33

BAB IV

METODE PENELITIAN

4.1. Lokasi Penelitian

Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium Sintesis, dan Laboratorium

Biomedik Universitas Muhammadiyah Malang.

4.2. Alat Penelitian

4.2.1. Pembuatan Serbuk Simplisia

1. Mesin penggiling (Blender)

2. Pengayak mesh 20 dan 40

3. Timbangan analitik balance Scout Pro 400 g

4. Oven BINDER

4.2.2. Proses Fraksinasi

1. Timbangan analytical balance Scout Pro 400 g

2. Timbangan analytical balance Mettler Toledo

3. Penyaring Buchner

4. Oven BINDER

5. Toples

6. Pipet tetes

7. Batang pengaduk

8. Sudip

9. Beaker glass

10. Cawan Porselen

11. Rotary evaporator vacuum Buchi R-215

4.2.3. Identifikasi Senyawa dengan KLT

1. Analytical balance

2. Chamber

3. Vial

4. Lempeng KLT (Silika gel TLC 60 F254)

5. Vortex

34

6. Pipa kapiler 5µl

7. Hot plate

8. Pinset

9. Sinar UV 254 nm dan 365 nm

4.2.4. Pengujian Difusi Cakram

1. Autoklaf

2. Inkubator

3. Laminar Air Flow

4. Hot plate

5. Vortex

6. Timbangan analitik

7. Mikropipet

8. Tabung reaksi

9. Bunsen

10. Erlenmeyer

11. Beaker glass

12. Penjepit

13. Jangka sorong

14. Cawan petri

15. Kawat ose

16. Eppendorf

17. Yellow tip

18. Blue tip

19. Blank discs

20. Cotton swab

4.2.5. Identifikasi Jamur Candida albicans

1. Mikroskop cahaya

2. Bunsen

3. Kawat ose

4. Object glass

5. Cover glass

35

4.3. Bahan Penelitian

4.3.1. Bahan Uji

Bahan tanaman yang digunakan dalam penelitian ini adalah daging buah

Limonia acidissima L. yang didapatkan dari Rasanae Barat, Bima, NTB (Nusa

Tenggara Barat) dan telah diidentifikasi oleh UPT. Balai Materia Medika, Dinas

Kesehatan, Jawa Timur. Mikroba uji yang digunakan adalah Candida albicans

yang diperoleh dari laboratorium biomedik Universitas Muhammadiyah Malang.

4.3.2. Proses Fraksinasi

1. Pelarut etanol teknis

2. Serbuk daging buah Kinca

4.3.3. Identifikasi Senyawa dengan KLT

1. N-Heksana pro analisis

2. Etil asetat pro analisis

3. Etanol pro analisis

4. Asam sulfat 10%

5. Larutan KOH 10%

6. FeCl3 1%

7. Pereaksi Dragendorff

8. Pereaksi Anisaldehida-Asam sulfat

4.3.4. Pengujian Difusi Cakram

1. Fraksi etanol daging buah Limonia acidissima L.

2. Sabouraud Dextrose Agar (SDA)

3. Aqudest steril

4. Nistatin

5. Hasil peremajaan jamur Candida albicans

6. DMSO 1%

4.3.5. Identifikasi Jamur Candida albicans

1. Hasil peremajaan jamur Candida albicans

2. Lactophenol cotton blue (LPCB)

3. Alkohol 70%

36

4.4. Variabel Penelitian

4.4.1. Variabel Bebas

Variabel bebas pada penelitian ini adalah golongan senyawa yang terdapat

pada fraksi etanol daging buah Limonia acidissima dengan konsentrasi fraksi

sebesar 25%; 30%; dan 35%.

4.4.2. Variabel Terikat

Variabel terikat dalam penelitian ini yaitu diameter zona hambat yang

dihasilkan oleh senyawa uji. Senyawa uji pada penelitian ini merupakan senyawa

yang terdapat dalam fraksi etanol daging buah Limonia acidissima yang dapat

menghambat pertumbuhan jamur Candida albicans yang ditandai dengan adanya

daerah bening disekitar senyawa uji yang ada pada media.

4.5. Penyiapan Sterilisasi Alat dan Bahan

Semua alat yang akan digunakan untuk pengujian antijamur perlu disterilkan

terlebih dahulu, yaitu dengan cara sterilisasi kering dan sterilisasi basah.

4.5.1. Sterilisasi Kering

Sterilisasi kering meliputi cara sterilisasi dengan api langsung dan cara

sterilisasi dengan oven pemanas.

