VALIDASI METODE ANALISIS DAIDZEIN DALAM WOUND …repository.usd.ac.id/15940/2/148114176_full.pdf ·...

VALIDASI METODE ANALISIS DAIDZEIN DALAM WOUND HEALING

PATCH SECARA REVERSED PHASE HIGH PERFORMANCE LIQUID

CHROMATOGRAPHY

SKRIPSI

Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat

Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.)

Program Studi Farmsi

Oleh:

Gloria Elan Deovita

NIM : 148114176

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS SANATA DHARMA

YOGYAKARTA

2018

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

i

VALIDASI METODE ANALISIS DAIDZEIN DALAM WOUND HEALING

PATCH SECARA REVERSED PHASE HIGH PERFORMANCE LIQUID

CHROMATOGRAPHY

SKRIPSI

Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat

Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.)

Program Studi Farmsi

Oleh:

Gloria Elan Deovita

NIM : 148114176

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS SANATA DHARMA

YOGYAKARTA

2018


ii


iii


iv


v


vi

PRAKATA

Puji syukur ke hadirat Tuhan Yang Maha Esa atas cinta kasih, berkat, dan

penyertaan-Nya yang begitu besar, sehingga penulis dapat menyelesaikan skripsi

yang berjudul “Validasi Metode Analisis Daidzein dalam Wound Healing Patch

secara Reversed Phase High Performance Liquid Chromatography” sebagai salah

satu syarat demi memperoleh gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.) di Fakultas Farmasi

Universitas Sanata Dharma Yogyakarta. Skripsi ini merupakan bagian dari

penelitian Dr. Sri Hartati Yuliani, Apt. yang berjudul “Pengembangan Sediaan

Penyembuh Luka bagi Penderita Diabetes dengan Bahan Aktif Ekstrak Tempe”

berdasarkan SK No. 020d/ LPPM USD/IV/2017.

Selama pelaksaan penelitian, penulis mendapatkan banyak dukungan

motivasi, bantuan arahan, bimbingan, kritik, saran dan doa dari berbagai pihak.

Maka dari itu, penulis mengucapkan terima kasih kepada:

1. Aris Widayati, M.Si., Ph.D., Apt, selaku Dekan Fakultas Farmasi Universitas

Sanata Dharmas Yogyakarta

2. Dr. Sri Hartati Yuliani, Apt. Selaku dosen penguji skripsi dan Kaprodi Fakultas

Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta atas teladan kepemimpinan,

masukan, kritik, dan saran yang telah diberikan selama penulis berkuliah dan

menyusun skripsi.

3. Florentinus Dika Octa Riswanto, M.Sc. selaku pembimbing utama skripsi yang

telah memberikan perhatian, bimbingan, arahan, kritik, saran, doa, semangat,

motivasi, dan bantuan lainnya sejak awal hingga akhir penelitian.

4. Dr. Christine Patramurti, Apt. Selaku dosen penguji yang memberikan kritik

dan saran untuk menyusun skripsi ini.

5. Michael Raharj Gani M.Farm., Apt. selaku dosen pendamping yang telah

banyak membantu dan memberikan motivasi serta saran pada penelitian ini.

6. Dr. Dewi Setyaningsih, M.Sc., Apt. Selaku Kepala Laboratorium Fakutas

Farmasi Universitas Sanata Dharma yang memberikan perijinan untuk

menggunakan laboraorium.


vii

7. Ibu Dr. Erna Tri Wulandari, M. Si., Apt. selaku DPA yang senantiasa

mendampingi penulis selama menjadi mahasiswa.

8. Seluruh dosen dan karyawan Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma atas

bantuan selama proses pembelajaran menempuh jenjang S1 Farmasi.

9. Aditya Bimo, Agung Sinto Nugroho, Yohanes Wagiran, dan segenap staf

laboran yang senantiasa siap membantu dan meluangkan waktunya dalam

penyediaan bahan dan alat selama penelitian.

10. Jaka Iriyanta dan In Trismawati, orang tua yang selalu mendoakan,

mendukung, dan memberi motivasi sehingga penulis dapat menyelesaikan

kuliah S1.

11. Sigit Tri Ratna yang senantiasa memberikan dukungan dan semangat.

12. Leona Wong dan Maria Euphrasia Yolanda selaku tim skripsi yang selalu

memberikan pengertian, kerja sama, motivasi, dan dukungan dalam proses

penyelesaian skripsi.

13. Teman-temanku Nita, Anas, Indri, Meilina, Tinni, Sari, Lala, Diana, dan

FSMD 2014 yang telah memberikan kenangan dan pengalaman selama kuliah.

14. Seluruh pihak yang mungkin tidak dapat disebutkan satu per satu yang telah

membantu penulis dalam menyelesaikan skripsi.

Penulis menyadari bahwa masih banyak kekurangan dalam penyusunan

skripsi ini, karena keterbatasan wawasan dan kemampuan. Penulis dengan senang

hati membuka terhadap adanya kritik dan saran yang membangun. Semoga skripsi

ini bermanfaat dan berguna bagi perkembangan penelitian ilmiah dan ilmu

pengetahuan.

Yogyakarta, 8 Desember 2017

Penulis

Gloria Elan Deovita


viii

DAFTAR ISI

HALAMAN JUDUL …………………………………………………….. i

HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING………………………….. ii

HALAMAN PENGESAHAN …………………………………………… iii

PERNYATAAN KEASLIAN KARYA …………………………………. iv

LEMBAR PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI……………... v

PRAKATA ……………………………………………………………….. vi

DAFTAR ISI ……………………………………………………………... viii

DAFTAR TABEL ………………………………………………………... ix

DAFTAR GAMBAR …………………………………………………….. x

DAFTAR LAMPIRAN …………………………………………………... xi

ABSTRACT ……………………………………………………….............. xii

INTISARI ………………………………………………………............... xiii

PENDAHULUAN ……………………………………………………….. 1

METODE PENELITIAN ………………………………………………... 2

HASIL DAN PEMBAHASAN ………………………………………….. 6

KESIMPULAN ………………………………………………………....... 12

UCAPAN TERIMA KASIH……………………………………………… 12

DAFTAR PUSTAKA ……………………………………………………. 13

LAMPIRAN ………………………………………………………............ 15

BIOGRAFI PENULIS …………………………………………………… 30


ix

DAFTAR TABEL

Tabel I Nilai Resolusi Daidzein pada Sampel ………………………….. 6

Tabel II. Hasil Penetapan Linearitas ………………………………........... 8

Tabel III. Penentuan Akurasi dan Presisi Intraday dan Interday Metode

Reversed Phase HPLC (n=3) …………………………………... 10

Tabel IV Penentuan Persen Recovery dan RSD Intraday dan Interday

pada Proses Ekstraksi (n=3) ……………………………......... 11


x

DAFTAR GAMBAR

Gambar 1. Kromatogram patch plasebo (A) Profil pemisahan daidzein pada

baku daidzein 1,26 μg/mL (B) sampel wound healing patch (C)

sampel wound healing patch yang ditambahkan baku daidzein

1,26 μg/mL (D). Kolom C18 Phenomex® 250x4,6 mm. Fase

gerak metanol : akuabidestilata (70:30). Flow rate 0,8 mL/menit.

