1

VALIDASI METODE ANALISIS FLAVONOID EKSTRAK ETANOL DAUN

BINAHONG SECARA KOLORIMETRI

Lucky Setia Rahman1,Sri Wardatuni2 dan Sutanto3 1,3) Program Studi Farmasi, FMIPA, Universitas Pakuan, Bogor

ABSTRAK

Banyak tanaman mempunyai khasiat untuk menyembuhkan. Salah satu tanaman yang

memiliki khasiat untuk menyembuhkan adalah binahong. Binahong mengandung flavonoid,

alkaloid, saponin dan tannin.

Penelitian ini bertujuan untuk melakukan validasi metode analisis penetapan kadar

flavonoid pada ekstrak etanol daun binahong. Simplisia binahong di ekstraksi dengan pelarut

etanol 70%. Validasi metode analisis dilakukan dengan spektrofotometri UV-Vis

menggunakan metode Chang (2002) dengan larutan standar kuersetin. Alumunium klorida 10

% dan natrium asetat 1 M sebagai pereaksi yang diukur pada panjang gelombang 424 nm.

Parameter validasi metode analisis kadar flavonoid yang dilakukan dalam penelitian ini

meliputi linearitas, akurasi, presisi, batas deteksi dan batas kuantitasi.

Hasil penelitian menunjukkan uji linearitas pada konsentrasi 2-10 ppm menghasilkan

koefisien korelasi (r2) sebesar 0,9995 dan koefisien fungsi regresi (Vx0) 1,9214 %. Akurasi

dan presisi larutan standar kuersetin+ contoh spike 2ppm 101,190%, 6ppm 100,655% dan

10ppm 100,778%. Batas deteksi sebesar 0,3459 ppm dan batas kuantitasi sebesar 1,1528

ppm. Seluruh parameter yang telah dilakukan memenuhi persyaratan. Hasil penetapan kadar

flavonoid ekstrak etanol daun binahong sebesar 0,5429 %.

Kata kunci : Daun binahong, validasi metode analisis, flavonoid.

ABSTRACT

Many plants have healing properties. One of the plants that have healing properties

are binahong. Binahong contains flavonoids, alkaloids, saponins and tannins.

This study aims to validate analytical methods of assay of flavonoids in ethanol

extract of the leaves binahong. Simplicia binahong in solvent extraction with 70% ethanol.

Validation of analytical methods performed by UV-Vis spectrophotometry using methods

Chang (2002) with a standard solution of quercetin. 10% aluminum chloride and sodium

acetate 1 M as reagents measured at a wavelength of 424 nm. Parameter validation of

analytical methods levels of flavonoids are performed in this study include linearity,

accuracy, precision, limits of detection and quantitation limits.

The results showed linearity test at a concentration of 2-10 ppm produces a

correlation coefficient (r2) of 0.9995 and the coefficient of the regression function (Vx0)

1.9214%. Accuracy and precision of standard solution of quercetin + spike example 2ppm

101.190%, 6ppm 100.655% and 100.778% 10ppm. Amounted to 0.3459 ppm detection limits

and quantitation limit of 1.1528 ppm. All parameters that have been made to meet the

requirements. The results of the assay of the ethanol extract of leaf flavonoid binahong of

0.5429%.

Keywords: Binahong leaf, validation of analytical methods, flavonoids.

2

PENDAHULUAN

Tanaman binahong merupakan

tanaman obat yang mengandung metabolik

sekunder berupa flavonoid, alkaloid, dan

saponin. Hasil uji fitokimia ekstrak etil

asetat daun binahong ditemukan senyawa

polifenol, alkaloid, dan flavonoid (Mufid,

2010). Rachmawati (2007), telah melakukan

skrining fitokimia daun Binahong (Anredera

cordifolia (Ten.) Steenis) menggunakan

pelarut n-heksana dan metanol diperoleh

kandungan kimia berupa saponin,

triterpenoid, flavonoid dan minyak atsiri.

Menurut Sukandar dkk (2011),

kandungan senyawa dalam daun binahong

berupa senyawa flavonoid, alkaloid,

terpenoid dan saponin serta dalam

rimpangnya terkandung senyawa ancordin.

Berdasarkan penelitian, senyawa metabolit

sekunder yang terdapat pada daub binahong

antara lain steroid, terpenoid, alkaloid,

flavonoid, saponin, polifenol dan tanin

(Mustikasari dkk, 2012).

Anasta dkk (2013) telah melakukan

skrining fitokimia metabolit sekunder pada

daun Binahong untuk uji In Vitro daya

hambat pertumbuhan bakteri Aeromonas

hydrophila dan hasilnya positif bahwa daun

binahong dapat menghambat pertumbuhan

bakteri A. hydrophila penyebab penyakit

Motile Aeromonads Septicaemia (MAS)

secara In Vitro.

Makalunsenge dkk (2014)

melakukan uji aktivitas antibakteri ekstrak

daun binahong terhadap Staphylococcus

aureus dan dapat disimpulkan bahwa

ekstrak metanol dan fraksi n-heksan mampu

menghambat pertumbuhan bakteri

staphylococcus aureus. Hasil uji lain yang

dilakukan oleh Dersana dkk (2012)

menyebutkan bahwa perasan daun binahong

memiliki aktivitas antibakteri terhadap

Escherichia coli secara In Vitro.

