VALIDASI METODE SPEKTROF OTOMETRI VISIBEL UNTUK … file7. Pak Bambang dan Bu Kis, laboratorium...

VALIDASI METODE SPEKTROFOTOMETRI VISIBEL UNTUK PENETAPAN KADAR AMOKSISILIN MENGGUNAKAN

PEREAKSI ASETILASETON DAN FORMALIN

SKRIPSI

Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi

oleh:

Margareta Sunarto

NIM : 038114004

FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS SANATA DHARMA

YOGYAKARTA 2007

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

God didn’t promise day without pain,

Laughter without sorrow, sun without rain…

But He promises strength for the day,

Comfort for the tears, and light for the way.

Disappointments are like road humps, they slow you.

Down a bit, but you’ll enjoy the smooth road afterwords.

Don’t stay on the humps too long, move on!

When you feel down, because you didn’t get what you want,

Just sit tight and be happy.

Because God must has something better to be given to you.

When something happens to you,

Good or bad, consider what it means.

There’s always a purpose in life’s events,

To teach you how to laugh more,

Or not to cry too hard.

Kupersembahkan karya ini untuk

Papa dan Mama

Sebagai rasa terima kasih dan baktiku

Andre dan Ita

Yang kucintai dan kusayangi

Almamaterku


KATA PENGANTAR

Syukur dan terima kasih kepada Bapa di surga, Tuhan Yesus, dan Bunda

Maria atas berkat dan penyertaan-Nya, penulis dapat menyelesaikan penelitian yang

berjudul ” Validasi Metode Spektrofotometri Visibel Untuk Penetapan Kadar

Amoksisilin Menggunakan Pereaksi Asetilaseton dan Formalin”. Skripsi ini

disusun untuk memenuhi salah satu syarat dalam mencapai gelar Sarjana Farmasi

(S.Farm.) pada Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma.

Pada kesempatan ini, penulis ingin menyampaikan terima kasih yang tulus

kepada:

1. Rita Suhadi, M.Si., Apt. selaku Dekan Fakultas Farmasi Universitas

Sanata Dharma.

2. Prof. Dr. Sudibyo Martono, M.S., Apt. selaku dosen pembimbing.

Terima kasih untuk masukan, bimbingan, dorongan, waktu, pengertian

dan perhatian yang begitu besar, serta semangat yang selalu diberikan

selama penelitian dan penyusunan skripsi ini

3. Dra. A. Nora Iska Harnita, M.Si., Apt. selaku dosen penguji, terima

kasih atas dukungan, saran, dan waktu yang diberikan.

4. Drs. Sulasmono, Apt. selaku dosen penguji, terima kasih atas dukungan

saran, dan waktu yang diberikan.

5. Segenap dosen Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma.


6. Papa, Mama, Andre, Ita, buat semua doa, cinta, dukungan, perhatian,

pengertian, kesabaran, canda, dan tawa yang buat Cici selalu kuat.

Makasih banyak ya.. I love you all...

7. Pak Bambang dan Bu Kis, laboratorium analisis obat dan makanan

Fakultas Farmasi Universitas Gadjah Mada, yang selalu menemani dan

membantu selama penelitian. Terima kasih banyak ya Pak, Bu…

8. Segenap laboran di Universitas Gadjah Mada dan Universitas Sanata

Dharma. Terima kasih untuk waktu dan bantuannya.

9. Arnie, Eta, teman seperjuanganku. Inget slogan kita: gagal itu biasa,

tetapi berhasil itu luar biasa… Makasih banyak teman buat dukungan,

bantuan, dan kerjasamanya.

10. Mas Isun, kakak dan sahabatku, terima kasih untuk semua keceriaan,

kesedihan, semangat, harapan, kekecewaan, dan semua hal yang pernah

aku alami dengan adanya persahabatan kita. Hope our friendship will

last forever. Aku belajar banyak hal dari persahabatan kita.. Overall,

thanks for eveything.. I Love you brother..

11. Temen-temen Eternal Choir dan Koor Gregorius Caecilia buat semua

kebersamaan, kegilaan, kekompakkan, keceriaan, dan pengertiannya.

Thanks a lot..

12. Gurit buat editan dan ilmu-ilmu komputernya, Leli buat terjemahannya.

Makasih ya..

13. Vita, Mitul, BleQ, Shyu, Nandut, Jevi, Yeyen, Reni, Asep, buat curhat-

curhat, gossip, dukungan, dan masukan buat aku.


14. Temen-temen kelompok A dan temen-temen Kelas A 2003, buat

dukungan, kekompakan dan kebersamaan kita selama ini.

15. Mas Bowo, Mas Fahrul, buat diskusinya.

16. Semua pihak yang tidak dapat saya sebutkan satu per satu yang telah

membantu dalam penelitian dan penyusunan skripsi ini.

Penulis menyadari bahwa skripsi ini sangat sederhana dan masih banyak

kekurangannya. Oleh karena itu, saran serta kritik yang membangun sangat

diharapkan untuk kesempurnaan skripsi ini di masa yang akan datang.

Yogyakarta, Januari 2007

Penulis


INTISARI

Amoksisilin memiliki kemiripan struktur dengan sefaleksin yang juga memiliki gugus amin primer. Oleh karena itu, metode spektrofotometri visibel untuk penetapan kadar sefaleksin menggunakan pereaksi asetilaseton dan formalin diharapkan dapat juga digunakan untuk penetapan kadar amoksisilin.

Penelitian ini merupakan jenis penelitian non eksperimental dengan rancangan penelitian deskriptif. Pada penelitian ini dilakukan optimasi waktu reaksi, pH, dan volume yang menghasilkan serapan maksimum. Hasilnya kemudian digunakan dalam validasi metode. Selain itu, dilakukan pula aplikasi metode penetapan kadar tersebut pada sediaan tablet amoksisilin.

Hasil penelitian menunjukkan bahwa reaksi mulai stabil setelah menit ke-50 selama 30 menit, volume optimum pereaksi adalah 7 ml dan pH optimum adalah 4. Warna kuning yang terbentuk memberikan serapan maksimum pada panjang gelombang 401 nm. Untuk validasi metode, didapat data sebagai berikut: koefisien variansi sebesar 0,56%, perolehan kembali sebesar 104,09%, dan koefisien korelasi (r) persamaan garis linier kurva baku sebesar 0,9995. Aplikasi metode penetapan kadar pada sediaan amoksisilin menunjukkan hasil yang baik dengan kadar rata-rata amoksisilin dalam tablet adalah 589,56 mg. Dari seluruh data yang diperoleh, dapat disimpulkan bahwa metode penetapan kadar amoksisilin secara spektrofotometri visibel menggunakan pereaksi asetilaseton dan formalin memiliki akurasi dan presisi yang baik, namun akurasinya kurang baik. Kata kunci: amoksisilin, asetilaseton, formalin, spektrofotometri visibel.


ABSTRACT The structure of amoxicillin is similar to that of cephalexin which is also

has primary amine groups. For that reason, it is hoped that visible spectrophotometric method in determining the amount of cephalexin by using acetylacetone and formalin can also be used to determine the amount of amoxicillin.

This research is a non-experimental descriptive research. In this research, the reaction time, the pH and the volume of the reagent have been optimized to obtain the maximum absorption. Then, its result is used in the validation method. In addition, the method’s developed is applied to determine the amount of amoxicillin in the tablets. The research result shows that the reaction begin to stable from the fiftieth minutes for 30 minutes, the optimal volume of the reagent is 7 ml, and the optimal pH is 4. The yellow chromophore is scanned and showed 401 nm as a maximum wavelength. From the validation method, the coefficient of variation is 0.56%, the recovery is 104.09%, and the correlation coefficient (r) is 0.9995. The application of the method’s developed in determining amoxicillin in tablet showed a good result with the average amount of amoxicillin is 589.56 mg/tablet. From the result it can be concluded that visible spectrophotometric method to determine the amount of amoxicillin by using acethylacetone and formalin gives a good precision and linearity, but not the accuracy. Key word: amoxicillin, acetylacetone, formalin, visible spectrophotometric


DAFTAR ISI

HALAMAN JUDUL ............................................................................................. i

HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING ................................................... ii

HALAMAN PENGESAHAN................................................................................ iii

HALAMAN PERSEMBAHAN ........................................................................... iv

KATA PENGANTAR .......................................................................................... v

PERNYATAAN KEASLIAN KARYA ............................................................... viii

INTISARI............................................................................................................... ix

ABSTRACT ............................................................................................................ x

DAFTAR ISI ......................................................................................................... xi

DAFTAR TABEL ................................................................................................. xiv

DAFTAR GAMBAR ............................................................................................ xv

DAFTAR LAMPIRAN ......................................................................................... xvi

BAB I PENGANTAR ......................................................................................... 1

A. Latar Belakang ................................................................................. 1

1. Perumusan masalah .................................................................... 3

2. Keaslian penelitian ..................................................................... 4

3. Manfaat penelitian ...................................................................... 5

B. Tujuan Penelitian ............................................................................. 5

BAB II PENELAAHAN PUSTAKA .................................................................. 6

A. Amoksisilin ...................................................................................... 6

B. Asetilaseton ...................................................................................... 9


C. Formalin ........................................................................................... 9

D. Spektrofotometri UV-Vis ................................................................. 10

1. Definisi spektrofotometri UV-Vis .............................................. 10

2. Konsep dasar radiasi elektromagnetik ........................................ 10

3. Tipe transisi elektron .................................................................. 11

4. Interaksi molekul dengan radiasi elektromagnetik .................... 13

5. Analisis kuantitatif secara spektrofotometri UV-Vis.................. 13

6. Serapan suatu larutan .................................................................. 14

7. Kesalahan fotometrik .................................................................. 15

8. Syarat-syarat penggunaan Hukum Beer...................................... 16

9. Penggunaan spektrofotometri UV-Vis dalam metode analisis ... 18

E. Pengembangan Metode Spektrofotometri......................................... 18

F. Validasi, Kesalahan, dan Parameter Metode Analisis ..................... 20

1. Validasi metode analisis ............................................................. 20

2. Kesalahan metode analisis ......................................................... 22

3. Parameter-parameter validasi metode analisis ........................... 23

G. Landasan Teori ................................................................................. 24

H. Hipotesis ........................................................................................... 24

BAB III METODOLOGI PENELITIAN ........................................................... 25

A. Jenis dan Rancangan Penelitian ....................................................... 25

B. Definisi Operasional ........................................................................ 25

C. Alat-alat Penelitian ........................................................................... 25

D. Bahan-bahan Penelitian .................................................................... 26


E. Tata Cara Penelitian ......................................................................... 26

1. Pembuatan larutan uji ................................................................. 26

2. Optimasi penetapan kadar amoksisilin ...................................... 27

3. Pembuatan kurva baku ............................................................... 28

4. Aplikasi metode penetapan kadar amoksisilin pada tablet AM . 29

5. Validasi metode........................................................................... 30

F. Analisis Hasil ................................................................................... 30

BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN ............................................................. 31

A. Pembuatan Larutan Baku Amoksisilin ............................................. 31

B. Penetapan Waktu Reaksi dan Operating Time ................................. 31

C. Penetapan pH Optimum Pereaksi ..................................................... 36

D. Penetapan Volume Optimum Pereaksi ............................................. 38

E. Penetapan Panjang Gelombang Serapan Maksimum ....................... 39

F. Pembuatan Kurva Baku ................................................................... 41

G. Penetapan Kadar Amoksisilin dalam Tablet ..................................... 44

H. Validasi Metode Analisis ................................................................. 45

BAB V KESIMPULAN DAN SARAN .............................................................. 48

A. Kesimpulan ...................................................................................... 48

B. Saran ................................................................................................. 48

DAFTAR PUSTAKA ........................................................................................... 49

LAMPIRAN .......................................................................................................... 52

BIOGRAFI............................................................................................................. 60


DAFTAR TABEL

Halaman

Tabel I. Parameter Analisis yang Diperlukan Untuk Kesahihan Pengukuran 23

Tabel II. Hasil Penetapan Waktu Reaksi ......................................................... 35

Tabel III. Hasil Penetapan pH Optimum Pereaksi ............................................ 38

Tabel IV. Hasil Penetapan Volume Optimum Pereaksi .................................... 39

