UJI TETRAZOLIUM DAN UJI DAYA HANTAR LISTRIK, SALAH SATU

METODE UJI CEPAT PENDUGA MUTU BENIH

Oleh: Bambang Priyo Utomo, S.P.

PBT Ahli Pertama Balai Besar Perbenihan Dan Proteksi Tanaman Perkebunan

(BBP2TP) Surabaya

Vigor benih merupakan fokus bagi insan perbenihan. Benih yang vigor adalah produk

teknologi, yang telah melalui upaya pemuliaan genetik dan pemurnian fisik sehingga

diperoleh sebuah lot benih berisi individu-individu benih yang prima, memiliki tingkat

kemurnian genetik yang tinggi, bersih penampilan fisik, sehat pertumbuhan dan

homogen. Vigor benih jelas mengait berbagai fungsi insan benih yang bergerak di sektor

hulu maupun hilir.

Hasil peneltian menunjukkan bahwa keadaan benih pasca tanam di lapang dapat

disimulasikan dalam bentuk model-model tertentu, sehingga dapat diketahui mutu benih

dengan melakukan simulasi yang mendekati keadaan sebenarnya. Dari simulasi atau uji

tersebut dapat pula diketahui tingkat vigor benih.

Metode pendugaan mutu, khususnya mutu fisiologis dilakukan melalui metode

langsung dan tidak langsung. Metode langsung menggunakan indikator pertumbuhan

kecambah; benih dikecambahkan pada kondisi ideal untuk berkecambah dan tumbuh,

dilakukan di germinator, rumah kaca atau areal persemaian selama jangka waktu

tertentu. Metode tidak langsung didasarkan pada proses metabolisme benih serta

kondisi fisik benih disebut pula uji cepat viabilitas. Secara umum uji cepat memiliki dua

tujuan (Willan, 1985), yaitu: (a) menentukan secara cepat kualitas benih suatu jenis

yang berkecambah lambat atau menunjukkan dormansi di bawah perkecambahan

normal (b) menentukan viabilitas potensial dari suatu kelompok benih. Sebagai langkah

awal untuk menduga dengan cepat viablitas benih, yang sebelumnya dapat diketahui

dengan melakukan pengecambahan maka dilakukan uji cepat dengan berbagai metode.

Diantaranya yaitu Uji Tetrazolium dan Uji Daya Hantar Listrik

1. Uji Tetrazolium

Uji tetrazolium adalah uji yang dalam pelaksanaannya menggunakan zat indikator

berupa 2.3.5 Trifenil tetrazolium. Uji tetrazolium disebut juga uji biokhemis benih. Karena

dengan uji ini akan diketahui terjadinya proses biokimiawi yang berlangsung dalam sel,

khususnya dalam embrio benih. Uji tetrazolium juga disebut uji cepat, karena indikator

pada uji ini adalah pola-pola pewarnaan pada embrio, bukan proses perkecambahan

yang umumnya memerlukan waktu yang lebih lama dalam menentukan final count.

Klorida/bromida yang larut dalam air digunakan untuk mengindikasikan adanya sel-sel

yang hidup. Bila indikator diimbibisi oleh benih kedalam sel-sel benih yang hidup

dengan bantuan enzim dehidrogenase akan terjadi proses reduksi sehingga terbentuk

zat trifenil formazan, endapan yang berwarna merah. Pada sel-sel yang mati tidak

terjadi reduksi, sehingga warnanya tetap. Adanya pola-pola warna merah pada bagian-

bagian penting pada embrio benih mengindikasikan benih mampu menumbuhkan

embrio menjadi kecambah yang normal.

Kegunaan uji tetrazolium cukup banyak yakni: untuk mengetahui viabilitas benih yang

segera akan ditanam, untuk mengetahui viabilitas benih dorman dan untuk mengetahui

hidup atau matinya benih segar tidak tumbuh dalam pengujian daya berkecambah

benih. Uji tetrazolium sebagai uji vigor bisa dilakukan, dengan cara membuat penilaian

benih lebih ketat untuk katagori benih vigor diantara benih viabel.

