UJI AKTIVITAS FRAKSI n-HEKSANA-ETIL ASETAT DAUN ASOKA · vii PRAKATA Puji dan syukur penulis...

UJI AKTIVITAS FRAKSI n-HEKSANA-ETIL ASETAT DAUN ASOKA

(Ixora coccinea L.) TERHADAP PENGHAMBATAN MATRIX

METALLOPROTEINASE-9 (MMP-9)

SKRIPSI

Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat

Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.)

Program Studi Farmasi

Diajukan oleh :

Maria Angelina Djohan

NIM : 168114107

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS SANATA DHARMA

YOGYAKARTA

2020

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

i

UJI AKTIVITAS FRAKSI n-HEKSANA-ETIL ASETAT DAUN ASOKA

(Ixora coccinea L.) TERHADAP PENGHAMBATAN MATRIX

METALLOPROTEINASE-9 (MMP-9)

SKRIPSI

Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat

Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.)

Program Studi Farmasi

Diajukan oleh :

Maria Angelina Djohan

NIM : 168114107

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS SANATA DHARMA

YOGYAKARTA

2020


ii


iii

..


iv

HALAMAN PERSEMBAHAN

“Janganlah hendaknya kamu kuatir tentang apa pun juga, tetapi nyatakanlah

dalam segala hal keinginanmu kepada Allah dalam doa dan permohonan dengan

ucapan syukur”

(Filipi 4:6)

“Serahkanlah perbuatanmu kepada Tuhan, maka terlaksanalah segala rencanamu”

(Amsal 16:3)

KARYA INI KUPERSEMBAHKAN UNTUK:

Tuhan Yesus Kristus, sumber kehidupan, keselamatan, dan pengharapanku.

Papa Djohan Solihin dan Mama Netty Maria Sutopo yang telah memberikan

cinta dan kasih sayang, serta senantiasa mendoakan kesuksesanku.

Koko Albertus Djauhari Djohan. You are my best brother ever.

dan tentunya,

Almamaterku Universitas Sanata Dharma


v


vi


vii

PRAKATA

Puji dan syukur penulis panjatkan pada Tuhan Yang Maha Esa, karena

berkat anugerah-Nya, skripsi yang berjudul Uji Aktivitas Fraksi n-Heksana-Etil

Asetat Daun Asoka (Ixora Coccinea L.) Terhadap Penghambatan Matrix

Metalloproteinase-9 (MMP-9) dapat diselesaikan dengan baik dan tepat waktu.

Penelitian ini merupakan bagian dari penelitian Maywan Hariono, Ph.D., Apt.

yang didanai oleh Persatuan Kimia Medisinal Indonesia (PERAKMI)-

Timmerman Award 2017 dan Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma

melalui dana student club 2019. Skripsi ini disusun sebagai syarat untuk

memperoleh gelar sarjana Farmasi (S.Farm.) di Universitas Sanata Dharma

Yogyakarta.

Banyak pihak yang turut serta mendukung dan membimbing penulis

dalam penyusunan naskah skripsi ini. Tanpa bantuan mereka, penulis tidak

mungkin sampai pada tahap penyelesaian skripsi ini. Oleh karena itu, penulis

hendak mengucapkan terima kasih sebesar-besarnya kepada:

1. Ibu Dr. Yustina Sri Hartini, Apt. selaku Dekan Fakultas Farmasi

Universitas Sanata Dharma Yogyakarta.

2. Ibu Dr. Christine Patramurti, Apt. selaku Ketua Program Studi Farmasi

Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta.

3. Bapak Maywan Hariono, Ph.D., Apt. selaku dosen pembimbing skripsi

yang telah membimbing tim penelitian serta selalu memberikan dukungan,

kritik dan saran kepada penulis dari awal penyusunan skripsi hingga

selesai.

4. Ibu Dr. Yustina Sri Hartini, Apt. dan Ibu Dr. Christine Patramurti, Apt.

selaku dosen penguji skripsi yang telah memberi masukan dan saran dalam

menyelesaikan penyusunan skripsi ini.

5. Papa Djohan Solihin dan Mama Netty Maria Sutopo yang selalu

memberikan semangat, cinta kasih, dan doa dalam penyusunan skripsi

hingga selesai.

6. Koko Albertus Djauhari Djohan yang telah mendengarkan keluh kesah

penulis, memberikan dukungan, semangat, dan doa dalam melakukan


viii

penelitian hingga selesai serta penulis berharap agar kakak tersayang dapat

sukses selalu.

7. Pandu Hariyono dan Jasson Rhinehard Karamoy, selaku sahabat yang

telah dianggap saudara sendiri, penulis berterima kasih karena telah

menemani penulis dalam suka maupun duka selama dua tahun ini.

8. Seluruh anggota Drug Discovery Student Club, terutama Pandu, Jasson,

Wiwy, dan Try, selaku teman seperjuangan skripsi yang telah mendukung

dan menyemangati penulis dalam menyelesaikan penyusunan skripsi ini.

9. “Divisi Penelitian dan Pengembangan BEMF Farmasi 2018/2019” yang

telah mendukung dan bekerja sama dengan penulis dalam selama

melakukan penelitian.

10. Kevin, Ervan, Krisna, Sangga, Wisnu, dan Aldo, Ricky, Aris, Willy,

Kemara, Glenys, Sese, Maudy, Ingrid selaku kakak-kakak yang turut

membantu dan memberikan dukungan kepada penulis terkait penelitian

yang dilakukan.

11. Etha, Chasa, Evi, Gita, Erdyn, dan Maxi, selaku sahabat terbaik. Penulis

mengucapkan terima kasih atas persahabatan yang dijalani selama ini.

12. Christa, Chacha, Desty, Lilik, dan Audrey selaku teman-teman kelas yang

telah berjuang bersama dalam perkuliahan. Penulis mengucapkan terima

kasih atas pertemanan yang telah dijalani.

13. Teman-teman FSM C 2016 serta Angkatan 2016 Farmasi yang telah

bertahan sampai sejauh ini dan memberikan banyak kenangan selama

perkuliahan.

14. Pak Wagiran, Mas Bimo, dan Pak Parlan, selaku laboran yang telah

mendukung dan membantu penulis dalam melakukan penelitian hingga

selesai.

15. Adik-adik tingkat tersayang yang meliputi kelompok “Pemecah Kuvet”,

“Pharmacy of Fransiskus”, “Malaikat Cantik”, “Aku Cinta Kimia

Organik”, FSM A 2019, dan FSM D 2019. Penulis mengucapkan terima

kasih atas dukungan dan doa serta penulis berharap agar adik-adik

tersayang kelak sukses selalu.


ix

16. Semua pihak yang tidak dapat disebutkan satu persatu yang telah

membantu dan mendukung penulis dalam menyelesaikan skripsi ini.

Penulis menyadari bahwa skripsi ini masih jauh dari kata sempurna dan

masih memiliki banyak kekurangan. Oleh karena itu, penulis sangat

mengharapkan kritik dan saran yang dapat membangun dan berharap semoga

skripsi ini bermanfaat bagi pengembangan ilmu pengetahuan. Terima kasih.

Yogyakarta, 9 Januari 2020

Penulis,


x

ABSTRAK

Enzim Matrix Metalloproteinase-9 (MMP-9) memiliki peranan penting

dalam perkembangan kanker payudara triple negative karena ekspresi yang tinggi

pada enzim tersebut dapat meningkatkan laju migrasi dan metastasis sel kanker.