Tabel V. Hasil Penetapan Kurva Baku Amoksisilin........................................ 42

Tabel VI. Hasil Modifikasi Kurva Baku Amoksisilin....................................... 43

Tabel VII. Hasil Penetapan Kadar Amoksisilin dalam Tablet AM .................... 44

Tabel VIII. Data Hasil Penetapan Perolehan Kembali......................................... 46


DAFTAR GAMBAR

Halaman

Gambar 1. Struktur Sefaleksin ........................................................................... 2

Gambar 2. Struktur Amoksisilin ......................................................................... 3

Gambar 3. Reaksi Antara Sefaleksin dengan Pereaksi Asetilaseton

dan Formalin .................................................................................... 8

Gambar 4. Struktur Asetilaseton ........................................................................ 9

Gambar 5. Struktur Formalin ............................................................................. 10

Gambar 6. Diagram Tingkat Energi Elektronik ................................................. 12

Gambar 7. Usulan Mekanisme Reaksi Pembuatan Pereaksi

Asetilaseton-Formalin ....................................................................... 33

Gambar 8. Usulan Mekanisme Reaksi Antara Pereaksi Asetilaseton-Formalin

dan Amoksisilin ................................................................................ 35

Gambar 9. Hasil Penetapan Operating Time ...................................................... 36

Gambar 10. Reaksi Eliminasi Pada Reaksi Antara Amoksisilin dengan Asetilaseton

dan Formalin Pada Suasana Asam dan Basa .................................... 37

Gambar 11. Spektra Panjang Gelombang Serapan Maksimum Amoksisilin

Konsentrasi 0,084 mg/ml (a), 0,117 mg/ml (b), dan 0,151 mg/ml (c)

Hasil Reaksi dengan Asetilaseton dan Formalin .............................. 40

Gambar 12. Gugus pada senyawa hasil reaksi yang memberikan serapan pada

panjang gelombang 335 nm .............................................................. 41

Gambar 13. Hubungan Konsentrasi Amoksisilin dengan Serapan Senyawa Hasil

Reaksi Antara Amoksisilin dengan Asetilaseton dan Formalin........ 43


DAFTAR LAMPIRAN

Halaman

Lampiran 1. Data Penimbangan Baku Amoksisilin ........................................... 52

Lampiran 2. Data Penetapan Kadar Sampel ....................................................... 53

Lampiran 3. Data Hasil Penetapan Perolehan kembali ...................................... 54

Lampiran 4. Contoh Perhitungan........................................................................ 55

Lampiran 5. Spektrum Baku Amoksisilin 0,005M............................................. 59


BAB I

PENGANTAR

A. Latar Belakang

Saat ini, penggunaan antibiotik sebagai sarana pengobatan infeksi semakin

berkembang dalam masyarakat terutama pada pengobatan penyakit yang disebabkan

oleh mikroorganisme. Banyaknya penyakit yang ditimbulkan oleh mikroorganisme

menyebabkan antibiotik menduduki peringkat yang tinggi dalam peresepan.

Antibiotik merupakan suatu produk metabolik (zat kimia) yang dihasilkan oleh

mikroorganisme tertentu, yang dalam jumlah amat kecil bersifat merusak atau

menghambat mikroorganisme lain (Pelczar and Chan, 1988).

Amoksisilin merupakan antibiotik golongan β-laktam yang menduduki

peringkat tertinggi dalam peresepan, diantaranya dapat ditunjukkan dengan survei

yang berjudul ‘Jenis-Jenis Antibiotika yang Diresepkan dan Masuk di Beberapa

Apotek Wilayah Kotamadya Yogyakarta‘, antibiotik β-laktam tersebut menduduki

peringkat tertinggi dengan persentase 69,25%, sedangkan jika dilihat jenis

antibiotiknya, amoksisilin menduduki peringkat tertinggi dengan persentase 31,59%

(Kusuma, 2000). Selain itu, menurut Wiratih (2002) dalam penelitiannya yang

berjudul ‘Gambaran Resep Antibiotik di Apotek-Apotek yang Terletak di Perbatasan

Bagian Utara Kotamadya Yogyakarta dan Kabupaten Sleman’, antibiotik β-laktam

juga menduduki peringkat tertinggi dengan persentase 52,64%, sedangkan jika

dilihat jenis antibiotiknya, amoksisilin menduduki peringkat tertinggi dengan

persentase 51,37%.


Agar dapat berefek maksimal, suatu obat harus memiliki dosis yang tepat.

Oleh karena itu, harus dilakukan pengawasan untuk menjamin mutu, khasiat, dan

keamanan penggunaan obat tersebut. Salah satu caranya adalah dengan melakukan

penetapan kadar zat aktif untuk menjamin ketepatan dosis yang akan diterima oleh

konsumen.

Amoksisilin dapat ditetapkan kadarnya dengan metode kromatografi cair

kinerja tinggi (KCKT) dan metode titrasi iodometri (Anonim, 1995). Kedua metode

tersebut memiliki kelebihan dan kekurangan. Metode KCKT memberikan hasil yang

cepat karena tidak memerlukan pemisahan terlebih dahulu, tetapi operasionalnya

mahal, sedangkan metode titrasi iodometri membutuhkan biaya yang lebih sedikit,

tetapi kurang sensitif untuk analisis dalam jumlah kecil.

Menurut Patel dkk. (1992), sefaleksin (gambar 1) dapat ditetapkan

kadarnya secara spektrofotometri visibel berdasarkan reaksi antara gugus amin

primernya dengan hasil kondensasi antara 2 mol asetilaseton dan 1 mol formalin.

C

H

NH2

C

O

NH

NO

S

COOH

CH3

. H2O

Gambar 1. Struktur sefaleksin

Gugus amin primer

Maka, amoksisilin (gambar 2) yang juga memiliki gugus amin primer diharapkan

dapat ditetapkan kadarnya dengan cara seperti pada cara penetapan sefaleksin

menggunakan pereaksi asetilaseton dan formalin.


HO C

H

NH2

C

O

NH

NO

S

COOH

CH3

CH3

. 3H2O

Gambar 2. Struktur amoksisilin

Gugus amin primer

Dari penelitian ini diharapkan dapat dikembangkan suatu metode analisis

yang mudah, murah, sederhana, sensitif, serta memiliki akurasi, presisi, dan linearitas

yang baik untuk menetapan kadar amoksisilin.

1. Perumusan masalah

Berdasarkan latar belakang, maka diperoleh permasalahan sebagai berikut :

a. apakah metode spektrofotometri visibel untuk penetapan kadar amoksisilin

menggunakan pereaksi asetilaseton dan formalin memenuhi parameter

validasi metode analisis yang meliputi akurasi, presisi, dan linearitas?

b. apakah metode spektrofotometri visibel untuk penetapan kadar amoksisilin

menggunakan pereaksi asetilaseton dan formalin dapat diaplikasikan pada

sediaan obat tablet amoksisilin?

2. Keaslian penelitian

Sepengetahuan peneliti, belum pernah ada penelitian tentang validasi

metode penetapan kadar amoksisilin dengan pereaksi asetilaseton dan formalin

secara spektrofotometri visibel. Penetapan kadar amoksisilin yang pernah dilakukan

antara lain titrasi iodometri hasil hidrolisis amoksisilin secara coulometri (Hidayat,


1999) dan penetapan kadar penisilin sebagai pengotor pada produk obat yang beredar

di pasaran secara KCKT-spektrometri massa (Takada dkk., 2005).

Selain itu, telah dilakukan beberapa penelitian tentang penetapan kadar

yang mirip dengan metode penetapan kadar amoksisilin dengan pereaksi asetilaseton

dan formalin secara spektrofotometri, antara lain penelitian Patel dkk. (1992) tentang

penetapan kadar sefaleksin dalam berbagai sediaan secara spektrofotometri visibel

menggunakan pereaksi asetilaseton dan formalin, penelitian Rianti (2005) tentang

penetapan kadar sefadroksil secara spektrofotometri visibel menggunakan pereaksi

etilasetoasetat dan formalin, penelitian Rofie (2005) tentang penetapan kadar

sefadroksil secara spektrofotometri ultraviolet menggunakan pereaksi etilasetoasetat

dan asetaldehid, penelitian Mirmayanti (2007) tentang penetapan kadar sefadroksil

secara spektrofotometri visibel menggunakan pereaksi asetilaseton dan formalin, dan

penelitian Roosita (2007) tentang penetapan kadar ampisilin secara spektrofotometri

visibel menggunakan pereaksi asetilaseton dan formalin.

3. Manfaat penelitian

Penelitian ini diharapkan akan memberikan manfaat untuk pengembangan

metode analisis yang mudah, murah, sederhana, sensitif, serta memiliki akurasi,

presisi, dan linearitas yang baik untuk menetapkan kadar amoksisilin.

B. Tujuan Penelitian


1. untuk mengetahui apakah metode spektrofotometri visibel untuk penetapan kadar

amoksisilin menggunakan pereaksi asetilaseton dan formalin memenuhi

parameter validasi metode analisis yang meliputi akurasi, presisi, dan linearitas.

2. untuk mengetahui apakah metode spektrofotometri visibel untuk penetapan kadar

amoksisilin menggunakan pereaksi asetilaseton dan formalin dapat diaplikasikan

pada sediaan tablet amoksisilin.

BAB II


PENELAAHAN PUSTAKA

A. Amoksisilin

Amoksisilin (gambar 2) adalah antibiotik golongan β-laktam turunan

aminopenisilin yang bersifat bakterisid, bekerja dengan menghambat sintesis dinding

sel bakteri (Petri, 2001). Tanpa adanya dinding sel, bakteri tidak dapat bertahan

terhadap pengaruh luar. Selain itu, kerusakan membran dapat mengganggu

pertukaran zat aktif yang penting untuk kehidupan bakteri (Wattimena dkk., 1997).

Antibiotik ini mempunyai spektrum kerja yang luas, dapat mengalami absorpsi cepat

dan sempurna dari saluran pencernaan, serta tahan dalam suasana asam sehingga

dapat diberikan secara oral (Petri, 2001).

Amoksisilin berupa serbuk hablur, putih, praktis tidak berbau. Amoksisilin

sukar larut dalam air dan metanol, tidak larut dalam benzen, dalam

karbontetraklorida, dan dalam kloroform (Anonim, 1995). Larutan yang mengandung

amoksisilin 2 mg/ml mempunyai pH antara 3,5 sampai 6,0 (Anonim, 2005). Baku

pembanding yang digunakan adalah amoksisilin Baku Pembanding Farmakope

Indonesia (BPFI), tidak boleh dikeringkan sebelum digunakan. Amoksisilin harus

disimpan dalam wadah tertutup rapat pada suhu kamar terkendali (Anonim, 1995).

Tablet amoksisilin mengandung tidak kurang dari 90,0% dan tidak lebih

dari 120,0% C16H19N3O5S jumlah yang tertera pada etiket. Tablet amoksisilin harus

disimpan dalam wadah tertutup rapat pada suhu kamar terkendali (Anonim, 2005).

Amoksisilin dapat ditetapkan kadarnya dengan berbagai cara, antara lain

(Bird, 1994):


1. Metode titrimetri yang meliputi iodometri dan potensiometri. Pada penetapan

kadar menggunakan kedua metode tersebut, amoksisilin harus dihidrolisis

terlebih dahulu menjadi asam penisiloat. Selanjutnya, pada metode iodometri

hasil hidrolisis tersebut akan bereaksi dengan iodium atau kalium iodat,

sedangkan pada metode potensiometri dengan litium-metoksid, asam perklorat,

merkuri nitrat, atau kupri sulfat.

2. Metode spektrofotometri yang meliputi spektrofotometri ultraviolet dan visibel.

Pada penetapan kadar menggunakan metode spektrofotometri ultraviolet,

amoksisilin harus diderivatisasi agar memberikan serapan yang cukup.

Sementara itu, pada metode spktrofotometri visibel amoksisilin akan bereaksi

dengan suatu senyawa membentuk warna yang kemudian diukur serapannya pada

daerah cahaya tampak. Salah satu contohnya adalah reaksi antara gugus karbonil

pada cincin β-laktam amoksisilin dengan hidroksilamin dan ion ferri membentuk

kompleks warna ungu yang kemudian diukur serapannya pada panjang

gelombang 480 nm.