Faktor-faktor yang perlu diperhatikan dalam uji tetrazolium ialah : penyiapan benih yang

akan diuji dengan menghitung jumlahnya, pelembaban benih untuk aktivasi enzim dan

pelunakan jeringan benih, pembukaan jaringan benih untuk pewarnaan ( penusukan,

pemotongan, pengupasan testa, pengeluaran embrio), penyiapan larutan tetrazolium,

suhu dan lama perendaman, penilaian benih vigor tinggi, vigor rendah dan benih non

viabel, ketelitian analis.

Prinsip metode TZ adalah bahwa setiap sel hidup akan berwarna merah oleh reduksi

dari suatu pewarnaan garam tetrazolium dan membentuk endapan formazan merah,

sedangkan sel-sel mati akan berwarna putih. Enzim yang mendorong terjadinya proses

ini adalah dehidrogenase yang berkaitan dengan respirasi (Byrd, 1988). Kelebihan

metode TZ meliputi waktu pengujian yang singkat, sangat tepat diaplikasikan pada

benih yang mengalami dormansi serta benih yang mengalami pemasakan lanjutan (after

ripening), tingkat ketelitian tinggi, sedangkan kelemahannya memerlukan keahlian dan

pelatihan yang intensif, bersifat laboratoris, tidak dapat mendeteksi kerusakan akibat

fungi atau mikroba lainnya dan bersifat merusak.

Metode Uji Tetrazolium

(Sumber:Panduan Praktikum Ilmu dan Teknologi Benih IPB, 2011)

Benih dilembabkan selama 1 malam.

Belah bagian embrio untuk mempercepat masuknya larutan tetrazolium ke dalam

benih. Rendam benih tersebut dengan larutan Tetrazolium secukupnya sampai

benih terendam seluruhnya. Untuk mempercepat proses pewarnaan bisa

dipakai suhu 40oC selama 1 jam

Evaluasi/Pengamatan

Tabel 1. Pola Pewarnaan Embrio Benih

Benih Bisa Tumbuh Benih Tidak Bisa Tumbuh

Seluruh embrio berwarna merah

cemerlang

Bagian dari ujung skutelum tidak

berwarna

Bagian dari ujung skutelum tidak

berwarna dan bagian dari radikula yang

tidak kritis juga tidak berwarna

Bagian seminal dari akar tidak ada

pewarnaan

Plumula tidak ada pewarnaan

Bagian tengah dari skutelum dan bagian

dari tempat pertumbuhan akar seminal

tidak terjadi pewarnaan.

Plumula dan radikula tidak berwarna

Bagian bawah plumula, radikula dan

skutelum tidak berwarna

Pewarnaan embrio merah muda yang

sangat redup

2. Uji Daya Hantar Listrik

Pengukuran konduktivitas (daya hantar) listrik didasari pemikiran bahwa benih yang

bermutu rendah akan membocorkan bahan-bahan yang dikandungnya lebih banyak

daripada benih yang bermutu lebih baik. Kebocoran pada membran sel juga merupakan

tempat kerusakan yang utama dari peristiwa deteriorasi benih. Bahan-bahan yang

dikeluarkan benih pada peristiwa tersebut antara lain K, Cl, gula, dan asam amino.

Nilai daya hantar yang tinggi menunjukkan kebocoran metabolit benih yang tinggi, yang

berarti benih tersebut memiliki kualitas yang telah menurun. Benih dengan vigor rendah

Gambar 1. Uji Benih dengan tetrazolium

telah diketahui mengalami penurunan integritas membran sebagai hasil dari deteriorasi

masa penyimpanan dan kerusakan mekanik. Selama imbibisi, benih yang memiliki

struktur membran lemah melepaskan koloidal sitoplasmik ke medium imbibisi. Koloidal

dengan sifat elektrolitik membawa sebuah muatan elektrik yang dapat dideteksi dengan

conduktivity meter.

