JURNAL - KCKT "Analisa Kafein Dengan Alat HPLC" ABSTRAK Penentuan kadar kafein dalam sampel kafein. Sampel di larutkan dengan pelarut aq uabidest, kemudian sampel di saring dengan pompa vakum dengan menggunakan kertas saring khusus ( kertas saring 47 mm, 0,45 m ), hasil saringan dianalisa dengan a lat HPLC ( High Performance Liquid Chromatography ) dimana fasa geraknya adalah methanol : aquabidest ( 30 mL : 70 mL ), menggunakan detektor S2500 UV dengan pa njang gelombang 272 nm, menggunakan kolom kromasil 100-5C 18, dengan sistem peng aliran fasa geraknya adalah isokratik. Hasil percobaan menunjukkan konsentrasi l arutan contoh yaitu 5,088 ppm yang di injeksi sebanyak 15 L dan memperoleh waktu retensi selama 1,000 menit dengan AREA = 45003, AREA % = 24,33, HEIGHT = 8248, H EIGHT % = 72,45. ABSTRACT Determination of caffeine content in a sample of caffeine. Samples dissolved in a solvent aquabidest, then samples were filtered with a vacuum pump by using a s pecial filter paper (filter paper 47 mm, 0.45 m), the filter was analyzed by inst rument of HPLC (High Performance Liquid Chromatography) in which the movement ph ase is methanol : aquabidest (30 mL: 70 mL), using the S2500 UV detector with a wavelength of 272 nm, using a column kromasil 100-5C18, the drainage system is a n isocratic phase motion. The experimental results showed the concentration of s ample solution is 5,088 ppm of the injection of 15 L and obtained during the rete ntion time 1,000 minutes with AREA = 45003, AREA% = 24,33, HEIGHT = 8248, HEIGHT = 72,45%. BAB I PENDAHULUAN A .Latar Belakang HPLC (High Performance Liquid Ch0-an oromatoggraphy) atau biasa juga disebut den gan kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT) dikembangkan pada akhir tahun 1960-a n dan awal tahun 1970-an, saat ini HPLC merupakan teknik pemisahan yang diterima secara luas untuk analisis bahan obat ,baik dalam bulk atau dalam sediaan farma setik. Instrumentasi HPLC pada dasarnya terdiri atas : wadah fase gerak,pompa,alat untu k memasukkan sampel(tempat injeksi) kolom,detector,wadah penampungbuangan fase g erak,dan suatu computer atau integrator atau perekam. (http://en.wikipedia.org/w iki/ kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT) Kafeina atau populernya kafein ialah senyawa alkaloid xantina berbentuk Kristal dan berasa pahit yang bekerja sebagai obat perasangsang psikoaktif dan diuretic ringan.kafeina ditemukan oleh seorang kimiawan jerman friedrich Ferdinand runge pada tahun 1819.Ia menciptakan istilah kaffein untuk merujuk pada senyawa kimia pa da kopi. B.Rumusan Masalah Peralatan yang digunakan untuk analisa contoh dalam bentuk bulk atau sediaan far masetik Prinsip kerja dari HPLC Sumber dari kafein C. Tujuan 1..Untuk mengetahui cara menggunakan HPLC 2. Untuk dapat menentukan retention time,area,kadar area, height dan kadar darikafein. BAB II PEMBAHASAN Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) atau High Pressure Liquid Chromatography (HPLC) merupakan salah satu metode kimia dan fisikokimia. KCKT termasuk metode analisis terbaru yaitu suatu teknik kromatografi dengan fasa gerak cairan dan fa sa diam cairan atau padat. Banyak kelebihan metode ini jika dibandingkan dengan metode lainnya (Done dkk, 1974; Snyder dan Kirkland, 1979; Hamilton dan Sewell, 1982; Johnson dan Stevenson, 1978). Kelebihan itu antara lain: Mampu memisahkan molekul-molekul dari suatu campuran Mudah melaksanakannya Kecepatan analisis dan kepekaan yang tinggi Dapat dihindari terjadinya dekomposisi / kerusakan bahan yang dianalisis Resolusi yang baik Rapat digunakan bermacam-macam detektor