3. Metode kromatografi yang meliputi kromatografi lapis tipis, kromatografi cair

kinerja tinggi menggunakan fase gerak campuran larutan kalium fosfat dalam air

dan asetonitril (96:4) dan fase diam oktadesilsilan, serta kromatografi gas.

Khusus untuk kromatografi gas, amoksisilin harus diderivatisasi terlebih dahulu

agar mudah menguap dan stabil pada suhu tinggi.

4. Metode lainnya seperti elektroforesis, polarografi, fluoresensi, mikrobiologi

(menggunakan Sarcina lutea atau Bacillus subtilis), dan Enzyme Linked

Immunosorbent Assay (ELISA).


Menurut Patel dkk. (1992), sefaleksin (gambar 1) dapat ditetapkan

kadarnya secara spektrofotometri visibel berdasarkan reaksi antara gugus amin

primernya dengan hasil kondensasi antara 2 mol asetilaseton dan 1 mol formalin.

Reaksi secara singkat dapat dilihat pada gambar 3 berikut:

H3COCCH2

C OH3CHCHO

CO CH3

CH2COCH3

C

O

CH3

C

H3C CH3

C

O

H3C

CH CH2

CH

C

O O

N

H

R

H

+ +

sefaleksin

+

kromofor

C C

O

NH

N

O

S

COOH

CH3

H

R =

Gambar 3. Reaksi antara sefaleksin dengan pereaksi asetilaseton-formalin (Patel dkk., 1992)

Maka, amoksisilin (gambar 2) yang juga memiliki gugus amin primer diharapkan

dapat ditetapkan kadarnya dengan cara tersebut.

B. Asetilaseton


Asetilaseton (gambar 4) atau CH3.CO.CH2.CO.CH3 (BM = 100,211)

merupakan cairan tidak berwarna atau kuning lemah, barbau harum, dan mudah

terbakar. Satu bagian asetilaseton larut dalam delapan bagian air, dapat campur

dengan alkohol, benzen, kloroform, eter, aseton, dan asam asetat glasial (Anonim,

1989). Asetilaseton mendidih pada suhu 138-139 oC (Anonim, 1995).

H3C C

O

CH2

C

O

CH3

Gambar 4. Struktur Asetilaseton

C. Formalin

Formalin merupakan larutan 37% uap formalin (gambar 5) atau HCHO

(BM = 30,03) di dalam air. Formalin berupa cairan jernih, tidak berwarna atau

hampir tidak berwarna, bau menusuk, serta memiliki uap yang merangsang selaput

lendir hidung dan tenggorokan. Jika disimpan di tempat dingin formalin akan

menjadi menjadi keruh. Formalin dapat bercampur dengan air, alkohol, dan aseton

(Anonim, 1989). Sebaiknya disimpan dalam wadah tertutup baik, terlindung dari

cahaya, pada suhu di atas 20o (Anonim, 1995).

H C

O

H

Gambar 5. Struktur Formalin

D. Spektrofotometri UV-Vis


1. Definisi spektrofotometri UV-Vis

Spektrofotometri UV-Vis adalah anggota teknik spektroskopik yang

menggunakan sumber radiasi elektromagnetik ultraviolet dekat (190 – 380 nm) dan

sinar tampak (380 – 780 nm) dengan instrumen spektrofotometer. Spektrofotometri

UV-Vis melibatkan energi elektronik yang cukup besar pada molekul yang dianalisis

sehingga spektrofotometri UV-Vis lebih banyak dipakai untuk analisis kuantitatif

dibandingkan kualitatif (Mulja dan Suharman, 1995).

Secara umum, spektrofotometri UV-Vis terbagi menjadi dua metode, yaitu

direct spectrophotometry UV-Vis dan indirect spectrophotometry UV-Vis. Pada

direct spectrophotometry serapan energi cahaya didasarkan oleh ikatan rangkap

terkonjugasi pada senyawa tersebut. Sementara pada indirect spectrophotometry,

pengukuran serapan energi cahaya dapat dilakukan setelah senyawa mengalami

reaksi kimiawi atau modifikasi gugus kromofor (Schimer, 1982).

2. Konsep dasar radiasi elektromagnetik

Panjang gelombang cahaya ultraviolet ataupun sinar tampak yang diserap

suatu senyawa bergantung pada mudahnya terjadi promosi elektron pada senyawa

tersebut. Molekul-molekul yang memerlukan lebih banyak energi untuk promosi

elektron akan menyerap pada panjang gelombang yang lebih pendek. Molekul yang

memerlukan energi lebih sedikit akan menyerap pada panjang gelombang yang lebih

panjang (Fessenden dan Fessenden, 1994). Hal tersebut sesuai dengan teori yang

dikemukakan oleh Max Planck bahwa cahaya merupakan suatu paket energi diskret

yang disebut foton. Kuantitas energi yang diserap oleh suatu senyawa berbanding


terbalik dengan panjang gelombang radiasi. Rumusan energi sebuah foton

dinyatakan sebagai (Mulja dan Suharman, 1995):

E = h . v = h . λc

= h . c . v

Keterangan: E = energi yang diabsorpsi (J) h = konsatante Planck sebagai faktor pembanding = 6,63 x 10-27 erg.detik atau 6,63 x 10-34 Joule detik v = frekuensi radiasi (Hz) c = kecepatan cahaya = 3 x 1010 cm/detik λ = panjang gelombang (cm) v = bilangan gelombang (cm-1) 3. Tipe transisi elektron

Suatu senyawa dapat menyerap radiasi dalam daerah UV-Vis karena

mempunyai elektron, baik berpasangan maupun sendiri, yang dapat dieksitasikan ke

tingkat energi yang lebih tinggi (Skoog, 1985).

Ada tiga macam distribusi elektron di dalam suatu senyawa organik secara

umum, yang selanjutnya dikenal sebagai orbital elektron pi (π), sigma (σ), dan

elektron tidak berpasangan (n). Transisi yang dapat terjadi adalah (Skoog, 1985):

a. transisi σ →σ*. Pada transisi tipe ini, suatu elektron di dalam orbital

molekul bonding akan dieksitasikan ke orbital anti bonding sehingga molekul berada

dalam bentuk excited state. Untuk mengeksitasikan elektron yang berada dalam

suatu ikatan kovalen tunggal terikat kuat (orbital σ) diperlukan radiasi berenergi

tinggi atau panjang gelombang pendek. Oleh karena itu, serapan maksimum yang

disebabkan oleh transisi σ →σ* tidak pernah teramati dalam daerah ultraviolet dekat.

Transisi σ →σ* memberikan serapan maksimum pada daerah ultraviolet jauh.


b. transisi n → σ*. Senyawa-senyawa jenuh yang mengandung atom-atom

dengan elektron-elektron tak berpasangan (elektron non bonding) mempunyai

kemampuan untuk mengadakan transisi n → σ*. Pasangan elektron bebas tersebut

akan dieksitasikan ke tingkat energi yang lebih tinggi karena elektron non bonding

tidak terikat terlalu kuat seperti elektron bonding σ, sehingga serapannya terjadi pada

panjang gelombang yang lebih besar. Akibatnya, transisi ini memerlukan energi

yang lebih kecil daripada transisi σ →σ* dan dapat disebabkan oleh radiasi di daerah

antara 150-250 nm, dengan kebanyakan puncak absorpsi tampak pada panjang

gelombang di bawah 200 nm.

c. transisi n → π* dan π → π*. Umumnya penggunaan spektroskopi serapan

pada senyawa-senyawa organik didasarkan pada transisi elektron n dan π ke π*.

Energi yang dibutuhkan cukup rendah yaitu pada daerah sekitar 200-700 nm.

Diagram tingkat energi elektronik dapat dilihat pada gambar 6 berikut:

σ* Anti bonding π* Anti bonding

E n Non bonding π Bonding σ Bonding

Gambar 6. Diagram tingkat energi elektronik

4. Interaksi molekul dengan radiasi elektromagnetik

Radiasi elektromagnetik dapat berinteraksi dengan molekul dalam berbagai

cara. Jika interaksinya menghasilkan transfer energi dari sumber radiasi kepada


molekul maka dinamakan absorpsi (Pecsok dkk., 1976). Agar dapat mengabsorpsi

radiasi UV-Vis, suatu molekul membutuhkan gugus yang dinamakan kromofor yang

merupakan suatu gugus kovalen tak jenuh terkonjugasi yang bertanggungjawab

untuk absorpsi radiasi UV-Vis (Fell, 1986). Selain itu, dikenal pula auksokrom yang

merupakan gugus yang mengandung heteroatom yang memberikan transisi n → σ*.

Terikatnya gugus auksokrom oleh gugus kromofor secara langsung akan

mengakibatkan pergeseran pita absorpsi menuju ke λ yang lebih panjang, disertai

peningkatan atau penurunan intensitas (Mulja dan Suharman, 1995).

5. Analisis kuantitatif secara spektrofotometri UV-Vis

Analisis kuantitatif zat tunggal dilakukan dengan mengukur nilai serapan

(A) pada panjang gelombang yang memberikan serapan maksimum. Nilai serapan

(A) digambarkan oleh suatu hukum yang disebut hukum Lambert-Beer.

a. Hukum Lambert menyatakan bahwa intensitas cahaya yang

ditransmisikan menurun secara eksponensial sesuai dengan kenaikan tebal zat

penyerap.

b. Hukum Beer menyatakan bahwa intensitas cahaya yang ditransmisikan

menurun secara eksponensial sesuai dengan kenaikan konsentrasi zat penyerap.

Kombinasi kedua hukum tersebut menghasilkan hukum Lambert-Beer yang

menyatakan hubungan antara logaritma intensitas sinar yang masuk dengan sinar

yang keluar sebagai fungsi tebal zat penyerap dan konsentrasi zat penyerap,

dirumuskan sebagai berikut:

Log Io/I = a.c.b = A


Dengan: a = daya serap c = konsentrasi larutan b = tebal kuvet A = serapan Io = intensitas energi yang mencapai cuplikan I = intensitas pancaran yang dikeluarkan dari cuplikan.

Nilai a atau daya serap menggambarkan nilai serapan yang spesifik dan

sering disebut A cm%1

1 yang artinya serapan larutan dengan konsentrasi 1% b/v dengan

pelarut tertentu pada kuvet setebal 1 cm adalah suatu angka yang spesifik (Fell,

1986).

6. Serapan suatu larutan

Serapan adalah karakteristik untuk suatu larutan senyawa pada suatu

panjang gelombang. Hubungan serapan dengan daya serap molar digambarkan

dengan rumus ε = a . M, dimana M adalah berat molekul senyawa (Silverstein dkk.,

1991).

Penyinaran senyawa organik tidak selalu diikuti oleh eksitasi elektron baik

dari orbital ikatan atau pasangan elektron bebas ke orbital non ikatan. Pernyataan ini

dapat dituang dalam persamaan berikut ini:

ε = 0,87 x 1020 x P x a

keterangan: P = probabilitas transisi elektron dengan nilai antara 0-1 a = panjang kromofor

Kromofor dengan panjang gelombang 1 nm akan memberikan nilai daya

serap molar (ε) sebesar 105. Pada prakteknya kromofor yang menyerap cahaya

dengan diikuti terjadinya transisi penuh akan memiliki nilai daya serap molar (ε)

lebih dari 10.000, sedang yang probabilitas transisinya rendah akan memiliki daya


serap molar (ε) yang kurang dari 1000 (Williams dan Fleming, 1980). Nilai serapan

jenis adalah karakteristik penyerapan molekul pada pelarut dan panjang gelombang

tertentu, dan tidak tergantung konsentrasi serta lamanya radiasi (Pecsok dkk., 1976).

7. Kesalahan fotometrik

Ketepatan dan ketelitian pembacaan intensitas sinar yang sampai pada

detektor digambarkan sebagai nilai kesalahan fotometrik. Ketepatan fotometrik

berkurang pada nilai serapan rendah maupun pada nilai serapan tinggi. Pada serapan

yang rendah, intensitas sinar yang ditransmisikan baik ada maupun tidak ada sampel

hampir sama sehingga kemungkinan terjadinya kesalahan sangat besar. Hal tersebut

karena ada keterbatasan kepekaan detektor. Pada serapan yang tinggi, intensitas sinar

yang sampai pada detektor sangat rendah sehingga tidak dapat diukur dengan tepat

(Pecsok dkk., 1976).