1. Sterilisasi dengan api langsung

Sterilisasi ini dilakukan terhadap peralatan seperti jarum ose dan pinset.

2. Sterilisasi dengan oven pemanas

Oven pemanas digunakan untuk sterilisasi peralatan gelas yang tidak

berskala, seperti cawan petri, tabung reaksi dan pipet. Alat-alat yang

disterilkan dimasukkan ke dalam oven setelah mencapai suhu 160°C

selama 1-2 jam.

4.5.2. Sterilisasi Basah

Sterilisasi basah dilakukan dengan menggunakan autoklaf. Peralatan yang

disterilkan dengan sterilisasi basah diantaranya gelas ukur, Erlenmeyer, pipet tetes,

dan media pertumbuhan Candida albicans (Sabouraud Dextrose Agar). Proses

sterilisasi ini dilakukan pada suhu 121°C selama 15 – 20 menit.

37

4.6. Metode Penelitian

4.6.1. Rancangan Penelitian

Penelitian ini bersifat eksperimental yang bertujuan untuk mengetahui

aktivitas antijamur senyawa dalam fraksi etanol daging buah Limonia acidissima

terhadap Candida albicans yang ditunjukkan dengan zona hambat serta mengetahui

golongan senyawa yang terdapat pada fraksi etanol daging buah Limonia

acidissima secara in vitro dengan metode difusi cakram.

Penelitian ini dilakukan dengan menggunakan dua perlakuan yakni

kelompok uji yaitu fraksi etanol dengan berbagai konsentrasi (12,5 mg/disk; 15

mg/disk; dan 17,5 mg/disk) dan kelompok kontrol yang terdiri dari kontrol positif

yaitu nistatin dan kontrol negatif yaitu aquadest dan DMSO 1%. Penelitian ini

melalui beberapa tahapan, yaitu:

1. Penyiapan simplisia

2. Penarikan komponen senyawa dengan metode fraksinasi bertingkat

3. Pemisahan komponen senyawa dengan metode KLT

4. Pengujian antijamur dengan metode difusi cakram

4.6.2. Kerangka Operasional

Gambar 4.1.Skema kerangka operasional

Analisis Data

Sterilisasi alat dan bahan untuk pengujian antijamur

Preparasi media dan jamur Candida albicans

Pengujian antijamur dengan metode

difusi cakram

Penyiapan simplisia

Pembuatan fraksi etanol

Identifikasi senyawa

dengan KLT

Kelompok Kontrol:

Kontrol positif (Nistatin)

Kontrol negatif (Aquades +

DMSO 1%)

Kelompok Uji:

Fraksi etanol daging buah Limonia

acidissima dengan konsentrasi 25%;

30%; dan 35%

38

4.7. Prosedur Kerja

4.7.1. Preparasi Simplisia

Sampel yang diteliti adalah daging buah Limonia acidissima. Daging buah

dicuci dengan air hingga bersih dan dilakukan pengeringan pada suhu 40°C. Setelah

kering kemudian dihaluskan dengan mesin penggilingan, sehingga diperoleh

serbuk halus. Serbuk halus tersebut kemudian diayak menggunakan Shieve Shaker

dengan derajat kehalusan tertentu.

4.7.2. Proses Fraksinasi Bahan Uji

Pada proses fraksinasi yang dilakukan, digunakan tiga macam pelarut yaitu,

n-heksana, etil asetat, dan etanol. Fraksinasi dimulai dari pelarut non polar yaitu n-

heksana, kemudian dilanjutkan dengan pelarut semi polar yaitu etil asetat, dan

selanjutnya dengan pelarut polar yaitu etanol.

Dalam proses pembuatan fraksi etanol, digunakan serbuk daging buah buah

Limonia acidissima yang telah diekstraksi dengan n-heksana dan etil asetat

sebanyak 1300 gram dan kemudian diekstraksi dengan pelarut etanol menggunakan

metode maserasi (perendaman) selama 24 jam. Proses yang dilakukan adalah

sebagai berikut:

1. Serbuk halus daging buah Limonia acidissima yang telah diekstraksi dengan

n-heksana dan etil asetat sebanyak 1300 gram dimasukkan ke dalam sebuah

bejana bermulut besar;

2. Tambahkan etanol sebanyak 13000 mL (perbandingan 1:10), rendam selama

24 jam, kemudian saring dengan corong Buchner dan didapatkan filtrat 1 dan

residu 1;

3. Residu 1 dimaserasi kembali dengan etanol sebanyak 6500 mL (perbandingan

1:5), direndam selama 24 jam. Kemudian saring dan didapat filtrat 2 dan

residu 2;