Keuntungan menggunakan uji DHL ini disebabkan karena cepat, tepat, tidak mahal, dan

prosedurnya sederhana. Namun, kadar air awal dan ukuran benih dapat mempengaruhi

rata-rata kebocoran benih. Apalagi, perlakuan benih dengan antibiotik mungkin

mempengaruhi pengukuran konduktivitas, mengharuskan antibiotik tersebut dihilangkan

sebelum penentuan konduktivitas.

Salah satu kelemahan dari metode DHL adalah hasil akhir yang ditunjukkan adalah rata-

rata dari semua benih yang diuji. Padahal secara anatomis benih dalam satu lot akan

memiliki perbedaan dari tiap individunya. Disamping struktur kulit benih yang berbeda,

terjadi pula perbedaan kemunduran plasmalema akibat dari tingkat deteriorasi yang

berbeda antar individu benih.

Metode Uji DHL (Sumber: Panduan Praktikum Ilmu Dan Teknologi Benih IPB, 2011)

Tiga lot benih 50 butir, setiap ulangan ditimbang.

Kemudian dimasukkan kedalam glassjar dan ditambahkan 250 ml air bebas ion.

Buat 3 ulangan juga untuk glassjar yang hanya berisi air untuk blanko.

Tutup glassjar untuk mencegah kontaminasi dan letakkan pada suhu konstan

20±2 0C selama 24 jam.

Siapkan konduktometer yang telah dibersihkan dan dilakukan pemanasan secara

manual. Air bebas ion sebanyak 400-600 ml disiapkan dalam glassjar untuk

membilas dip cell pada setiap pengukuran. Kalibrasi alat selalu dilakukan

menggunakan larutan KCl 0.01 M (pembacaan larutan ini harus menunjukkan

nilai antara 1273-1278 μS.cm –1).

Setelah 24 jam, glassjar berisi benih diguncang selama 10-15 detik untuk

memastikan pencampuran yang merata dengan larutan rendaman.

Air rendaman benih selanjutnya dipindahkan kedalam glassjar lain yang bersih

dengan menuangkan benih dan air menggunakan saringan.

Masukkan dip cell ke dalam air rendaman serta ukur/baca nilai konduktivitasnya.

Setiap kali pengukuran dip cell harus selalu dibilas dan dikeringkan.

Penghitungan konduktivitas per gram benih untuk masing-masing ulangan

menggunakan rumus sebagai berikut :

Konduktivitas (μS.cm –1g-1) = Konduktivitas sampel-blanko (μS.cm -1)

Berat benih per ulangan (g)

Penutup

Uji Tetrazolium dan Uji Daya Hantar Llistrik merupakan uji cepat untuk menduga mutu

benih. Uji tetrazolium menggunakan teknik pewarnaan untuk mendeteksi sel yang hidup

maupun yang mati, sehingga dengan cepat akan diketahui tingkat vigor benih yang diuji.

Benih yang vigor dicirikan struktur tumbuh benih yang meliputi plumula, radikula,

kotiledon dan embrio berwarna merah cemerlang atau merah. Sedangkan benih yang

tidak vigor tidak mengalami pewarnaan pada struktur tumbuhnya. Uji daya hantar listrik

(DHL) akan menunjukkan benih yang bervigor tinggi mempunyai integritas membran

yang baik, sehingga akan menunjukkan nilai kebocoran membran (nilai DHL) yang

rendah. Sebaliknya benih yang bervigor rendah akan menunjukkan nilai DHL yang

tinggi. Sejak tahun 1996 ISTA telah menetapkan uji DHL sebagai uji vigor yang

divalidasi untuk benih Pisum sativum, dan selanjutnya ISTA (2010) telah melakukan

validasi untuk digunakan pada benih Phaseolus vulgaris. Melihat perkembangan

penggunaan metode uji cepat ini maka teknik uji cepat ini sangat berpeluang untuk

menjadi metode pengujian yang valid di laboratorium penguji benih tanaman, termasuk

benih tanaman perkebunan.

Gambar 1. Konduktometer