Untuk pembacaan serapan (A) atau transmitan (T) pada daerah terbatas,

kesalahan penentuan kadar hasil analisis dinyatakan sebagai:

CCΔ =

Tlog4343,0 x

TTΔ

ΔT adalah nilai rentang skala transmitan terkecil dari alat yang masih dapat terbaca

pada analisis dengan metode spektrofotometri UV-Vis. Nilai ΔT untuk setiap

spektrofotometer UV-Vis biasanya bervariasi 0,2-1% dan selalu dicantumkan

sebagai spesifikasi instrumen. Dari rumus tersebut di atas dapat diperhitungkan

kesalahan pembacaan A atau T pada analisis dengan metode spektrofotometer UV-

Vis. Pembacaan A (0,2-0,8) atau %T (15-65%) akan memberikan prosentase


kesalahan analisis yang dapat diterima yaitu sebesar 0,5-1% untuk ΔT = 1 (Mulja

dan Suharman, 1995).

Apabila pengukuran dilakukan di luar rentang A (0,2-0,8) atau %T (15-

65%), maka sebaiknya dalam pengukuran digunakan panjang gelombang yang paling

tepat dan menggunakan sel dengan pencahayaan paling tepat. Hal ini untuk

menghindari besarnya kesalahan pembacaan serapan, yang berakibat pada kesalahan

penetapan kadar (Pecsok, 1976).

8. Syarat-syarat penggunaan Hukum Beer (Skoog, 1985)

a. syarat konsentrasi.

Penyimpangan Hukum Beer dapat disebabkan dari nilai yang

tergantung dari indeks bias larutan. Hubungan tersebut dapat dilihat dari

persamaan berikut (Willard dkk., 1988):

Besar penyimpangan = 22 )2(.+nnε

Keterangan: ε = daya serap molar n = indeks bias larutan

Pada konsentrasi < 0,01 M, indeks bias larutan relatif konstan tetapi

pada konsentrasi tinggi indeks bias ternyata berubah sehingga perlu dikoreksi

agar diperoleh nilai serapan yang sesuai.

Pada konsentrasi tinggi, jarak rata-rata diantara zat-zat pengabsorpsi

menjadi kecil sehingga masing-masing zat mempengaruhi distribusi muatan

tetangganya. Interaksi ini dapat mengubah kemampuan untuk mengabsorpsi

cahaya pada panjang gelombang yang diberikan. Oleh karena interaksi ini


bergantung pada konsentrasi, maka peristiwa ini menyebabkan

penyimpangan dari kelinieran hubungan antara absorpsi dengan konsentrasi.

Pengaruh serupa kadang-kadang terjadi di dalam larutan yang mengandung

konsentrasi zat pengabsorpsi yang rendah tetapi konsentrasi zat non-

pengabsorpsinya tinggi, terutama elektrolit. Interaksi elektrostatis ion-ion

yang berdekatan dengan zat pengabsorpsi akan mempengaruhi nilai

absorptivitas molar. Pengaruh ini dapat dihindari dengan cara pengenceran.

b. syarat kimia.

Zat pengabsorpsi tidak boleh terdisosiasi, berasosiasi, atau bereaksi

dengan pelarut menghasilkan suatu produk pengabsorpsi spektrum yang

berbeda dari zat yang dianalisis.

c. syarat cahaya.

Hukum Beer hanya berlaku untuk cahaya yang betul-betul

monokromatik (cahaya yang mempunyai satu macam panjang gelombang).

d. syarat kejernihan.

Kekeruhan larutan misalnya yang disebabkan oleh partikel-partikel

koloid akan menyebabkan penyimpangan hukum Beer. Sebagian cahaya akan

dihamburkan oleh partikel-partikel koloid akibatnya kekuatan cahaya yang

diabsorpsi berkurang dari yang seharusnya.

9. Penggunaan spektrofotometri UV-Vis dalam metode analisis

Spektrofotometri UV-Vis dapat digunakan untuk analisis kuantitatif dan

kualitatif suatu senyawa. Analisis kuantitatif dengan metode spektrofotometri UV-

Vis dapat digolongkan menjadi tiga macam (Mulja dan Suharman, 1995) yaitu:


a. analisis kuantitatif zat tunggal (analisis satu komponen)

b. analisis kuantitatif campuran dua macam zat (analisis dua komponen)

c. analisis kuantitatif campuran tiga macam zat atau lebih (analisis multi

komponen).

Analisis kualitatif dengan metode spektrofotometri UV-Vis hanya dipakai

untuk data sekunder atau data pendukung. Pada analisis kualitatif dengan metode

spektrofotometri UV-Vis yang dapat ditentukan ada dua yaitu:

a. pemeriksaan kemurnian spektrum UV-Vis

b. penentuan panjang gelombang serapan maksimum.

(Mulja dan Suharman, 1995)

E. Pengembangan Metode Spektrofotometri

Salah satu bentuk pengembangan metode spektrofotometri adalah dengan

reaksi pembentukan warna. Reaksi tersebut umumnya dilakukan dengan

memodifikasi kromofor dari suatu molekul sehingga dapat dideteksi di daerah visibel

(Fell, 1986). Kadarnya kemudian ditetapkan dengan membandingkan serapannya

dengan kurva baku yang dibuat menggunakan baku pembanding (Rooth dan

Blaschke, 1994).

Keuntungan utama reaksi pembentukan warna adalah bahwa metode ini

dapat menambah sensitivitas dan selektivitas spektroskopi absorpsi (Fell, 1986).

Kriteria untuk reaksi pembentukan warna yang baik adalah sebagai berikut

(Vogel, 1978):

1. kespesifikan reaksi warna


Sangat sedikit reaksi yang spesifik untuk zat-zat tertentu. Oleh karena itu,

harus diupayakan agar reaksi yang terjadi spesifik untuk zat tertentu. Caranya antara

lain mereaksikan zat dengan reagen yang spesifik, mengubah kondisi percobaan, dan

mengendalikan pH.

2. kesebandingan antara warna dan konsentrasi

Intensitas warna larutan hendaknya meningkat secara linier dengan naiknya

konsentrasi zat yang akan ditetapkan.

3. kestabilan warna

Warna yang dihasilkan hendaknya cukup stabil dalam waktu tertentu untuk

memungkinkan pembacaan yang tepat.

4. reprodusibilitas

Hasil yang didapat harus dapat diulang jika dilakukan pada kondisi yang

sama.

5. kejernihan larutan

Larutan harus bebas dari endapan agar tidak menghamburkan ataupun

menyerap cahaya.

6. kepekaan tinggi

Diharapkan reaksi warna sangat peka bahkan untuk zat dalam jumlah kecil.

F. Validasi, Kesalahan, dan Parameter Metode Analisis

1. Validasi metode analisis

Validasi metode analisis diartikan sebagai suatu prosedur yang digunakan

untuk membuktikan apakah suatu metode analisis memenuhi persyaratan yang

ditentukan (Anonim, 2005).


Pedoman-pedoman validasi metode analisis didukung oleh parameter-

parameter sebagai berikut :

a. ketepatan. Ketepatan (accuracy) berarti kedekatan hasil analisis yang

diperoleh dengan menggunakan metode tersebut terhadap nilai sebenarnya. Accuracy

dinyatakan dengan persen perolehan kembali (recovery) dari penambahan zat yang

diketahui kadarnya (Anonim, 2005). Untuk kadar analit ≥ 10% biasanya disepakati

perolehan kembali harus masuk dalam rentang 98-102% (Yuwono dan Indrayanto,

2005).

b. ketelitian. Ketelitian (precision) berarti ukuran kedekatan masing-

masing hasil analisis dari beberapa pengukuran di bawah kondisi analisis yang sama.

Ketelitian biasanya dinyatakan dengan standar deviasi atau relatif standar deviasi

(koefisien variasi) (Anonim, 2005).

Presisi dapat dibedakan menjadi tiga, yaitu (Anonim, 2005):

1). repeatability adalah presisi yang dihasilkan dari pengujian suatu metode yang

dilakukan oleh individu yang sama dengan menggunakan prosedur yang sama

dan dikerjakan dalam waktu yang singkat.

2). intermediate precission adalah presisi yang dihasilkan dari pengujian suatu

metode yang dilakukan oleh individu yang berbeda dengan menggunakan

prosedur dan instrumen yang sama.

3). reproducibility adalah presisi yang dihasilkan dari pengujian suatu metode

analisis yang dikerjakan pada laboratorium yang berbeda.

Untuk kadar analit ≥ 10% biasanya disepakati koefisien variasi tidak boleh

lebih dari 2,7% (Yuwono dan Indrayanto, 2005).


c. limit of detection (LOD). Limit of Detection adalah kadar terkecil

analit yang dapat terdeteksi tetapi tidak perlu secara kuantitatif. Penentuan LOD

dilakukan dengan cara membandingkan respon pengukuran analit dengan blangko.

Rasio signal-to-noise yang diterima untuk LOD adalah 2:1 atau 3:1 (Anonim, 2005).

d. limit of quantitation (LOQ). Limit of Quantitation adalah konsentrasi

terkecil analit dalam sampel yang dapat diukur dengan ketelitian dan ketepatan yang

diterima di bawah kondisi percobaan yang ditetapkan metode tersebut. Rasio signal-

to-noise yang diterima untuk LOQ adalah 10:1 (Anonim, 2005).

e. spesifisitas. Spesifisitas merupakan kemampuan pengukuran analit

secara akurat dan spesifik dengan kehadiran komponen lain (zat aktif, eksipien,

pengotor, dan produk degradasi) dalam matriks sampel (Anonim, 2005).

f. linearity. Linearity adalah kemampuan suatu metode analisis untuk

secara langsung atau melalui perhitungan matematika mendapatkan hasil uji yang

sebanding dengan kadar analit dalam sampel (Anonim, 2005).

g. range. Range suatu metode analisis diartikan sebagai interval antara

kadar terendah sampai tertinggi analit yang dapat diukur secara kuantitatif

menggunakan metode analisis tertentu dan menghasilkan ketelitian dan ketepatan,

dan linearitas yang mencukupi (Anonim, 2005).

2. Kesalahan metode analisis

Ada dua macam kesalahan pada analisis kimia menurut Mulja dan

Suharman (1995) yaitu:


a. Kesalahan sistematik. Kesalahan ini merupakan hasil analisis yang

menyimpang secara tetap dari nilai sebenarnya karena proses pelaksanaan prosedur

analisis. Kesalahan sistematik ini dapat diketahui sebabnya sehingga dapat

dikendalikan oleh peneliti. Beberapa cara untuk memperkecil kesalahan ini antara

lain dengan melakukan kalibrasi instrumen secara berkala, pemilihan metode dan

prosedur standar dari badan resmi, pemakaian bahan kimia dengan derajat untuk

analisis, serta peningkatan pengetahuan dari peneliti yang bekerja di laboratorium

analisis.

b. Kesalahan tidak sistematik. Kesalahan ini disebut juga penyimpangan

tidak tetap dari hasil penentuan kadar menggunakan instrumen yang disebabkan

fluktuasi dari instrumen yang dipakai (derau). Penyebab kesalahan ini tidak

diketahui. Salah satu cara untuk mengatasi kesalahan ini adalah dengan

menggunakan instrumen dengan kualitas yang baik.

3. Parameter-parameter validasi metode analisis

Uji yang paling umum dan prosedur pengukuran dapat dibagi menjadi

empat kategori, yaitu (Anonim, 2005):

a. Kategori I. Kategori ini meliputi metode analisis untuk kuantifikasi

komponen terbesar dalam obat atau zat aktif (termasuk pengawet) dalam sediaan.


b. Kategori II. Kategori ini meliputi metode analisis untuk penentuan

pengotor dalam obat atau senyawa degradasi dalam sediaan, termasuk pengukuran

kuantitatif dan uji batas.

c. Kategori III. Kategori ini meliputi metode analisis untuk penentuan

sifat-sifat fisik lain dari obat seperti uji disolusi dan uji pelepasan.

d. Kategori IV. Kategori ini meliputi metode analisis untuk uji identifikasi.