4. Residu 2 dimaserasi kembali dengan etanol sebanyak 6500 mL (perbandingan

1:5), direndam selama 24 jam. Kemudian saring dan didapat filtrat 3 dan

residu 3;

5. Proses maserasi ini dilakukan dengan cara yang sama dan berulang sampai

filtrat tidak lagi menunjukkan adanya komponen yang tertarik dengan pelarut

39

etanol yang ditandai dengan tidak adanya noda pada plat KLT. Filtrat yang

ditotolkan masing-masing sebanyak 5 μL untuk melihat kepekatannya;

6. Proses maserasi ini, dilakukan sebanyak lima kali, dengan proses maserasi

ketiga dan kelima sama dengan proses yang dilakukan pada maserasi kedua

dan ketiga;

7. Filtrat yang telah didapat tersebut dikumpulkan, lalu dipisahkan dengan

pelarutnya (etanol) dan dipekatkan dengan rotary evaporator vacuum dengan

suhu ± 40⁰C sampai didapat larutan yang kental.

8. Pindahkan larutan kental tersebut ke dalam cawan porselen yang telah

ditimbang sebelumnya dan keringkan di oven pada suhu 40⁰C;

9. Setelah fraksi cukup kental, timbang fraksi dan cawan hingga konstan dan

simpan fraksi pada lemari pendingin.

Gambar 4.2. Bagan alur proses pembuatan fraksi etanol daging buah Limonia

acidissima L.

Serbuk halus daging buah Limonia acidissima sebanyak 1300 g

Tambahkan etanol sebanyak 13000 mL, rendam selama 24 jam, saring

dengan corong Buchner, dan tampung filtrat

Residu 1 Dimaserasi kembali dengan etanol

sebanyak 6500 mL, direndam selama

24 jam, saring dan tampung filtrat

Residu 2

Filtrat 1

Dimaserasi kembali dengan etanol

sebanyak 6500 mL, direndam selama

24 jam, saring dan tampung filtrat

Residu 3 Proses ini dilakukan dengan cara yang

sama dan berulang sampai filtrat tidak

lagi menunjukkan adanya komponen

yang tertarik dengan pelarut

Filtrat 2

Filtrat 3

Pekatkan seluruh filtrat dengan rotary

evaporator vacuum sampai diperoleh

larutan kental

Dikeringkan di oven

pada suhu 40⁰C

40

4.7.3. Pemisahan Senyawa dengan KLT

Fraksi etanol daging buah Limonia acidissima sebanyak 0,5 gram dihidrolisis

dengan 5 mL HCl 2N, didihkan lalu tutup dengan corong berisi kapas basah selama

50 menit. Setelah dingin, tambahkan ammonia (NH4OH) sampai basa, kemudian

ekstraksi dengan 4-5 mL n-heksana sebanyak dua kali, lalu uapkan hingga tersisa

0,5 mL, totolkan pada plat KLT sebanyak 10 µL. Kemudian eluasi dengan berbagai

macam fase gerak. Eluen yang memiliki kemampuan terbaik dalam memisahkan

komponen senyawa, akan digunakan pada pengujian aktivitas antijamur dengan

metode difusi cakram.

a. Fase diam : Silika Gel TLC 60 F254

b. Optimasi fase gerak:

1. N-Heksana : Etil Asetat (7 : 3)

2. N-Heksana : Etil Asetat (5 : 5)

3. N-Heksana : Etil Asetat (2 : 8)

4. N-Heksana : Etil Asetat (3 : 7)

4.7.4. Identifikasi Golongan Senyawa

Untuk identifikasi golongan senyawa pada fraksi etanol daging buah

Limonia acidissima dilakukan dengan metode KLT, dengan penampak noda:

a. Alkaloid : Pereaksi Dragendorff (menghasilkan noda warna jingga);

b. Terpenoid : Pereaksi anisaldehida-asam sulfat. Plat dipanaskan dengan

suhu 100°C (menghasilkan noda warna ungu);

c. Flavonoid : Pereaksi H2SO4 10% (menghasilkan noda warna kuning);

d. Polifenol dan tanin : Pereaksi FeCl3 10% (menghasilkan noda warna hitam);

e. Antrakuinon : Pereaksi KOH 10% dalam metanol (menghasilkan noda

warna kuning atau kuning kecoklatan).

