UJI PENANGKAPAN RADIKAL HIDROKSIL OLEH FRAKSI AIR DARI EKSTRAK TEH HITAM DAN VITAMIN C SECARA

IN VITRO DENGAN METODE DEOKSIRIBOSA

Agnes Nora Iska Harnita Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta

Intisari

Mengingat besarnya kerusakan yang ditimbulkan oleh radikal bebas pada hampir semua molekul biologis seperti DNA, protein, dan membran lipid, maka saat ini banyak dikembangkan senyawa antioksidan. Namun, suatu senyawa dapat menjadi antioksidan pada suatu target, tetapi mungkin dapat menjadi prooksidan pada target yang lain. Penelitian ini bertujuan untuk membandingkan aktivitas antioksidan dari bahan alam (fraksi air dari ekstrak teh hitam) dan senyawa sintetis (vitamin C) secara in vitro dengan metode deoksiribosa. Penelitian ini merupakan jenis penelitian eksperimental karena subyek uji diberi perlakuan. Secara in vitro, pengujian penangkapan radikal hidroksil dapat dilakukan dengan metode deoksiribosa. Metode ini menggunakan reagen Fenton untuk menghasilkan radikal hidroksil, gula deoksiribosa sebagai substrat, asam trikloroasetat (TCA) dan asam tiobarbiturat (TBA) untuk membentuk suatu kromogen berwarna merah muda yang dapat diukur absorbansinya pada panjang gelombang 532 nm. Hasil penelitian menunjukkan bahwa aktivitas antioksidan secara in vitro menggunakan metode deoksiribosa yang dinyatakan dalam effective scavenging 30 (ES30) menunjukkan fraksi air dari ekstrak teh hitam lebih kecil dibandingkan vitamin C. Kata kunci: radikal hidroksil, metode deoksiribosa, fraksi air dari ekstrak teh hitam, dan

vitamin C.

Bab I. Pendahuluan

Radikal bebas adalah spesies kimia yang memiliki satu atau lebih elektron yang

tidak berpasangan pada orbital terluarnya, sehingga dapat menyerang senyawa-senyawa

lain seperti DNA, membran lipid, dan protein. Radikal ini akan merebut elektron dari

molekul lain yang ada disekitarnya untuk menstabilkan diri, sehingga spesies kimia ini

sering dihubungkan dengan terjadinya kerusakan sel, kerusakan jaringan, dan proses

penuaan (Halliwell and Gutteridge, 1999).

Beberapa jenis radikal bebas yang termasuk dalam ROS (Reactive Oxygen

Species ) adalah radikal superoksid (O2•-), radikal hidroksil (•OH), radikal peroksil

(ROO•), radikal peroksinitrit (O=NOO•-), dan radikal oksida nitrit (NO•). Diantara jenis-

152

jenis radikal tersebut, radikal hidroksil merupakan jenis radikal yang paling reaktif

(Anonim, 2005).

Mengingat besarnya kerusakan yang ditimbulkan oleh radikal bebas, saat ini

banyak dikembangkan senyawa-senyawa antioksidan. Suatu senyawa antioksidan

mungkin bisa melindungi suatu target dari kerusakan oksidatif, tetapi tidak dapat

melindungi target yang lain, bahkan dapat memperburuk kondisi. Sebagai contoh,

senyawa antioksidan sintetis seperti BHA (Butylated Hidroxy Anisole) yang merupakan

suatu inhibitor lipid peroksidasi yang poten, tetapi pada dosis konsumsi yang berlebihan

dapat memacu terjadinya kanker. Hal ini diduga adanya kerusakan oksidatif pada DNA

sehingga memicu terjadinya mutasi. Beberapa literatur juga menyebutkan bahwa vitamin

C dan vitamin E selain sebagai senyawa antioksidan tetapi juga bersifat prooksidan. Hal

ini yang mendorong pengembangan senyawa antioksidan yang berasal dari bahan-bahan

alami seperti teh hitam.

Aktivitas antioksidan dari teh berasal dari senyawa-senyawa polifenol seperti

katekin dan flavonoid – flavonoid lainnya. Teh hitam merupakan salah satu minuman

yang banyak dikonsumsi oleh masyarakat. Jenis teh ini dibuat melalui fermentasi dengan

mengoksidasi katekin dalam daun segar dengan katalis polifenol oksidase, sehingga

memberi ciri khas teh hitam yaitu berwarna, kuat, dan berasa tajam.