Salah satu permasalahan kompleks terapi kanker payudara yaitu kurangnya

selektivitas obat terhadap target terapinya sehingga diperlukan penemuan baru

berbasis bahan alam dengan memanfaatkan sumber daya sekitar untuk

meningkatkan efektivitas dan efisiensi terapi tersebut. Penelitian ini bertujuan

untuk melakukan fraksinasi daun asoka (Ixora coccinea L.) dan mengidentifikasi

senyawa-senyawa yang terkandung dalam fraksi tersebut yang diharapkan aktif

menghambat enzim MMP-9 secara in vitro. Fraksinasi dilakukan menggunakan

kromatografi kolom fase normal dengan fase gerak n-heksana-etil asetat (3:1) dan

dianalisis menggunakan kromatografi lapis tipis dan Gas Chromatography-Mass

Spectrometry (GC-MS). Uji in vitro enzim MMP-9 dilakukan dengan prinsip

fluorescence resonance energy transfer (FRET) based MMP-9. Hasil uji in vitro

menunjukkan persen penghambatan aktivitas enzim MMP-9 oleh fraksi 1 dari

partisi etil asetat daun asoka sebesar 75% pada konsentrasi 1000 µg/mL sehingga

fraksi tersebut memiliki potensi sebagai kandidat obat kanker payudara triple

negative. Senyawa yang terkandung dalam fraksi 1 berdasarkan analisis spektra

GC-MS diprediksi sebagai ixorapeptida dengan variasi residu asam amino.

Kata kunci: Ixora coccinea L., kanker payudara, MMP-9, triple negative, uji in

vitro


xi

ABSTRACT

Matrix Metalloproteinase-9 (MMP-9) plays an important role in a triple

negative breast cancer progression because its over-expression increases cancer

cells migration as well as its metastatic rate. One of the complicated problems in

the breast cancer therapy is the lack of selectivity against its targets; therefore,

new discoveries are urgently needed especially using natural products resources

to increase its therapeutic effectiveness and efficiency. This study aims to

fractionate asoka (Ixora coccinea L.) leaves and to identify its chemical

substances in fractions that are expected to inhibit in vitro MMP-9 enzyme

activity. Fractionation was carried out using a normal phase column

chromatography with n-hexane-ethyl acetate as the mobile phase and followed by

analyzing them using thin layer chromatography and Gas Chromatography-Mass

Spectrometry (GC-MS). MMP-9 in vitro assay was carried out using a

fluoroscence resonance energy transfer (FRET) based MMP-9. The result

demonstrates that fraction 1 from ethyl acetate partition is able to inhibit 75% of

MMP-9 activity at 1000 µg/mL associated with its potency to delay the triple

negative breast cancer cell progression. Compounds that might be identified in

fraction 1 are ixorapeptide with modified amino acid residue based on GC-MS

spectrum analysis.

Keywords: Ixora coccinea L., breast cancer, MMP-9, triple negative, in vitro

assay


xii

DAFTAR ISI

Halaman

HALAMAN JUDUL ............................................................................... i

HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING ........................................ ii

HALAMAN PENGESAHAN .................................................................. iii

HALAMAN PERSEMBAHAN ............................................................... iv

PERNYATAAN KEASLIAN KARYA ................................................... v

PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI ...................................... vi

PRAKATA .............................................................................................. vii

ABSTRAK .............................................................................................. x

ABSTRACT .............................................................................................. xi

DAFTAR ISI ........................................................................................... xii

DAFTAR TABEL ................................................................................... xiii

DAFTAR GAMBAR ............................................................................... xiv

DAFTAR LAMPIRAN ............................................................................ xv

PENDAHULUAN ................................................................................... 1

METODE PENELITIAN ......................................................................... 2

HASIL DAN PEMBAHASAN ................................................................ 7

KESIMPULAN ....................................................................................... 16

SARAN ................................................................................................... 17

UCAPAN TERIMA KASIH .................................................................... 17

DAFTAR PUSTAKA .............................................................................. 18

LAMPIRAN ............................................................................................ 20

BIOGRAFI PENULIS ............................................................................. 26


xiii

DAFTAR TABEL

Halaman

Tabel I. Perhitungan persentase aktivitas enzim dan persentase

penghambatan terhadap MMP-9.................................................. 13

Tabel II. Prediksi senyawa-senyawa yang terkandung dalam fraksi 1 n-

heksana-etil asetat daun asoka berdasarkan library

WILEY7.LIB .............................................................................. 15


xiv

DAFTAR GAMBAR

Halaman

Gambar 1. Profil KLT ekstrak metanol daun asoka menggunakan fase

gerak n-heksana : etil asetat (3:1) menggunakan sinar UV 254

nm (a) dan profil KLT partisi etil asetat menggunakan fase

gerak n-heksana : etil asetat (3:1) menggunakan sinar UV 365

nm (b)........................................................................................ 9

Gambar 2. Profil KLT partisi etil asetat menggunakan fase gerak n-

heksana : etil asetat (3:1) menggunakan sinar UV 254 nm (a)

dan profil KLT partisi etil asetat menggunakan fase gerak n-

heksana : etil asetat (3:1) menggunakan sinar UV 365 nm

(b)........................................................................................ 10

Gambar 3. Hasil uji KLT 3 fraksi n-heksana-etil asetat daun asoka

menggunakan sinar UV 254 nm (a) dan hasil uji KLT 3 fraksi

n-heksana-etil asetat daun asoka menggunakan sinar UV 365

nm (b)........................................................................................ 11

Gambar 4. Mekanisme pemotongan substrat oleh enzim MMP-9 ............. 12

Gambar 5. Kromatogram GC fraksi 1 n-heksana-etil asetat daun asoka

dengan ditandakannya masing-masing puncak 1,2, dan 3 ........ 14

Gambar 6. Spektrum MS senyawa pada puncak 1 .................................... 14




xv

DAFTAR LAMPIRAN

Halaman

Lampiran 1. Rancangan microwell plate untuk uji aktivitas in vitro ....... 20

Lampiran 2. Surat keterangan determinasi tanaman asoka ..................... 21

Lampiran 3. Perhitungan kadar air serbuk simplisia daun asoka ............ 22

Lampiran 4. Perhitungan persentase rendemen ekstrak daun asoka ........ 22

Lampiran 5. Perhitungan persentase rendemen partisi etil asetat daun

asoka ................................................................................. 22

Lampiran 6. Perhitungan persentase rendemen tiga fraksi n-heksana-

etil asetat daun asoka ......................................................... 22

Lampiran 7. Struktur prediksi senyawa-senyawa yang terkandung

dalam fraksi 1 n-heksana-etil asetat daun asoka

berdasarkan library WILEY7.LIB ..................................... 23

Lampiran 8. Struktur ixorapeptide I dan ixorapeptide II ........................ 25


1

PENDAHULUAN

Kanker payudara merupakan jenis kanker yang disebabkan oleh sel-sel

pada payudara yang mulai tumbuh di luar kendali sehingga dapat membentuk

tumor dan dapat menyerang jaringan di sekitarnya serta menyebar ke organ lain

yang disebut metastasis (American Cancer Society, 2016). Matrix

metalloproteinase-9 (MMP-9) merupakan salah satu enzim yang berperan penting

dalam perkembangan kanker payudara karena dapat mendegradasi extracellular

matrix (ECM) sehingga sel kanker dapat bermigrasi dan bermetastasis (Merdad et

al., 2014). Ekspresi MMP-9 diidentifikasi paling tinggi pada kanker payudara

jenis triple-negative dan berkontribusi pada perkembangan metastasis (Mehner et

al., 2014). Studi menunjukkan adanya hubungan ekspresi berlebihan MMP-9

dengan tingginya insiden metastasis (Yousef et al., 2014). Dengan adanya insiden

metastasis yang merugikan bagi penderita kanker payudara, maka diperlukan

penemuan baru khususnya dari bahan alam dengan memanfaatkan sumber daya

sekitar yang efektif dalam pengobatan kanker payudara.

Penelitian mengenai MMP-9 inhibitor telah dilakukan oleh Drug

Discovery Student Club (DDSC) Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma

dengan melakukan seleksi tanaman di Indonesia yang berpotensi sebagai

penghambat MMP-9. Seleksi ini didasarkan pada uji in silico (komputasi) docking

molekular struktur kristal enzim MMP-9 terhadap 200 senyawa dari in-house

database yang dikoleksi dari salah satu situs herbal Indonesia

(http://herbaldb.farmasi.ui.ac.id/v3/) menggunakan software AutoDock Vina

(www.scripps.edu.my). Sebanyak 17 tanaman di Indonesia telah diseleksi dari 20

senyawa dengan energi bebas ikatan terendah (-11,2 hingga -8,1 kkal/mol). Salah

satu senyawa hits yang menarik, terkandung dalam daun asoka yaitu ixorapeptide

I yang mempunyai free energy of binding sebesar -8,3 kkal/mol (Rollando et al.,

2019).