Deteksi pada 248 nm ……………………………………………. 7

Gambar 2. Kurva Hubungan Konsentrasi Baku Daidzein dengan AUC……. 9


xi

DAFTAR LAMPIRAN

Lampiran 1. Certificate of Analysis (CoA) Daidzein ……………………… 15

Lampiran 2. Struktur Daidzein (Nan et al. 2014) ………………………..... 16

Lampiran 3. Data Penimbangan Baku Daidzein …………………………... 16

Lampiran 4. Data Penimbangan Ekstraksi Patch …………………………... 16

Lampiran 5. Kromatogram Blanko Metanol ……………………................ 17

Lampiran 6. Kromatogram Baku Daidzein …………………….................. 17

Lampiran 7. Kromatogram Sampel Ekstrak Tempe yang direndam dalam

Patch dan Contoh Perhitungan Resolusi ………......................

18

Lampiran 8. Perhitungan Seri Konsentrasi Kurva Baku ………………….. 19

Lampiran 9. Contoh Perhitungan Data Akurasi dan Presisi Metode ……... 20

Lampiran 10. Kromatogram Akurasi dan Presisi Metode …………………. 22

Lampiran 11. Contoh Perhitungan Data Recovery Ekstraksi ………………. 24

Lampiran 12. Kromatogram Recovery Ekstraksi ……………………......... 27

Lampiran 13. Perhitungan LOD dan LOQ ……………………................... 29


xii

ABSTRACT

Daidzein, a phytoesterogen component found in the soy isoflavones, has

important roles to people’s health such as anti-inflammatory effect, neuroprotective

effect, reducing lipid levels and repairing the collagen layer of the skin. Daidzein

can be obtained from ethanol extract of tempe. Daidzein can be used as potential

active substances in the wound healing patch. In order to ensure efficacy, quality

and safety, an appropriate analytical method was required for daidzein analysis in

the wound healing patch.

This study aimed to develop a valid reversed phase HPLC method.

Analytical method validation was conducted to assess validation parameters such

as selectivity, linearity, method accuracy and precision, LOD and LOQ, and

recovery extraction, so it can be used for determining the daidzein content in wound

healing patch. Daidzein was analyzed using a reversed phase HPLC system consist

of C18 column as stationary phase with methanol and redistilated water (70:30) as

mobile phase, and the flow rate of 0,8 mL/min.

The results showed that the value of the resolution was 1.929. The value

of correlation coefficient (r) was 0.9982 with the standard curve equation of y =

22567x + 13048. The LOD value was 0,1733 μg/mL and the LOQ value was 0,5777

μg/mL. The value of method recovery was 80- 110% with a precise of ≤ 7,3%, and

the value of recovery extraction is 68-79%.

Keyword : daidzein, method validation, reversed phase HPLC, wound healing

patch


xiii

ABSTRAK

Daidzein, suatu komponen fitoesterogen yang terdapat pada isoflavon

kedelai, memiliki peran penting bagi kesehatan manusia seperti efek anti-inflamasi,

efek neuroprotektif, menurunkan kadar lipid, serta dapat memperbaiki lapisan

kolagen pada kulit. Daidzein dapat diperoleh dari ekstrak etanol tempe. Daidzein

dapat dijadikan sebagai zat aktif potensial pada wound healing patch. Untuk

menjamin khasiat, mutu dan keamanan maka dibutuhkan metode analisis yang

sesuai untuk analisis daidzein dalam wound healing patch.

Penelitian ini bertujuan untuk mengembangkan metode HPLC fase

terbalik yang valid. Validasi metode analisis dilakukan terhadap parameter validitas

meliputi selektivitas, linearitas, akurasi dan presisi metode, LOD dan LOQ, serta

recovery ekstraksi, sehingga dapat digunakan untuk penetapan kadar daidzein

dalam wound healing patch. Daidzein dianalisis menggunakan sistem HPLC fase

terbalik dengan fase diam berupa kolom C18 dan fase gerak campuran metanol dan

akuabidestilata (70:30) dengan kecepatan alir 0,8 mL/menit.

Hasil penelitian menunjukkan nilai resolusi yaitu 1,929. Nilai koefisien

korelasi (r) yaitu 0,9982 dengan persamaan kurva baku y = 22567x + 13048. Nilai

LOD yaitu 0,1733 µg/mL dan LOQ yaitu 0,5777 µg/mL. Nilai persen recovery

metode yaitu 80-110% dengan presisi ≤ 7,3 %, dan nilai persen recovery ekstraksi

yaitu 68-79%.

Kata Kunci : daidzein, HPLC fase terbalik, validasi metode, wound healing patch


1

PENDAHULUAN

Kedelai atau Glycine max (L.) Merr. (Leguminosae) adalah spesies

kacang-kacangan (legume) berasal dari Asia Tenggara (He & Chen 2013).

Konsumsi kedelai diketahui mampu menurunkan risiko penyakit kardiovaskuler

(Lissin & Cooke 2000), kanker payudara (Cornwell et al. 2004), osteoporosis

(Messina 2010), menurunkan kadar kolesterol dalam darah (Ricketts et al. 2005),

memperbaiki lapisan kolagen kulit (Uyar et al. 2014) serta diketahui memiliki efek

antioksidan (Rimbach et al. 2003). Di Indonesia kedelai diolah menjadi beberapa

makanan, salah satunya adalah tempe. Fermentasi pada pembuatan tempe terjadi

karena aktivitas kapang Rhizopus sp, proses ini dapat meningkatkan kandungan

nutrisi, vitamin, fitokimia, dan kandungan antioksidatif (Haron et al. 2009).

Khasiat dari produk kedelai dapat dikaitkan dengan adanya isoflavon

(Uyar et al. 2014). Isoflavon merupakan salah satu kelompok utama dari

fitoesterogen yang ditemukan pada tanaman yang dikonsumsi manusia (He &

Ismail 2008). Fitoesterogen merupakan komponen esterogenik dari tanaman dan

memiliki struktur dan fungsi yang sama dengan hormon esterogen endogen

mamalia (Yang et al. 2012).

Penelitian yang dilakukan oleh Yuliani et al. (2016) menyatakan bahwa

terdapat senyawa yang dominan dalam ekstrak tempe selain genistein, senyawa

tersebut diduga adalah daidzein. Daidzein merupakan komponen fitoesterogen

yang ditemukan pada isoflavon kedelai, yang dikenal mempunyai efek anti-

inflamasi, menurunkan kadar lipid, dan efek neuroprotektif (Kim et al. 2015).

Daidzein larut dalam propanon, metanol, etil asetat, dan kurang larut dalam

heksana, triklorometana, dan air (Nan et al. 2014).

Tempe dapat dijadikan sebagai salah satu sumber isoflavon yang potensial,

khususnya daidzein yang memiliki manfaat penting (Yang et al. 2012, Kim et al.

2015). Isoflavon merupakan zat aktif potensial sebagai wound healing pada kulit

(Renda et al. 2013) serta dapat memperbaiki lapisan kolagen pada kulit (Uyar et al.