Ariani dkk (2013) dalam

penelitiannya yang berjudul khasiat daun

binahong terhadap pembentukan jaringan

granulasi dan reepitalisasi penyembuhan

luka terbuka kulit kelinci menyimpulkan

bahwa pembentukan granulasi lebih banyak

dan reepitalisasi terjadi lebih cepat pada luka

kelici yang diberi daun binahong, sehingga

membuat luka lebih cepat sembuh.

Sukandar dkk (2011) melakukan uji

efek ekstrak metanol daun binahong

terhadap gula darah pada mencit model

diabetes militus dan menyimpulkan bahwa

pada dosis 50, 100, dan 200 mg/kg ekstrak

metanol daun binahong dapat menurunkan

glukosa darah.

Penetapan kadar senyawa aktif

sebagai salah satu bentuk pengukuran

analitik yang pada prinsipnya bertujuan

untuk mencari nilai sebenarnya. Nilai

sebenarnya dapat diperoleh dengan baik jika

menggunakan instrumen yang telah

terkalibrasi dan memenuhi parameter-

parameter validasi. Validasi metode analisis

merupakan suatu tindakan penilaian

terhadap parameter tertentu, berdasarkan

percobaan laboratorium, untuk

membuktikan bahwa parameter tersebut

memenuhi persyaratan untuk

penggunaannya (Harmita, 2006). Apabila

metode tersebut dapat dipertanggung

jawabkan secara keseluruhan (presisi,

akurasi, selektivitas, batas deteksi, batas

kuantitasi, stabilitas dan lain lain), tidak

menyimpang dan diakui, maka metode ini

dianggap valid dan dapat digunakan untuk

analisis rutin (Hidayat, 1999).

Pengembangan penetapan kadar

flavonoid telah dilakukan dengan

menggunakan spektrofotometri UV-Vis

(kolorimetri), akan tetapi selama ini belum

pernah dilaporkan penelitian mengenai

validasi metode analisis kadar flavonoid

dengan menggunakan spektrofotometri UV-

Vis (kolorimetri), untuk ekstrak binahong.

Metode ekstraksi yang digunakan adalah

maserasi. Pelarut yang digunakan adalah

etanol 70%. Etanol digunakan karena dapat

mengekstrak senyawa aktif lebih banyak

3

dibanding pelarut organik lainnya.

(Sudarmadji dkk, 2003).

METODE PENELITIAN

Pembuatan Serbuk Simplisia Daun

Binahong

Daun binahong yang telah

dikumpulkan, masing-masing dibersihkan

dari kotoran-kotoran yang menempel

(sortasi basah) lalu dicuci dengan air

mengalir sampai bersih, kemudian ditiriskan

untuk menghilangkan air sisa-sisa pencucian

dan kemudian ditimbang. Daun binahong

yang telah bersih dan bebas air pencucian

dikeringkan di dalam oven pada suhu 500C

sampai dengan kadar air tidak lebih dari

10%, lalu dibersihkan kembali dari kotoran

yang mungkin tidak hilang saat sortasi

kering. Simplisia kering tersebut selanjutnya

digrinder hingga menjadi simplisia serbuk

lalu diayak dengan ayakan mesh 20 lalu

ditimbang untuk mendapatkan bobot akhir

simplisia. Disimpan dalam wadah yang

kering dan bersih.

Pembuatan Ekstrak Daun Binahong

Serbuk simplisia daun binahong 50 g

dimaserasi dengan pelarut etanol 70%

sebanyak 250 ml selama 24 jam kemudian

disaring sehingga diperoleh filtrat dan

ampas, kembali dilakukan maserasi terhadap

ampas dengan 150 ml dan 100 ml etanol

selama 24 jam, kemudian filtrat hasil

maserasi digabungkan dan dimasukkan ke dalam labu ukur 500 ml, lalu diencerkan

sampai batas dengan etanol. Filtrat

didiamkan selama 24 jam dan

dienaptuangkan. Filtrat selanjutnya

digunakan untuk penentuan kadar flavonoid.

Analisis Karakteristik Serbuk Simplisia

Daun Binahong.

Penetapan Kadar Air

Prosedur penentuan kadar air

simplisia dilakukan dengan menggunakan

alat moisture balance, yaitu dengan cara

menekan tombol on/off terlebih dahulu,

kemudian pinggan diletakkan di tengah dan

penahan punch diatasnya. Kemudian

di set program, akurasi dan temperatur

sesuai dengan simplisia yang akan diuji, lalu

ditara. Ditimbang simplisia sebanyak 1 gram

(akurasi rendah) atau 5 gram (akurasi

sedang), simplisia disimpan diatas punch,

diratakan sampai menutupi permukaan

punch lalu ditutup, setelah 10 menit proses

selesai maka persen kadar air dari simplisia

akan tertera secara otomatis (penentuan

dilakukan secara duplo). Kadar air umum

simplisia umumnya tidak lebih dari 12 %

(DepKes RI, 2000).

Penetapan Kadar Abu Lebih kurang 2 g sampai 3 g zat

yang telah digerus dan ditimbang seksama,

dimasukkan ke dalam krus platina atau

silikat yang telah dipijarkan dan ditara.

Dipijarkan perlahan-lahan hingga arang

habis, didinginkan dan ditimbang. Jika

dengan cara ini arang tidak dapat

dihilangkan, maka ditambahkan dan disaring

melalui kertas saring bebas abu. Dipijarkan

sisa kertas dan kertas saring dalam krus

yang sama. Dimasukkan filtrat ke dalam

krus, diuapkan, dipijarkan hingga bobot

tetap, dan ditimbang. Kadar abu dihitung

terhadap bahan yang telah dikeringkan di

udara. (DepKes RI, 1979). Standar kadar

abu total menurut DepKes RI tidak lebih

dari 15%.

