, Plasebo grubunda 15.5±2.1 hucre rejenereoln1U~tur. Verapamil grubunda 20± 11.1 hucresaY11abilmi~tir. Bu bulgular l~lgmda bir kalsiyum kanalblokuru olan Verapamilin santral noronlannrejenerasyonunu artIrdlgl bulunmu~tur.

Anahtar KelimeIer: Dorsal kok gangliyonu, kalsiyumkanal antagonisti, sinir rejenerasyonu

Abstract: So far, lot of studies have been done to improveor regain the neuronal disfunction and loss, caused byneurodegenerative diseases, stroke and trauma. Calciumwhich is a member of seconder messenger systeminvolved in regulation of cellular events, has been thesubject of some experiments. For this purpose, the effectsof Verapamil-HCl, which is a voltage gated calciumchannel blocker, on Central Nerve System regenerationwas studied. The effects of 0.1 mg/kg dose on rats, whosedorsal column injured and grafted with a sciatic nervegraft at C2 level, was compared with placebo and shamsurgery groups. As a result, there was regeneration in75±16 cells and statistical analyse revealed significantdifference between placebo (33.5±9.7, p=0,004) and shamsurgery (33±4.2, p=0,002) groups. The regeneration atsciatic nerve lesion side is greater than the other sidewhich the sciatic nerve was not cut. In Sham surgerygroup 19.3±5.4, in plasebo group 15.5±2.1, and inVerapamil group 20±11.1 cells were regenerated. It wassuggested that Verapamil improves the regeneration ofnerves.

Key Words: calcium channel blocker, dorsal root ganglion,nerve regeneration

Tiirk Naro§iriirji Dergisi 11: 27 - 31, 2001 Un/ii: Verapami/ ile Uyanlmz§ Dorsa/ Kok Gang/ion Hiicresi Rejenerasyonll

Her yll milyonlarca insan travma, dejeneratifhastahklar ya da stroke gibi nedenlerden dolaYIya§amml ya da noronal fonksiyonlarmdan birklsmml kaybetmektedir. Bu kaYlplannazaltllabilmesi i~in bir ~ok ~al1;;malaryapllmaktadu(1,2,4,12-14,17,18). Noronlann bu gibidurumlardan sonra olu§an birincil ve ikincilhasarlardan korunmasl ilk plandaki ama~ olarakdii§iiniilmii§tiir. Bu ama~la bir ~ok deneysel ya daklinik ~ah§ma yapllml§tlr. Noronlarm olu§acak yenihasarlardan korunmasl ile ilgili bazl olumlugeli§meler olsa da hasar somaSI kaybolan noronlannyerlerine yenilerinin konulmasl ile ilgili ~ok ba§anhsonu~lar ahnamaml§tlr. Her ne kadar iimit vericigeli§meler olsa da heniiz yetersiz durumdadlr.

Noronal rejenerasyon ~ah§malarmda degi;;ikmodeller kullamlmaktadu. Sempatik gangliyonhiicreleri, dorsal kok ganglion hiicreleri, retinalgangliyon hiicreleri ula;;llabilir ornekler olarakolduk~a onem kazanml;;tlr. Santral ozellikli hiicregovdesinin santral sinir sistemi dl§mda bulunmasldeneysel ~ah;;malar i~in olduk~a yararh olmu§tur.Memelilerde smuh olan rejenerasyon ozeUiklerinindaha alt canhlarda kaybolmaml;; olmasl bu canhlardayapllan ~ah;;malarda rejenerasyon yetenegi ile ilgilidirekt bilgiler de saglanml;;tlr.

Kalsiyumun santral sinir sistemi noronlaniizerindeki etkileri hem rejenerasyon ~ah§malanndahem de hiicre has an ya da oliimii ~ah§malanndaara§tlnlmaktadlr.

Normal durumlarda kalsiyumun hiicreye giri;;ikanal reseptorleri araClhgl ile olmaktadu. Bunlararasmda voltaj duyarh kalsiyum kanal reseptorleri(VSCCR),N-metil D-aspartat reseptorleri (NMDAR),noronal acetylcholine reseptorii (n AchR), tip 3serotonin reseptorleri (5 HT3R) kalsiyum ge~irgenAMP A and kainate glutamate reseptorleri saYllabilir.VSCCR leride kendi i~inde L,N,P,Q ve T alt tiplerii~erir(7,10,11).

Hiicre i~indeki kalsiyum konsantrasyonu, hiicrei~ine ahmml kontrol eden kanal reseptorlerine ekolarak, bazl depolama (Endoplazmik retikulum ER)ve tamponlama-ta;;lma sistemleri ile de gereklidiizeylerde tutulur(9).