Kolom dapat digunakan kembali Mudah melakukan "sample recovery" Metode HPLC dapat digunakan untuk analisa kuantitatif dan sekaliguskualitatif. U ntuk analisa kualitatif dengan membandingkan kromatogram sampel dengan kromatogr am baku pembanding berdasarkan waktu retensinya. Sedangkan untuk analisa kuatitatif dapat digunakan dengan persamaan : Cx = Ax / Ap X Cp Keterangan : A = Peak area = Luas puncak C= Konsentrasi X = sampel P = pembanding Atau jika ingin mendapatkan data yang lebih valid dapat pula ditentukan dengan m enggunakan kurva kalibrasi larutan standar. 1. JENIS HPLC Pemisahan dengan HPLC dapat dilakukan dengan fase normal (jika fase diamnya lebi h polar dibanding dengan fase geraknya) atau fase terbalik (jika fase diamnya ku rang non polar dibanding dengan fase geraknya). Berdasarkan pada kedua pemisahan ini, sering kali HPLC dikelompokkan menjadi HPLC fase normal dan HPLC fase terb alik. Selain klasifikasi di atas, HPLC juga dapat dikelompokkan berdasarkan pada sifat fase diam dan atau berdasarkan pada mekanisme sorpsi solut; dengan jenis-jenis HPLC sebagai berikut: 1. Kromatografi Adsorbsi Prinsip kromatografi adsorpsi telah diketahui sebagaimana dalam kromatografi kol om dan kromatografi lapis tipis. Pemisahan kromatografi adsorbsi biasanya menggu nakan fase normal dengan menggunakan fase diam silika gel dan alumina, meskipun demikian sekitar 90% kromatografi ini memakai silika sebagai fase diamnya. Pada silika dan alumina terdapat gugus hidroksi yang akan berinteraksi dengan solut. Gugus silanol pada silika mempunyai reaktifitas yang berbeda, karenanya solut da pat terikat secara kuat sehingga dapat menyebabkan puncak yang berekor3). 2. Kromatografi fase terikat Kebanyakan fase diam kromatografi ini adalah silika yang dimodifikasi secara kim iawi atau fase terikat. Sejauh ini yang digunakan untuk memodifikasi silika adal ah hidrokarbon-hidrokarbon non-polar seperti dengan oktadesilsilana, oktasilana, atau dengan fenil. Fase diam yang paling populer digunakan adalah oktadesilsila n (ODS atau C18) dan kebanyakan pemisahannyaadalahfaseterbalik.Sebagai fase gerak adalah campuran metanol atau asetonitril dengan air atau deng an larutan bufer. Untuk solut yang bersifat asam lemah atau basa lemah, peranan pH sangat krusial karena kalau pH fase gerak tidak diatur maka solut akan mengal ami ionisasi atau protonasi. Terbentuknya spesies yang terionisasi ini menyebabk an ikatannya dengan fase diam menjadi lebih lemah dibanding jika solut dalam ben tuk spesies yang tidak terionisasi karenanya spesies yang mengalami ionisasi aka n terelusi lebih cepat 3. Kromatografi penukar ion KCKT penukar ion menggunakan fase diam yang dapat menukar kation atau anion deng an suatu fase gerak. Ada banyak penukar ion yang beredar di pasaran, meskipun de mikian yang palingluaspenggunaannyaadalahpolistirenresin. Kebanyakan pemisahan kromatografi ion dilakukan dengan menggunakan media air kar ena sifat ionisasinya. Dalam beberapa hal digunakan pelarut campuran misalnya ai r-alkohol dan juga pelarut organik. Kromatografi penukar ion dengan fase gerak a ir, retensi puncak dipengaruhi oleh kadar garam total atau kekuatan ionik serta oleh pH fase gerak. Kenaikan kadar garam dalam fase gerak menurunkan retensi sol ut. Hal ini disebabkan oleh penurunan kemampuan ion sampel bersaing dengan ion f ase gerak untuk gugus penukar ion pada resin. 4.Kromatografi Pasangan ion Kromatografi pasangan ion juga dapat digunakan untuk pemisahan sampel-sampel ion ik dan mengatasi masalah-masalah yang melekat pada metode penukaran ion. Sampel ionik ditutup dengan ion yang mempunyai muatan yang berlawanan. 