Analisis Fitokimia Serbuk Simplisia

DaunBinahong.

Uji Saponin

Sekitar kurang lebih 500 mg serbuk

simplisia daun binahong lalu masukkan ke

dalam tabung reaksi, ditambahkan 10 ml air

panas, didinginkan dan kemudian dikocok

selama 10 detik (jika zat yang diperiksa

berupa cair, diencerkan 1 ml sediaan yang

diperiksa dengan 10 ml air dan dikocok kuat

selama 10 menit), terbentuk buih yang

mantap selama tidak kurang dari 10 menit,

setinggi 1 cm sampai 10 cm. pada

4

penambahan 1 tetes asam klorida 2 N buih

tidak hilang (DepKes RI, 1979).

Uji Tanin

Sebanyak 20 mg sampel

ditambahkan etanol sampai terendam

semuanya. Kemudian sebanyak 1 ml larutan

dipindahkan kedalam tabung reaksi dan

ditambahkan 2-3 tetes larutan FeCl3 1 %.

Hasil positif ditunjukkan dengan

terbentuknya warna hitam kebiruan atau

hijau (Sastrawan dkk, 2013).

Sebanyak 20 mg sampel ditambahkan air

sampai sampel terendam semuanya,

kemudian dipanaskan selama 5 menit.

Kemudian 1 ml larutan dipindahkan

kedalam tabung reaksi dan ditambahkan 2-3

tetes gelatin 1 %, lalu ditambahkan Natrium

klorida (NaCl) 10 %. Hasil positif

menunjukkan adanya endapan (Kumoro,

2015).

Uji Flavonoid

Sebanyak lebih kurang 500 mg

serbuk simplisia daun binahong ditambah

100 ml air panas kemudian dididihkan

selama 5 menit, disaring sehingga diperoleh

filtrat yang digunakan sebagai larutan

percobaan. 5 ml larutan percobaan

ditambahkan serbuk Mg dan 1 ml HCL

pekat. Selanjutnya ditambahkan amil

alcohol dengan kuat dan dibiarkan memisah.

Terbentuknya warna merah, kuning atau

jingga dalam larutan amil alkohol

menunjukkan adanya senyawa golongan

flavonoid (DepKes RI, 1979).

Uji Alkaloid

Sebanyak kurang lebih 500 mg

serbuk simplisia daun binahong

ditambahkan 1 ml asam klorida 2 N dan 9

ml air suling, dipanaskan diatas penangas air

selama 2 menit, dinginkan kemudian

disaring. Dipindahkan 3 tetes filtrat pada

kaca arloji, ditambahkan 2 tetes pereaksi

Bouchardat LP. Jika pada kedua percobaan

tidak terjadi endapan, maka serbuk tidak

mengandung alkaloid.

Jika dengan pereaksi Mayer LP

terbentuk endapan menggumpal berwarna

putih atau kuning yang larut dalam metanol

dan dengan pereaksi Bouchardat LP

terbentuk endapan berwarna coklat sampai

hitam, maka ada kemungkinan terdapat

alkaloid.

Lanjutkan percobaan dengan

mengocok sisa filtrat dengan 3 ml ammonia

peka P dan 10 ml campuran 3 bagian

volume eter P dan 1 bagian volume

kloroform P. ambil fase organik, tambahkan

natrium sulfat anfidrat P, saring. Uapkan

filtrat diatas penangas air, larutkan sisa

dalam sedikit asam klorida 2 N. Lakukan

percobaan dengan keempat golongan larutan

percobaan, serbuk mengandung alkaloid jika

sekurang-kurangnya terbentuk endapan

dengan menggunakan dua golongan larutan

percobaan yang digunakan (DepKes RI,

1979).

Pembuatan Larutan

Larutan pereaksi AlCl3 10 %

Ditimbang dengan teliti ± 5 gram

AlCl3, dimasukkan ke dalam labu ukur 50

ml dan dilarutkan dengan aquadest sampai

tanda batas.

Larutan Standar Induk Kuersetin

Ditimbang dengana teliti ± 50 mg

kuersetin, dimasukkan ke dalam labu ukur

50 ml dan dilarutkan dengan etanol 95%

sampai tanda batas (1000 ppm). Untuk

mendapatkan larutan induk kuersetin dengan

konsentrasi 100 ppm dilakukan dengan cara

memipet 10 ml kuersetin (1000 ppm),

dimasukkan ke dalam labu ukur 100 ml, dan

dilarutkan dengan etanol 95 % sampai tanda

batas (100 ppm).

Penentuan Panjang Gelombang

Maksimum Larutan Standar Kuersetin

Sebanyak 5 mL larutan standar

kuersetin konsentasi 10 ppm dimasukkan

5

dalam labu ukur 50 mL, ditambah 15 mL

etanol 95 % , 1 mL AlCl3 10%, 1 mL

natrium asetat 1 M dan air suling sampai

batas. Dikocok homogen lalu dibiarkan

selama 30 menit, diukur absorbannya pada

panjang gelombang 380-780 nm dengan

menggunakan spektrofotometer.