Kalsiyumun hiicreye giri§ yolu ve intrasellulerkonsantrasyonu hiicreyi degi§ik §ekillerdeetkileyebilir. Kalsiyum hiicre ya§am oramm

artlrabildigi gibi hiicre oliimiine de neden olabilir.Kalsiyumun hiicre i~indeki daglllml da hiicrededegi§ik yamtlara neden olabilir. Aynca VSCCR leridehiicre oliimii, norit biiyiimesi, sinaps formasyonu,fenotipik farkhla;;ma gibi etkileri kontrol ederler(8).

MATERYAL VE METOD

Bu ~ah§mada aglrhklan 200-250 gram arasmdadegi§en 12 adet di§i Spraque Dawley sl~an (HarlanSpraque Dawley, Indiana) Wisconsin UniversitesiTIP Fakiiltesi Hayvan Baklm Unitesi ile yapllanprotokole gore kullamlml§tlr. Hayvanlar Ketamin­HCl ve Xylazin Firma adl-iilke kan§lml ileuyutulduktan soma sol siyatik sinir hem hazulaYlcllezyon yapmak hemde gref olarak kullanmak amaClile eksize edilmi§tir. Bu insizyon kapatlldlktan somaiist servikal bolgede yapllan orta hat insizyonu ile,C2 totallaminektomi yapllml;;, dura a91dlktan somaorta hattm her iki yamnda Imm uzakhkta ve Immderinlikte bilateral dorsal kolon hasan

olu§turulmu;;tur ($ekil 1). Daha soma siyatik sinirgrefti bu lezyonlann iizerine gelecek ;;ekilde piaya1010 monofilaman naylon siitiirle dikilmi§tir. Greftindistal ucu oksipital kemik periostuna tespit edilipinsizyon kapatllml§tlr. Sham grubuna herhangi birila~ ya da ila~ ta§IYlclSI verilmemi;;tir. Plasebogrubuna ise Verapamil-HCl nin i~inde ~oziildiigiiFosfat tamponlu salin (PBS) i~inde 1/1000 EtOH 0.5ml verilmi§tir. Deney sonunda, 2. giinde, 4. giindeve 6. giinde 0.1 mg/kg dozunda Verapamil-HCI~oze1tisi 0.5 ml intraperitoneal olarak 4 kezverilmi§tir. 12. giinde servikal insizyon a~lhp graftucu bulunmu§ ve 3 ml Fluorogold (FG)(16)(Fluorochrome, Denver,CO) (Excitation 350-395 nMI Emission 530-600 nM) ile i§aretlenmi§tir. 2 giinsoma hayvanlar yiiksek doz Ketamin/Xylazinkan§lml ile uyutulup intrakardiyak olarak 60 ml, 0.1M PBS ve 300 m!. %4 Paraformaldehid ile perfiizeedilmi§tir. Sol taraf ve sag taraftan L5 Dorsal kokgangliyonlan (DKG) ~lkanlml§, %4 Paraformaldehidve %20 Sukroz ile muamele edilmi;;tir. Bu DKG ler,daha soma SIVInitrojen ile OCT (Histoprep, FisherScientific) i~inde dondurulmu§ ve cryostat ile 14 mm.kalmhgmda kesilmi;;tir. Bu ornekler floresansmikroskop (Axioscope, Zeiss, Almanya) altmdaincelenmi§ve fluorogold ile i;;aretlihiicreler saYllml§tlr($ekiI2). Sonu~lar t-testi, normalite, equal variance, veMann- Whitney Rank Sum Testi kullamlarakdegerlendirilmi§tir. Veriler ± SD olarak verilmi§tir.

SONUC;LAR

Sham grubunda siyatik sinirin kesildigi tarafta

Tlirk Noro~irurji Dergisi 11: 27 - 31, 2001

Lezyon yeri

7sm.