2014). Wound healing patch terbuat dari selulosa bakteri Acetobacter xylinum

menggunakan media ketela rambat melalui proses fermentasi (Gani 2013). Selulosa

bakteri memiliki kandungan air yang tinggi sekitar 98-99%, daya serap yang baik


2

terhadap cairan, bersifat non-allergenik, dan biasanya digunakan sebagai makanan

atau produksi material baru sebagai alat kesehatan dan penutup luka pada kulit

(Ciechanska 2004). Wound healing patch yang dianalisis pada penelitian ini adalah

sediaan yang dikembangkan menurut Gani (2013) dengan modifikasi penambahan

ekstrak etanol tempe hasil ekstraksi Yuliani et al. (2016).

Berdasarkan uraian tersebut, untuk menjamin mutu, khasiat dan keamanan

sediaan wound healing patch maka perlu adanya metode yang valid untuk analisis

daidzein dalam wound healing patch. Validasi metode penting dilakukan untuk

mendapatkan suatu kondisi metode analsis yang valid (dilihat dari parameter

validasi linearitas, rentang, akurasi, presisi, selektivitas, LOD dan LOQ yang

memenuhi kriteria). Metode yang sudah tervalidasi dapat diaplikasikan dalam

penetapan kadar senyawa daidzein dalam wound healing patch sehingga

mendukung pemanfaatannya di bidang kesehatan.

Analisis isoflavon biasanya dilakukan dengan metode TLC-densitometri

(Setiawati et al. 2014), HPTLC (Shailajan et al. 2014), dan HPLC (Yuliani et al.

2016). Pada penelitian ini digunakan metode HPLC karena memiliki kelebihan

yaitu dapat memisahkan dan mengidentifikasi komponen pada sampel bahkan

dalam konsentrasi analit yang kecil (Wang 2002), memiliki kecepatan analisis,

sensitifitas dan selektivitas yang tinggi, serta dapat dilakukan pendeteksian

serempak (simultaneous detection) hanya dalam sekali injeksi (Ardianingsih 2009).

Tujuan penelitian ini adalah untuk mengembangkan metode HPLC fase

terbalik yang valid dengan memenuhi parameter validitas meliputi selektivitas,

linearitas, akurasi dan presisi metode, LOD dan LOQ, serta recovery ekstraksi

sehingga dapat digunakan untuk penetapan kadar daidzein dalam wound healing

patch.

METODE PENELITIAN

Alat dan Bahan

Alat yang digunakan pada penelitian ini adalah HPLC (Shimadzu LC-

2010CHT) dengan detektor ultraviolet (Shimadzu), kolom C18 (Luna merek

Phenomex® 250 x 4,6 mm, ukuran partikel 5µm), seperangkat computer (merek HP


3

3CR3160MT7C, printer HP Deskjet 1000 D2566 HP-024-002-035302), timbangan

analitik ultramicro merek RADWAG® seri UYA 2.3 Y (max : 2,1 g, min 0,01 mg),

timbangan analitik OHAUS® seri PA413 (max 410 g, min 0,001 g), ultrasonikator

Refsch Tipe : T460 (Schwing 1 PXE, FTZ-Nr. C-066/83, HF-Frequ:35 kHz), Hot

Plate, Orbital Shaker (Optima OS-762), Rotary Evaporator (BUCHI Rotavapor ),

waterbath, millipore Whatman 0,45 µm, mikropipet (Socorex), alat vakum GAST

dan alat-alat gelas (Pyrex).

Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah wound healing patch

selulosa bakteri Acetobacter xylinum yang dibuat menggunakan media ketela

rambat (Gani 2013) dengan modifikasi penambahan ekstrak etanol tempe (Yuliani

et al. 2016), patch plasebo, reference standard daidzein dengan kemurnian ≥ 98%

(Sigma-Aldrich) metanol gradient grade for LC (Merck), etanol, etil asetat,

akuadestilata dan akuabidestilata yang diperoleh dari D7031 EASYpure® II

Reservoir Feed Water Purification System.

Sistem Kromatografi

Sistem kromatografi yang digunakan mengacu pada optimasi yang

dilakukan oleh Wong (2018). Fase diam yang digunakan yaitu kolom C18

Phenomex® 250 x 4,6 mm. Fase gerak menggunakan metanol dan akuabidestilata

dengan perbandingan 70:30. Flow rate yang digunakan yaitu 0,8 mL/menit. Deteksi

menggunakan panjang gelombang 248 nm. Volume injeksi HPLC 10 µL.

Pembuatan Fase Gerak

Fase gerak dibuat dengan mencampurkan metanol dan akuabidestilata

dengan perbandingan 70:30. Masing-masing fase gerak tersebut disaring dengan

penyaring Whatman 0,45 µm yang dibantu dengan pompa vakum kemudian

didegassing selama 20 menit menggunakan ultrasonikator.

Pembuatan Larutan Baku Daidzein 200,0 μg/mL

Ditimbang seksama kurang lebih 0,20 mg baku daidzein dan dilarutkan

dalam metanol hingga 1,0 mL dalam wadah microtube.


4

Pembuatan Larutan Intermediet Daidzein 20,0 μg/mL

Diambil 100 μL larutan baku daidzein 200,0 μg/mL dan dilarutkan dalam

metanol hingga 1,0 mL.

Pembuatan Larutan Seri Baku Daidzein

Larutan seri baku daidzein dengan konsentrasi 0,1; 0,3; 0,5; 0,6; 0,7; 0,9;

1,1; 1,2; 1,8; 2,4; 3,0; dan 3,6 μg/mL dibuat dengan cara mengencerkan 5; 15; 25;

30; 35; 45; 55; 60; 90; 120; 150; dan 180 μL larutan intermediet daidzein 21,09

μg/mL dan ditambahkan metanol hingga volume 1,0 mL. Masing-masing seri

konsentrasi tersebut disaring menggunakan millipore dan dipindahkan ke dalam

vial HPLC, kemudian didegassing selama 10 menit.

Preparasi Sampel

Patch dipotong seluas 4 cm2 ditimbang kemudian dimasukkan ke dalam

Erlenmeyer berisi akuadestilata dan etanol dengan perbandingan 50:50 v/v

sejumlah 50 mL (Wong 2018). Sampel tersebut dimaserasi selama 24 jam pada

suhu kamar dengan kecepatan 120 rpm. Setelah 24 jam, etanol diuapkan dengan

menggunakan rotary evaporator. Fase air yang tidak ikut menguap kemudian

dimasukkan ke corong pisah dan ditambahkan dengan 25 mL etil asetat. Dilakukan

ekstraksi cair-cair kemudian fraksi etil asetat diambil, sedangkan fraksi

akuadestilata diekstraksi lagi dengan etil asetat 25 mL. Setelah dua kali ekstraksi

cair-cair, fraksi etil asetat ditampung dan kemudian diuapkan menggunakan

waterbath pada suhu 50°C sampai kering. Larutan sampel dibuat dengan

melarutkan fraksi kering dalam 10 mL metanol.