Penentuan Waktu Inkubasi Optimum

Sebanyak 5 mL larutan standar

kuersetin konsentasi (100 ppm) dimasukkan

dalam labu ukur 50 mL, ditambah 15 mL

etanol 95 %, 1 mL AlCl3 10%, 1 mL natrium

asetat 1 M dan air suling sampai batas,

kemudian dihomogenkan dan diinkubasi

pada suhu kamar. Serapan diukur pada

panjang gelombang maksimum pada 5, 10,

15, 20, 25 dan 30 menit, sehingga didapat

waktu optimum yang stabil.

Validasi Metode Analisis

Uji Linearitas

Dibuat deret standar kuersetin 2, 4,

6, 8, dan 10 ppm dari larutan standar

kuersetin (100 ppm) sebanyak 1, 2, 3, 4, dan

5 ml ke dalam labu ukur 50 ml. Selanjutnya

pada masing-masing labu ukur ditambahkan

15 mL etanol 95 %, 1 mL AlCl310%, 1 mL

Na asetat 1 M dan air suling sampai tanda

batas. Dikocok homogen lalu dibiarkan

selama waktu optimum, diukur absorbannya

pada panjang gelombang maksimum.

Pengukuran absorban diatas dibuat kurva

antara konsentrasi larutan standar kuersetin

dengan nilai absorban yang diperoleh dan

dihasilkan persamaan regresi linier (y = bx +

a). persamaan regresi ini digunakan untuk

menghhitung kadar ekstrak (ppm) dengan

memasukkan absorban ekstrak sebagai nilai

y ke dalam persamaan.

Uji Akurasi dan Presisi

1. Uji akurasi dan presisi dilakukan

dengan membuat larutan standar

kuersetin 2, 6, dan 10 ppm, masing-

masing larutan tersebut dibuat

sebanyak 7 labu ukur. Sebanyak 1, 3,

dan 5 mL larutan standar kuersetin

100 ppm kedalam labu ukur 50mL.

Selanjutnya pada masing-masing

labu ukur ditambahkan 15 mL etanol

95 %, 1 mL AlCl3 10%, 1 mL na

asetat 1 M dan air suling sampai

tanda batas. Dikocok homogen lalu

dibiarkan selama waktu optimum,

diukur absorbannya pada panjang

gelombang maksimum.

2. Uji akurasi dan presisi dilakukan

dengan membuat larutan standar

kuersetin 2, 6, dan 10 ppm, masing-

masing larutan tersebut dibuat

sebanyak 7 labu ukur. Sebanyak 1, 3,

dan 5 mL larutan standar kuersetin

100 ppm kedalam labu ukur 50 mL.

Selanjutnya pada masing-masing

labu ukur ditambahkan 1 mL sampel

ekstrak cair daun binahong, 15 mL

etanol 95 %, 1 mL AlCl3 10 %, 1 mL

Na asetat 1 M dan air suling sampai

tanda batas. Dikocok homogen lalu

dibiarkan selama waktu optimum,

diukur absorbannya pada panjang

gelombang maksimum dan

dilakukan 7 kali analisis.

Uji Batas Deteksi (LOD) dan Batas

Kuantitasi (LOQ)

Dibuat larutan standar kuersetin yang

mengacu pada kurva kalibrasi, dari standar

kuersetin dihitung konsentrasi dandihitung

standar deviasi.

Perhitungan :

Sy = √𝛴(𝑥𝑖−ẍ)2

𝑛−1

Q = k x SD

Slope

Keterangan :

Q = Batas deteksi dan batas kuantitas

K = 3 untuk batas deteksi dan 10 untuk batas

Kuantitas

Penetapan Kadar Flavonoid

6

Dipipet 1 ml sampel (filtrat hasil

maserasi) ke dalam labu ukur 50 ml,

kemudian ditambahkan pereaksi yang terdiri

dari 15 mL etanol 95 %, 1 mL AlCl3 10 %, 1

mL Na Asetat, dan air suling sampai tanda

batas. Dikocok homogen lalu dibiarkan

selama waktu optimum, diukur absorbannya

pada panjang gelombang maksimum.

Absorban yang dihasilkan dimasukkan ke

dalam persamaan regresi dari kurva standar

kuersetin. Kemudian dihitung flavonoid

total dengan rumus :

%kadar = ppm x volume x fp x 10−6

gram bobot simplisia x 100 %

HASIL DAN PEMBAHASAN

Hasil Pembuatan Serbuk Daun Binahong

Pemeriksaan serbuk simplisia daun

binahong meliputi pemeriksaan organoleptik

yang terdiri dari bentuk, warna, bau dan

rasa. Hasil pemeriksaan yang meliputi

parameter tersebut menyatakan bahwa

serbuk simplisia daun binahong yang

dihasilkan memiliki warna hijau tua, bau

yang khas dan rasa yang sedikit pahit.

.

Gambar 1 Serbuk Simplisia Daun Binahong

Hasil perhitungan rendemen serbuk

simplisia daun binahong sebesar 8,56 %.

Hasil ini didapat dari daun binahong segar

sebanyak 2,5 kg. setelah melalui proses

pengeringan kemudian daun binahong

diayak dengan ayakan mesh 20. Hasil

penggrinderan dari 246 gram serbuk didapat

214 gram serbuk yang telah seragam.

Penentuan kadar air berguna untuk

menyatakan kandungan air dalam serbuk

simplisia dan untuk memperkecil

pertumbuhan mikroorganisme dalam serbuk

simplisia. Semakin besar kadar air simplisia

maka semakin banyak mikroorganisme yang

dapat menyebabkan rusaknya simplisia.