Metode in vitro yang dipilih untuk menentukan aktivitas antioksidan dari fraksi

air teh hitam adalah metode deoksiribosa. Metode ini menggunakan reagen Fenton

sebagai penghasil radikal hidroksil dan gula deoksiribosa sebagai model makromolekul

yang didegradasi. Produk degradasi deoksiribosa oleh radikal hidroksil dapat dilihat

dengan spektrofotometer visibel karena produk senyawa yang dihasilkan dari reaksi

degradasi deoksiribosa dapat bereaksi dengan asam tiobarbiturat dalam suasana asam

dengan bantuan pemanasan dan menghasilkan suatu produk berwarna merah muda yang

dapat diukur absorbansinya pada panjang gelombang maksimum 532 nm (Halliwell et

al., 1987).

Suatu senyawa dikatakan memiliki aktivitas sebagai antioksidan apabila senyawa

tersebut dapat memperlambat atau menghambat proses oksidasi senyawa lain (McBridge

and Kraemer, 1999). Pengujian aktivitas antioksidan fraksi air dari ekstrak teh hitam

dimaksudkan untuk mengetahui seberapa besar konsentrasi yang dibutuhkan untuk

153

menangkap suatu radikal bebas sehingga efek negatif dari radikal bebas tersebut dapat

dikurangi.

Berdasarkan latar belakang di atas, maka penelitian dilakukan untuk mengetahui

kekuatan aktivitas antioksidan fraksi air dari ekstrak teh hitam dibandingkan dengan

vitamin C. Senyawa yang digunakan sebagai pembanding (kontrol positif) dalam uji

aktivi tas penangkapan radikal hidroksil dalam penelitian ini adalah vitamin C. Menurut

Halliwell dan Gutteridge (1999), secara in vitro vitamin C dapat berkhasiat sebagai

antioksidan dengan menangkap radikal hidroksil dengan konstanta kecepatan reaksi lebih

besar dari 109 M –1 s –1.

Besarnya kemampuan penangkapan radikal hidroksil dinyatakan sebagai persen

scavenging. Semakin besar nilai persen scavenging suatu senyawa/fraksi menunjukkan

besarnya kemampuan senyawa tersebut dalam menangkap suatu radikal bebas. Pada

penelitian ini aktivitas antioksidan fraksi air teh hitam dinyatakan dalam effective

scavenging 30 (ES30). Nilai tersebut menyatakan besarnya konsentrasi fraksi yang

dibutuhkan untuk menangkap radikal hidroksil sebanyak 30 %.

Bab II. Metode Penelitian

A. Preparasi Sampel

Sampel berupa teh hitam merk X diambil sebanyak 80 bungkus dari 100 bungkus.

Sebanyak 20 bungkus sampel dari jenis teh hitam dihomogenkan, digiling, dihaluskan

dengan blender. Serbuk diayak dengan derajad halus serbuk 4/18.

Penyarian dilakukan dengan cara perkolasi : timbang 300 g teh hitam, masukkan ke

dalam perkolator, tambahkan etanol 70 % sebanyak 1 liter dan diamkan selama 3 jam dan

dituangi dengan cairan penyari sampai cairan penyari yang keluar sudah jernih. Perkolat

kemudian dievaporasi hingga mendapatkan ekstrak kental. Selanjutnya , ekstrak kental

yang diperoleh diuapkan di atas waterbath sambil diangin-anginkan dengan kipas angin

sampai diperoleh ekstrak kering (Anonim, 1986)

Fraksinasi dilakukan dengan cara ekstraksi : timbang 75 g ekstrak kering dan

dilarutkan dengan aquades 150 ml di atas penangas air sambil diaduk. Larutan tersebut

diekstraksi dengan 100 ml kloroform, gojog selama 10 menit dan didiamkan selama 15

menit. Pisahkan fraksi air dari fraksi kloroform. Diulang sebanyak 3 kali . Fraksi air

154

diambil dan diekstraksi dengan 50 ml etil asetat, gojog selama 10 menit, diamkan selama

15 menit. Fraksinasi diulang dan selanjutnya fraksi air yang diperoleh dipekatkan dengan

rotaevaporator suhu 50ºC sampai kental. Penguapan dilanjutkan di atas waterbath sambil

diangin-anginkan dengan kipas angin hingga kering. Ekstrak kering kemudian disimpan

dalam eksikator.

Timbang seksama sebanyak 0,01 g serbuk fraksi air teh hitam, masukkan ke

dalam beker gelas 100 ml dan tambahkan aquades secukupnya. Pindahkan ke labu ukur

10 ml dan tambahkan aquades hingga tanda.