Validasi Metode

Penentuan Selektivitas

Selektivitas ditetapkan dengan penentuan nilai Resolusi (Rs). Larutan

sampel diambil sebanyak 250 μL dan diencerkan dalam 1,0 mL metanol dengan

tiga kali replikasi. Larutan disaring menggunakan millipore dan didegassing selama

10 menit, kemudian diinjeksikan pada sistem HPLC dengan fase gerak


5

metanol:akuabidestilata 70:30 dan flow rate 0,8 mL/menit. Nilai Rs ≥ 1,5

menunjukkan puncak telah terpisah sempurna satu sama lain (Snyder et al. 2010).

Penentuan Linearitas

Linearitas diukur menggunakan larutan baku dengan enam tingkat

konsentrasi yaitu 0,6; 1,2; 1,8; 2,4; 3,0; dan 3,6 μg/mL, dengan tiga kali replikasi

untuk tiap larutan. Larutan disaring menggunakan millipore dan didegassing

selama 10 menit, kemudian diinjeksikan ke dalam sistem HPLC. AUC (Area Under

Curve) yang diperoleh dari masing-masing puncak diplotkan terhadap konsentrasi

seri larutan baku sehingga didapatkan persamaan y=bx+a (y = nilai AUC, x =

konsentrasi senyawa, a = intersept, b = slope). Linearitas dapat diterima adalah jika

memenuhi nilai koefisien korelasi (r) ≥ 0,998 (Kazakevich & LoBruto 2007)

Penentuan Akurasi dan Presisi Metode

Akurasi dan presisi metode diukur dengan cara penambahan baku pada

larutan sampel placebo patch dengan tiga level konsentrasi yaitu 1; 2; dan 3 μg/mL

dengan tiga kali replikasi. Larutan disaring menggunakan millipore dan

didegassing selama 10 menit, kemudian diinjeksikan pada sistem HPLC. Evaluasi

intraday dilakukan pada hari yang sama, sedangkan evaluasi interday dilakukan

pada hari yang berbeda selama tiga hari. Akurasi dan presisi dikatakan baik apabila

memiliki nilai persen recovery antara 80%-110% untuk kadar analit 1-10 ppm dan

RSD ≤ 7,3% untuk kadar analit 10 ppm (AOAC 2016)

Penentuan Recovery Ekstraksi

Recovery ekstraksi ditetapkan dengan cara penambahan baku daidzein

masing-masing 125; 150; 175 μL ke dalam tiga placebo patch yang berbeda dengan

cara diteteskan pada permukaan patch. Kemudian dilakukan ekstraksi patch untuk

menarik kembali daidzein dengan kondisi ekstraksi yang telah ditetapkan oleh

Wong (2018). Larutan hasil ekstraksi disaring menggunakan millipore dan

didegassing selama 10 menit, kemudian diinjeksikan pada sistem HPLC. Evaluasi

intraday dilakukan pada hari yang sama dengan tiga kali replikasi, sedangkan

evaluasi interday dilakukan pada hari yang berbeda selama tiga hari.


6

Penentuan LOD dan LOQ

LOD dan LOQ ditetapkan menggunakan larutan baku dengan enam

tingkat konsentrasi yaitu 0,1; 0,3; 0,5; 0,7; 0,9; dan 1,1 μg/mL. Penetapan batas

deteksi dan kuantifikasi menggunakan pendekatan standar deviasi menurut Miller

dan Miller (2010).

HASIL DAN PEMBAHASAN

Spesifisitas dan Selektivitas

Parameter spesifisitas bertujuan untuk mengetahui kemampuan suatu

metode analisis untuk mengukue analit tertentu secara tepat dan spesifik dengan

adanya komponen lain dalam matriks sampel, sedangkan selektivitas digunakan

untuk mengetahui kemampuan suatu metode untuk membedakan antara analit

dengan komponen lainnya yang terdapat di dalam sampel dengan kondisi

pemisahan. Pemisahan antara dua puncak ditentukan dengan nilai resolusi (Rs)

(Snyder et al. 2010).

Uji spesifisitas dilakukan dengan membandingkan puncak daidzein yang

diperoleh dari hasil injeksi larutan patch plasebo, larutan baku daizein, larutan

sampel wound healing patch, dan larutan sampel wound healing patch yang

ditambahkan larutan baku daidzein. Hasilnya ditunjukkan pada Gambar 1. Daidzein

terdeteksi pada waktu retensi 5,214-5,300 menit. Tinggi puncak daidzein

meningkat apabila baku daidzein ditambahkan ke dalam sampel wound healing

patch. Dengan demikian, daidzein dapat terdeteksi dalam matriks sampel wound

healing patch dengan spesifik. Penentuan selektivitas dapat dilihat dari pemisahan

puncak daidzein dengan senyawa lain yang terdapat dalam sampel. Analisis

dilakukan terhadap sampel dengan tiga kali replikasi. Hasil yang diperoleh dari

penentuan selektivitas ditunjukkan pada Tabel I.

Tabel I. Nilai Resolusi Daidzein pada Sampel

Replikasi Resolusi Daidzein Rata-rata Resolusi

1 1,945

1,929 2 1,936

3 1,906


7

Hasil tersebut telah memenuhi kriteria yang ditetapkan untuk nilai resolusi

yaitu ≥ 1,5 (Snyder et al. 2010), sehingga dapat dikatakan metode HPLC selektif

untuk memisahkan daidzein dengan senyawa lain pada matriks. Pemisahan

daidzein dengan senyawa lain pada larutan sampel wound healing patch

ditunjukkan pada Gambar 1(C).

Gambar 1. Kromatogram patch plasebo (A) Profil pemisahan daidzein (Dz) pada baku

daidzein 1,26 μg/mL (B) sampel wound healing patch (C) sampel wound healing patch yang

ditambahkan baku daidzein 1,26 μg/mL (D). Kolom C18 Phenomex® 250x4,6 mm. Fase gerak

metanol : akuabidestilata (70:30). Flow rate 0,8 mL/menit. Deteksi pada 248 nm.

Dz

Dz

Dz

(A)

(B)

(C)

(D)


8

Linearitas

Linearitas merupakan kemampuan suatu metode analisis untuk

memberikan respon yang secara langsung proporsional terhadap konsentrasi analit

dalam sampel dengan rentang yang ada. Linearitas dari metode dapat ditentukan

salah satunya dengan nilai koefisien korelasi (r) kurva baku. Hasil penetapan

linearitas ditunjukkan pada Tabel II.