Hasil pengujian kadar diperoleh kadar air

simplisia sebesar 7,63 %. Hal ini sesuai

dengan persyaratan umum simplisia yang

tidak boleh lebih dari 10 %.

Penentuan kadar abu dilakukan

untuk mengidentifikasi zat anorganik yang

ada dalam simplisia. Hasil pengujian kadar

abu pada simplisia daun binahong adalah

3.5107 %. Hasil tersebut memenuhi

persyaratan yaitu tidak lebih dari 12 %

(Depkes RI, 1989).

Estrak Cair Daun Binahong

Proses ekstraksi dilakukan dengan

cara maserasi yang termasuk ekstraksi cara

dingin (DepKes RI, 2000). Ekstraksi

maserasi digunakan karena pengerjaannya

cukup sederhana. Maserasi digunakan untuk

mengambil zat atau senyawa aktif yang

terdapat pada suatu bahan menggunakan

pelarut tertentu (Hayati dkk, 2012).

Pelarut yang digunakan dalam

maserasi simplisia daun binahong adalah

etanol 70 %. Penggunaan pelarut etanol 70

% bertujuan untuk menarik senyawa

flavonoid, karena etanol 70 % dapat menarik

senyawa flavonoid lebih baik apabila

dibandingkan dengan etanol 96 % (Yulistian

dkk, 2015).

Gambar 2 Ekstrak Cair Daun Binahong.

Hasil Uji Fitokimia Serbuk Simplisia

Daun Binahong

Pengujian fitokimia pada simplisia

dilakukan untuk mengetahui golongan

senyawa apa saja yang terkandung pada

suatu simplisia. Dari hasil uji fitokimia yang

telah dilakukan menunjukkan bahwa daun

binahong mengandung senyawa saponin,

7

tanin, flavonoid dan alkaloid. Data

selengkapnya dapat dilihat pada Tabel 1.

Tabel 1. Hasil Uji Fitokimia Simplisia

Daun Binahong

Senyawa Hasil

Saponin

Tanin

Flavonoid

Alkaloid

+

+

+

+

Keterangan: Tanda (+) menunjukkan hasil

positif.

Berdasarkan hasil uji penelitian

menunjukkan bahwa simplisia daun

binahong positif mengandung senyawa

Saponin, Flavonoid dan Alkaloid. Hal ini

dibuktikan oleh beberapa pengujian

fitokimia.

Identifikasi saponin menunjukkan

hasil positif dengan terbentuknya buih

setelah pengocokan, karena saponin yang

bersifat seperti sabun. Terbentuknya buih

yang mantap selama tidak kurang dari 10

menit, setinggi 1 cm sampai 10 cm. Pada

penambahan 1 tetes asam klorida 2 N buih

tidak hilang (DepKes RI, 1979).

Identifikasi tanin menunjukkan hasil

positif dengan terbentuknya perubahan

warna sampel menjadi hijau kecoklatan.

Perubahan warna tersebut menunjukkan

adanya senyawa tanin yang terkondensasi

(Hanani, 2015). Selain dengan cara itu, uji

tanin juga dilakukan dengan cara

penambahan gelatin 1% dan NaCl 10%,

terbentuknya endapan berwarna putih

menunjukkan bahwa sampel mengandung

tanin. Hal itu menunjukkan bahwa tanin

bersifat mengendapkan protein (Hanani,

2015).

Pada identifikasi flavonoid,

terbentuknya warna jingga menunjukkan

bahwa simplisia daun binahong positif

mengandung flavonoid. Warna merah,

kuning atau jingga yang timbul dalam

larutan amil alkohol menunjukkan adanya

senyawa golongan flavonoid (DepKes RI,

1979).

Identifikasi yang terakhir adalah

identifikasi golongan senyawa alkaloid.

Dalam identifikasi ini menggunakan

pereaksi Bouchardat LP dan Mayer LP.

Sejumlah 1 ml filtrat dengan penambahan 2

tetes Bouchardat LP menunjukkan hasil

positif dengan adanya endapan coklat

kehitaman. Pada penambahan pereaksi

Mayer LP kembali menunjukkan hasil

positif senyawa alkaloid dengan ditandai

adanya endapan coklat kehitaman. Simplisia

mengandung alkaloid jika terbentuk endapan

pada kedua percobaan tersebut (DepKes RI,

1979).

Hasil ini sesuai dengan penelitian

Sukandar dkk (2011) yang menyatakan

bahwa daun binahong mengandung senyawa

Flavonoid, Alkaloid dan Saponin.

Hasil Penentuan Panjang Gelombang.

Penetapan kadar pada penelitian ini

dilakukan dengan metode spektrofotometri

UV-Vis. Penentuan panjang gelombang

maksimum dilakukan sehingga penetapan

kadar dapat dilakukan. Penentuan panjang

gelombang maksimum dilakukan terhadap

larutan standar kuersetin pada kisaran

panjang gelombang 380 nm – 780 nm

dengan konsentrasi 10 ppm. Berdasarkan

hasil penentuan didapat nilai absorbansi

tertinggi 0,781 pada panjang gelombang 424

nm. Panjang gelombang maksimum ini

mendekati literatur, dimana panjang

gelombang maksimum kuersetin adalah 415

nm (Chang, et al. 2002). Perbedaan panjang

gelombang maksimum tersebut terjadi

karena penelitian dilakukan pada kondisi,

alat, bahan, waktu dan individu yang

berbeda. Berikut hasil penetapan panjang

gelombang maksimum : Tabel 2. Data Hasil Penetapan Panjang

Gelombang Maksimum

Panjang

Gelombang (nm) Absorbansi (a)