5. Kromatografi Eksklusi Ukuran Kromatografi ini disebut juga dengan kromatografi permiasi gel dan dapat digunak an untuk memisahkan atau menganalisis senyawa dengan berat molekul > 2000 dalton . Fase diam yang digunakan dapat berupa silika atau polimer yang bersifat porus se hingga solut dapat melewati porus (lewat diantara partikel), atau berdifusi lewa t fase diam. Molekul solut yang mempunyai BM yang jauh lebih besar, akan terelus i terlebih dahulu, kemudian molekul-molekul yang ukuran medium, dan terakhir ada lah molekul yang jauh lebih kecil. Hal ini disebabkan solut dengan BM yang besar tidak melewati porus, akan tetapi lewat diantara partikel fase diam. Dengan dem ikian, dalam pemisahan dengan eksklusi ukuran ini tidak terjadi interaksi kimia antara solut dan fase diam seperti tipe kromatografi yang lain. 6. Kromatografi Afinitas Dalam kasus ini, pemisahan terjadi karena interaksi-interaksi biokimiawi yang sa ngat spesifik. Fase diam mengandung gugus-gugus molekul yang hanya dapat menyera p sampel jika ada kondisi-kondisi yang terkait dengan muatan dan sterik tertentu pada sampel yang sesuai (sebagaimana dalam interaksiantara antigen dan antibodi ). Kromatografi jenis ini dapat digunakan untuk mengisolasi protein (enzim) dari campuran yang sangat kompleks). 2. SISTEM PERALATAN HPLC Instrumentasi HPLC pada dasarnya terdiri atas: wadah fase gerak, pompa, alat unt uk memasukkan sampel (tempat injeksi), kolom, detektor, wadah penampung buangan fase gerak, dan suatu komputer atau integrator atau perekam. Diagram skematik si stem kromatografi cair seperti ini : 1. Wadah Fase gerak dan Fase gerak Wadah fase gerak harus bersih dan lembam (inert). Wadah pelarut kosong ataupun l abu laboratorium dapat digunakan sebagai wadah fase gerak. Wadah ini biasanya da pat menampung fase gerak antara 1 sampai 2 liter pelarut(1). Fase gerak atau eluen biasanya terdiri atas campuran pelarut yang dapat bercampu r yang secara keseluruhan berperan dalam daya elusi dan resolusi. Daya elusi dan resolusi ini ditentukan oleh polaritas keseluruhan pelarut, polaritas fase diam , dan sifat komponen-komponen sampel. Untuk fase normal (fase diam lebih polar d aripada fase gerak), kemampuan elusi meningkat dengan meningkatnya polaritas pel arut. Sementara untuk fase terbalik (fase diam kurang polar daripada fase gerak) , kemampuan elusi menurun dengan meningkatnyapolaritaspelarut.Fase gerak sebelum digunakan harus disaring terlebih dahulu untuk menghindari pa rtikel-partikel kecil ini. Selain itu, adanya gas dalam fase gerak juga harus di hilangkan, sebab adanya gas akan berkumpul dengan komponen lain terutama di pomp a dan detektor sehingga akan mengacaukan analisis. Elusi dapat dilakukan dengan cara isokratik (komposisi fase gerak tetap selama e lusi) atau dengan cara bergradien (komposisi fase gerak berubah-ubah selama elus i) yang analog dengan pemrograman suhu pada kromatografi gas. Elusi bergradien d igunakan untuk meningkatkan resolusi campuran yang kompleks terutama jika sampel mempunyai kisaran polaritasyangluas4). Fase gerak yang paling sering digunakan untuk pemisahan dengan fase terbalik ada lah campuran larutan bufer dengan metanol atau campuran air dengan asetonitril. Untuk pemisahan dengan fase normal, fase gerak yang paling sering digunakan adal ah campuran pelarut-pelarut hidrokarbon dengan pelarut yang terklorisasi atau me nggunakan pelarut-pelarut jenis alkohol. Pemisahan dengan fase normal ini kurang umum dibanding dengan fase terbalik. 