Tabel II. Hasil Penetapan Linearitas

Replikasi I Replikasi II Replikasi III

Konsentrasi

(µg/mL)

AUC Konsentrasi

(µg/mL)

AUC Konsentrasi

(µg/mL)

AUC

0,6327 14150 0,6327 23502 0,6327 25029

1,2654 33885 1,2654 46889 1,2654 43295

1,8981 48124 1,8981 80674 1,8981 57696

2,5308 74316 2,5308 95105 2,5308 70351

3,1635 82303 3,1635 128307 3,1635 83357

3,7962 108833 3,7962 137186 3,7962 98410

A = 4217,6

B = 29121

r = 0,9940

A = 2566,7

B = 37350

r = 0,9909

A = 13048,4

B = 22567

r = 0,9982

Dalam penelitian ini, digunakan enam tingkat konsentrasi larutan baku

daidzein (0,6; 1,2; 1,8; 2,4; 3,0; 3,6 μg/mL) dengan tiga kali replikasi. Menurut

Kazakevich & LoBruto (2007), suatu metode analisis dikatakan linear apabila

memenuhi nilai koefisien korelasi (r) ≥ 0,998. Dari hasil penelitian, linearitas yang

paling baik ditunjukkan pada replikasi ketiga yaitu dengan nilai koefisien korelasi

(r) = 0,998 dengan persamaan kurva baku y = 22567x + 13048. Kurva baku yang

diperoleh menunjukkan peningkatan konsentrasi akan memberikan peningkatan

respon pengukuran (AUC). Hal ini menunjukkan bahwa metode analisis yang

digunakan memiliki linearitas yang baik.


9

Gambar 2. Kurva hubungan konsentrasi baku daidzein dengan AUC

rentang 0,6-3,6 μg/mL

Akurasi dan Presisi Metode

Penetapan akurasi bertujuan untuk mengetahui ketepatan dari suatu

metode analisis untuk mengukur kedekatan nilai rujukan dan nilai yang diperoleh

dari sampel. Sedangkan penetapan presisi bertujuan untuk mengetahui kedekatan

nilai antara masing-masing hasil uji dibawah kondisi metode yang telah ditetapkan

yang umumnya diukur dengan nilai standar deviasi relatif (RSD) (Miller & Miller

2010). Dalam penelitian ini, parameter akurasi dan presisi ditetapkan secara

intraday dan interday hari ke-1, 2, dan 3 untuk melihat akurasi dan presisi dari

metode ketika pengulangan dilakukan di bawah kondisi yang sama dalam hari yang

sama atau ketika metode digunakan pada hari yang berbeda. Akurasi dan presisi

metode ditetapkan dengan metode spiked placebo berdasarkan ICH (2005),

menggunakan tiga tingkat konsentrasi baku yaitu 1; 2; dan 3 μg/mL. Hasil

penetapan akurasi dan presisi metode ditunjukkan dalam Tabel III.

y = 22567x + 13048r = 0.9982

0

20000

40000

60000

80000

100000

120000

0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4

AU

C

Konsentrasi Daidzein (µg/mL)

Kurva Baku Daidzein


10

Tabel III. Penentuan Akurasi dan Presisi Intraday dan Interday Metode Reversed Phase

HPLC (n=3)

Konsentrasi

teoretis (μg/mL)

Konsentrasi

terukur (μg/mL)

Akurasi

(%)

RSD

(%)

Intraday

1,055 1,030 97,679 2,045

2,109 2,241 106,256 3,098

3,164 2,888 91,287 2,443

Interday

1,055 0,9875 93,654 4,970

2,109 2,212 104,902 2,220

3,164 2,953 90,343 3,100

Menurut AOAC (2016), kriteria penerimaan untuk akurasi berdasarkan

persen recovery yaitu 80%-110% untuk kadar analit 1-10 ppm, sedangkan kriteria

penerimaan untuk presisi berdasarkan nilai RSD yaitu ≤ 7,3% untuk kadar analit 10

ppm. Hasil menunjukkan bahwa persen recovery dan RSD telah memenuhi kriteria

yang ditetapkan, baik akurasi dan presisi intraday maupun interday. Hal ini

menunjukkan bahwa metode yang digunakan akurat dan presisi karena dapat

memberikan ketepatan dan kedekatan hasil yang diperoleh dengan nilai rujukan.

Recovery Ekstraksi

Penetapan recovery ekstraksi bertujuan untuk mengetahui seberapa

banyak analit yang diperoleh kembali dari sampel pada saat proses analisis yang

dinyatakan dalam nilai persen recovery, selain itu juga untuk mengetahui efektivitas

metode ekstraksi untuk menarik analit dari matriks sampel. Dalam penelitian ini,

parameter recovery ekstraksi ditetapkan menggunakan tiga tingkat kandungan baku

yaitu 125; 150; 175 μg yang diteteskan ke dalam matriks sampel agar terjebak di

dalamnya. Penetapan ini dilakukan secara intraday dan interday hari ke-1, 2, dan 3

untuk melihat akurasi dan presisi dari metode ketika pengulangan dilakukan di

bawah kondisi yang sama dalam hari yang sama atau ketika metode digunakan pada

hari yang berbeda. Hasil persen recovery dan RSD yang diperoleh ditunjukkan

dalam Tabel IV.


11

Tabel IV. Penentuan Persen Recovery dan RSD Intraday dan Interday pada Proses Ekstraksi

(n=3)

Bobot daidzein yang

ditambahkan (μg)

Bobot daidzein yang

terukur terukur (μg)

Recovery

(%)

RSD

(%)

Intraday

109,35 92,05 84,18 6,17

131,22 117,40 89,46 0,57

153,09 130,28 85,10 6,68

Interday

109,35 91,61 83,77 4,98

131,22 113,40 86,42 4,20

153,09 130,55 85,28 3,33

Hasil menunjukkan bahwa persen recovery yang didapat yaitu 83-89%

baik intraday maupun interday, hal ini sudah sesuai dengan kriteria menurut AOAC

(2016) untuk kadar analit 10 ppm yaitu sebesar 80-110%. Hasil RSD yang didapat

sudah memenuhi kriteria ≤ 7,3%, artinya pengukuran yang dilakukan sudah presisi

atau adanya kedekatan nilai antara masing-masing hasil uji dibawah kondisi metode

yang telah ditetapkan.

LOD dan LOQ

Limit of Detection (LOD) merupakan jumlah terkecil analit dalam sampel

yang masih dapat dideteksi dan dibedakan dari blanko. Limit of Quantification

(LOQ) merupakan konsentrasi analit terkecil dalam sampel yang masih dapat

diukur. Penentuan LOD dan LOQ menggunakan enam tingkat konsentrasi baku

yaitu 0,1; 0,3; 0,5; 0,7; 0,9; dan 1,1 μg/mL. Nilai LOD dan LOQ diperoleh dengan

pendekatan simpangan baku menurut Miller & Miller (2010). Hasil LOD yang

diperoleh yaitu 0,1733 µg/mL dan LOQ 0,5777 µg/mL. LOD dan LOQ

menunjukkan sensitivitas dari suatu metode. Semakin kecil nilai LOD dan LOQ

maka dapat dikatakan bahwa metode HPLC memiliki sensitifitas yang semakin

tinggi (Armbuster & Try 2008).


12

KESIMPULAN

Metode reversed phase HPLC untuk analisis daidzein dalam wound

healing patch yang dikembangkan dalam penelitian ini telah memenuhi parameter

selektivitas, linearitas, akurasi dan presisi metode, LOD dan LOQ, sehingga dapat

dimanfaatkan dalam penetapan kadar daidzein. Hal tersebut dibuktikan dengan

hasil yang diperoleh meliputi selektivitas dengan nilai resolusi (Rs) > 1,5, linearitas

dengan nilai r = 0,9982 yang diperoleh dari persamaan y = 22567x + 13048 dengan

rentang 0,6-3,6 µg/mL, akurasi dengan nilai 80-110%, presisi dengan nilai RSD ≤

7,3%, LOD 0,1733 µg/mL dan LOQ 0,5777 µg/mL, dan hasil dari recovery

ekstraksi yaitu sebesar 80-90%.