Parameter-parameter yang diperlukan untuk metode analisis dapat dilihat

pada tabel I berikut:

Tabel I. Parameter analisis yang diperlukan untuk kesahihan pengukuran

Kategori II Parameter analisis Kategori I Kuantitatif Uji batas Kategori III Kategori IV

Accuracy Ya Ya * * Tidak Precision Ya Ya Tidak Ya Tidak Specificity Ya Ya Ya * Ya

LOD Tidak Tidak Ya * Tidak LOQ Tidak Ya Tidak * Tidak

Linearity Ya Ya Tidak * Tidak Range Ya Ya * * Tidak

* = mungkin diperlukan tergantung dari jenis uji

(Anonim, 2005)

G. Landasan Teori

Amoksisilin memiliki kemiripan struktur dengan sefaleksin. Penetapan

kadar amoksisilin diharapkan dapat dilakukan secara spektrofotometri visibel

menggunakan pereaksi asetilaseton dan formalin, seperti yang pernah dilkakukan

pada sefaleksin. Prinsip penetapan kadar tersebut adalah berdasarkan reaksi antara


amoksisilin dengan hasil kondensasi antara satu mol formalin dan dua mol

asetilaseton membentuk warna kuning yang intensitasnya kemudian diukur

menggunakan spektrofotometri visibel pada panjang gelombang serapan maksimum.

H. Hipotesis

Amoksisilin dapat ditetapkan kadarnya secara spektrofotometer visibel

dengan menggunakan pereaksi asetilaseton dan formalin. Metode yang

dikembangkan tersebut memenuhi parameter validasi yaitu akurasi, presisi, dan

linearitas serta dapat diaplikasikan pada sediaan tablet amoksisilin.

BAB III

METODOLOGI PENELITIAN

A. Jenis dan Rancangan Penelitian


Penelitian ini merupakan jenis penelitian non eksperimental dengan

rancangan penelitian deskriptif, sebab pada penelitian ini tidak dilakukan manipulasi

terhadap subjek uji. Penelitian hanya mendeskripsikan keadaan yang ada.

B. Definisi Operasional

1. Validasi metode analisis merupakan serangkaian prosedur yang digunakan untuk

membuktikan apakah suatu metode analisis memenuhi persyaratan yang

ditentukan, meliputi ketepatan, ketelitian, dan linearitas.

2. Spektrofotometri visibel adalah anggota teknik spektroskopik yang menggunakan

sumber radiasi elektromagnetik sinar tampak (380 – 780 nm) dengan instrumen

spektrofotometer.

3. Kadar amoksisilin ditetapkan dalam satuan mg/tablet.

C. Alat-alat Penelitian

Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah spektrofotometer

ultraviolet – visibel (Spectronic Genesys 5, MILTON ROY), pH meter (Hanna

Instrument pH 209), neraca analitik (Precisa 125 A.SCS Swiss Quality), penangas air,

termometer, kertas saring, dan alat-alat gelas yang lazim.

D. Bahan-bahan Penelitian

Bahan yang digunakan dalam penelitian ini meliputi tablet amoksisilin 500

mg dari suatu pabrik (kode=AM), standar amoksisilin (Brataco Chemika).


Asetilaseton, formalin, asam asetat glasial, natrium asetat (p.a., E. Merck), dan

akuades (Fakultas Farmasi UGM).

E. Tata Cara Penelitian

1. Pembuatan larutan uji

a. pembuatan larutan natrium asetat 0,2 M.

Sebanyak 16,4 g natrium asetat ditimbang seksama, dimasukkan ke dalam

labu ukur 1 liter kemudian dilarutkan dengan akuades sampai tanda.

b. pembuatan larutan asam asetat 0,2 M.

Sebanyak 12,5 ml asam asetat 96% dipipet, kemudian diencerkan dengan

akuades sampai volume 1,0 liter.

c. pembuatan larutan NaOH 1M.

Ditimbang seksama 0,4 g NaOH kemudian dilarutkan dalam akuades bebas

CO2 sampai volume 10,0 ml.

d. pembuatan larutan HCl 2M.

Sebanyak 17,0 ml asam klorida pekat dipipet, kemudian diencerkan dengan

akuades sampai volume 100,0 ml.

e. pembuatan larutan pereaksi (Patel dkk., 1992).

Sebanyak 16,0 ml natrium asetat 0,2 M dan 34,0 ml asam asetat 0,2 M

dicampur dengan 7,8 ml asetilaseton dan 15,0 ml formalin. Panaskan 5 menit

di atas waterbath pada suhu 80 oC, dinginkan, pH diatur sampai (4,3),

kemudian diencerkan dengan akuades sampai 100,0 ml.

f. pembuatan larutan baku amoksisilin.


Ditimbang seksama 209,7 mg baku amoksisilin kemudian dilarutkan dengan

akuades sampai 100,0 ml hingga diperoleh konsentrasi 0,005 M.

2. Optimasi penetapan kadar amoksisilin (Patel dkk., 1992)

Pada penelitian ini dilakukan optimasi berbagai kondisi percobaan yaitu pH

pereaksi, volume pereaksi, operating time, dan panjang gelombang serapan

maksimum amoksisilin.

a. penentuan operating time.

Sebanyak 2,0 ml larutan baku amoksisilin 0,005 M dimasukkan ke

dalam labu ukur 25 ml, ditambahkan larutan pereaksi pH 4 sebanyak 4

ml. Diencerkan dengan akuades sampai tanda. Diukur serapan larutan

pada panjang gelombang 400 nm, sampai diperoleh serapan yang stabil

pada rentang waktu tertentu. Dilakukan juga pengukuran blangko.

b. penetapan nilai pH yang menghasilkan serapan maksimum.

Nilai pH larutan pereaksi dibuat bervariasi, yaitu pH 3, 4, 5, 6, dan 7.

Untuk masing-masing nilai pH dipipet sebanyak 4 ml, dimasukkan ke

dalam labu ukur 25 ml, ditambahkan 2,0 ml larutan baku amoksisilin

0,005 M, didiamkan selama operating time pada suhu 35 oC kemudian

encerkan dengan akuades sampai tanda. Diukur serapan larutan pada

panjang gelombang 400 nm. Dilakukan juga pengukuran blangko. Nilai

pH optimum adalah pH larutan pereaksi yang menghasilkan serapan

paling besar.

c. penetapan volume larutan pereksi yang menghasilkan serapan maksimum.


Dari larutan pereaksi dengan pH optimum dipipet masing-masing 1, 2,

3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, dan 10 ml, dimasukkan ke dalam labu ukur 25 ml,

ditambahkan 2,0 ml larutan baku amoksisilin 0,005 M, didiamkan

selama operating time pada suhu 35 oC, dan diencerkan dengan akuades

sampai tanda. Diukur serapan larutan pada panjang gelombang 400 nm.

Dilakukan juga pengukuran blangko. Volume optimum adalah volume

larutan pereaksi yang menghasilkan serapan paling besar.

d. Penentuan panjang gelombang serapan maksimum.

Sebanyak 1,0; 1,4; dan 1,8 ml larutan baku amoksisilin 0,005 M

masing-masing dimasukkan ke dalam labu ukur 25 ml, ditambahkan

larutan pereaksi dengan volume dan pH hasil optimasi. Diamkan selama

operating time pada suhu 35 oC . Diencerkan dengan akuades sampai

tanda. Larutan tersebut kemudian discan antara panjang gelombang 380

hingga 450 nm. Dilakukan juga pengukuran blangko. Panjang

gelombang serapan maksimum adalah panjang gelombang yang

memberikan serapan maksimum.

3. Pembuatan kurva baku (Patel dkk., 1992)

Larutan baku amoksisilin dipipet sebanyak 0,8; 1,0; 1,2; 1,4; dan 1,6 ml,

masing-masing dimasukkan ke dalam labu ukur 25 ml, ditambahkan pereaksi dengan

pH dan volume hasil optimasi. Didiamkan selama operating time pada suhu 35 oC,

diencerkan dengan akuades sampai tanda. Kemudian diukur serapannya pada

panjang gelombang serapan maksimum. Dilakukan juga pengukuran blangko. Dibuat


kurva hubungan kadar vs serapan dan ditentukan persamaan regresi linier serta

koefisien korelasinya.

4. Aplikasi metode penetapan kadar amoksisilin pada tablet AM (Patel dkk.,

1992)

a. pengambilan sampel.

Sampel yang digunakan terdiri dari 1 merek tablet yang mengandung 500 mg

amoksisilin yang beredar di pasaran (tablet AM). Tablet amoksisilin yang

dipilih adalah tablet dengan nomor batch yang sama.

b. penentuan bobot rata-rata tablet.

Ditimbang 20 tablet satu persatu, kemudian dihitung bobot rata-rata tiap

tablet.

c. penetapan kadar amoksisilin dalam tablet AM (Patel dkk., 1992).

Ditimbang seksama sejumlah serbuk dari 20 tablet yang setara dengan 209,7

mg amoksisilin. Dimasukkan ke dalam labu ukur 100 ml, diencerkan dengan

akuades sampai tanda. Dipipet 1,0 ml, dimasukkan ke dalam labu ukur 25 ml,

ditambahkan pereaksi dengan pH dan volume hasil optimasi. Didiamkan

selama operating time pada suhu 35 oC, diencerkan dengan akuades sampai

tanda. Kemudian diukur serapannya pada panjang gelombang serapan

maksimum Dilakukan juga pengukuran blangko

5. Validasi metode

a. akurasi (dinyatakan dengan perolehan kembali).


Ditimbang seksama sejumlah serbuk dari 20 tablet yang setara dengan 104,85

mg amoksisilin dan 104,85 mg baku amoksisilin. Dimasukkan ke dalam labu

ukur 100 ml, diencerkan dengan akuades sampai tanda. Dipipet 1,0 ml,

dimasukkan ke dalam labu ukur 25 ml, ditambahkan pereaksi dengan pH dan

volume hasil optimasi. Didiamkan selama operating time pada suhu 35 oC,

diencerkan dengan akuades sampai tanda. Kemudian diukur serapannya pada

panjang gelombang serapan maksimum. Dilakukan juga pengukuran blangko.

Setelah itu dihitung jumlah perolehan kembali sampel.

b. presisi (dinyatakan dengan koefisien variasi).

Penetapan koefisien variasi dilakukan dengan menggunakan data kadar

amoksisilin dalam tablet AM.

c. linearitas (dinyatakan dengan koefisien korelasi).

Penetapan koefisen korelasi dilakukan dengan menggunakan koefisien

korelasi korva baku amoksisilin.

F. Analisis Hasil

Analisis hasil penelitian berupa analisis validitas metode yang meliputi

linearitas dengan taraf kepercayaan 99%, akurasi, dan presisi. Selain itu, dilakukan

juga analisis kuantitatif berupa kadar amoksisilin yang dihitung dengan

menggunakan persamaan kurva baku.

BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN


A. Pembuatan Larutan Baku Amoksisilin

Larutan baku yang digunakan dalam penelitian ini adalah larutan baku

amoksisilin 0,005 M dalam akuades. Larutan ini dibuat dengan cara melarutkan

209,7 mg baku amoksisilin dalam 100,0 ml akuades. Pelarut yang digunakan adalah

akuades karena amoksisilin larut dalam akuades (Anonim, 1995).

B. Penetapan Waktu Reaksi dan Operating Time (OT)

Waktu reaksi merupakan waktu yang dibutuhkan agar reaksi berlangsung

sempurna, sehingga pada pengukuran yang terbaca adalah semua amoksisilin yang

telah bereaksi.

Pereaksi yang digunakan dalam penelitian ini adalah pereaksi campuran

asetilaseton-formalin. Pereaksi tersebut dibuat dengan cara mencampurkan

asetilaseton dan formalin di dalam bufer asetat yang terdiri dari asam asetat dan

natrium asetat. Bufer asetat berfungsi menjaga pH pereaksi agar stabil di sekitar pH

4. Setelah dicampur, larutan dipanaskan selama 5 menit pada suhu 80 oC untuk

mempercepat reaksi. Kemudian larutan didinginkan, dan dilakukan penyesuaian pH

dengan menggunakan larutan HCl atau larutan NaOH.