Penelitian mengenai MMP inhibitor dilanjutkan dengan melakukan

ekstraksi pada bagian tanaman tertentu menggunakan pelarut metanol pada

sepuluh tanaman yang diketahui keberadaannya berdasarkan monografi dan studi

literatur. Ekstrak dari tiap tanaman dilanjutkan dengan uji in vitro penghambatan


http://herbaldb.farmasi.ui.ac.id/v3/

http://www.scripps.edu.my/

2

pada MMP-9 dan menunjukkan persen penghambatan yang bervariasi dari 0-92%

pada konsentrasi 1 mg/mL. Salah satu ekstrak tanaman yang menunjukkan

penghambatan yang tinggi adalah daun asoka (Ixora coccinea L.) dengan

hambatan sebesar 86% dan IC50 = 81,55 µg/mL (Rollando et al., 2019).

Penelitian lain juga melaporkan bahwa ekstrak metanol daun asoka

menunjukkan aktivitas sebagai antibakteri, antijamur, antioksidan, dan antitumor

(Lee et al., 2010). Sebanyak 30 senyawa berhasil diidentifikasi pada ekstrak

metanol daun asoka, salah satunya yaitu ixorapeptide I yang memiliki aktivitas

sitotoksik terhadap sel kanker hati Hep3B. Senyawa ini berhasil diisolasi dari

partisi etil asetat dan fraksi yang diperoleh menggunakan fase gerak n-heksana-

etil asetat dengan metode kromatografi kolom (Lee et al., 2010).

Penelitian ini melanjutkan penelitian dari DDSC Fakultas Farmasi

Universitas Sanata Dharma dengan melakukan fraksinasi pada partisi etil asetat

dari ekstrak metanol daun asoka menggunakan fase gerak n-heksana-etil asetat

dan metode kromatografi kolom. Partisi etil asetat dipilih dalam penelitian ini

berdasarkan penelitian yang dilakukan oleh (Lee et al., 2010) yang menyatakan

bahwa partisi etil asetat telah diidentifikasi mengandung ixorapeptide I. Fraksi

yang diperoleh dikelompokkan berdasarkan profil kromatografi lapis tipis dan

diuji penghambatannya terhadap aktivitas enzim MMP-9 secara in vitro.

METODE PENELITIAN

Bahan Penelitian

Seluruh bahan kimia yang digunakan bermutu analisis yang disuplai oleh

Merck, kecuali pada proses ekstraksi dan partisi yang menggunakan bahan kimia

bermutu teknis yang disuplai oleh CV. General Labora. Bahan utama yang

digunakan untuk ekstraksi dan partisi adalah serbuk daun asoka, metanol, n-

heksana, etil asetat, n-butanol, akuades, kloroform dan kertas saring Whatman No.

1. Bahan untuk fraksinasi yaitu silika gel 60 untuk kromatografi kolom, plat silika

gel 60 F254 untuk KLT, dan pelarut organik sebagai fase gerak yaitu n-heksana

dan etil asetat. Bahan untuk uji aktivitas in vitro yaitu kit enzim MMP-9 yang

didapatkan dari Biovision terdiri dari enzim MMP-9 terliofilisasi, substrat peptida


3

Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET)-based MMP-9, buffer, NNGH

(N-isobutil-N-(4-metoksifenilsulfonil) glisil hidroksamat) sebagai kontrol positif,

gliserol untuk mengencerkan enzim, dan dimetilsulfoksida (DMSO) sebagai

pelarut sampel.

Alat Penelitian

Alat yang digunakan dalam penelitian ini antara lain timbangan analitik

(Ohaus), pompa vakum (GAST model DOA-P504-BN), oven (Memmert UF 260),

waterbath (Memmert), grinder, vaccum rotary evaporator (Buchi), shaker

(Optima®), corong pisah (Pyrex), pipet mikro (Socorex), chamber, kolom

kromatografi dengan panjang 29,5 cm dan diameter 5 cm, lampu UV254, lampu

UV365, dan alat gelas pada umumnya. Alat untuk uji aktivitas in vitro yaitu pipet

mikro (Eppendorf), microwell plate 96, pipet tips, inkubator, vortex, dan multi-

mode microplate reader (Synergy HTX-3). Alat untuk identifikasi struktur yaitu

kromatografi gas-spektrometer massa (GC-MS QP2010S Shimadzu).

Prosedur Penelitian

Penyiapan Bahan Uji dan Determinasi Tanaman

Daun asoka varietas bunga kuning diperoleh dari daerah Paingan,

Yogyakarta dengan kriteria daun memiliki permukaan halus, tidak berlubang,

berwarna hijau, segar, bersih, dan berukuran sedang sampai besar. Daun asoka

kemudian dideterminasi di Fakultas Biologi Universitas Gadjah Mada,

Yogyakarta untuk memastikan spesimen yang dimaksud merupakan tanaman

asoka (Ixora coccinea L.)

Pembuatan Simplisia Daun Asoka

Daun asoka dipisahkan dari bahan pengganggu seperti tanah, batu kerikil,

rumput, bagian tanaman yang tidak dibutuhkan (batang dan bunga), bagian yang

rusak, dan lain-lain. Setelah itu, daun dicuci dengan air mengalir sambil

dibersihkan. Kemudian daun asoka dipotong membujur dengan ukuran sedang

hingga besar. Setelah dipotong, daun asoka tersebut dikeringkan dengan cara

dijemur di atas nampan yang ditutupi dengan kain hitam. Daun asoka yang telah

kering dipisahkan dari bahan-bahan pengganggu yang masih tersisa, kemudian

dibuat serbuk dengan menggunakan grinder dan disimpan.


4

Penetapan Kadar Air Pada Simplisia Daun Asoka

Menurut Farmakope Herbal Indonesia (2011), penetapan kadar air

dilakukan dengan metode destilasi toluena. Pereaksi toluen jenuh air dibuat

dengan cara mengocok toluen P dengan sedikit air kemudian dibiarkan terpisah

dan lapisan air dibuang. Setelah itu, serbuk daun asoka ditimbang lebih kurang 10

gram dan ditambahkan 200 mL toluen jenuh air dalam labu. Toluen jenuh air

dimasukan ke tabung penerima melalui pendingin sampai leher alat penampung

dan labu dipanaskan selama 15 menit. Setelah toluen mulai mendidih,

penyulingan diatur dengan kecepatan lebih kurang 2 tetes tiap detik sampai

sebagian besar air tersuling. Setelah itu, kecepatan penyulingan dinaikan hingga 4

tetes tiap detik. Penyulingan dilanjutkan selama 5 menit dan tabung penerima

didinginkan hingga suhu ruang. Setelah itu, volume air dibaca setelah air dan

toluen terpisah. Kadar air dapat dihitung menggunakan rumus:

Kadar air = x 100 %

(Direktorat Jendral Bina Kefarmasian dan Alat Kesehatan RI, 2011).

Pembuatan Ekstrak Metanol Daun Asoka

Pembuatan ekstrak metanol daun asoka dilakukan dengan metode

maserasi menggunakan pelarut metanol dengan perbandingan serbuk : metanol

(1:3) selama 24 jam sambil diaduk dengan menggunakan shaker. Serbuk daun

asoka ditimbang lebih kurang 180 gram dengan pelarut metanol sebanyak 540

mL. Hasil maserasi kemudian disaring dengan menggunakan corong Buchner

yang dilapisi kertas saring Whatman No. 1 sambil divakum. Serbuk hasil

penyarian dimaserasi kembali dengan pelarut yang sama dengan volume awal

selama 24 jam, proses maserasi ini dilakukan sebanyak empat kali.