B. Optimasi Metode Deoksiribosa

1. Penentuan operating time (OT)

Pada tabung reaksi bertutup, masukkan sebanyak 300 μl larutan deoksiribosa 2,5

mM, kemudian tambahkan 300 μl FeCl3 1 mM; 300 μl EDTA 1 mM; 300 μl H2O2 20

mM; 4200 μl bufer fosfat pH 7,4; dan 300 μl vitamin C 1 mM. Inkubasikan pada suhu

37 ºC selama 30 menit, kemudian tambahkan 1 ml TCA 5 % dan 1 ml TBA 1 %. Tabung

reaksi yang berisi campuran tersebut dipanaskan pada water bath suhu 80 ºC selama 30

menit, dinginkan dengan air mengalir selama 5 menit dan dibaca absorbansinya pada

panjang gelombang maksimal teoritis (λmaks teoritis) 532 nm selama 1 jam (Kunchandy

and Rao, 1989).

2. Penentuan panjang gelombang serapan maksimum (λmaks)

Pada tabung reaksi bertutup, masukkan berturut-turut 200, 300, dan 400 μl larutan

deoksiribosa 2,5 mM, kemudian ke dalam masing-masing tabung tambahkan 300 μl

FeCl3 1 mM; 300 μl EDTA 1 mM; 300 μl H2O2 20 mM; bufer fosfat pH 7,4; dan 300 μl

vitamin C 1 mM (penambahan bufer fosfat disesuaikan dengan volume deoksiribosa yang

ditambahkan sehingga volume akhir campuran adalah 6 ml). Inkubasikan pada suhu 37

ºC selama 30 menit, kemudian tambahkan 1 ml TCA 5 % dan 1 ml TBA 1 %. Tabung

reaksi yang berisi campuran tersebut dipanaskan pada water bath suhu 80 ºC selama 30

menit, dinginkan, dan dibaca absorbansinya dari panjang gelombang 400 – 600 nm.

3. Pembuatan kurva hubungan antara konsentrasi deoksiribosa dengan absorbansi

kromogen MDA – TBA

155

Pada tabung reaksi bertutup, masukkan berturut-turut 100, 200, 300, 400, 500,

dan 600 μl larutan deoksiribosa 2,5 mM, kemudian ke dalam masing-masing tabung

tambahkan 300 μl FeCl3 1 mM; 300 μl EDTA 1 mM; 300 μl H2O2 20 mM; bufer fosfat

pH 7,4; dan 300 μl vitamin C 1 mM (penambahan bufer fosfat disesuaikan dengan

volume deoksiribosa yang ditambahkan sehingga volume akhir campuran adalah 6 ml).

Inkubasikan pada suhu 37 ºC selama 30 menit, kemudian tambahkan 1 ml TCA 5 % dan

1 ml TBA 1 %. Tabung reaksi yang berisi campuran tersebut dipanaskan pada water bath

suhu 80 ºC selama 30 menit, dinginkan, dan dibaca absorbansinya pada operating time

dan panjang gelombang maksimum hasil optimasi.

C. Pengujian Aktivitas Antioksidan

1. Larutan kontrol

Pada satu tabung reaksi bertutup, masukkan 600 μl larutan deoksiribosa 2,5 mM,

kemudian ke dalam tabung tersebut, tambahkan 300 μl FeCl3 1 mM; 300 μl EDTA 1

mM; 300 μl H2O2 20 mM; 4200 μl bufer fosfat pH 7,4; dan 300 μl vitamin C 1 mM

sehingga diperoleh volume akhir campuran adalah 6 ml. Inkubasikan pada suhu 37 ºC

selama 30 menit, kemudian tambahkan 1 ml TCA 5 % dan 1 ml TBA 1 %. Tabung reaksi

yang berisi campuran tersebut dipanaskan pada water bath suhu 80 ºC selama 30 menit,

dinginkan, dan dibaca absorbansinya pada operating time dan panjang gelombang

maksimum hasil optimasi.

2. Larutan sampel A(Vitamin C sebagai antioksidan).

Pada empat tabung reaksi bertutup yang masing-masing telah dimasukkan 600 μl

larutan deoksiribosa 2,5 mM, tambahkan 200, 400, 600, dan 800 vitamin C 60 mM.

Kemudian ke dalam masing-masing tabung, tambahkan 300 μl FeCl3 1 mM; 300 μl

EDTA 1 mM; 300 μl H2O2 20 mM; bufer fosfat pH 7,4; dan 300 μl vitamin C 1 mM

(penambahan bufer fosfat disesuaikan dengan volume vitamin C yang ditambahkan

sehingga volume akhir campuran adalah 6 ml). Inkubasikan pada suhu 37 ºC selama 30

menit, kemudian tambahkan 1 ml TCA 5 % dan 1 ml TBA 1 %. Tabung reaksi yang

berisi campuran tersebut dipanaskan pada waterbath suhu 80 ºC selama 30 menit,

dinginkan, dan dibaca absorbansinya pada operating time dan panjang gelombang

maksimum hasil optimasi.