409 0,702

8

0.69

0.7

0.71

0.72

0 10 20 30 40

Ab

sorb

an

si

Waktu (menit)

0.690.7

0.710.720.730.740.750.760.770.780.79

412 416 420 424 428 432 436 440

Ab

sorb

an

si

Panjang Gelombang (nm)

412 0,723

415 0,745

418 0,764

421 0,776

424 (λ max)

0,781

427 0,780

430 0,776

433 0,767

436 0,753

439 0,729

Gambar 3 Kurva Panjang Gelombang Maksimum

Penentuan panjang gelombang

maksimum dilakukan untuk mengetahui

ketika absorpsi mencapai maksimum,

sehingga meningkatkan proses absorpsi

larutan terhadap sinar (Gandjar, 2007).

Hasil Optimasi Waktu Inkubasi

Penentuan waktu inkubasi dilakukan

agar diperoleh absorbansi optimum.

Penentuan ini penting untuk mengetahui

waktu reaksi antara kuersetin dan

alumunium klorida terjadi secara optimal

dan meminimalisir kesalahan. Sebelum

mencapai waktu optimum reaksi

pembentukan kompleks antara kuersetin dan

alumunium klorida sempurna dan setelah

melewati waktu optimum kompleks yang

terbentuk bisa saja rusak. Sehingga

pengukuran diluar waktu optimum dapat

memberikan kesalahan (Tulandi dkk, 2015).

Optimasi waktu inkubasi ditentukan

dengan larutan standar kuersetin pada

konsentrasi 10 ppm dan pada panjang

gelombang 424 nm. Hasil penentuan

diperoleh absorbansi tertinggi 0,712 pada

waktu 20 menit. Berikut data hasil optimasi

waktu inkubasi :

Tabel 3. Data Hasil Optimasi Waktu

Inkubasi

Waktu (Menit) Absorbansi (a)

5 0,7

10 0,707

15 0,711

20 0,712

25 0,711

30 0,711

Gambar 4 Kurva Optimasi Waktu Inkubasi

Validasi Metode Analisis

Hasil Uji Linearitas

Uji linearitas merupakan metode

yang bertujuan untuk membuktikan

hubungan linear antara konsentrasi analit

dengan respon alat yang dinyatakan dalam

koefisien korelasi (r2). Parameter lain yang

dihitung adalah koefisien fungsi regresi

(Vx0). Uji linearitas dilakukan dengan

mengukur absorbansi deret standar larutan

kuersetin (2 ppm - 10 ppm). Adapun syarat

kelinieran regresi menurut Harmita (2006)

yaitu memiliki koefisien korelasi (r2) ≥

0,990 dan koefisien fungsi regresi (Vx0) ≤ 2

%. Setelah dilakukan percobaan, didapatkan

persamaan garis y = 0,0624x – 0,0119

dengan nilai slope 0,0624, intersep 0,0119

dan koefisien korelasi (r2) 0,9995. Dari

persamaan tersebut didapat nilai koefisien

fungsi regresi (Vx0) 1,9214 %. Nilai tersebut

9

telah memenuhi syarat validasi menurut

Harmita (2006).

Hasil Uji Akurasi dan Presisi

Larutan Standar Kuersetin

Akurasi metode ditentukan dari nilai

Uji Perolehan Kembali (% UPK), sedangkan

presisi dinyatakan sebagai keterulangan.

Keterulangan ini dinyatakan sebagai

Koefisien Variasi (% KV). Persyaratan UPK

yang dapat diterima adalah 98 % - 102 %

dan % KV yang masih diterima yaitu ≤ 2 %

(Harmita, 2006). Uji akurasi dan presisi

dilakukan dengan mengukur absorbansi

larutan standar kuersetin pada konsentrasi 2,

6 dan 10 ppm serta pada masing-masing

konsentrasi dilakukan 7 kali pengulangan.

Berikut hasil yang diperoleh dari percobaan:

Tabel 4. Hasil % UPK dan %KV Larutan

Standar Kuersetin

Konsentrasi

(ppm) % UPK SD % KV

2 99,965 0,973 0,973

6 99,446 0,260 0,260

10 100,281 0,171 0,171

Berdasarkan tabel diatas,

menunjukkan bahwa akurasi dan presisi

larutan standar kuersetin memenuhi syarat

% UPK dan % KV menurut Harmita (2006).

Larutan Standar Kuersetin + Contoh

Spike Hasil uji akurasi dan presisi larutan

standar kuersetin ditambah ekstrak cair daun

binahong sebagai contoh spike mendapatkan

hasil sebagai berikut :

Tabel 5. Hasil % UPK dan %KV Larutan

Standar Kuersetin + Contoh Spike

Konsentrasi

(ppm)

% UPK SD % KV

2 101,190 0,891 0,008

6 100,655 1,015 0,010

10 100,778 0,889 0,008

Berdasarkan tabel diatas

menunjukkan bahwa nilai-nilai tersebut

memenuhi persyaratan % UPK dan % KV.

Hasil Batas Deteksi (LOD) dan Batas

Kuantitasi (LOQ).

Dari persamaan linier y = 0,0624x –

0,0119 dapat dicari batas deteksi (LOD) dan

batas kuantitasi (LOQ). Dimana LOD

ditentukan untuk mengetahui konsentrasi

terendah yang masih bisa dideteksi oleh alat.