Seperti yang disusulkan oleh Rofie (2005), mekanisme reaksi pembentukan

pereaksi asetilaseton-formalin dapat dilihat pada gambar 7 berikut:


H3C C

O

CH2

C

O

CH3

asetilaseton

HH3C C

O

HC

H

C

OH

CH3

- H

H3C C

O

CH

C

OH

CH3

enol asetilaseton

O H

CH3CCH

C

H3C O

+ C

O

HH

enol asetilaseton formalin

HC

O

H3C

C

HCH2

OH

C

H3C O

H

- H2O

ß-hidroksi karbonil

C

O

H3C

CCH2

C

H3C CH2

C

O H

CH3

HC

C

O CH3

+

C

O H

H3C

C CH2

CH

C

H3C O

C

O

CH3

C

O CH3

karbonil tak jenuh a,ß enol asetilaseton

H

- H


p.s.

O

CH3C

CH CH2

CH

C

O

CH3

C C

H3C O O CH3

3,5-diasetil-2,6-heptanadion

Gambar 7. Usulan mekanisme reaksi pembuatan pereaksi asetilaseton-formalin

Setelah selesai dibuat, pereaksi asetilaseton-formalin tersebut kemudian

ditambahkan ke dalam sejumlah larutan baku amoksisilin, lalu didiamkan pada suhu

35 oC selama waktu tertentu hingga terbentuk warna kuning yang stabil. Mekanisme

reaksi yang diusulkan dapat dilihat pada gambar 8 di bawah ini:

C

O

H3C

CH CH2

CH

C

O

CH3

C C

H3C O O CH3

N

H

R

H

C

O

H3C

CH CH2

CH

C

O

CH3

C C

H3C O

H3C

NH

OH

HH

RAmoksisilin

HO C C

O

NH

N

O

H

S

COOH

CH3

CH3R =


p.s.C

O

H3C

CH CH2

C

C

O

CH3

C C

H3C O

H3C

HN

OH2

R

H C

O

H3C

CH CH2

C

C

O

CH3

C C

H3C ON

CH3

R

H

-H2O

H-

C

O

H3C

CH CH2

C

C

O

CH3

C C

O CH3N

CH3

R

H

H

CH

H2CN

C

C

H2C

H R

C

CH3

O

CH3C

O

H3C

C

CN

C

C

H2C C

CH3

O

CH3C

O

H3CH

ROH2

H3C

-H2O

H

p.s.

-


kromofor

Gambar 8. Usulan mekanisme reaksi antara pereaksi asetilaseton-formalin dengan amoksisilin Hasil penetapan waktu reaksi dapat dilihat pada tabel II berikut:

Tabel II. Hasil penetapan waktu reaksi

Serapan* Waktu Reaksi (menit) Rep. 1 Rep. 2 Rep. 3

20 0,530 0,538 0,525 25 0,581 0,585 0,574 30 0,625 0,598 0,630 35 0,662 0,654 0,669 40 0,680 0,667 0,697 45 0,695 0,686 0,714 50 0,724 0,695 0,732 55 0,739 0,701 0,748 60 0,742 0,703 0,746 65 0,748 0,716 0,762 70 0,744 0,724 0,764 75 0,745 0,729 0,770 80 0,749 0,724 0,763

*) Serapan senyawa hasil reaksi antara amoksisilin dengan asetilaseton dan formalin

Dari penelitian didapat bahwa reaksi stabil setelah menit ke-50, berarti

pembentukan reaksi warna telah selesai pada menit ke-50 tersebut. Selanjutnya,


untuk mengetahui stabilitasnya , dilakukan penetapan OT yang merupakan rentang

waktu saat suatu senyawa memberikan serapan yang stabil.

Setelah didiamkan selama 50 menit pada suhu 35 oC larutan dibaca

serapannya menggunakan spektrofotometer selama 30 menit. Ternyata selama itu

serapan larutan masih stabil. Hasilnya dapat dilihat pada gambar 9 berikut:

Gambar 9. Hasil penetapan operating time

C. Penetapan pH Optimum Pereaksi

pH optimum pereaksi adalah pH larutan pereaksi yang memberikan serapan

maksimum. Penetapan pH Optimum pereaksi bertujuan untuk menentukan pH

dimana reaksi antara amoksisilin dengan pereaksi dapat berlangsung secara

optimum. Hal tersebut karena reaksi antara amoksisilin dengan pereaksi asetilaseton-

formalin ini adalah reaksi yang sangat tergantung pada pH. Pada tahap pertama

terjadi reaksi adisi amina pada gugus karbonil (gambar 8). Bila larutan terlalu asam,

akan terjadi reaksi sebagai berikut:

RNH2 (pada amoksisilin) + H+ RNH3+


Akibatnya, konsentrasi amina menjadi menjadi kecil sekali bahkan dapat diabaikan.

Sehingga reaksi akan menjadi lambat. Tahap kedua dalam reaksi itu adalah eliminasi

gugus H2O (gambar 8). Berbeda dengan reaksi tahap pertama, laju reaksi ini akan

bertambah dengan meningkatnya keasaman. Jika suasana larutan terlalu basa, gugus

-OH2+ tidak akan terbentuk. Sebagai gantinya, akan terbentuk gugus –OH yang

merupakan gugus pergi yang kurang baik dibandingkan dengan gugus -OH2+

(gambar 10).

C

O

H3C

CH CH2

C

C

O

CH3

C C

H3C O

H3C

HN

OH

R

H

C

O

H3C

CH CH2

C

C

O

CH3

C C

H3C O

H3C

HN R

H

OH2

suasana asam suasana basa

n formalin pada suasana asam dan basa

dak akan berlangsung sehingga

Gambar 10. Reaksi eliminasi pada reaksi antara amoksisilin dengan asetilaseton da

maka reaksi tahap kedua ti Jika hal tersebut terjadi,

reaksi tidak sempurna. Dari kedua tahap reaksi tersebut dapat disimpulkan bahwa

bertambahnya keasaman akan menyebabkan reaksi tahap dua berjalan cepat

sedangkan reaksi tahap satu berjalan lambat, demikian pula sebaliknya. Jadi perlu

dicari pH optimum yang memberikan laju reaksi paling cepat (Fessenden dan

Fessenden, 1994).


Hasil penetapan pH optimum pereaksi dapat dilihat pada tabel III berikut:

Tabel III. Hasil penetapan pH optimum pereaksi

Serapan* pH Pereaksi Rep. 1 Rep. 2 Rep. 3 3,0 0,586 0,608 0,592 4,0 0,746 0,750 0,740 5,0 0,447 0,487 0,458 6,0 0,274 0,265 0,269 7,0 0,258 0,250 0,252

*) Serapa yawa hasil reaksi oksisilin denga seton dan forma

anjutnya,

pH perea

D. Penetapan Volume Optimum Pereaksi

Volume n pereaksi yang

memberi

enambahkan pereaksi pH 4

dengan v

n sen antara am n asetila lin

Dari penelitian didapat bahwa pH optimum adalah pH 4. Untuk sel

ksi yang digunakan adalah pH 4.

.

optimum pereaksi adalah volume laruta

kan serapan maksimum. Penetapan volume optimum pereaksi bertujuan

untuk menentukan volume pereaksi agar semua amoksisilin dapat habis bereaksi.

Jika pereaksi yang ditambahkan kurang, dikhawatirkan belum semua amoksisilin

bereaksi sehingga pada saat pengukuran belum semua amoksisilin yang terbaca

sehingga tidak menggambarkan kadar yang sebenarnya.

Penetapan volume pereaksi dilakukan dengan m

olume yang bervariasi. Serapan kemudian diukur pada panjang gelombang

400 nm. Hasil penetapan volume optimum pereaksi dapat dilihat pada tabel IV

berikut:


Tabel IV. Hasil penetapan volume optimum pereaksi

Serapan* Vol. Pereaksi (ml) Rep. 1 Rep. 2 Rep. 3 1 0,439 0,440 0,442 2 0,619 0,617 0,620 3 0,708 0,709 0,707 4 0,758 0,760 0,761 5 0,771 0,774 0,772 6 0,787 0,785 0,788 7 0,800 0,799 0,802 8 0,797 0,798 0,796 9 0,793 0,804 0,799 10 0,759 0,800 0,799

*) Serapa wa hasil reaksi oksisilin denga seton dan forma

dengan 7

E. Penetapan Panjang Gelombang Serapan Maksimum (λmax)

g suatu

senyawa

ingga

450 nm.

n senya antara am n asetila lin

Dari penelitian didapat bahwa serapan amoksisilin stabil saat direaksikan

ml hingga 10 ml pereaksi. Untuk selanjutnya volume pereaksi yang digunakan

adalah 7 ml.

Panjang gelombang serapan maksimum adalah panjang gelomban

yang memberikan serapan yang paling besar. Pengukuran kadar dengan

metode spektrofotometri umumnya dilakukan pada panjang gelombang serapannya

maksimum. Hal tersebut karena pada panjang gelombang serapan maksimum

perubahan serapan untuk setiap perubahan konsentrasi adalah paling besar sehingga

menghasilkan sensitifitas dan akurasi yang lebih besar. Selain itu, pada panjang

gelombang serapan maksimum absorptivitas molar senyawa relatif konstan sehingga

didapat kurva kalibrasi konsentrasi vs serapan yang linear (Pecsok dkk., 1976).

Dalam penelitian, penentuan panjang gelombang dimulai dari 380 h

Hal tersebut karena menurut Patel dkk. (1992), reaksi antara gugus amin

primer sefaleksin dengan hasil kondensasi antara satu mol formalin dan dua mol


asetilaseton akan menghasilkan senyawa berwarna kuning yang memberikan serapan

paling besar pada panjang gelombang 400 nm. Gugus pada sefaleksin yang berperan

dalam pembentukan senyawa berwarna tersebut adalah gugus amin primer (gambar

3). Penetapan kadar amoksisilin dalam penelitian ini juga didasarkan pada reaksi

antara gugus amin primer amoksisilin dengan hasil kondensasi antara satu mol

formalin dan dua mol asetilaseton (gambar 8). Dengan demikian, diperkirakan

panjang gelombang serapan maksimum reaksi penetapan kadar ini juga berada di

sekitar 400 nm.

Untuk

c.b.a.

penentuan panjang gelombang serapan maksimum digunakan tiga

konsentras

imum dapat dilihat pada

gambar 1

Gambar 11. Spektra panjang gelombang serapan maksimum amoksisilin konsentrasi 0,084 mg/ml (a), 0,117 mg/ml (b), dan 0,151 mg/ml (c) hasil reaksi dengan

adalah

401,0 nm. Disamping itu, adanya perubahan konsentrasi tidak merubah panjang

gelombang serapan maksimum gambar 11 (a, b, dan c).

i yang bertujuan untuk melihat apakah dengan perubahan konsentrasi akan

terjadi perubahan panjang gelombang serapan maksimum.

Hasil penetapan panjang gelombang serapan maks

1 (a, b, dan c) berikut:

asetilaseton dan formalin

didapat panjang gelombang maksimum

Berdasarkan percobaan


Selain itu, pada spektrum terlihat bahwa senyawa hasil reaksi juga

memberikan serapan pada panjang gelombang nm. Diperkirakan, serapan tersebut

adalah serapan gugus fenol pada amoksisilin (gambar 12).

C

CN

CH2

H3C

O

C

O

CH3

CH3

H

O

S

CH3

CH3

Gambar 12. Gugus pada senyawa hasil reaksi yang diperkirakan memberikan serapan pada panjang gelombang 335 nm

F. Pembuatan Kurva Baku

si

ang selanjutnya digunakan untuk menghitung kadar amoksisilin. Dalam pembuatan

kurva baku sebaiknya di amoksisilin baku dengan

konsen

HO C C

O

N

NH

COOH

C

C

CH3C

Gugus yang memberikan serapan

Pembuatan kurva baku bertujuan untuk memperoleh persamaan garis regre

y

gunakan suatu seri larutan

trasi yang berbeda yang memiliki serapan dalam rentang 0,2-0,8 pada panjang

gelombang serapan maksimum. Pembacaan serapan dalam rentang 0,2-0,8 akan

memberikan prosentase kesalahan analisis yang dapat diterima yaitu 0,5-1,0%. Hal

ini dilakukan untuk meminimalkan kesalahan sistematiknya (Mulja dan Suharman,

1995).


Pada penelitian ini, penetapan kurva baku dilakukan dengan menggunakan 5

seri konsentrasi amoksisilin yaitu 0,067; 0,084; 0,101; 0,117; dan 0,134 mg/ml

dengan replikasi sebanyak tiga kali.