Hasil maserasi pertama, kedua, ketiga, dan keempat kemudian

dimasukkan ke dalam vaccum rotary evaporator pada suhu 40°C untuk

menguapkan pelarut metanol yang terdapat pada ekstrak. Kemudian, ekstrak

diletakkan pada cawan petri dan diuapkan kembali dengan menggunakan

waterbath pada suhu 40°C untuk menghilangkan pelarut yang masih terdapat

dalam ekstrak. Ekstrak yang diperoleh diuji pemisahannya dengan KLT


5

menggunakan fase diam plat silika gel 60 F254 dan fase gerak n-heksana : etil

asetat (3:1). Selanjutnya, rendemen ekstrak dihitung menggunakan rumus:

Persentase rendemen ekstrak = x 100 %


Partisi Ekstrak Metanol Daun Asoka

Ekstrak metanol daun asoka ditimbang lebih kurang empat puluh gram

(40 g) dan dipartisi dengan 800 mL pelarut mulai dari n-heksana, etil asetat, n-

butanol, dan air menggunakan corong pisah sehingga didapatkan partisi dari

masing-masing pelarut (Abu et al., 2017). Partisi yang diperoleh diuji

pemisahannya dengan KLT menggunakan fase diam plat silika gel 60 F254 dan

fase gerak n-heksana : etil asetat (3:1). Selanjutnya, rendemen partisi dihitung

menggunakan rumus:

Persentase rendemen partisi = x 100 %


Fraksinasi Partisi Etil Asetat Daun Asoka

Partisi etil asetat daun asoka ditimbang lebih kurang lima gram (5 g)

untuk dilakukan fraksinasi menggunakan kromatografi kolom dengan fase diam

berupa silika gel 60 untuk kromatografi kolom dan fase gerak n-heksana : etil

asetat (3:1) yang telah dipilih secara isokratik berdasarkan optimasi. Fraksi-fraksi

yang diperoleh diuji pemisahannya dengan KLT menggunakan fase diam plat

silika gel 60 F254 dan fase gerak n-heksana : etil asetat (3:1), kemudian fraksi yang

mempunyai profil KLT yang sama dijadikan satu. Selanjutnya, rendemen fraksi

dihitung menggunakan rumus:

Persentase rendemen fraksi = x 100 %


Uji Aktivitas In Vitro Penghambatan MMP-9

Enzim MMP-9 yang terliofilisasi direkonstitusi dengan 110 µL gliserol

30 % dalam air deionisasi. Enzim yang telah terekonstitusi dilarutkan dalam 550

µL buffer dan siap digunakan untuk pengujian. Sampel disiapkan dengan cara


6

dilarutkan dalam DMSO dengan konsentrasi akhir 100.000 ppm dalam larutan

stok sehingga diperoleh konsentrasi akhir 1000 ppm dalam tiap well. Konsentrasi

akhir DMSO dalam tiap well sebesar 1 %. Pertama, blanko kontrol disiapkan

dengan menambahkan 100 µL buffer uji MMP-9, sedangkan blanko sampel

disiapkan dengan menambahkan 99 µL buffer uji MMP-9 dan 1 µL sampel yang

akan diuji. Sampel disiapkan dengan cara menambahkan 44 µL buffer uji MMP-9,

1 µL fraksi yang akan diuji, dan 5 µL enzim MMP-9 tiap well. Kontrol pelarut

disiapkan sama dengan penyiapan sampel namun 1 µL fraksi yang akan diuji

diganti dengan pelarut yang digunakan (DMSO). Kontrol positif terdiri dari 43 µL

buffer uji MMP-9, 2 µL NNGH, dan 5 µL enzim MMP-9. Kontrol negatif

disiapkan dengan menambahkan 45 µL buffer uji MMP-9, dan 5 µL enzim MMP-

9. Blanko kontrol, blanko sampel, sampel, kontrol positif, kontrol negatif, dan

kontrol pelarut kemudian diinkubasi pada suhu 37°C selama 30 menit. Setelah itu,

1 µL substrat FRET-based MMP-9 dan 49 µL buffer ditambahkan pada sampel,

kontrol pelarut, kontrol positif, dan kontrol negatif serta diinkubasi pada suhu

37°C selama 60 menit. Rancangan microwell plate untuk uji aktivitas in vitro

dapat dilihat pada Lampiran 1.

Setelah inkubasi selesai, fluorosensi dari masing-masing well dibaca

menggunakan multi-mode microplate reader (Synergy HTX-3) pada panjang

gelombang eksitasi 325 nm dan panjang gelombang emisi 393 nm. Hasil

fluorosensi senyawa sampel, kontrol positif, dan kontrol negatif dikurangi dengan

blanko dan didapatkan persentase aktivitas enzim dengan rumus

( x 100 %). Persentase penghambatan enzim

MMP-9 didapatkan dengan rumus (100 % - persentase aktivitas enzim (%)).

Identifikasi Senyawa dalam Fraksi n-heksana-etil asetat

Identifikasi senyawa dilakukan dengan metode Gas Chromatography-Mass

Spectrometry (GC-MS) yang dilakukan di Laboratorium Terpadu Universitas

Islam Indonesia. Fraksi sebanyak 5 mg dilarutkan dalam pelarut kloroform

kemudian diambil sebanyak 0,5 µL untuk diinjeksikan ke dalam GC-MS. GC-MS

yang digunakan memiliki jenis kolom Rtx 5 MS (5% diphenyl / 95% dimethyl


7

polysiloxane), fase gerak berupa helium dan suhu kolom dikondisikan sebesar

100°C selama 5 menit dan dinaikkan sebesar 5

°C per menit hingga mencapai

300°C.

HASIL DAN PEMBAHASAN

Daun asoka yang digunakan dalam penelitian ini didapatkan dari daerah

Paingan, Yogyakarta. Tanaman tersebut telah dideterminasi dengan cara

pengamatan ciri-ciri dari tanaman tersebut dan dicocokkan dengan literatur. Hasil

determinasi menunjukkan bahwa tanaman yang diteliti adalah daun asoka dengan

nama latin Ixora coccinea L. yang ditunjukkan pada surat keterangan determinasi

tanaman asoka (Lampiran 2).

Pada penelitian ini, dilakukan penetapan kadar air pada serbuk simplisia

daun asoka dengan metode destilasi toluena (Direktorat Jendral Bina Kefarmasian

dan Alat Kesehatan RI, 2011) yang bertujuan untuk meminimalisir terjadinya

pertumbuhan mikroba, jamur, dan mikroorganisme lainnya (Sulistyani, 2018).

Persyaratan kadar air untuk serbuk simplisia yang dapat diterima yaitu ≤ 10 %

(Badan Pengawas Obat dan Makanan, 2014). Volume air yang didapatkan dalam

penetapan kadar air untuk serbuk simplisia daun asoka adalah 0,5 mL dan bobot

serbuk simplisia yang ditimbang adalah 10,00 gram sehingga kadar air serbuk

simplisia daun asoka yang didapatkan dalam penelitian ini yaitu 5 % sehingga

telah memenuhi persyaratan kadar air yang telah ditetapkan. Perhitungan kadar air

serbuk simplisia daun asoka disajikan pada Lampiran 3.

Sebanyak 182,71 gram serbuk daun asoka diekstraksi dengan

menggunakan 548,13 mL pelarut metanol. Ekstraksi dilakukan dengan metode

maserasi yang bertujuan agar pelarut yang digunakan dapat menembus dinding sel

tanaman dan melarutkan kandungan senyawa-senyawa sehingga dapat dilepaskan

dari dinding sel tanaman. Metode maserasi digunakan karena metode ini

merupakan metode yang sederhana dan tidak menggunakan proses pemanasan

sehingga mencegah kerusakan senyawa akibat pemanasan. Selain itu, metode

maserasi biasanya digunakan untuk mengekstraksi bahan tanaman yang lunak

seperti daun (Nn, 2015). Pemilihan pelarut dalam ekstraksi dipengaruhi oleh

beberapa faktor meliputi selektivitas, polaritas, titik didih, keamanan, dan biaya


8

(International Centre for Science and High Technology, 2008). Pelarut yang

digunakan dalam proses ekstraksi adalah metanol karena memiliki indeks

polaritas sebesar 5,1 sehingga dapat menarik senyawa yang bersifat polar dan non

polar, memiliki titik didih sebesar 64,7°C sehingga dapat diuapkan dengan

optimal, dan lebih ekonomis (Department of Chemistry, 2005; International

Centre for Science and High Technology, 2008). Ekstrak kental daun asoka yang

didapatkan memiliki organoleptis berupa cairan kental berwarna coklat kehitaman

dengan bau yang khas. Ekstrak metanol daun asoka diperoleh sebesar 47,84 gram

sehingga didapatkan persentase rendemen ekstrak sebesar 26,18 %. Perhitungan

persentase rendemen ekstrak metanol daun asoka disajikan pada Lampiran 4.