Sedangkan LOQ dilakukan untuk

mengetahui konsentrasi terkecil dari analit

yang masih bisa terbaca oleh alat. Berikut

hasil LOD dan LOQ :

Tabel 6. Batas Deteksi dan Batas

Kuantitasi

Konsentr

asi (x)

Absor

bansi

(A) Ŷ ( ŷ-y )2

LO

D

LOQ

2

4

6

8

10

0,112

0,245

0,353

0,490

0,614

0,1129

0,2337

0,3625

0,4873

0,6121

0,000000

81

0,000053

29

0,000090

25

0,000007

29

0,000003

61

0,34

59

1,15

28

Berdasarkan hasil perhitungan

dengan menggunakan persamaan linier yang

sudah didapat, diperoleh batas deteksi

0,3459 ppm. Itu menunjukkan bahwa

konsentrasi terendah yang dapat dideteksi

oleh alat adalah 0,3459 ppm. Batas

kuantitasi yang diperoleh adalah 1,1528 ppm

yang artinya pada konsentrasi 1,1528 ppm

spektrofotometri UV-Vis dapat adanya

kuersetin pada larutan uji.

Hasil Penetapan Kadar Flavonoid

Penetapan kadar flavonoid dilakukan

terhadap ekstrak cair daun binahong yang

direaksikan dengan alumunium klorida dan

terbentuk perubahan warna menjadi kuning.

Penetapan panjang gelombang maksimum

dilakukan dengan larutan kuersetin sebagai

kontrol atau pembanding yang direaksikan

10

dengan alumunium klorida 10% dan

Natrium asetat 1M ysng sksn membentuk

warna kuning dari hasil reaksi tersebut

(Markham, 1988).

Sampel diukur pada panjang gelombang 424

nm dan menghasilkan nilai absorbansi

sebesar 0,614 A. kadar flavonoid harus

dihitung dengan memasukkan nilai absorban

tersebut ke dalam persamaan linier y =

0,0624x – 0,0119. Sehingga diketahui

konsentrasi sampel yaitu 10,0304 ppm dan

diperoleh % kadar flavonoid sebesar 0,5014

%.

KESIMPULAN DAN SARAN

Kesimpulan

1. Validasi Metode Analisis

- Linearitas pada konsentrasi 2-10 ppm

dengan koefisien korelasi (r2) sebesar

0,9995 dan koefisien fungsi regresi

(Vx0) 1,9214 %.

- Hasil uji akurasi dan presisi larutan

standar kuersetin dan larutan standar

kuersetin + contoh spike memenuhi

syarat % UPK ( dalam rentang 98 % -

102 % ) dan KV ( ≤ 2 ).

- Batas deteksi ( LOD ) sebesar 0,3459

ppm dan batas kuantitasi( LOQ )

sebesar 1,1528 ppm.

2. Kadar flavonoid yang didapat dari

ekstrak cair daun binahong sebesar

0,5429 %.

Saran

Perlu dilakukan validasi metode

analisis dengan semua parameter validasi,

agar bisa didapat data yang menyeluruh dari

metode analisis tersebut.

DAFTAR PUSTAKA

Anasta PY, Basyumi M, Lesmana I. 2013.

Skrining Fitokimia Metabolit

Sekunder pada Daun Binahong

(Anredera cordifolia (Tens) Steenis)

untuk Uji In Vitro Daya Hambat

Pertumbuhan Aeromonas

hydrophila. Fakultas Pertanian

Universitas Sumatera Utara. Medan.

Anonim. 1979. Materia Medika Indonesia.

Jilid III. Jakarta ; Direktorat Jenderal

Pengawasan Obat Dan Makanan .

Departemen Kesehatan Republik

Indonesia. Jakarta.

. 1989. Materia Medika Indonesia.

Jilid V. Jakarta ; Direktorat Jenderal

Pengawasan Obat Dan Makanan .

Departemen Kesehatan Republik

Indonesia. Jakarta.

. 2000. Parameter Standar Umum

Ekstrak Tumbuhan Obat. Direktorat

Pengawasan Obat dan Makanan.

Departemen Kesehatan Republik

Indonesia. Jakarta. Hal 1-2.

Ansel, HC. 1989. Pengantar Bentuk Sediaan

Farmasi. Edisi 4. UI Press. Jakarta.

Hal : 96.

Ariani S, Loho L, Durry MF. 2013. Khasiat

Daun Binahong (Anredera cordifolia

(Tens) Steenis) terhadap

Pembentukan Jaringan Granulasi

dan Reepitalisasi Penyembuhan

Luka Terbuka Kulit Kelinci.

Universitas Sam Ratulangi. Manado.

Chan CC, MH Yang, HM Wen, and JC

Chern. 2002. Estimation of total

flavonoid content in propolis by two

complementery colorimetric

methods. J Food Drug Anal. 10 (3),

178-182.

Darsana IO., Besung IK., Mahatmi H. 2012.

Potensi Daun Binahong (Anredera

cordifolia (Tens) Steenis) dalam

menghambat Pertumbuhan Bakteri

Escherichia coli secara In Vitro.

Indonesia Veterinus. 1 (3) : 337-351.

11

Day, R.A dan Underwood A.L. 1992.

Analisis Kimia Kuantitatif. Penerbit

Erlangga: Jakarta.

Dersana IO, Besung IK, Mahatmi H. 2012.