Ul1lU: Verapamil ile Uyarzlml~ Dorsal Kok Gal1gliol1 HIicresi Rejel1erasyol111

rejenere olan hucre SaYls133±4.2olarak bulunmu~tur.Plasebo grubunda 33.5±9.7 hucre rejenere olmu~tur.Verapamil verilen grupta 75±16.0 i~aretlenen hucresaYllml~hr. Gruplar kar~lla~hnldlgmda plasebogrubu ve sham grubu arasmda istatistiksel bir anlamyok iken (p=O.928),verapamil ile aralannda belirginfark saptanml~tlr.(p=O.002 ve p=O.004)

Siyatik sinirin kesilmedigi, kontrol kani1 taraftasham grubunda 19.3±5.4 hucre saptanml~tlr. Plasebogrubunda 15.5±2.1 hucre rejenere olmu~tur.Verapamil grubunda 20±11.1 hucre saYllabilmi~tir.Bu grup degerleri kendi aralanndakar~lla~tlflldlgmda aralarmda istatistiksel anlamhfark bulunamaml~tlr. ($ekiI3)

$ekil 1: Cerrahi uygulamanm §ematik gosterimi. Lezyonyeri, deneysel DKG tarafmda siyatik sinir kesilmi§ve kar§! tarafmdaki (Kontrol) DKGgosterilmektedir.

L5 DKG(Sol)-

Kontrol DKG

(Sag)

Siyatik sinir kesilen taraf ile kesilmeyen tarafdegerleri kar~lla~tlflldlgmda tUrn gruplardaistatistiksel anlamh fark saptanml~tlr(sham,p=O.Oll,plasebo, p=O.007, verapamil, p=O.OOl).

TARTI$MA

Aslmda hucre hasan ve hucrenin hasara

yamtlan ile ilgili mekanizmalar <;okkarma~!k olsada rejenerasyon oncesinde ortaya <;lkandegi~ikliklerde rejenerasyonun seyrini degi~tirecekdurumdadlr. Bu mekanizmalarm buyuk bir klsmmdakalsiyuma bagh aktivasyonlar ve bunun sonundaortaya <;lkanolaylar rol oynar. Axotomi sonrasmda,

$ekiI2: Fluorogold ile i§aretlenmi§ rejenere olan DKG hiicreleri. (A) Sham grubunda kontrol taraftan alman ornek, (B)Shamgrubunda siyatik sinirin kesilmi§ oldugu taraftan alman ornek. (C)Plasebo grubunda kontrol taraf, (D)Plasebo grubundasinir kesilen taraf, (E) Verapamil verilen grupta kontrol taraf, (F) Verapamil grubunda sinir kesilen taraf. X200

Turk Noro§irurji Dergisi 11: 27 - 31, 2001 Cln/U: Verapamil ile Uyanlml§ Dorsal Kok Ganglion Hucresi Rejenerasyol1ll

Verapamil ile uyanlml~ hucre rejenerasyonu

100

80

60iii >.,'"<fJ~

40u ':i:r:

20

0

"0 "0"0>bI:!>bI:!>bI:!'" '"'"<Jl <Jl:z<Jl<Jl:zb E6bE'6

..a '" ..a'"<lI<lI'" ..<:

8-'"..<:'"'" <Jl '"<Jl0.-

E: ~E: ~<lI<lI> >

$ekil 3: Sonu<;lann grafik gosterimi. (Sol: Sinir kesilentaraf), (Sag:Sinirin kesilmedigi kar§l taraf)

hasar yerinden kalsiyum akr~l ile hucre i<;indebelirgin konsantrasyon degi~ikligi olu~ur.Hasarlanml~ axon ucunda konsantrasyon Imm'dendaha azdu. Axonal hasar yerinin membran ilekapatIlmasl sonucunda serbest kalsiyumkonsantrasyonu normal degerlere iner. Buyukyaplsal degi~ikliklerin oldugu bolge ileaksoplazmamn degi~medigi smuda intrasellulerkalsiyum konsantrasyonu 300-500 mMarasmdadu(21). Burasl yaplsal degi~iklikler ilenormal axoplazmanm slmndu. Hasarlanmaml~noronlarda da benzer ~ekilde konsantrasyonlannolu~turulmasl ile aym yaplsal degi~iklikleruyanlabilmi~tir. Yaplsal olarak keskin slmrlarmbulundugu bu yerde kalsiyum konsantrasyonfarklan bu kadar keskin degildir(21). Bu kalsiyumseviye degi~iklikleri ultrastruktural degi~ikliklereneden olabildigi gibi hucre olumune de nedenolabilir.