2. Pompa Pompa yang cocok digunakan untuk HPLC adalah pompa yang mempunyai syarat sebagai mana syarat wadah pelarut yakni: pompa harus inert terhadap fase gerak. Bahan ya ng umum dipakai untuk pompa adalah gelas, baja tahan karat, Teflon, dan batu nil am. Pompa yang digunakan sebaiknya mampu memberikan tekanan sampai 5000 psi dan mampu mengalirkan fase gerak dengan kecepatan alir 3 mL/menit. Untuk tujuan prep aratif, pompa yang digunakan harus mampu mengalirkan fase gerak dengan kecepatan 20 mL/menit 3. Tempat penyuntikan sampel Sampel-sampel cair dan larutan disuntikkan secara langsung ke dalam fase gerak y ang mengalir di bawah tekanan menuju kolom menggunakan alat penyuntik yang terbu at dari tembaga tahan karat dan katup teflon yang dilengkapi dengan keluk sampel (sample loop) internal atau eksternal. Posisi pada saat memuat sampel Posisi pada saat menyuntik sampel 4. Kolom dan Fase diam Ada 2 jenis kolom pada HPLC yaitu kolom konvensional dan kolom mikrobor. Kolom m erupakan bagian HPLC yang mana terdapat fase diam untuk berlangsungnya proses pe misahan solut/analit. Kolom mikrobor mempunyai 3 keuntungan yang utama dibanding dengan kolom konvensional, yakni: Konsumsi fase gerak kolom mikrobor hanya 80% atau lebih kecil dibanding dengan k olom konvensional karena pada kolom mikrobor kecepatan alir fase gerak lebih lam bat (10 -100 l/menit). Adanya aliran fase gerak yang lebih lambat membuat kolom mikrobor lebih ideal ji ka digabung dengan spektrometer massa. Sensitivitas kolom mikrobor ditingkatkan karena solut lebih pekat, karenanya jen is kolom ini sangat bermanfaat jika jumlah sampel terbatas misal sampel klinis. Meskipun demikian, dalam prakteknya, kolom mikrobor ini tidak setahan kolom konv ensional dan kurang bermanfaat untuk analisis rutin. Kebanyakan fase diam pada H PLC berupa silika yang dimodifikasi secara kimiawi, silika yang tidak dimodifika si, atau polimer-polimer stiren dan divinil benzen. Permukaan silika adalah pola r dan sedikit asam karena adanya residu gugus silanol (Si-OH). Silika dapat dimo difikasi secara kimiawi dengan menggunakan reagen-reagen seperti klorosilan. Rea gen-reagen ini akan bereaksi dengan gugus silanol dan menggantinya dengan gugusgugus fungsional yang lain. Oktadesil silika (ODS atau C18) merupakan fase diam yang paling banyak digunakan karena mampu memisahkan senyawa-senyawa dengan kepolaran yang rendah, sedang, m aupun tinggi. Oktil atau rantai alkil yang lebih pendek lagi lebih sesuai untuk solut yang polar. Silika-silika aminopropil dan sianopropil (nitril) lebih cocok sebagai pengganti silika yang tidak dimodifikasi. Silika yang tidak dimodifikas i akan memberikan waktu retensi yang bervariasi disebabkan karena adanya kandung an air yang digunakan.5.Detektor HPLC Detektor pada HPLC dikelompokkan menjadi 2 golongan yaitu: oluter universal (yan g mampu mendeteksi zat secara umum, tidak bersifat spesifik, dan tidak bersifat selektif) seperti oluter indeks bias dan oluter spektrometri massa; dan golongan oluter yang spesifik yang hanya akan mendeteksi analit secara spesifik dan sele ktif, seperti oluter UV-Vis, oluter fluoresensi, dan elektrokimia. Idealnya, suatu oluter harus mempunyai karakteristik sebagai berikut: (1) mempun yai respon terhadap olute yang cepat dan reprodusibel; (2) mempunyai sensitifita s yang tinggi, yakni mampu mendeteksi olute pada kadar yang sangat kecil; (3) st abil dalam pengopersiannya; (4) mempunyai sel volume yang kecil sehingga mampu m eminimalkan pelebaran pita; (5) signal yang dihasilkan berbanding lurus dengan k onsentrasi olute pada kisaran yang luas (kisaran dinamis linier); dan (6) tidak peka terhadap perubahan suhu dan kecepatan alir fase gerak2). 