Pemilihan fase gerak yang tepat merupakan langkah yang sangat

penting untuk mendapatkan pemisahan komponen campuran senyawa yang

optimal (Atun, 2014). Optimasi fase gerak dilakukan dengan metode kromatografi

lapis tipis (KLT). KLT merupakan teknik pemisahan komponen campuran senyawa

dengan menggunakan fase diam yang dilapiskan pada plat kaca atau aluminium

dan fase gerak yang akan mengalir melewati fase diam. Pengaliran fase gerak

dikenal sebagai proses elusi. Sejumlah sampel yang sangat kecil ditotolkan

menggunakan pipa kapiler di atas permukaan plat, kemudian plat diletakkan

dengan tegak dalam bejana yang berisi fase gerak. Setelah itu, fase gerak akan

naik sepanjang permukaan lapisan plat dan membawa komponen yang terdapat

dalam sampel (Atun, 2014). Plat yang sudah dielusi kemudian dilihat di bawah

detektor UV untuk analisis lebih lanjut (Sherma and Fried, 2013). Pemilihan fase

gerak yang digunakan yaitu n-heksana : etil asetat (3:1) yang menghasilkan

pemisahan komponen campuran senyawa yang optimal dengan panjang elusi

sebesar 4 cm.

Berdasarkan pengamatan profil KLT ekstrak metanol daun asoka,

terdapat sembilan bercak pada detektor UV254 dan sepuluh bercak pada detektor

UV365. Bercak pada profil KLT terlihat gelap pada sinar UV 254 nm, sedangkan

warna bercak pada sinar UV 365 nm yaitu ungu violet. Selain itu, terdapat

beberapa bercak menumpuk yang menandakan terdapat beberapa senyawa dalam

tiap bercak sehingga perlu dilakukan optimasi fase gerak yang lebih spesifik agar


9

mendapatkan pemisahan senyawa yang paling optimal. Profil KLT ekstrak

metanol daun asoka menggunakan fase gerak n-heksana : etil asetat (3:1) disajikan

pada Gambar 1.

Gambar 1. Profil KLT ekstrak metanol daun asoka menggunakan fase gerak n-heksana : etil

asetat (3:1) menggunakan sinar UV 254 nm (a) dan profil KLT partisi etil asetat

menggunakan fase gerak n-heksana : etil asetat (3:1) menggunakan sinar UV 365 nm (b)

Sebanyak 40,02 gram ekstrak metanol daun asoka dipartisi dengan 800

mL pelarut mulai dari n-heksana, etil asetat, n-butanol, dan air menggunakan

corong pisah sehingga didapatkan partisi dari masing-masing pelarut (Abu et al.,

2017). Partisi etil asetat dipilih dalam penelitian ini berdasarkan penelitian yang

dilakukan oleh (Lee et al., 2010) yang menyatakan bahwa partisi etil asetat telah

diidentifikasi mengandung ixorapeptide I. Partisi etil asetat diuapkan pada suhu

45°C untuk menguapkan pelarut etil asetat karena etil asetat memiliki titik didih

sebesar 77°C (Pubchem, 2019). Bobot partisi etil asetat daun asoka yang didapat

sebesar 6,36 gram sehingga didapatkan persentase rendemen partisi etil asetat

sebesar 15,89 %. Perhitungan persentase rendemen partisi etil asetat disajikan

pada Lampiran 5.

Berdasarkan pengamatan profil KLT partisi etil asetat, terdapat delapan

bercak pada detektor UV254 dan tujuh bercak pada detektor UV365. Hal ini

menandakan bahwa terdapat beberapa senyawa dalam ekstrak metanol daun asoka

yang dapat terlarut dalam etil asetat. Bercak pada profil KLT terlihat gelap pada

(a) (b)


10

sinar UV 254 nm, sedangkan warna bercak pada sinar UV 365 nm yaitu ungu

violet dan biru aquamarine. Bercak gelap yang muncul pada deteksi UV 254 nm

disebabkan karena adanya penyerapan sinar UV254 oleh senyawa di area tersebut

yang menyebabkan indikator fosfor pada plat KLT tidak berfluorosensi

(Touchstone, 1992; World Health Organization, 2019). Deteksi UV365

menunjukkan adanya bercak berwarna ungu violet dan aquamarine yang

menandakan bahwa senyawa-senyawa tersebut berfluoresensi pada UV 365 nm.

Fluoresensi ini disebabkan karena adanya penyerapan sinar UV365 oleh senyawa

tersebut dan sinar yang telah diserap akan diemisikan kembali (Garcia et al.,

2012). Profil KLT partisi etil asetat menggunakan fase gerak n-heksana : etil

asetat (3:1) disajikan pada Gambar 2.

Gambar 2. Profil KLT partisi etil asetat menggunakan fase gerak n-heksana : etil asetat (3:1)

menggunakan sinar UV 254 nm (a) dan profil KLT partisi etil asetat menggunakan fase gerak

n-heksana : etil asetat (3:1) menggunakan sinar UV 365 nm (b)

Partisi etil asetat kemudian difraksinasi menggunakan kromatografi

kolom dengan fase diam berupa silika gel 60 untuk kromatografi kolom dan fase

gerak dengan perbandingan n-heksana : etil asetat (3:1) yang telah dipilih secara

isokratik berdasarkan optimasi. Fraksi-fraksi yang diperoleh diuji pemisahannya

dengan KLT menggunakan fase diam plat silika gel 60 F254 dan fase gerak n-

heksana : etil asetat (3:1). Setelah itu, fraksi yang mempunyai profil KLT yang

sama dijadikan satu sehingga didapatkan tiga fraksi yang memiliki profil KLT

berbeda.

(a) (b)


11

Berdasarkan pengamatan profil KLT pada detektor UV254 dan UV365,

terdapat lima bercak pada fraksi 1, enam bercak pada fraksi 2, dan tiga bercak

pada fraksi 3. Bercak pada profil KLT ketiga fraksi terlihat gelap pada sinar UV

254 nm, sedangkan warna bercak pada sinar UV 365 nm yaitu ungu violet. Bercak

yang menyerap sinar UV254 diprediksi mengandung gugus kromofor (ikatan

rangkap terkonjugasi) (Sherma and Fried, 2013), sedangkan bercak yang

berfluoresensi pada UV 365 nm biasanya mengandung struktur yang rigid,

mempunyai gugus N-heterosiklik atau ikatan hidrogen intramolekular (Sherma

and Fried, 2013). Hasil uji KLT tiga fraksi n-heksana-etil asetat daun asoka

disajikan pada Gambar 3.

Gambar 3. Hasil uji KLT 3 fraksi n-heksana-etil asetat daun asoka menggunakan sinar UV

254 nm (a) dan hasil uji KLT 3 fraksi n-heksana-etil asetat daun asoka menggunakan sinar

UV 365 nm (b)

Bobot fraksi 1 n-heksana-etil asetat daun asoka yang didapat sebesar 0,34

gram sehingga didapatkan persentase rendemen fraksi 1 n-heksana-etil asetat daun

asoka sebesar 6,79 %. Bobot fraksi 2 n-heksana-etil asetat daun asoka yang

didapat sebesar 0,02 gram sehingga didapatkan persentase rendemen fraksi 2 n-

heksana-etil asetat daun asoka sebesar 0,40 %. Bobot fraksi 3 n-heksana-etil asetat

daun asoka yang didapat sebesar 0,04 gram sehingga didapatkan persentase

rendemen fraksi 3 n-heksana-etil asetat daun asoka sebesar 0,80 %. Perhitungan

(a) (b)

Fraksi 1 Fraksi 2 Fraksi 3 Fraksi 1 Fraksi 2 Fraksi 3


12

persentase rendemen tiga fraksi n-heksana-etil asetat daun asoka disajikan pada

Lampiran 6.