156

3. Larutan sampel B ( Fraksi air dari ekstrak teh hitam sebagai antioksidan)

Pada tabung reaksi bertutup, masukkan sebanyak 600 μl larutan deoksiribosa 2,5

mM dan fraksi air teh hitam 1 mg / ml sebanyak 200 μl, 400 μl, 600 μl, 800 μl dan 1000

μl. Kemudian ke dalam masing-masing tabung tambahkan 300 μl FeCl3 1 mM; 300 μl

EDTA 1 mM; 300 μl H2O2 20 mM; buffer fosfat pH 7,4; dan 300 μl vitamin C 1 mM

(Penambahan buffer fosfat disesuaikan dengan volume larutan fraksi etil asetat teh hitam

yang ditambahkan sehingga volume akhir campuran adalah 6 ml). Inkubasikan pada suhu

37 ºC selama 30 menit. Setelah itu, tambahkan 1 ml TCA 5 % dan 1 ml TBA 1 %.

Tabung reaksi yang berisi larutan sampel tersebut dipanaskan menggunakan waterbath

pada suhu 80ºC selama 30 menit. Kemudian didinginkan dengan air mengalir selama 5

menit dan dibaca absorbansinya pada panjang gelombang maksimum hasil optimasi. Buat

juga larutan kontrol.

Bab III. Hasil dan Pembahasan

A. Preparasi Sampel

Perkolasi dengan cairan penyari etanol 70% dimaksudkan untuk melarutkan

senyawa-senyawa polifenolik yang terkandung di dalam teh. Perkolat yang didapat

dievaporasi untuk menguapkan seluruh cairan penyari menjadi ekstrak kental.

Selanjutnya ekstrak kental dikeringkan dengan cara diuapkan di atas waterbath sambil

diangin-anginkan dengan kipas angin untuk membantu penguapan. Penyimpanan ekstrak

kering di dalam eksikator untuk melindunginya dari uap air udara.

Fraksinasi ekstrak kering teh hitam yang telah dilarutkan dengan aquades

dilakukan secara ekstraksi dengan corong pisah. Ekstraksi dengan kloroform untuk

menghilangkan senyawa-senyawa yang bersifat non-polar seperti lipid, klorofil, dll,

sedangkan senyawa-senyawa polifenolik termasuk flavonoid tetap berada dalam fraksi

air. Senyawa-senyawa polifenolik inilah yang diduga mempunyai aktivitas antioksidan.

B. Optimasi Metode Deoksiribosa

Menurut Halliwell dan Gutteridge (1999), reaksi degradasi gula deoksiribosa akan

menghasilkan suatu produk karbonil dan dikarbonil diantaranya malondialdehid (MDA).

Adanya MDA dapat dideteksi dengan asam tiobarbiturat (TBA) dalam suasana asam

157

membentuk suatu kromogen yang berwarna merah muda. Jumlah kromogen MDA-TBA

yang terbentuk sangat tergantung dari jumlah deoksiribosa yang didegradasi. Semakin

tinggi konsentrasi deoksiribosa yang ditambahkan akan menyebabkan peningkatan

absorbansi kromogen MDA-TBA

HN

SHN O

O

+HH

O O

N

N OHS

OH

HO N SH

N

OH

MDA-TBA(berwarna merah muda)

Asam Tiobarbiturat Malondialdehid

2

Gambar 1. Reaksi pembentukan kromogen MDA-TBA

Pengukuran operating time kromogen MDA-TBA yang dihasilkan dari larutan

kontrol dengan konsentrasi deoksiribosa absorbansi kromogen MDA-TBA telah stabil

sejak menit ke nol sampai menit ke-60 dengan absorbansi 0,511 pada panjang gelombang

teoritis 532 nm.

Panjang gelombang maksimum dari kromogen MDA-TBA ditentukan dengan

melakukan scanning terhadap kromogen MDA-TBA pada rentang panjang gelombang

400-600 nm. Rentang ini dipilih karena kromogen MDA-TBA memiliki panjang

gelombang maksimum teoritis 532 nm. Dari ketiga seri larutan deoksiribosa tersebut

diperoleh panjang gelombang maksimum secara berturut-turut adalah 531,8, 531,8, dan