Adapun hasil kurva baku dari 3 kali replikasi dapat dilihat pada tabel V

berikut:

Tabel V. Hasil penetapan kurva baku amoksisilin

Serapan* Konsentrasi Amoksisilin Rep. 1 Rep. 2 Rep. 3 (mg/ml)

0,067 0,384 0,386 0,384 0,084 0,461 0,462 0,460 0,101 0,546 0,539 0,542 0,117 0,615 0,615 0,614 0,134 0,687 0,678 0,682

A = 0,0807 B = 4,5516 r = 0,9995 α = 77,60o

Vx0 = 1,009%

A = 0,0921 A = 0,0846 B = 4,4127 B = 4,4912 r = 0,9993 r = 0,9995 α = 77,23o α = 77,44o

V x0 = 1,721% V x

0 = 1,269%*) Serapan senyawa hasil rea ksisilin de on dan for

Seluruh persamaan regresi linier pada tabel V di atas menghasilkan nilai

l dengan

taraf k

hampir membentuk garis tegak lurus dengan sumbu x. Oleh karena itu,

ksi antara amo ngan asetilaset malin

koefisien korelasi (r) hitung yang lebih besar dari koefisien korelasi (r) tabe

epercayaan 99% dan derajat bebas 3 yaitu 0,959 (Cann, 2003). Dapat

dikatakan ada korelasi bermakna antara serapan dan konsentrasi amoksisilin.

Persamaan regresi yang digunakan untuk menghitung kadar amoksisilin dalam

penelitian ini adalah persamaan y = 4,5516x – 0,0807 (replikasi 1) karena nilai r

yang diperoleh paling mendekati satu dan nilai koefisien variasi fungsi (Vx0) yang

paling kecil.

Dari data terlihat bahwa α yang didapat terlalu besar sehingga jika

digambarkan


dilakukan modifikasi satuan konsentrasi larutan baku sehingga didapat data yang

dapat dilihat pada tabel VI berikut:

Tabel VI. Hasil modifikasi kurva baku amoksisilin

Konsentrasi Amoksisilin Baku (mg/ml)

Konsentrasi Amoksisilin Serapan* Baku (mg/5ml)

0,067 0,335 0,384 0,084 0,420 0,461 0,101 0,505 0,546 0,117 0,585 0,615 0,134 0,670 0,687

*) Serapan hasil reaksi antara amok engan asetilaseton dan fo Persamaan kurva baku hasil modifikas oleh dengan memplotkan konsentrasi

r adalah

senyawa sisilin d rmalin

i diper

baku (mg/5 ml) vs serapan. Didapat: y = 0,9103x + 0,0807 dengan nilai

0,9995 dan α = 42,31o (gambar 13). Dengan demikian, persamaan garis tersebut

dapat digunakan untuk menetapkan kadar amoksisilin yang direaksikan dengan

asetilaseton dan formalin.

alin

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0,3 0,4 0,5 0,6 0,7

Kadar Amoksisilin (mg/5ml)

Sera

pan

Seny

awa

Has

il R

eaks

i Ant

ara

Am

oksi

sili

n de

ngan

Ase

tila

seto

n da

n F

orm

Gambar 13. Hubungan konsentrasi amoksisilin dan serapan senyawa hasil reaksi antara amoksisilin dengan asetilaseton dan formalin

y = 0,9103x + 0,0807


G. Penetapan Kadar Amoksisilin dalam Tablet

Penetapan kadar amoksisilin dalam tablet dilakukan dengan 3 kali

penimbangan dan masing-masing penimbangan dilakukan replikasi pemipetan 3 kali.

Replikasi pemipetan bertujuan untuk m

Tablet amoksisilin yang digunakan adalah tablet dari suatu pabrik dengan

nomor batch yang sama. Dengan nomor batch yang sama, diharapkan variasi yang

terjadi pada saat formulasi dapat diminimalkan sehingga jika keragaman hasil benar-

benar menggambarkan ketelitian metode ini.

Dari hasil penelitian didapat data yang disajikan pada tabel VII berikut:

Tabel VII Hasil penetapan kadar amoksisilin dalam tablet AM

engetahui reprodusibilitasnya.

Penimbangan Sampel (mg) Serapan* Kadar (mg) % kadar KV (%) Per tablet Dlm tablet

150,0 0,533 0,530 0,528

592,24 588,42 585,80

118,45 117,68 117,16

0,55

150,0 0,536 0,526 0,529

596,29 583,18 586,99

119,26 116,64 117,40

1,14

0,532 0,532 0,532

591,04 591,04 591,04

118,21 118,21 118,21

0 150,0

=589,56 x =117,91 KV x =0,56 *) Serapan senyawa hasil reaksi antara amoksisilin dengan asetilaseton dan formalin

Dari data didapat kadar rata-rata am

oksisilin dalam tablet adalah 589,56 mg

atau s tablet

amoksisilin m dari 120,0%

jumlah yang terter (An ), karena menurut

etiket, tablet amoksisilin yang dig blet andung zat aktif

amoksisilin 500 mg/tablet.

ekitar 117,91%. Hasil tersebut masih memenuhi syarat karena

engandung tidak kurang dari 90,0% dan tidak lebih

amoksisilin dari a pada etiket onim, 2005

unakan (ta AM) meng


H. Validas e Analisi

Validasi met lisis diar agai sua dur yang digunakan

untuk buktikan suatu m nalisis m i persyara ang

ditentukan (Anonim, 2

netapan ka oksisilin kukan d elitian ini termasuk

ke dalam kategori I yaitu ntuk peneta komponen terbesar dalam

enurut

i Metod s

ode ana tikan seb tu prose

mem apakah etode a emenuh tan y

005).

Pe dar am yang dila alam pen

u pan kadar sediaan.

M Anonim (2005), parameter yang perlu ditetapkan dalam analisis kategori I

adalah akurasi, presisi, spesifisitas, linearitas, dan range.

Dalam penelitian ini, beberapa parameter yang ditetapkan adalah:

1. akurasi.

Akurasi adalah kedekatan hasil analisis yang diperoleh menggunakan suatu

metode dengan nilai sebenarnya. Akurasi dinyatakan dengan perolehan kembali

dari penambahan zat yang dike , 2005).

P

oksisilin. Kadar yang didapat kemudian dibandingkan

dengan kadar yang sebenarnya.

tahui kadarnya (Anonim

ada penelitian ini, penetapan perolehan kembali dilakukan dengan

menimbang sejumlah sampel yang mengandung amoksisilin kemudian ditambah

dengan sejumlah baku am


Dari hasil penelitian didapat data yang disajikan pada tabel VIII berikut:

Tabel VIII. Data hasil penetapan perolehan kembali

Kadar Sebanarnya

(mg/ml) Serapan* Kadar didapat Perolehan Kembali

(mg/ml) (%)

0,515 2,39 104,37 0,510 2,36 103,06 2,29 0,518 2,40 104,80 0,514 2,38 104,39 0,516 2,39 104,82 2,28 0,509 2,35 103,07 0,516 2,39 104,82 0,510 2,36 103,06 2,28 0,513 2,38 104,39

x = 104,09 KV = 0,76%

*) Serapan senyawa hasil reaksi antara amoksisilin dengan asetilaseton dan formalin

ari data dapat dilihat bahwa rata-rata perolehan kembali yang didapat

adalah 104,09%. Hal tersebut tidak memenuhi syarat karena untuk kadar analit

10% biasanya disepakati perolehan kembali harus masuk dalam rentang 98-102%

(Yu cara

spektrofotomet n dan formalin

mem urang baik.

2. presi

D

≥

wono dan Indrayanto, 2005). Berarti metode penetapan amoksisilin se

ri visibel menggunakan pereaksi asetilaseto

iliki akurasi yang k

si.

Presisi adalah kedekatan masing-masing hasil analisis dari beberapa

penguk di bawah k nalisis yang s Presisi biasany takan

dengan persen simpangan baku atau simpanga u relatif (koef riasi)

(Anon 05).

Pada penelitian ini, penetapan presisi dilakukan dengan menggunakan data

rata-

uran ondisi a ama. a dinya

n bak isien va

im, 20

penetapan kadar amoksisilin dalam tablet AM. Dari tabel V terlihat bahwa


rata koefisien variasi yang didapat adalah 0,56%. Hal tersebut masih memenuhi

syarat karena untuk kadar analit ≥ 10% biasanya disepakati koefisien variasi

tidak boleh lebih dari 2,7% (Yuwono dan Indrayanto, 2005). Berarti metode

penetapan amoksisilin secara spektrofotometri visibel menggunakan pereaksi

asetilaseton dan formalin memiliki presisi yang baik.

linearitas. 3.

Linearitas ditentukan dengan melihat nilai koefisien korelasi (r) hitung pada

per

dan derajat bebas 3 yaitu 0,959 (Cann, 2003). Dapat dikatakan

ada

samaan regresi linier kurva baku. Dari hasil penentuan kurva baku, didapat

persamaan y = 0,9103x + 0,0807 dengan r = 0,9995. Nilai koefisien korelasi (r)

hitung tersebut lebih besar dari koefisien korelasi (r) tabel dengan taraf

kepercayaan 99%

korelasi bermakna antara serapan dan konsentrasi amoksisilin. Selain itu,

didapat nilai koefisien variasi fungsi (Vx0) sebesar 1,009%. Menurut Mulja dan

Hanwar (2003), nilai Vx0 tidak boleh lebih dari 2%. Berarti metode penetapan

amoksisilin secara spektrofotometri visibel menggunakan pereaksi asetilaseton

dan formalin memiliki linearitas yang baik.


BAB V

KESIMPULAN DAN SARAN

I. Kesimpulan

Berdasarkan hasil penelitian dapat disimpulkan sebagai berikut:

metode spektrofotometri visibel untuk1. penetapan kadar amoksisilin

menggunakan pereaksi asetilaseton dan formalin memiliki presisi dan linearitas

yang baik, namun akurasinya kurang baik.

. aplikasi metode ini pada sediaan tablet amoksisilin memberikan hasil yang baik

dengan kadar rata-rata amoksisilin dalam tablet sebesar 589,56 mg.

J. Saran

Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut tentang suhu yang menghasilkan

kecepatan reaksi dan serapan yang opt

2

imum.


DAFTAR PUSTAKA

Anonim, 1989, The Merck Index An Encyclopedia of Chemicals, Drugs, and

IV, 95-96, 1136, 1157, Departemen

Kesehatan Republik Indonesia, Jakarta.

nonim, 2005, The United States Pharmacopeia, 28th ed., 138-139, 141, 143, 144, 146, United States Pharmacopeia Convention, Rockville.

ird, A. E., 1994, Amoxicillin in Analytical Profiles of Drug Substances and Excipients, 23, 4-44, Academic Press Inc., California.

ann, A. J., 2003, Maths from Scratch for Biologist, 213, John Wiley & Sons Ltd., England.

ell, A. F., 1986, Ultraviolet, Visible, and Flourescence in Clarke’s Isolation and Identification of Drugs in Pharmaceuticals Body Fluid and Post Mortem Material, 2nd ed., 221-232, The Pharmaceutical Press, London.

essenden, R. J. dan Fessenden, J. S., 1994, Kimia Organik, Diterjemahkan oleh Pudjaatmaka, A. H., Edisi ketiga, Jilid I, 23, 67-129, Penerbit Erlangga, Jakarta.

Harmita, 2004, Petunjuk Pela e dan Cara Perhitungannya, Majalah Ilmu Kefarmasian, I (3):117-135.

Biologicals, 11th ed., 81, 4261, Merck & Co. Inc., Rahway N. J., USA.

Anonim, 1995, Farmakope Indonesia, Edisi

A

B

C

F

F

ksanaan Validasi Metod

Hidayat, R., 1999, Titrasi Iodometri Hasil Hidrolisis Amoksisilin Secara Coulometri, http://fa.lib.itb.ac.id/go.php?id=jbptitbfa-gdl-sl-1999-rahmathida-223., diakses pada 8 April 2006.

Kusuma, resepkan dan Masuk di Beberapa Apotek Wilayah Kotamadya Yogyakarta, Skripsi, Fakultas Farmasi

irmayanti, B., 2007, Validasi Metode Penetapan Kadar Sefadroksil dengan

ogyakarta.

rmasi Airlangga, III (2): 71-76.