Potensi Daun Binahong (Anredera

cordifolia (Tens) Steenis) dalam

Menghambat Pertumbuhan Bakteri

Escerichia coli Secara In Vitro.

Indonesia Medicius Veterinus. 1(3):

337-351.

Gandjar, Ibnu Gholib. 2007. Kimia Farmasi

Analisis. Pustaka Pelajar.

Yogyakarta.

Ghania, N. 2014. Uji Aktivitas Ekstrak

Etanol 70% Daun Binahong

(Anredera cordifolia (Tens) Steenis)

Terhadap Penurunan Kadar Asam

Urat Dalam Darah Tikus Putih

Jantan yang Diinduksi dengan

Kafeina. Skripsi. Universitas Islam

Syarif Hidayatullah. Jakarta.

Hanani E. 2015. Analisis Fitokimia. Penerbit

Buku Kedokteran EGC. Jakarta

Harborne JB. 1987. Metode Fitokimia.

Padmawinata K, Soedira I,

penerjemah; Niksolihin S, editor.

Penerbit ITB: Bandung. Terjemahan

dari: Phytochemical Methode.

Harmita. 2006. Analisis Fisikokimia.

Departemen Farmasi FMIPA

Universitas Indonesia: Depok.

Hayati E K, Jannah A, Fasya A G. 2009.

Aktifitas Antibakteri Komponen

Tannin Ekstrak Daun Belimbing

Wuluh (Averrhoa bilimbi L), sebagai

Pengawet Alami, Penelitian

Kompetitif Depag Malang. UIN.

Malang.

Hidayat, A. 1999. Validasi Metode Analisis

Kimia. Agro Bio. Vol. 2, No. 2: 22-

28. Kementerian Kesehatan Republik

Indonesia. 2011. Farmakope Herbal

Indonesia Edisi 1. Departemen

Kesehatan Republik Indonesia.

Jakarta.

Khopkar, S.M. 1990. Konsep Dasar Kimia

Analitik. Penterjemah A.

Saptorahardjo. Cetakan 1. Penerbit

Universitas Indonesia: Jakarta.

Kumoro, AC. 2015. Teknologi Ekstraksi

Senyawa Bahan Aktif dari Tanaman

Obat. Platanxia. Yogyakarta. Hal :

73.

Makalunsenge F., Salimi YK., Duengo S.

2014. Uji Aktivitas Antibakteri

Ekstrak Daun Binahong terhadap

bakteri Staphylococcus aureus.

Skripsi. FMIPA. Universitas Negeri

Gorontalo. Gorontalo.

Manoi, F, & Balitro. 2009. Binahong

(Anredera cordifolia) sebagai obat.

Warta Penelitian dan

Pengembangan Tanaman Industri.

Vol 15 No : 1.

Markham, K.R. 1988. Cara

Mengidentifikasi Flavonoid.

Padmawinata K, penerjemah.

Bandung: Penerbit ITB. Terjemahan

dari: Techniques of Flavonoid

Identification.

Mufid, K. 2010. Skripsi Uji Aktivitas

Antibakteri Ekstrak Daun Binahong

(Anredera cordifolia (Tens) Steenis)

Terhadap Bakteri Staphylococcus

aureus dan Pseudomonas

aeruginosa. Universitas Islam Negeri

Maulana Malik Ibrahim. Malang.

12

Mustikasari V, Sutanto, Wardatun S. 2012.

Potensi Ekstrak Daun Binahong

(Anredera cordifolia (Tens) Steenis)

sebagai Antioksidan. Kumpulan

Jurnal Farmasi. Program Studi

Farmasi FMIPA Universitas Pakuan.

Bogor. Hal : 8-14.

Rachmawati, S. 2007. Studi Mikroskopi, dan

Skrining Fitokimia Daun Binahong

(Anredera cordifolia (Tens) Steenis).

Fakultas Farmasi UNAIR Surabaya.

Surabaya.

Sangi M, Max R J R, Herny E IS, Veronica

MA. 2008. Analisis Kimia

Tumbuhan Obat di Kabupaten

Minahasa Utara. Chem. Prog. Vol.

1(1).

Sastrawan IN, Sangi M, Vanda K. 2013.

Skrining Fitokimia dan Uji Aktifitas

Antioksidan Ekstrak Biji Adas

(Foeniculum vulgare) Menggunakan

Metode DPPH. Jurnal Ilmiah Sains.

Vol. 13 No 2 : 110-115.

Sudarmadji, Slamet, H.Bambang, Suhardi.

2003 Analisa Bahan Makanan dan

Pertanian. Liberty. Yogyakarta.

Sukandar, YE., Qowiyyah, A., Minah, N.

2011. Efek Ekstrak Metanol Daun

Binahong (Anredera cordifolia)

Terhadap Gula Darah Pada Mencit

Model Diabetes Militus. Jurnal

Medika Planta. Vol 01 No : 4.

Sumardi. 2005. Tinjauan Umum Validasi

metode Analisis. Pusat Penelitian

Kimia LIPI Bandung. Bandung.

Yulistian DP, Utomo EP, Ulfa SM,

Yusnawan E. 2015. Studi

Pengaruh Jenis Pelarut Terhadap

Hasil Isolasi dan Kadar Senyawa

Fenolik dalam Biji Kacang

Tunggak (Vigna unguiculata (L.)

Walp) sebagai Antioksidan.

Skripsi. Universitas Brawijaya.

Malang.