Meskipun demikian perlu dilakukan penelitian selanjutnya tentang

pengembangan metode ekstraksi wound healing patch untuk menghasilkan

recovery yang lebih baik atau menggunakan standar internal sebagai pengoreksi.

UCAPAN TERIMA KASIH

Penelitian ini didanai oleh penelitian PTUPT Ristekdikti dengan nomor

kontrak 075/panel.LPPM USD/IV/2017.


13

DAFTAR PUSTAKA

AOAC, 2016. Appendix F: Guidelines for Standard Method Performance

Requirements, AOAC Official Methods of Analysis, 1-18.

Ardianingsih, R., 2009. Penggunaan High Performance Liquid Chromatography

(HPLC) Dalam Proses Analisa Deteksi Ion. Berita Dirgantara, 10(4), 101–

104.

Armbuster, D.A., and Pry, T., 2008. Limit of Blank, Limit of Detection and Limit

of Quantitation, Clin Biochem Rev, 29, 49-52.

Ciechanska, D., 2004, Multifunction Bacterial Cellulose/Chitosan Composite

Material for Medical Application, Fibres & Textiles in Eastern Europe,

Vol.12, 4 (48), 69-72.

Cornwell, T., Cohick, W. & Raskin, I., 2004. Dietary Phytoestrogens and Health

Dietary phytoestrogens and health. Phytochemistry, 65, 995-1016.

Gani, M. R., 2013. Pengaruh Pemberian Sediaan Biomaterial Selulosa Bakteri

Acetobacter xylinum dari Limbah Ketela Rambat (Ipomoea batatas Poir)

dengan Penambahan Chitosan sebagai Material Penutup Luka pada Tikus

Galur Wistar Jantan, Skripsi, Yogyakarta: Fakultas Farmasi, Universitas

Sanata Dharma.

Haron, H., Ismail, A., Azlan, A., Shahar, S., and Su, L., 2009. Daidzein and

Genestein Contents in Tempeh and Selected Soy Products. Food Chemistry,

115(4), 1350–1356.

He, F. & Chen, J., 2013. Consumption of Soybean, Soy Foods, Soy Isoflavones and

Breast Cancer Incidence : Differences Between Chinese Women and Women

in Western Countries and Possible Mechanisms. Food Science and Human

Wellness, 2(3–4), 146–161.

He, K. & Ismail, A., 2008. Determination of Daidzein and Genistein Contents in

Mangifera Fruit. Mal J Nutr, 14(2), 189–198.

Kazakevich, Y. & LoBruto, R., 2007. HPLC For Pharmaceutical Scientists,

Hoboken, New Jersey: John Wiley & Sons, Inc.

Kim, E., Woo, M., Qin, L., Ma, T., Beltram, C.D., Bao, Y., Bailey., J.A., Corbett,

D., Ratan, R.R., Lahiri, D.L., and Cho, S., 2015. Daidzein Augments

Cholesterol Homeostasis via ApoE to Promote Functional Recovery in

Chronic Stroke. Neurobiology of Disease, 35(45), 15113–15126.

Lissin, L.W. & Cooke, J.P., 2000. Phytoestrogens and Cardiovascular Health.

Journal of the American College of Cardiology, 35(6), 1403–1410.

Messina, M., 2010. Insights Gained from 20 Years of Soy Research. The Journal

of Nutrition, 140, 2289–2295.

Miller, J.N. & Miller, J.C., 2010. Statistics and Chemometrics for Analytical

Chemistry Sixth Edit., Harlow, England: Pearson Education Limited.

Nan, G., Shi, J., Huang, Y., Sun, J., Lv, J., Yang, G., and Li, Y., 2014. Dissociation

Constants and Solubilities of Daidzein and Genistein in Different Solvents.

Journal of Chemical and Engineering Data, 59, 1304-1311.

Q2(R1); ICH, 2005. ICH Q2(R1) - Validation of Analytical Procedures: Text and

Methodology, International Conference on Harmonisation Tripartite

Guideline, 1-13.


14

Renda, G. Yalcin, F.N., Nemutlu, E., Akkol, E.K., Suntar, I., Keles, H., Ina, H.,

Calis, I., and Ersoz, T., 2013. Comparative Assessment of Dermal Wound

Healing Potentials of Various Trifolium L. Extracts and Determination of

Their Isoflavone Contents as Potentials Active Ingredients. Journal of

Ethnopharmacology, 148, 423-432.

Ricketts, M., David, D.M., Banz, W.J., Mezei, O., and Shay, N.F., 2005. Molecular

mechanisms of action of the soy isoflavones includes activation of

promiscuous nuclear receptors. A review. Journal of Nutritional Biochemistry,

16, 321–330.

Rimbach, G., Pascual-teresa, S.D.E. & Ewins, B.A., 2003. Antioxidant and free

radical scavenging activity of isoflavone metabolites. Xenobiotica, 33(9),

913–925.

Setiawati, A., Yuliani, S.H., Gani, M.R., Veronica, E.F., Putri, D.C.A., Putra, R.E.,

Putra, D.C., Kurniawan, A.M., dan Istiyastono, E.P., 2014. Analisis

Kuantitatif Isoflavon Tempe Secara Cepat dan Sederhana Menggunakan

Metode Kromatografi Lapis Tipis- Densitometri. Jurnal Farmasi Sains dan

Komunitas, 11(1), 13–17.

Shailajan, S., Kumaria, S., Pednekar, S., Menon, S., Joshi, H., and Matani, A., 2014.

Chromatographic Evaluation of a Phytoestrogen Genistein from Flemingia

vestita Benth : an Endemic Plant of Northeast India. Pharmacognosy

Communication, 4(4), 2–9.

Snyder, L.R., Kirkland, J.J. & Dolan, J.W., 2010. Introduction to Modern Liquid

Third Edition, Third Edit., Hoboken, New Jersey: John Wiley&Sons, Inc.

Uyar, B., Sivrikoz, O., Ozdemir, U., Dasbasi, T., and Sacar, H., 2014. Histological

Investigation of The Effect Of Soybean (Glycine Max) Extracts on The

Collagen Layer and Estrogen Receptors in The Skin of Female Rats. Clinics,

69(12), 854–861.

Wang, C., 2002. Review of The Methods Used in The Determination of

Phytoesterogens. Journal of Chromatography B, 777, 3–28.

Wong, L., 2018. Optimasi Metode Analisis Daidzein dalam Wound Healing Patch

Secara Reverse Phase High Performance Liquid Chromatography. Skripsi,

Yogyakarta: Fakultas Farmasi, Universitas Sanata Dharma.