2. ELUSI GRADIEN Elusi Gradien didefinisikan sebagai penambahan kekuatan fasa gerak selama analis is kromatografi berlangsung. Efek dari Elusi Gradien adalah mempersingkat waktu retensi dari senyawa-senyawa yang tertahan kuat pada kolom. Dasar-dasar elusi gr adien dijelaskan oleh Snyder. Elusi Gradien menawarkan beberapa keuntungan : a. Total waktu analisis dapat direduksi b. Resolusi persatuan waktu setiap senyawa dalam campuran bertambah c. Ketajaman Peak bertambah (menghilangkan tailing) d. Efek sensitivitas bertambah karena sedikit variasi pada peak Gradien dapat dihentikan sejenak atau dilanjutkan. Optimasi Gradien dapat dipili h dengan cara trial and error. 1. DATA HANDLING Hasil dari pemisahan kromatografi biasanya ditampilkan dalam bentuk kromatogram pada rekorder. waktu retensi dan volume retensi dapat diketahui /dihitung. Lni bisa digunakan untuk mengidentifikasi secara kualitatif suatu komponen, bila kon disi kerja dapat dikontrol. Lebar puncak dan tinggi puncak sebanding atau propor sional dengan konsentrasi dan dapat digunakan untuk memperoleh hasil secara kuan titatif. 2. FASA GERAK Di dalam kromatografi cair komposisi dari solven atau rasa gerak adalah salah sa tu dari variabel yang mempengaruhi pemisahan. Terdapat variasi yang sangat luas pada solven yang digunakan untuk KCKT, tetapi ada beberapa sifat umum yang sanga t disukai, yaitu rasa gerak harus : 1. Murni, tidak terdapat kontaminan 2. Tdak bereaksi dengan wadah (packing) 3. Sesuai dengan defektor 4. Melarutkan sampel 5. Memiliki visikositas rendah 6. Bila diperlukan, memudahkan "sample recovery" 7. Diperdagangan dapat diperoleh dengan harga murah (reasonable price) Umumnya, semua solven yang sudah digunakan langsung dibuang karena prosedur pemu miannya kembali sangat membosankan dan mahal biayanya. Dari semua persyaratan di atas, persyaratan 1) s/d 4) merupakan yang sangat penting. Menghilangkan gas (gelembung udara) dari solven, terutama untuk KCKT yang menggu nakan pompa bolak balik (reciprocating pump) sangat diperlukan terutama bila det ektor tidak tahan kinerja sampai 100 psi. Udara yang terlarut yang tidak dikelua rkan akan menyebabkan gangguan yang besar di dalam detektor sehingga data yang d iperoleh tidak dapat digunakan (the data may be useless). Menghilangkan gas (deg assing) juga sangat baik bila menggunakan kolom yang sangat sensitifterhadap uda ra (contoh : kolom berikatan dengan NH2). (Rucker, G 1988) Perangkat Alat HPLC Di Laboratorium Instrumen SMAK (Sekolah Menengah Analis Kim ia) MakassarBAB III METODE ANALISA Alat dan Bahan ALAT : 1. Gelas Piala 50 ml 2. Labu ukur 100 ml dan 50 ml. 3. Corong 4. Pengaduk 5. Mikroburet 6. Kertas Saring 7. Neraca Digital 8. HPLC 9. Pompa vakum BAHAN : 1. Kafein 2. Aquabidestilata steril CARA KERJA A. Preparasi Sampel - Ditimbang 0,0212 gram kafein Tabel pengamatan : Bobot sampel (kafein) = 0,0212 gram Perhitungan : Bobot kafein yang ditimbang untuk larutan induk 200 ppm ppm = 200ppm = = 20 mg = 0,02 g Konsentrasi larutan stok sebenarnya ppm = = = 212 ppm Pengenceran untuk 5 ppm V1C1 = V2C2 V1 . 212 ppm = 50 ml . 5ppm V1 Konsentrasi larutan standar kafein sebenarnya V1C1 = V2C2 1,20 ml. 212 ppm = 50 ml . C2 5,088 ppm = C2 BAB V KESIMPULAN DAN SARAN Kesimpulan Dari hasil analisa kafein 5 ppm dengan alat HPLC dapat disimpulkan bahwa : Retention time : 1,000 menit Area : 45003 Area% : 24,33 % Height : 8248 Height % : 72,45 % Saran Bagi peserta praktikum, untuk mendapatkn data yang akurat dan hasil analisis yan g memuaskan,ada beberapa hal yang perlu diperhatikan : Penguasaan teori dasar Prosedur kerja Penguasaan alat yang tepat