531,6 nm. Panjang gelombang maksimum kromogen MDA-TBA yang digunakan dalam

penelitian adalah 531,8 nm karena panjang gelombang ini lebih mendekati panjang

gelombang teoritis

C. Pengujian Aktivitas Antioksidan

Dari hasil uji penangkapan radikal hidroksil terlihat bahwa Konsentrasi yang

menunjukkan penangkapan radikal hidroksil sebesar 30% (ES30) fraksi air dari ekstrak

teh hitam lebih kecil dari ES30 vitamin kecil (Tabel I). Harga ES30 berbanding terbalik

dengan aktivitas antioksidan, sehingga dapat disimpulkan bahwa fraksi air dari ekstrak

teh hitam mempunyai aktivitas antioksidan secara in vitro yang lebih besar dibandingkan

vitamin C. Aktivitas antioksidan yang cukup besar ini karena di dalam fraksi air dari

158

ektrak teh hitam diduga mempunyai kandungan senyawa polifenolik yang besar seperti

diantaranya senyawa-senyawa flavonoid

Pada penelitian ini juga terbukti bahwa vitamin C selain bersifat antioksidan

tetapi juga bersifat prooksidan. Sifat antioksidan ditunjukkan terjadinya penurunan

absorbansi dibandingkan dengan kontrol (tanpa penambahan vitamin C ), sedangkan sifat

prooksidan ditunjukkan pada penambahan konsentrasi vitamin C sebesar 1,00539 mM

(0,17708 mg/ml) yaitu terjadi kenaikan absorbansi dari larutan uji dibandingkan dengan

kontrol (tanpa penambahan vitamin C) (Tabel II). Hal inilah yang mendorong penelitian-

penelitian untuk mendapatkan senyawa – senyawa antioksidan dari bahan alam.

Tabel I. Konsentrasi yang menunjukkan penangkapan radikal hidroksil sebesar 30% (ES30) oleh vitamin C dan fraksi air dari ekstrak teh hitam

ES30 (mg/ml) Replikasi Vitamin C Fraksi air dari

ekstrak teh hitam I 0,323 0,0740 II 0,331 0,0461 III 0,334 0,0515 IV 0,344 0,0608 V 0,374 0,0494 Rata – rata 0,341 0,0564 SD 0,0196 0,0113 CV (%) 5,75 19,97

159

Tabel II. Sifat antioksidan dan prooksidan vitamin C

Bab IV. Kesimpulan dan Saran

A. Kesimpulan

Hasil penelitian menunjukkan bahwa aktivitas antioksidan secara in vitro

menggunakan metode deoksiribosa yang dinyatakan dalam effective scavenging 30 (ES30)

menunjukkan fraksi air dari ekstrak teh hitam lebih kecil dibandingkan vitamin C,

sehingga aktivitas antioksidan fraksi air dari ekstrak teh hitam lebih besar dibandingkan

dengan vitamin C.

B. Saran

Berdasarkan hasil dari penelitian yang telah dilakukan, peneliti memberikan saran

untuk dilakukan penelitian lebih lanjut tentang senyawa-senyawa antioksidan yang lain

yang berasal dari alam.

Daftar Pustaka

Anonim, 1986, Sediaan Galenik,1-28, Depkes RI, Jakarta. Anonim, 2005, Reactive Oxygen Species (ROS), http://users.rcn.com/jkimball.ma.

ultranet/BiologyPages/R/ROS.html. Diakses pada 20 Agustus 2005. Halliwel, B. and Gutteridge, J.M.C., 1999, Free Radicals in Biology and Medicine, Third

Edition, 23, 36-49, 53-60, 106-206, 264-271, 366, Oxford University Press, New York.

Halliwel, B., Gutteridge, J.M.C., and Aruoma, O.I., 1987, The Deoxyribose Method: A Simple “Test-Tube” Assay for Determination of Rate Constants for Reaction of Hydroxyl Radicals, Anal. Biochem., 165, 215-219, Academic Press, London.

Kunchandy, E. and Rao, M.N.A., 1990, Oxygen Radical Scavenging Activity of Curcumin, Int. J. of Pharm, 58, 237-240.

Kunchandy, E. and Rao, M.N.A., 1989, Effect of Curcumin on Hidroxyl Radical Generation Through Fenton Reaction, Int. J. of Pharm, 57, 173-176.

Replikasi Konsentrasi vitamin C (mg/ml) I II

0 0,953 0,954 0,177 1,320 1,319 0,354 0,642 0,662 0,531 0,424 0,436 0,708 0,353 0,347 0,885 0,275 0,268 1,063 0,230 0,222 1,396 0,195 0,197 1,417 0,172 0,166 1,594 0,149 0,160

160

McBride, J.M., and Kraemer, W.J., 1999, Free Radicals, Exercise, and Antioxidant, J. Strength Cond. Research, 13(2), 175-183.

161