Yang, S., Liao, C., Chen, Y., Syu, J., Jeng, C., and Wang, S., 2012. Daidzein

Induces Neuritogenesis in DRG Neuronal Cultures. Journal of Biomedical

Science, 19(80), 1–13.

Yuliani, S.H., Istyastono, E.P., and Riswanto, F.D., 2016. The Cytotoxic Activity

on T47D Breast Cancer Cell of Genistein-Standardized Ethanolic Extract of

Tempeh - A Fermented Product of Soybean (Glycine max). Oriental Journal

of Chemistry, 32(3), 1619-1624.


15

Lampiran 1. Certificate of Analysis (CoA) Daidzein


16

Lampiran 2. Struktur Daidzein (Nan et al. 2014)

Lampiran 3. Data Penimbangan Baku Daidzein

Kode Wadah awal

(mg)

Wadah+bahan

(mg)

Wadah akhir

(mg)

Bahan (mg)

D1 6,5935 6,8125 6,6015 0,2109

D3 7,5472 7,7795 7,5608 0,2187

Lampiran 4. Data Penimbangan Ekstraksi Patch

Wadah awal

(g)

Wadah+bahan

(g)

Wadah+bahan

setelah diuapkan

(g)

Bahan

(g)

Ekstraksi patch

plasebo

105,16 148,60 105,31 0,15

108,13 156,20 108,29 0,16

105,84 159,14 106,01 0,14

Ekstraksi

patch+baku

106,87 161,29 107,08 0,21

105,20 158,33 105,39 0,19

107,12 159,21 107,35 0,23


17

Lampiran 5. Kromatogram Blanko Metanol

Lampiran 6. Kromatogram Baku Daidzein

1. Kromatogram Baku Daidzein Konsentrasi 0,6327 µg/mL


18

2. Kromatogram Baku Daidzein Konsentrasi 3,7962 µg/mL

Lampiran 7. Kromatogram Sampel Patch yang direndam dalam Ekstrak

Tempe dan Contoh Perhitungan Resolusi

1. Kromatogram Sampel

2. Contoh Perhitungan Resolusi

Resolusi = 2(t2 − t1)

W2 + W1

Keterangan:

t1 dan t2 = waktu retensi dari peak 1 dan 2


19

W1 dan W2 = lebar peak 1 dan 2

Diketahui t daidzein = 5,229

t puncak di depan daidzein = 4,735

lebar puncak di depan daidzein = 0,2374

lebar puncak daidzein = 0,271

Resolusi = 2(t2−t1)

W2+W1 =

2 (5,229−4,735)

0,2374+0,271 = 1,945

Lampiran 8. Perhitungan Seri Konsentrasi Kurva Baku

Penimbangan baku daidzein = 0,2109 mg

Konsentrasi stok daidzein = 0,2109 𝑚𝑔

1,0 𝑚𝐿 = 0,2109 mg/mL = 210,9 µg/mL

Konsentrasi intermediet daidzein

C1 V1 = C2 V2

210,9 µg/mL . 100 µL = C2 . 1000 µL

C2 = 21,09 µg/mL

Konsentrasi larutan seri 0,6 µg/mL

C1 V1 = C2 V2

21,09 µg/mL . 30 µL = C2 . 1000 µL

C2 = 0,6327 µg/mL


C1 V1 = C2 V2

21,09 µg/mL . 60 µL = C2 . 1000 µL

C2 = 1,2654 µg/mL


C1 V1 = C2 V2

21,09 µg/mL . 90 µL = C2 . 1000 µL

C2 = 1,8981 µg/mL


C1 V1 = C2 V2

21,09 µg/mL . 120 µL = C2 . 1000 µL

C2 = 2,5308 µg/mL


C1 V1 = C2 V2


20

21,09 µg/mL . 150 µL = C2 . 1000 µL

C2 = 3,1635 µg/mL


C1 V1 = C2 V2

21,09 µg/mL . 180 µL = C2 . 1000 µL

C2 = 3,7962 µg/mL

Lampiran 9. Contoh Perhitungan Data Akurasi dan Presisi Metode

1. Contoh perhitungan konsentrasi teoritis



1,0 𝑚𝐿 = 0,2109 mg/mL = 210,9 µg/mL

Konsentrasi intermediet daidzein

C1 V1 = C2 V2

210,9 µg/mL . 100 µL = C2 . 1000 µL

C2 = 21,09 µg/mL

Konsentrasi larutan seri 1 µg/mL

C1 V1 = C2 V2

21,09 µg/mL . 50 µL = C2 . 1000 µL

C2 = 1,0545 µg/mL


C1 V1 = C2 V2

21,09 µg/mL . 100 µL = C2 . 1000 µL

C2 = 2,109 µg/mL


C1 V1 = C2 V2

21,09 µg/mL . 150 µL = C2 . 1000 µL

C2 = 3,1635 µg/mL

2. Contoh perhitungan konsentrasi sebenarnya (intraday replikasi 1)

1 µg/mL y = 22567x + 13048,4

36582 = 22567x + 13048,4


21

X = 1,043 µg/mL

2 µg/mL y = 22567x + 13048,4

62412 = 22567x + 13048,4

X = 2,187 µg/mL

3 µg/mL y = 22567x + 13048,4

79874 = 22567x + 13048,4

X = 2,961 µg/mL

3. Contoh perhitungan persen akurasi (replikasi 1)

% 𝐴𝑘𝑢𝑟𝑎𝑠𝑖 = 𝑘𝑜𝑛𝑠𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑠𝑖 𝑠𝑒𝑡𝑒𝑙𝑎ℎ 𝑎𝑑𝑖𝑠𝑖 − 𝑘𝑜𝑛𝑠𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑠𝑖 𝑡𝑎𝑛𝑝𝑎 𝑎𝑑𝑖𝑠𝑖

𝑘𝑜𝑛𝑠𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑠𝑖 𝑎𝑑𝑖𝑠𝑖 𝑥 100%

1 µg/mL Akurasi = 1,043 µg/mL−0 µg/mL

1,0545 µg/mL 𝑥 100%

= 98,895 %


2,109 µg/mL 𝑥 100%

= 103,719 %


3,1635 µg/mL 𝑥 100%

= 93,606 %

4. Contoh perhitungan RSD (replikasi 1)

𝑅𝑆𝐷 = 𝑆𝑡𝑎𝑛𝑑𝑎𝑟 𝑑𝑒𝑣𝑖𝑎𝑠𝑖 (𝑆𝐷)

𝑟𝑎𝑡𝑎 − 𝑟𝑎𝑡𝑎 𝑘𝑎𝑑𝑎𝑟 𝑥 100%

1 µg/mL RSD = 0,021

1,030 𝑥 100%

= 2,045 %

2 µg/mL RSD = 0,069

2,241 𝑥 100%

= 3,098 %

3 µg/mL RSD = 0,070

2,887 𝑥 100%

= 2,443 %


22

Konsentrasi

teoritis (μg/mL)

Konsentrasi

terukur (μg/mL)

Akurasi

(% recovery)