Mulja, M. M. dan Suharman, 1995, Analisis Instrumental, 6-10, 26-48, Airlangga University Press, Surabaya.

2000, Jenis-jenis Antibiotika yang Di

Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta.

MPereaksi Asetilaseton dan Formaldehid secara Spektrofotometri Visibel, Skripsi, Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma, Y

Mulja, M. dan Hanwar, D., 2003, Prinsip-Prinsip Cara Berlaboratorium yang Baik,

Majalah Fa


Patel, I. T., Devani, M. B., and Patel, T. M., 1992, Spectrophotometric Method for Determination of Cephalexin in Its Dosage Forms, J. of AOAC Int., 75 (6): 994-998.

Pelczar, M. J. and Chan, E. C. S., 1988, Elements of Microbiology, Ed III, 561,

Diterjemahkan oleh Ratna Siri Hadi Oetomo, Penerbit UI, Jakarta.

ecsok, R. L., Shields L. D., Cairns, T. Mc. and William, T. G., 1976, Modern

is of raw-Hill Companies Inc., USA.

Mada, Yogyakarta.

Roosita, ar Ampisilin dengan Pereaksi Asetilaseton dan Formaldehid secara Spektrofotometri Visibel, Skripsi,

yakarta.

PMethods Of Chemical Analysis, 2nd ed., 117, 139, 142-143, 226-235, John Wiley & Sons Inc., New York.

Petri, W. A., 2001, Antimicrobial Agents Penicillins, Cephalosporins, and Other β-

Lactam Antibiotics in Goodman and Gilman’s The Pharmalogical BasTherapeutics, 10th ed., Mc-G

Rianti, A., 2005, Penetapan Kadar Sefadroksil Secara Spektrofotometri Visibel

dengan Pereaksi Etilasetoasetat dan Formaldehid, Skripsi, Fakultas Farmasi Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta.

Rofie, F., 2005, Penetapan Kadar Sefadroksil dalam Kapsul Menggunakan Metode

Spektrofotometri Ultraviolet dengan Pereaksi Etilasetoasetat dan Asetaldehid, Skripsi, Fakultas Farmasi Universitas Gadjah

A., 2007, Validasi Metode Penetapan Kad

Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta.

Roth H. J. and Blaschke G., 1994, Pharmazeutische Analytik, diterjemahkan oleh Sarjono Kisman dan Slamet Ibrahim, 359-361, Gadjah Mada University Press, Yog

Schirmer, R. E., 1982, Modern Methods of Pharmaceuticals Analysis, I: 60-74, CRC

Press Inc., Florida. Silverstein, R. M., Bassler, G. C., and Morrill, T. C., 1991, Spectrometric

Identification of Organic Compounds, 5th ed, 292, John Wiley & Sons Inc., Canada.

Skoog, D. A., 1985, Principles of Instrumental Analysis, 3rd ed., 67, 164-168, 185-

186, Saunders College Publishing, Japan.


Takada, W., Adachi, T., Kihara, N., Kitamura, S., Kitagawa, T., Mifune, M., and

attimena, J. R., Sugiarso, W. C., Widianto, M. B., Sukandar E. Y., dan Setiadi, A.

illiams, D. H. dan Fleming, I., 1980, Spectroscopic Methods in Organic Chemistry,

illard, H. H., Merritt, L. L., Dean, J. A., and Settle, F. A., 1988, Instrumental

iratih, 2002, Gambaran Resep Antibiotik di Apotek-apotek yang Terletak di

ta Dharma, Yogyakarta.

uwono, M. dan Indrayanto, G., 2005, Validation of Chromatographic Methods of Analysis, Profiles of Drug Substances, Excipients, and Related Methodology, 32: 243-259.

Saito, Y., 2005, Quantitative Determination Method for Trace Amount of Penicillin Contaminants in Comercially Available Drug Product by HPLC Coupled with Tandem Mass Spectrometry, Chem. Pharm. Bull., 53 (2): 172-176.

Vogel, A. I., 1978, A Textbook of Quantitative Inorganic Analysis, 4th ed., 809-810,

846-849, The English Language Book Society, Richard Clay Ltd., Bungay.

WR., 1997, Farmakodinamik dan Terapi Antibiotik, 56-61, 66, Gadjah Mada University Press, Yogyakarta.

W3rd ed., 4, McGraw Hill Book Company, United Kingdom.

WMethods of Analysis, 7th ed., 162, Wadsworth Publishing Company, Belmont, California.

WPerbatasan Bagian Utara Kotamadya Yogyakarta dan Kabupaten Sleman, Skripsi, Fakultas Farmasi Universitas Sana

Y


LAMPIRAN

Lampira

n 1. Data Penimbangan Baku Amoksisilin

Kertas + zat (mg) 506,6

Kertas + sisa (mg) 297,0

Zat (mg) 209,6


Lampiran 2. Data Penetapan Kadar Sampel

. Perhitungan Bobot Rata-Rata Tablet a

obot tablet (g) ,7245 0,7187 ,7161 0,7183 ,7166 0,7176 ,7040 0,7110 ,7058 0,7095 ,7155 0,7219 ,7131 0,7194 ,7149 0,7239 ,7125 0,7100 ,7100 0,7219

B0000000000x = 0,71526 gram

. Penimbangan Sampel

Rep, 1 Rep, 2 Rep, 3

b Kertas + zat (g) 0,4276 0,4516 0,4514 Kertas + sisa (g) 0,2776 0,3016 0,3014

at (g) 0,1500 0,1500 0,1500 Z


Lampiran 3. Data Hasil Penetapan Perolehan Kembali

dar amoksisilin dalam sampel a. Perhitungan ka

a penetapan kadar, rata-rata kad sisilin per 15 mpel

dalah 123,64 mg

adar amoksisilin dalam sampel =

Dari dat didapat ar amok 0 mg sa

a

15064,123K x 100% = 82,43%

. Penimbangan baku + sampel

b

Rep. 1 Rep. 2 Rep. 3

Baku Sampel Baku Sampel Baku Sampel Kertas+zat 0,4091 g 0,4596 g 0,4091 g 0,4593 g 0,4091 g 0,4602 g Kertas+sisa 0,3043 g 0,3095 g 0,3043 g 0,3094 g 0,3043 g 0,3104 g

zat 0,1048 g 0,1501 g 0,1048 g 0,1499 g 0,1048 g 0,1498 g

10043,82Kadar amoksisilin dalam 150,1 mg sampel (rep. 1) = x 150,1 = 123,73 mg

adar sebenarnya = kadar amoksisilin dalam sampel + kadar baku

= 2,29 mg/ml

K

= 123,73 mg + 104,8 mg

= 228,53 mg

= 228,53 mg/100ml


Lam n 4. r

a. Pembuatan Kurva Baku Amoksisilin

pira Contoh Pe hitungan

aquadest.

Konsentrasi baku amo

Perhitungan konsentrasi baku amoksisilin:

Baku amoksisilin yang ditimbang = 209,6 mg, dilarutkan dalam 100 ml

ksisilin = 100

6,209 = 2,096 mg/ml

Dibuat seri kurva baku dengan mempipet:

0,8 ml

v1 . c = v2 . c1

,8 . 2,096 = 25 . c1

1 = 0,067 mg/ml

,0 ml

1 . c = v2 . c2

1,2 . 2,096 = 25 . c3

3

0

c

1

v

1,0 . 2,096 = 25 . c2

c2 = 0,084 mg/ml

1,2 ml

v1 . c = v2 . c3

c = 0,101 mg/ml


1,4 ml

v1 . c = v2 . c4

96 = 25 . c4

ml

1 . c = v2 . c5

96 = 25 . c5

ml

Seri kadar tersebut kemudian diplotkan vs serapan yang diperoleh sehingga diperoleh

persamaan kurva baku yang akan digunakan dalam penetapan kadar.

b. Penetapan Kadar Sampel

1,4 . 2,0

c4 = 0,117 mg/

1,6 ml

v

1,6 . 2,0

c5 = 0,134 mg/

Serapan yang didapat = 0,533, dimasukkan ke dalam persamaan kurva baku

0,533 = 0,9103x + 0,0807

x = 0,4967 mg/5 ml

x = 2,484 mg/ml

x = 2,484 x 50 ml

x = 124,2 mg dalam 50 ml sampel

x = 124,2 mg dalam 150 mg sampel

alam tablet = 0,1502,124kadar anoksisilin d x 715,26 = 592,24 mg

% kadar amoksisilin dalam tablet = 500

24,592 x 100% = 118,45%


c. Penetapan Recovery

Kadar sebenarnya = kadar amox dalam sampel + kadar amox baku

Kadar sebenarnya = 123,73 mg + 104,8 mg

ilarutkan dalam aquadest 100 ml

Kadar sebenarnya = 228,53 mg

Serbuk tersebut kemudian d

10053,228Kadar sebenarnya = = 2,29 mg/ml

bil 1 ml kemudian dimasukkan ke dalam labu 25 ml

sehingga konsentrasinya:

1 . 2,29 = 25 . c2

2

emas am

persamaan kurva baku.

asukkan ke dalam persamaan kurva baku

% recovery =

dari larutan tersebut, diam

v1 . c = v2 . c2

c = 0,0916 mg/ml

Kadar yang didapat dihitung dengan m ukkan serapan yang diperoleh ke dal

Serapan yang didapat = 0,515, dim

0,515 = 0,9103x + 0,0807

x = 0,4771 mg/5 ml

x = 0,0954 mg/ml

0916,00954,0 x 100% = 104,15%


c. Perhitungan Vx0

menggunakan rumus sebagai berikut (Harmita, 2004): Vx0 dapat dihitung

)2/()( −−Σ Nyy Sy = 11

Di mana 1y = Bx + A

Sx0 = BSy viasi fungsi

Vx0 =

; Sx0 = standar de

0Sx

1x; Vx0 = koefisien variasi fungsi

y1

Persamaan Kurva baku replikasi 1: y = 4,5516x + 0,0807

1y (y1 - 1y ) (y1 - 1y )2 x1

0,384 0,386 -2 x 10-3 4 x 10-6 0,067 0,461 0,463 -2 x 10-3 4 x 10-6 0,084 0,546 0,540 6 x 10-3 3,6 x 10-5 0,102 0,615 0,613 2 x 10-3 4 x 10-6 0,117 0,687 0,691 -4 x 10-3 1,6 x 10-5 0,133

= 6,4 x 10-51x Σ = 0,1006

3/10.4,6 5 = 4,619 x 10-3−Sy =

5516,410.619,4 3−

= 1,015 x 10-3Sx0 =

Vx0 = x10.01,1 3−

1001006,05 % = 1,009%


Lampiran 5. Spektrum Baku Amoksisilin 0,005 M


BIOGRAFI

Penulis skripsi yang berjudul “Validasi Metode

Spektrofotometri Visibel Untuk Penetapan Kadar

Amoksisilin Menggunakan Pereaksi Asetilaseton dan

Formalin” ini bernama Margareta Sunarto. Penulis lahir di

Garut pada tanggal 14 Januari 1985. Anak pertama dari tiga

bersaudara dari pasangan Sunarto Yosep Tjitrahadi dan

Catharina Lena Tanzil ini mengawali pendidikannya di TK

aya Susila Garut pada tahun 1988. Kemudian penulis melanjutkan pendidikannya

i SD Daya Susila Garut pada tahun 1991. Selanjutnya, pada tahun 1997 penulis

enempuh pendidikan di SLTP Yos Sudarso Garut. Setelah lulus, pada tahun 2000

enulis melanjutkan pendidikan di SMU Negeri 2 Yogyakarta. Lalu, pada tahun

003 penulis melanjutkan pendidikan di Fakultas Farmasi Universitas Sanata

harma Yogyakarta. Selama kuliah, penulis pernah menjadi asisten dosen untuk

mata kuliah praktikum spektroskopi

D

d

m

p

2

D

.


VALIDASI METODE SPEKTROF OTOMETRI VISIBEL UNTUK … file7. Pak Bambang dan Bu Kis, laboratorium...

Documents

Transcript of VALIDASI METODE SPEKTROF OTOMETRI VISIBEL UNTUK … file7. Pak Bambang dan Bu Kis, laboratorium...