4.7.5. Pembuatan Konsetrasi Larutan Uji

Pembuatan variasi konsentrasi larutan uji dibuat sebagai berikut:

a. Timbang fraksi etanol daging buah Limonia acidissima sebanyak 250 mg,

larutkan dalam 0,1 mL DMSO 1%, ditambahkan aquadest steril sampai 1

mL, sehingga didapatkan larutan uji dengan konsentrasi 25% (b/v);

41

b. Timbang fraksi etanol daging buah Limonia acidissima sebanyak 300 mg,

larutkan dalam 0,1 mL DMSO 1%, ditambahkan aquadest steril sampai 1

mL, sehingga didapatkan larutan uji dengan konsentrasi 30% (b/v);

c. Timbang fraksi etanol daging buah Limonia acidissima sebanyak 350 mg,

larutkan dalam 0,1 mL DMSO 1%, ditambahkan aquadest steril sampai 1

mL, sehingga didapatkan larutan uji dengan konsentrasi 35% (b/v).

4.7.6. Preparasi Media

Dalam penelitian ini digunakan satu media yakni Sabouraud Dextrose Agar

(SDA) dan dalam pembuatan suspensi mikroba menggunakan aquades steril dengan

meremajakan jamur sehari sebelum penggunaan.

Menurut Bridson, (2006), media Sabouraud Dextrose Agar dibuat dengan

formula seperti yang terdapat pada tabel IV.1. Bahan SDA sebanyak 65 g dilarutkan

dalam 1 liter air suling. Didihkan campuran tersebut sampai larut. Sterilkan dengan

sterilisasi basah (autoklaf) pada suhu 121°C selama 15 menit. Aduk rata dan

tuangkan ke dalam cawan Petri steril.

Tabel IV.1. Formula Sabouraud Dextrose Agar (Bridson, 2006).

Formula Gram/liter

Mycological peptone 10.0

Glucose 40.0

Agar 15.0

pH 5.6 ± 0.2

Pada penelitian kali ini, dibuat SDA sebanyak 250 mL, sehingga digunakan

bahan SDA sebanyak 16,25 g (Mycological peptone sebanyak 2,5 g, glukosa

sebanyak 10 g, dan agar sebanyak 3,75 g).

4.7.7. Identifikasi Jamur Candida albicans

Dari hasil peremajaan jamur Candida albicans yang dibuat untuk pengujian

aktivitas antijamur, dilakukan identifikasi dengan metode makroskopis dan

mikroskopis. Untuk uji makroskopis dilakukan dengan pengamatan secara visual

pada media agar (Mutiawati, 2016).

Untuk uji mikroskopis dilakukan dengan pewarnaan dengan pewarna

lactophenol cotton blue (LPCB). Pewarnaan ini dilakukan dengan meneteskan

42

setetes alkohol 70% pada object glass. Kemudian sterilkan jarum inokulasi diatas

api bunsen, ambil biakan jamur dengan jarum inokulasi tersebut, dan letakkan

diatas object glass yang telah ditetesi alkohol 70%. Lalu tambahkan satu atau dua

tetes pewarna LPCB sebelum alkohol mongering, dan tutup dengan cover glass.

Lakukan pengamatan dengan mikroskop (Leck, 1999).

4.7.8. Preparasi Jamur

Pada proses peremajaan, jamur Candida albicans yang berasal dari biakan

murni diambil satu ose kemudian ditanamkan pada cawan petri yang berisi media

Sabouraud Dextrose Agar. Kemudian diinkubasi selama 24 jam dengan suhu 37oC

(WHO, 2009).

Dalam pembuatan suspensi jamur Candida albicans, jamur dari hasil

peremajaan diambil sebanyak 1 ose. Siapkan tabung reaksi yang berisikan ±4 mL

aquadest steril. Untuk mendapatkan tingkat kekeruhan jamur 1.5 × 108 CFU/mL

(sesuai standar McFarland 0,5), masukkan jamur yang telah diambil sebanyak 1 ose

tersebut ke dalam tabung reaksi yang berisikan 4 mL aquadest steril (Gholampour-

Azizi, Samaneh, dan Fahimeh, 2015). Kemudian vortex suspensi jamur tersebut

hingga homogen. Setelah itu suspensi jamur dilihat kekeruhannya dibandingkan

dengan standar McFarland, dengan dilihat secara visual. Sebelumnya, dibuat

terlebih dahulu standar McFarland 0,5 dengan menggunakan 0,05 mL BaCl2 1%

dan 9,95 mL H2SO4 1% (Sutton, 2011).

Tabel IV.2. Standar kekeruhan McFarland (Matnani, et al., 2012; Zamora & Perez-

Gracia, 2012)

McFarland

Standard No.