Axotomi sonrasmda axonal retraksiyon,membran olu~umu ile kesik ucun kapahlmasl(20),kom~u axonal segmentin duzle~mesi, hasarlanml~axonal segmentden lamellipod uzamml, axonucundaki konsantrasyonun 1.5mm seviyesini a~maSlsonucunda mikrotubullerin kaybolmasl, elektrondense deposit birikimi, ve bu bolgeye hem en kom~ubolgede mikrotubullerin krsalmasl ve paraleldizilimlerin kaybolmasl gibi olaylar olmaktadlr(21).Bu olaylar rejenerasyon i<;ingerekli ilk a~amalardlr.Bundan sonraki a~amalarda yeni buyume konisi

olu~umu, rejenere yapmm yolunu bulmasl ve uygunsinaps olu~umu vardlr. Hucrenin ilk a~amalan ge<;ipge<;emeyecegi hucrenin ilk tra vma Yl a tla tmayetenegine baghdu. Yani hucrenin oldurucukalsiyum seviy~lerinden kurtulabilmesi gereklidir.Bu ama<;la deneyimizde bir L tipi VSCCR olanVerapamil kullamlarak hucre i<;ine a~m kalsiyumgirmesi engelenmeye ve dolaYlsl ile sonrakirejenerasyon a~amalanna ge<;mesi saglanml~hr.

Yapllan <;ah~malarda hucre olUmunun ilkhaftada olduk<;a hIZll oldugu ve tubulin gibi hucreiskelet elemanlarmm ta~mmasmm yava~ladlgl ve genexpresyonu farkhla~masmm azaldlgl devreyeuydugu bildirilmi~tir. Bu nedenlede ilk haftada 0.,2., 4., ve 6. gunlerde Verapamil verilmi~ ve budevrede hucre kalsiyum konsantrasyonu oldurucuyuksek degerlerin altmda tutulmaya <;ah~llml~hr.Gene bir kalsiyum kanal blokuru olan Flunarizinin,DKG lerde sinir buyume faktorunun (NGF) etkisininaxotomi sonucunda soma uzerinden kalkmaslsonucu ortaya <;lkan sinyalleri duzenleyerek,kromatin kondansasyonunu engelledigi dolaYlsl ileapoptozisi engelledigi gosterilmi~tir. Apoptozisegiden yolda onemli olan PI3-kinaz enzimininengellenmesinin buna neden oldugusamlmaktadlr(19). Verapamilin de benzer ~ekildehucre sinyal iletim yollanna etki ederek, hucreolumunu engelledigi, ya~ayabilirligi arhrdlgl vedolaYlsl ile rejenerasyona neden oldugudu~unulmu~tur(19).

Bu deneyde kullamlan siyatik sinir graftlerini<;erdikleri destekleyici faktorlerden yararlanmak,buyume i<;inengelleyici olan santral sinir sistemi glialortammm rejenerasyonu destekleyen periferik sinirschwann hucre ortamma degi~tirilmesi amaCl ilekullamlml~ ve yararh oldugu gosterilmi~tir(3,5). Bumetod DKG rejenerasyon deneylerinde slk<;a yege<;erlibir yontem olarak kullamlml~hr.(15) Siyatiksinirin kesilmesinin aym taraf DKG santralaxonlanmn rejenerasyonuna etki ettigi gosterilmi~ yebu tip lezyonlar "hazlrlaYlcl lezyonlar" olaraktammlanml~tIr(6). Burada ama<; distal axonunkesilmesi ile ortaya <;lkansomatik degi~ikliklerdensantral axonun yararlandullmasldu. Periferikaxonun kesilmesi ile ortaya <;lkankromatolizis, bazlyaplsal proteinlerin yaplm ye ta~mma hlZl artl~l gibihucresel degi~iklikler DKG hucresinin santralaxonunun kesilmesi ile elde edilememi~tir. Periferiksinirlerin axotomi sonrasmdaki ortaya <;lkanrejenerasyon, santal axonlarda yeterli olmamasmmnedenleri arasmda bu farkhhklann olmasl ilea<;lklanmaya <;ah~llml~hr.

Tiirk Ndro~iriirji Dergisi 11: 27 - 31, 2001 UIl/U: Vernpamil ile LTyanlml~ Dorsal Kdk Gallglioll HOeresi Rejellernsyollll

Deney sonu<;lanmlzda hazIrlaYlCl lezyoni<;ermeyen tarafta rejenerasyonun i<;eren taraf goredaha az oldugu saptanml~tIr. Bu sonu<;tarejenerasyonu hazIrlaYlCl lezyonlann artIrdlgl~eklindeki bulgularla uyumlu olmu~tur.

SONU<;

Santral sinir sistemi hiicrelerinin rejenere olmasliizerine bir <;ok<;ah~ma yapllmaktadlr. Burada ama<;bu yetenegi klSlth olan SSS hiicrelerinin rejenereolmasl sonucunda, travma, iskemi dejeneratifhastahklar sonucunda ortaya <;lkan fonksiyonkaYIplannm yeniden kazamlmasldlr. Giiniimiizdebu <;ah~malar her ne kadar tam olarak yiiz giildiiriiciiolmasa da, giiniin birinde kaYlp noronalfonksiyonlann tam olarak geri dondiiriilmesimiimkiin olacaktIr.