Uji Aktivitas In Vitro Penghambatan MMP-9

Fraksi 1 n-heksana-etil asetat daun asoka dipilih untuk dilakukan uji

aktivitas penghambatan enzim MMP-9 in vitro karena persentase rendemen yang

didapatkan paling tinggi di antara dua fraksi yang lain. MMP-9 adalah enzim

protease yang memiliki aktivitas proteolitik sehingga dapat memotong ikatan

peptida pada substratnya. Substrat yang digunakan dalam pengujian ini berupa

peptida yang terikat dengan gugus fluorofor sehingga ketika terpotong oleh MMP-

9, maka gugus fluorofor akan terlepas dan terbaca fluorosensinya. Semakin tinggi

fluorosensi yang terbaca menunjukkan semakin tinggi pula aktivitas enzim dalam

memotong ikatan peptida pada substrat (Nicolotti, 2012). Mekanisme pemotongan

substrat oleh enzim MMP-9 disajikan pada Gambar 4.

Gambar 4. Mekanisme pemotongan substrat oleh enzim MMP-9 (Nicolotti, 2012)

Blanko kontrol dalam penelitian ini digunakan sebagai baseline bacaan

fluoresensi berupa buffer tanpa aktivitas enzim MMP-9, sedangkan blanko sampel

digunakan sebagai baseline nilai fluoresensi sampel dalam buffer tanpa aktivitas

enzim MMP-9. Kontrol negatif digunakan untuk mengetahui nilai bacaan

MMP-9

Gugus

fluorofor

Peptida

MMP-9 +

Senyawa yang mengandung

gugus fluorofor terlepas

Kompleks MMP-9 – substrat


13

fluoresensi aktivitas enzim MMP-9 tanpa adanya inhibitor, sedangkan kontrol

positif digunakan sebagai pembanding penghambatan enzim MMP-9 serta

memastikan bahwa prosedur dan kit enzim telah sesuai untuk pengujian.

Kontrol positif dalam penelitian ini memiliki persen penghambatan

sebesar 100% yang mengindikasikan bahwa NNGH memiliki aktivitas yang

tinggi dalam menghambat aktivitas enzim MMP-9, sedangkan fraksi 1 n-heksana-

etil asetat daun asoka memiliki persen penghambatan sebesar 75% pada

konsentrasi 1000 µg/mL. Sartorelli et al., (2007) menyatakan bahwa senyawa

tunggal mampu memiliki aktivitas yang lebih tinggi dibandingkan dengan fraksi

sehingga dapat dilakukan penelitian lebih lanjut terhadap fraksi 1 n-heksana-etil

asetat daun asoka yang dapat diasosiasikan dengan penghambatan kanker

payudara triple negative. Perhitungan persentase aktivitas enzim dan persentase

penghambatan terhadap enzim MMP-9 disajikan pada Tabel I.

Tabel I. Perhitungan persentase aktivitas enzim dan persentase penghambatan terhadap enzim

MMP-9

Bacaan

Rata-

rata

Rata-rata

Blanko

Aktivitas

Enzim

(%)

Inhibisi

Enzim

(%)

Inhibisi

Enzim

Kontrol

Pelarut

(%)

Replikasi

1

Replikasi

2

Replikasi

3

Blanko

Kontrol 72 81 83 79 0 - - -

Blanko

Sampel 77 81 76 78 0 - - -

Kontrol

Negatif 181 209 192 194 115 100 0 -

Kontrol

Positif 81 68 68 72 -6 -5 105 100±7

Kontrol

Pelarut 184 186 194 188 109 95 5 5±5

Sampel 95 102 105 101 23 20 80 75±4

Identifikasi Senyawa

Identifikasi senyawa dilakukan dengan metode Gas Chromatography-

Mass Spectrometry (GC-MS) yang bertujuan untuk memprediksi senyawa-

senyawa yang terkandung dalam fraksi 1 n-heksana-etil asetat daun asoka

berdasarkan bobot molekulnya. Senyawa-senyawa tersebut dipisahkan terlebih

dahulu berdasarkan waktu retensinya dengan menggunakan Gas Chromatography

(GC) yang memiliki prinsip pemisahan komponen dalam sampel yang didasarkan


14

pada perbedaan distribusi antara fase diam (cairan atau padatan) dan fase gerak

berupa gas inert yang akan mengalir melalui sistem kromatografi (Enndler, 2004).

Setelah itu, senyawa-senyawa tersebut dideteksi massanya menggunakan Mass

Spectrometry (MS) dan dianalisis berdasarkan bobot molekulnya.

Hasil penelitian menunjukkan terdapat tiga puncak yaitu puncak 1, 2, dan

3 pada kromatogram yang mengindikasikan bahwa terdapat 3 senyawa yang

terdeteksi menggunakan GC. Waktu retensi yang diperoleh tiap puncak berbeda-

beda yaitu 10,709 menit, 12,380 menit, dan 14,153 menit. Semakin rendah waktu

retensi yang diperoleh, semakin rendah titik didih senyawa tersebut dan semakin

rendah pula afinitas senyawa tersebut dengan kolom yang digunakan (Pavia et al.,

2015). Kromatogram fraksi 1 n-heksana-etil asetat daun asoka disajikan pada

Gambar 5.

Gambar 5. Kromatogram GC fraksi 1 n-heksana-etil asetat daun asoka dengan ditandakannya

masing-masing puncak 1, 2, dan 3

Puncak 1 memiliki waktu retensi sebesar 10,709 menit, dan memiliki m/z

sebesar 548 yang terbaca pada spektrum MS. Spektrum MS senyawa pada puncak

1 disajikan pada Gambar 6.

Gambar 6. Spektrum MS senyawa pada puncak 1

Puncak 2 memiliki waktu retensi sebesar 12,380 menit dan memiliki m/z



1 2 3


15


Puncak 3 memiliki waktu retensi sebesar 14,153 menit dan memiliki m/z




Ketiga profil spektra yang diperoleh kemudian diprediksi senyawanya

menggunakan library WILEY7.LIB dengan pemilihan kemiripan yang tinggi

sehingga diperoleh lima prediksi senyawa untuk setiap puncak yang diperoleh.

Prediksi senyawa-senyawa yang terkandung dalam fraksi 1 n-heksana-etil asetat

daun asoka disajikan pada Tabel II dengan struktur prediksi senyawa-senyawa

tersebut yang disajikan pada Lampiran 7.

Tabel II. Prediksi senyawa-senyawa yang terkandung dalam fraksi 1 n-heksana-etil asetat

daun asoka berdasarkan library WILEY7.LIB

Puncak

Waktu

retensi

(menit)

Persen

intensitas Mr Fragmen Prediksi senyawa

1 10,709 37,10 548

282

275

174

757

370

Phenol,2,2'-[(1-methyl-1,2 ethanediyl) bis

(nitrilomethylidyne)] bis

Monoamidoethylmalonic acid

Butanoic acid, 2-oxo-, trimethylsilyl ester

Pregn-5-en-20-one, 3,11,17,21-

tetrakis[(trimethylsilyl)oxy]-,O-

(phenylmethyl)oxime,(3.beta,11.beta)

2,6-dihydroxybenzoic acid

2 12,380 32,18 529

318

100

264

276

186

Alpha-D-glucopyranoside, methyl 4,6-O-

nonylidene

4-deuterio-trans-3,4-dihydroxy-cyclopentene

Alpha-D-glucopyranoside, 4-O-hexyl

Beta-D-glucopyranosid, 1-O-methyl-4,6-O-N-

hexyliden

Undecanoic acid

3 14,153 30,72 528

200

318

305

354

Octanoic acid, 2-butyl

Menthyl-beta-D-glucopyranoside

Alpha-D-glucopyranose, 2-amino-3,6-anhydro-

2-deoxy-1,4-bis-O-(trimethylsilyl)-2-amino-

3,6-anhydro-A-glucopyranose-1,4

Oleic acid, trimethylsilyl ester


16

Lee et al. (2010) berhasil melakukan isolasi sebanyak 30 senyawa dari

ekstrak metanol daun asoka yaitu delapan triterpenoid meliputi lupeol (Mr =

426,7), 3-asetil betulat (Mr = 498,7), asam betunolat (Mr = 454,7), α-amirin (Mr =