1% BaCl2

(mL)

1% H2SO4 (mL) Kepadatan mikroba

(×108 CFU/mL)

0,5 0,05 9,95 1,5

1 0,10 9,90 3,0

2 0,20 9,80 6,0

3 0,30 9,70 9,0

Dari tabung reaksi yang berisi suspensi jamur, ambil suspensi dengan cotton

swab steril, untuk menghilangkan kelebihan cairan pada cotton swab, putar

beberapa kali dan tekan dengan kuat ke dinding dalam tabung, kemudian inokulum

dioles keseluruh permukaan media sebanyak 3 kali dengan memutar cawan dengan

sudut 60° untuk setiap pengolesan. Lalu oleskan cotton swab steril ke sekeliling

43

pinggiran permukaan agar. Biarkan inokulum mengering selama beberapa menit

pada suhu ruang dengan cawan tertutup (WHO, 2009).

4.7.9. Pengujian Metode Difusi Cakram

Proses pengujian antijamur untuk metode difusi cakram, antara lain sebagai

berikut :

1. Siapkan blank disc untuk konsentrasi uji, sebanyak 3 buah. Totolkan

sebanyak 10 µL untuk setiap larutan uji 25%; 30%; dan 35%. Keringkan

dalam oven dengan suhu 37°C selama 20 menit. Ulangi proses tersebut

hingga larutan yang ditotolkan dalam disk sebanyak 50 µL. Konsentrasi

pada disk untuk larutan uji 25% yaitu 12,5 mg/disk; pada konsentrasi 30%

yaitu 15 mg/disk; dan pada konsentrasi 35% yaitu 17,5 mg/disk. Untuk

sterilisasi disk dilakukan dengan pemancaran sinar UV selama 1 jam.

2. Siapkan juga 1 blank disc untuk penotolan kontrol positif (nistatin).

Totolkan sebanyak 20 µL, keringkan dalam oven dengan suhu 37°C selama

20 menit. Kemudian totolkan sebanyak 10 µL, keringkan dalam oven pada

suhu dan waktu yang sama. Ulangi penotolan 10 µL tersebut hingga

didapatkan jumlah totolan sebanyak 60 µL/disk. Untuk sterilisasi disk

dilakukan dengan pemancaran sinar UV selama 1 jam.

3. Olesi media Sabouraud Dextrose Agar dengan suspensi jamur Candida

albicans dengan tingkat kekeruhan 108 CFU/mL, yang telah dibandingkan

dengan standar McFarland 0,5.

4. Letakkan disk kontrol positif dan disk dengan sampel uji pada media SDA

yang telah diberi jamur Candida albicans dengan jarak tiap cakram 3 cm

dan dari tepi lempeng sebesar 2 cm. Tekan lembut disk pada permukaan

agar dengan menggunakan pinset sehingga terdapat kontak yang baik antara

disk dengan agar.

5. Kemudian letakkan disk untuk kontrol negatif (Aquades + DMSO 1%)

diatas permukaan agar. Kontrol negatif dibuat dengan mencampurkan

DMSO 1% sebanyak 100 µL dengan aquadest steril sebanyak 900 µL.

6. Selanjutnya media Sabouraud Dextrose Agar yang telah diberikan disk

larutan uji, kontrol positif, dan kontrol negatif diinkubasi pada suhu 37°C

selama 24 jam.

44

7. Hasil dari pengujian antijamur diamati dengan melihat adanya area yang

jernih disekitar disk.

8. Diameter zona hambatan yang terbentuk tersebut, diukur dengan

menggunakan jangka sorong, dan ditulis dalam satuan millimeter (mm).

9. Lakukan replikasi sebanyak tiga kali.

Gambar 4.3. Bagan prosedur pengujian antijamur dengan metode difusi cakram

Media uji ini diinkubasi pada suhu 37°C selama 24 jam

Dilakukan replikasi tiga kali untuk tiap konsentrasi uji

Analisis data

2

K- 1 3

K+

3 cm

2 cm

2 cm

2 cm

2 cm

1 (25%) 2 (30%) 3 (35%) K - (Aquadest +

DMSO 1%)

K +

(Nistatin)

45

4.7.10. Analisis Data

Analisis data dilakukan secara deskriptif dengan melakukan pengamatan

terhadap pengukuran diameter zona hambat dari daerah yang berwarna bening pada

masing-masing perlakuan baik kelompok kontrol maupun kelompok uji fraksi

etanol daging buah Limonia acidissima L.