RSD

Intraday / Interday 1

1,0545 1,0190 96,635 6,560

2,109 2,1146 100,265 3,212

3,1635 2,6878 84,964 4,725

Interday 2

1,0545 1,0300 97,6793 2,0451

2,109 2,2405 106,2561 3,0984

3,1635 2,8878 91,2873 2,4425

Interday 3

1,0545 0,9137 86,6471 6,3034

2,109 2,2816 108,1863 0,3468

3,1635 3,2830 103,7777 2,1329

Lampiran 10. Kromatogram Akurasi dan Presisi Metode

1. Kromatogram blank tanpa adisi baku


23

2. Kromatogram adisi 1 µg/mL pada intraday (replikasi 1)



24


Lampiran 11. Contoh Perhitungan Data Recovery Ekstraksi

1. Contoh perhitungan konsentrasi teoritis



0,25 𝑚𝐿 =

218,7 µ𝑔

250 µ𝐿

Bobot daidzein yang diteteskan ke patch

Low 218,7 µ𝑔

250 µ𝐿 =

𝑥

125 µ𝐿

X = 109,35 µg

Medium 218,7 µ𝑔

250 µ𝐿 =

𝑥

150 µ𝐿

X = 131,22 µg

High 218,7 µ𝑔

250 µ𝐿 =

𝑥

175 µ𝐿

X = 153,09 µg

Bobot rata-rata patch plasebo = 8,320 mg


25

Konsentrasi daidzein dalam patch = 109,35 µ𝑔

8,320 𝑚𝑔 = 13,14 µg/mg kriteria

penerimaan recovery untuk kadar analit 10 ppm yaitu 80-110% (AOAC

2016).

2. Contoh perhitungan bobot yang dperoleh (bobot terukur)

Low y = 22567x + 13048,4

68028 = 22567x + 13048,4

X = 2,436 µg/mL

Bobot daidzein = konsentrasi x FP x Volume awal larutan

= 2,436 µg/mL x 4 x 10 mL

= 97,45 µg

Medium y = 22567x + 13048,4

79559 = 22567x + 13048,4

X = 2,947 µg/mL


= 2,947 µg/mL x 4 x 10 mL

= 117,89 µg

High y = 22567x + 13048,4

89794 = 22567x + 13048,4

X = 3,400 µg/mL


= 3,400 µg/mL x 4 x 10 mL

= 136,03 µg

3. Contoh perhitungan persen recovery

𝑃𝑒𝑟𝑠𝑒𝑛 𝑅𝑒𝑐𝑜𝑣𝑒𝑟𝑦 = 𝑏𝑜𝑏𝑜𝑡 𝑡𝑒𝑟𝑢𝑘𝑢𝑟

𝑏𝑜𝑏𝑜𝑡 𝑡𝑒𝑜𝑟𝑒𝑡𝑖𝑠 𝑥 100%

Low Recovery = 97,45 µg

109,35 µg 𝑥 100%

= 89,12 %

Medium Recovery = 117,89 µg

131,22 µg 𝑥 100%

= 89,84 %


26

High Recovery = 136,03 µg

153,09 µg 𝑥 100%

= 88,86 %

4. Contoh perhitungan RSD (replikasi 1)

𝑅𝑆𝐷 = 𝑆𝑡𝑎𝑛𝑑𝑎𝑟 𝑑𝑒𝑣𝑖𝑎𝑠𝑖 (𝑆𝐷)

𝑟𝑎𝑡𝑎 − 𝑟𝑎𝑡𝑎 𝑏𝑜𝑏𝑜𝑡 𝑥 100%

Low RSD = 5,68

92,65 𝑥 100%

= 6,17 %

Medium RSD = 0,57

117,39 𝑥 100%

= 0,57 %

High RSD = 8,71

130,28 𝑥 100%

= 6,68 %

Bobot daidzein yang

ditambahkan (μg)

Bobot daidzein

yang terukur (μg)

Persen

recovery

RSD

(%)

Intraday / Interday 1

109,35 87,38 80,38 3,40

131,22 113,16 86,24 4,20

153,09 129,59 84,65 1,06

Interday 2

109,35 92,05 84,18 6,17

131,22 117,40 89,46 0,57

153,09 130,28 85,10 6,68

Interday 3

109,35 94,87 86,76 5,38

131,22 109,65 83,56 4,05

153,09 131,80 86,10 2,25


27

Lampiran 12. Kromatogram Recovery Ekstraksi

1. Kromatogram level low pada intraday

2. Kromatogram level medium pada intraday


28

3. Kromatogram level high pada intraday


29

Lampiran 13. Perhitungan LOD dan LOQ

Konsentrasi

analit (X)

X

bar

(X-Xbar)2 AUC

(Y)

Y teoritis Y- Y

teoritis

(Y- Y

teoritis)2

0,105 0,6 12,49 3592 3423,825 168,174 28282,679

0,316 11,05 10614 9371,416 1242,584 1544014

0,527 9,69 15086 15319,01 -233,007 54292,378

0,738 8,42 18544 21266,6 -2722,6 7412540,686

0,949 7,24 27549 27214,19 334,811 112098,372

1,16 6,15 34373 33161,78 1211,22 1467054,01

∑ 10618282,25

A = 450,03

B = 28201

r = 0,9915

S(y/x)2 = ∑ (Y−Y teoritis)

𝑛−2

= 10618282,25

4

= 2654570,563

S (y/x) = √2654570,563

= 1629,2853

Y LOD = A + (3 x S(y/x)) = 450,03 + (3 x 1629,2853) = 5337,886

LOD = Y LOD−A

b =

5337,886−450,03

28201 = 0,1733 µg/mL

Y LOQ = A + (10 x S(y/x)) = 450,03 + (10 x 1629,2853) = 16724,883

LOQ = Y LOQ−A

b =

16724,883−450,03

28201 = 0,5777 µg/mL


30

BIOGRAFI PENULIS

Penulis skripsi berjudul “Validasi Metode Analisis

Daidzein dalam Wound Healing Patch secara Reversed

Phase High Performance Liquid Chromatography”

memiliki nama lengkap Gloria Elan Deovita. Penulis

lahir di Bandar Lampung pada tanggal 24 Juli 1996

sebagai anak pertama dari dua bersaudara, dari

pasangan Jaka Iriyanta dan In Trismawati. Pendidikan

formal yang pernah ditempuh penulis adalah TK

Xaverius Way Halim (2000-2002), SD Xaverius 3

(2002-2008), SMPN 29 Bandar Lampung (2008-2011),

SMAN 5 Bandar Lampung (2011-2014) dan pada tahun 2014 melanjutkan

pendidikan di Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta. Selama

kuliah penulis aktif dalam kegiatan dan organisasi antara lain: anggota UKF DNA

Dance Crew, panitia Desa Mitra 2015, panitia Insadha 2016, panitia LCC Kimia

2016, panitia Pharmacy Performance 2016, dan asisten praktikum Kimia Analisis

2017.


VALIDASI METODE ANALISIS DAIDZEIN DALAM WOUND …repository.usd.ac.id/15940/2/148114176_full.pdf ·...

Documents

Transcript of VALIDASI METODE ANALISIS DAIDZEIN DALAM WOUND …repository.usd.ac.id/15940/2/148114176_full.pdf ·...