YaZl~ma Adresi: Dr. Agahan UnlUTusso Bloklan N-1/ 14Emek-Ankara 06510

agahan@ixir.comTel: 312-3103333/ 2629Fax: 312- 309 4340

KAYNAKLAR

1. Aguayo AI, Muller KI, Views on regeneration in thenervous system. Journal of Neurobiol Vol 23, NewYork: Wiley, 1992,467-604

2. Aguayo AI, Nicholls JG, Development andregeneration of the nervous system: a discussion.Philosophical transactions: Biological sciences. Vo!.331, London; Royal Society, 1991, 253-350

3. Bahr M, Eschweiler GW, Wolburg H : Precrushedsciatic nerve grafts enhance the survival and axonalregrowth of retinal ganglion cells in adult rats. ExpNeurol 116(1): 13-22, 1992

4. Borgens RB, Blight AR, Murphy DJ : Axonalregeneration in spinal cord injury: a perspective andnew technique. J Comp Neurol 250(2): 157-167, 1986

5. Campbell G, Lieberman AR, Anderson PN, TurmaineM: Regeneration of adult rat CNS axons into peripheralnerve autografts: ultrastructural studies of the earlystages of axonal sprouting and regenerative axonalgrowth. J Neurocytol 21(11): 755-787, 1992

6. Dahlin LB, Kanje M : Conditioning effect induced bychronic nerve compression. An experimental study of

the sciatic and tibial nerves of rats. Scand J PlastReconstr Surg Hand Surg 26(1): 37-41, 1992

7. Desmadryl G, Hilaire C, Vigues S, Diochot S, ValmierJ : Developmental regulation of T-, N- and L-typecalcium currents in mouse embryonic sensoryneurones. European Journal of Neuroscience 10(2):545-552, 1998

8. Franklin JL, Johnson EM, Jr.: Suppression ofprogrammed neuronal death by sustained elevationof cytoplasmic calcium. Trends Neurosci 15(12): 501­508, 1992

9. Ghosh A, Ginty DD, Bading H, Greenberg ME :Calcium regulation of gene expression in neuronalcells. J Neurobiol 25(3): 294-303, 1994

10. Ghosh A, Greenberg ME : Calcium signa ling inneurons: molecular mechanisms and cellular

consequences. Science 268(5208): 239-247, 199511. Greenberg DA: Calcium channels and calcium channel

antagonists. Ann Neurol 21(4): 317-330, 198712. Inoue T, Kawaguchi S, Kurisu K : Spontaneous

regeneration of the pyramidal tract after transectionin young rats. Neuroscience Letters 247(2-3): 151-154,1998

13. Olson L : Regeneration in the adult central nervoussystem: experimental repair stra tegies. NatureMedicine 3(12): 1329-1335, 1997

14. Ramon y Cajal S, May RM, Degeneration &regeneration of the nervous system, London; NewYork: Hafner Pub. Co., 1968,2 v. (769)

15. Richardson PM, McGuinness UM, Aguayo AJ : Axonsfrom CNS neurons regenerate into PNS grafts. Nature284(5753): 264-265, 1980

16. Schmued LC, Fallon JH : Fluoro-Gold: a newfluorescent retrograde axonal tracer with numerousunique properties. Brain Res 377(1): 147-154, 1986

17. Schwab ME, Brosamle C : Regeneration of lesionedcorticospinal tract fibers in the adult rat spinal cordunder experimental conditions. Spinal Cord 35(7):469­473, 1997

18. Seil FJ,Neural regeneration. Progress in brain research;v. 103, Amsterdam; New York: Elsevier, 1994,xvi, 413

19. Tong JX, Rich KM : Diphenylpiperazines enhanceregeneration after facial nerve injury. J Neurocytol26(5): 339-347, 1997

20. Xie XY, Barrett IN : Membrane resealing in culturedrat septal neurons after neurite transection: evidencefor enhancement by Ca(2+)-triggered protease activityand cytoskeletal disassembly. J Neurosci 11(10):3257­3267, 1991

21. Ziv NE, Spira ME: Spatiotemporal distribution of Ca2+following axotomy and throughout the recoveryprocess of cultured Aplysia neurons. Eur J Neurosci5(6): 657-668, 1993