426,7), β-amirin (Mr = 426,7), asam ursolat (Mr = 456,7), 3-asetil ursolat (Mr =

498,4), dan asam oleanonat (Mr = 454,7), empat steroid meliputi 6β-

hidroksistigmast-4-en-3-one (Mr = 428,7), sitosteril-3-O-β-D-glukosida (Mr =

576,86), β-sitosterol (Mr = 414,7), dan stigmasterol (Mr = 412,7), tujuh flavonoid

meliputi kaempferol (Mr = 286,24), kaempferol-7-O-α-rhamnoside (Mr = 432,4),

kaempferitrin (Mr = 578,5), luteolin (Mr = 286,24), (-)-epi-katekin (Mr = 290,27),

(+)-katekin (Mr = 290,079), dan epikatekin-(4β8,2βO7)-ent-epikatekin

(Mr = 864,8), tiga kumarin yang meliputi skopoletin (Mr = 192,17), kumarin (Mr

= 146,14), dan eritro-10,20-albiflorin (Mr = 480,5), dua diterpenoid yang meliputi

16α-hidro-19-asetoksi-(-)-kauran-17-oat (Mr = 360,5), dan 16α-hidro-19-ol-(-)-

kauran-17-oat (Mr = 318,5), dua peptida meliputi ixorapeptide I (Mr = 500,6) dan

ixorapeptide II (Mr = 534,7), dua kuinon meliputi 1,4-dihidroksi-3-metil-

antrakuinon (Mr = 254,24) dan α-tokoferil kuinon (Mr = 446,7), satu trigliserol

yaitu 2,3-dihidroksipropileicosanoat (Mr = 386,6), dan satu asam lemak yaitu

asam oleat (Mr = 282,5). Berdasarkan data tersebut, senyawa yang diprediksi

terdapat dalam fraksi 1 n-heksana-etil asetat daun asoka adalah golongan

ixorapeptida dengan variasi jenis residu asam amino karena berada dalam rentang

Mr 500,6 hingga 534,7. Selain itu terdapat kemiripan massa relatif dari fragmen

puncak 1, yaitu m/z 282 yang sesuai dengan Mr asam oleat dan m/z 318 yang

sesuai dengan Mr 16α-hidro-19-ol-(-)-kauran-17-oat, berdasarkan pengujian dari

Lee et al. (2010). Struktur ixorapeptide I dan ixorapeptide II disajikan pada

Lampiran 8.

KESIMPULAN

Fraksi n-heksana-etil asetat daun asoka dapat diperoleh melalui fraksinasi

menggunakan kromatografi kolom. Salah satu fraksi yang diperoleh (fraksi 1 n-

heksana-etil asetat daun asoka) mempunyai persentase penghambatan sebesar

75% pada konsentrasi 1000 µg/mL terhadap aktivitas MMP-9 secara in vitro

sehingga fraksi tersebut memiliki potensi sebagai kandidat obat kanker payudara.


17

Senyawa yang diprediksi terkandung dalam fraksi 1 n-heksana-etil asetat daun

asoka berdasarkan analisis spektra GC-MS adalah ixorapeptida dengan variasi

residu asam amino.

SARAN

Berdasarkan hasil uji aktivitas penghambatan enzim MMP-9 secara in

vitro oleh fraksi 1 n-heksana-etil asetat daun asoka, dapat dilakukan penelitian

lebih lanjut yaitu menguji aktivitas penghambatan MMP-9 pada fraksi 2 dan

fraksi 3 n-heksana-etil asetat untuk menemukan senyawa lain yang berpotensi

menghambat MMP-9 dan melakukan penelusuran terkait kandungan fraksi 1 n-

heksana-etil asetat daun asoka berupa isolasi serta pengujian aktivitas setiap isolat

yang diperoleh untuk menemukan senyawa yang potensial menghambat MMP-9.

UCAPAN TERIMA KASIH

Penulis berterima kasih kepada Persatuan Kimia Medisinal Indonesia

(PERAKMI)-Timmerman Award 2017 dan Fakultas Farmasi Universitas Sanata

Dharma melalui dana student club 2019 yang telah memberikan dukungan

finansial untuk penelitian ini.


18

DAFTAR PUSTAKA

Abu, F., Norma, C., Taib, M., Aris, M., Moklas, M., Akhir, S.M., 2017.

Antioxidant Properties of Crude Extract , Partition Extract , and Fermented

Medium of Dendrobium sabin Flower 2017. 1–9.

American Cancer Society, 2016. Breast Cancer What is breast cancer ? 33–34.

Atun, S., 2014. Metode Isolasi dan Identifikasi Struktur Senyawa Organik Bahan

Alam. Konservasi Cagar Budaya Borobudur, 8, 53–61.

Badan Pengawas Obat dan Makanan RI, 2014. Peraturan Kepala Badan

Pengawas Obat dan Makanan Republik Indonesia Nomor 12 Tahun 2014

Tentang Persyaratan Mutu Obat Tradisional. Jakarta: Badan Pengawas

Obat dan Makanan RI, 9.

Department of Chemistry, U. of M.A., 2005. Solvent Physical Properties [WWW

Document]. URL https://people.chem.umass.edu/xray/solvent.html (accessed

12.1.19).

Direktorat Jendral Bina Kefarmasian dan Alat Kesehatan RI, 2011. Farmakope

Herbal. Suplemen II. Edisi I, Jakarta: Kementerian Kesehatan RI, XXIV,

101–102, 105–111.

Enndler, E.R.K., 2004. Introduction to Chromatography 1–25.

Garcia, J.A., Moreno, J.M., Perales, F.J., Romero, J., Sanchez, P., Gomez-

Robledo, L., 2012. Fluorescence: An Interdisciplinary Phenomenon for

Different Education Levels 3(3), 30–35.

International Centre for Science and High Technology, 2008. Extraction

Technologies for Medicinal and Aromatic Plants. United Nations Industrial

Development Organization and the International Centre for Science and High

Technology. 103, 106.

Kondeti, R.R., Mulpuri, K.S., Meruga, B., 2014. Advancements in Column

Chromatography : A Review. World Journal of Pharmaceutical Sciences,.

1375–1383.

Lee, C., Liao, Y., Hwang, T., Wu, C., Chang, F., 2010. Ixorapeptide I and

ixorapeptide II , bioactive peptides isolated from Ixora coccinea. Bioorganic

& Medicinal Chemistry Letters, 20(24), 7354–7357.

Mehner, C., Hockla, A., Miller, E., Ran, S., Radisky, D.C., Radisky, E.S., 2014.

Tumor cell-produced matrix metalloproteinase 9 (MMP-9) drives

malignant progression and metastasis of basal-like triple negative breast

cancer. Oncotarget, 5(9). 2736–2749.

Merdad, A., Karim, S., Schulten, H., Dallol, A., 2014. Expression of Matrix

Metalloproteinases ( MMPs ) in Primary Human Breast Cancer : MMP-9 as a

Potential Biomarker for Cancer Invasion and Metastasis 1366, 1355–1366.

Nicolotti, O., Catto, M., Giangreco, I., Barletta, M., Leonetti, F., Stefanachi, A., et

al., 2012. Design, synthesis and biological evaluation of 5-hydroxy, 5-

substituted pyrimidine-2,4,6-triones as potent inhibitors of gelatinases

MMP-2 and MMP-9. European Journal of Medicinal Chemistry, 58,

368–376.

NN, A., 2015. Medicinal & Aromatic Plants A Review on the Extraction Methods

Use in Medicinal Plants , Principle , Strength and Limitation 4(3), 3–8.


19

Pavia, D.L., Lampman, G.M., Kriz, G.S., Vyvyan, J.R., 2015. Introduction to

Spectroscopy. 109.

Pubchem, 2019. Ethyl Acetate. Pubchem (Online),

https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/8857 accessed 24

November 2019.

Rollando, R., Karamoy, J.R., Hariyono, P., Atmono, M.T., Djohan, M.A., Wiwy,

W., Anggoro, A.B., Kurniawan, C., Nuwarda, R., Salin, N., Wahab, H.,

Hariono, M., 2019. Identifying Local Plants with Anti-Breast Cancer Matrix

Metalloproteinase 9 Activities : In Silico and In Vitro Study. 1–17.

Sartorelli, P., Andrade, S.P., Melhem, M.S.C., Prado, F.O., Tempone, A.G., 2007.

Isolation of Antileishmanial Sterol from the Fruits of Cassia fistula using

Bioguided Fractionation. 644–647.

Sherma, J., Fried, B., 2013. Handbook of Thin-Layer Chromatography. Marcel

Dekker. 2, 18, 39, 79, 749, 757, 1029.

Sulistyani, N., 2018. Modul 006: Pengembangan Sediaan Obat Tradisional.

Jakarta: Kementerian Riset, Teknologi dan Pendidikan Tinggi, 10–11,

21, 24.

Touchstone, J.C., 1992. Practice of Thin Layer Chromatography, 3rd ed. Wiley

Interscience. 195.

World Health Organization, 2019. Thin-layer chromatography, in: The

International Pharmacopoeia. World Health Organization. 1.

Yousef, E.M., Tahir, M.R., St-Pierre, Y., Gaboury, L.A., 2014. MMP-9

expression varies according to molecular subtypes of breast cancer. BMC

Cancer, 14(1), 1–12.


https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/8857

20

LAMPIRAN

Lampiran 1. Rancangan microwell plate untuk uji aktivitas in vitro

Blanko Kontrol Blanko Sampel Kontrol negatif Kontrol positif

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

A B100 B100 B100 B99

S1

B99

S1

B99

S1

B45

E5

Sb50

B45

E5

Sb50

B45

E5

Sb50

B43

I2

E5

Sb50

B43

I2

E5

Sb50

B43

I2

E5

Sb50

B Kontrol pelarut Sampel

B44

P1

E5

Sb50

B44

P1

E5

Sb50

B44

P1

E5

Sb50

B44

S1

E5

Sb50

B44

S1

E5

Sb50

B44

S1

E5

Sb50

C

D

E

F

G

H

Keterangan :

B100 = Buffer uji MMP-9 100 μL





P1 = Pelarut (DMSO)

S1 = Sampel (fraksi 1 n-heksana-etil asetat daun asoka) 1 μL

I2 = Inhibitor (NNGH) 2 μL

E5 = Enzim MMP-9 5 μL

Sb50 = Substrat 1 μL + buffer uji MMP-9 49 μL


21

Lampiran 2. Surat keterangan determinasi tanaman asoka


22

Lampiran 3. Perhitungan kadar air serbuk simplisia daun asoka

Kadar air = x 100 %

= x 100 % = 5 %.

Lampiran 4. Perhitungan persentase rendemen ekstrak metanol daun asoka

Persentase rendemen ekstrak = x 100 %

= x 100 % = 26,18 %.

Lampiran 5. Perhitungan persentase rendemen partisi etil asetat daun asoka

Persentase rendemen partisi = x 100 %

= x 100 % = 15,89 %

Lampiran 6. Perhitungan persentase rendemen tiga fraksi n-heksana-etil asetat

daun asoka

Persentase rendemen fraksi 1 = x 100 %

= x 100 % = 6,79 %.


= x 100 % = 0,40 %.


= x 100 % = 0,80 %.


23

Lampiran 7. Struktur prediksi senyawa-senyawa yang terkandung dalam fraksi 1

n-heksana-etil asetat daun asoka berdasarkan library WILEY7.LIB

Senyawa Struktur

Phenol,2,2'-[(1-methyl-1,2 ethanediyl)

bis(nitrilomethylidyne)]bis

Monoamidoethylmalonic acid

Butanoic acid, 2-oxo-, trimethylsilyl ester

Pregn-5-en-20-one, 3,11,17,21-

tetrakis[(trimethylsilyl)oxy]-, O-

(phenylmethyl)oxime, (3.beta.,11.beta.)

2,6-dihydroxybenzoic acid


24

Alpha-D-glucopyranoside, methyl 4,6-O-nonylidene

4-deuterio-trans-3,4-dihydroxy-cyclopentene

Alpha-D-glucopyranoside, 4-O-hexyl

Beta-D-glucopyranosid, 1-O-methyl-4,6-O-N-

hexyliden

Undecanoic acid

Octanoic acid, 2-butyl

Menthyl-beta-D-glucopyranoside

Alpha-D-glucopyranose, 2-amino-3,6-anhydro-2-

deoxy-1,4-bis-O-(trimethylsilyl)-2-amino-3,6-

anhydro-A-glucopyranose-1,4


25

Oleic acid, trimethylsilyl ester

Lampiran 8. Struktur ixorapeptide I dan ixorapeptide II

Senyawa Struktur

Ixorapeptide I

Ixorapeptide II


26

BIOGRAFI PENULIS

Penulis skripsi berjudul “Uji Aktivitas Fraksi n-

Heksana-Etil Asetat Daun Asoka (Ixora coccinea L.)

terhadap Penghambatan Matrix Metalloproteinase-9

(MMP-9)” memiliki nama lengkap Maria Angelina

Djohan. Penulis lahir di Bandar Lampung pada tanggal

31 Agustus 1998 sebagai anak kedua dari dua

bersaudara dari pasangan Djohan Solihin dan Netty

Maria Sutopo. Pendidikan formal penulis diawali di TK

Fransiskus Bandar Lampung (2002-2004), SD

Fransiskus 1 Bandar Lampung (2004-2010), SMP Fransiskus 1 Bandar Lampung

(2010-2013), dan SMA Fransiskus Bandar Lampung (2013-2016). Penulis

kemudian melanjutkan Pendidikan Sarjana 1 di Fakultas Farmasi Universitas

Sanata Dharma Yogyakarta pada tahun 2016. Selama menempuh kuliah, penulis

terlibat dalam beberapa kegiatan organisasi dan kepanitiaan, antara lain bendahara

organisasi Jaringan Mahasiswa Kesehatan Indonesia (JMKI) periode 2016/2017,

bendahara kegiatan Malam Keakraban (Makrab) JMKI dan Upgrading II 2017,

bendahara Seminar Nasional 2017, bendahara kegiatan Herbal Cosmetic

Competition 2017, sekretaris kegiatan Forum Diskusi Mahasiswa Farmasi 2017,

anggota divisi Perlengkapan kegiatan Pharmacy Performance 2016, dan anggota

divisi Perlengkapan Lomba Cerdas Cermat Kimia 2016. Selain itu, penulis pernah

mendapatkan prestasi berupa Juara I pada lomba esai dalam kegiatan Pekan

Olimpiade Mahasiswa 2017 yang diselenggarakan oleh Badan Eksekutif

Mahasiswa Universitas Sanata Dharma dan sebagai perempatfinalis Clinical

Pharmacy Skill Event (CPSE) dalam Kompetisi Farmasi Seluruh Indonesia

(KOFEIN) 2019 di Universitas Airlangga. Penulis pernah menjadi anggota dan

sekretaris dari Drug Discovery Student Club (DDSC) periode 2017-2019. Penulis

juga berperan aktif sebagai asisten praktikum mata kuliah Botani Farmasi (2017),

Kimia Analisis (2018), Kimia Organik (2019) dan Kimia Dasar (2019). Selain itu,

penulis merupakan alumnia Beasiswa Djarum Foundation periode 2018-2019.


UJI AKTIVITAS FRAKSI n-HEKSANA-ETIL ASETAT DAUN ASOKA · vii PRAKATA Puji dan syukur penulis...

Documents

Transcript of UJI AKTIVITAS FRAKSI n-HEKSANA-ETIL ASETAT DAUN ASOKA · vii PRAKATA Puji dan syukur penulis...