Deteksi elektrokimia asam lemak non-esterifikasi oleh elektroda enzim dengan rakitan lapis demi lapis

AbstrakDalam studi ini, deteksi dan pengukuran konsentrasi asam lemak non-esterifikasi (NEFA) telah dicapai dengan metode elektrokimia dalam satu langkah operasi. Lapisan tipis multilayer dari poli(dimethyldiallyammonium klorida) (PDA) dibungkus dengan multi-wall karbon nanotube (MWCNTs) dan dua enzim asil-CoA sintetase (ACS) dan asil-CoA oxidase (ACOD) berkumpul di layar karbon elektroda dicetak oleh imobilisasi lapisan demi lapis (LBL). Lapisan halus polimer-enzim yang diproduksi dengan metode LBL, memungkinkan transportasi massa dari reaktan mengalir ke bawah lapisan untuk mencapai reaksi enzim dua langkah. Polimer-CNTs dan elektroda enzim yang dimodifikasi memperlihatkan sifat electrokatalitik yang baik dalam mempertahankan aktivitas enzim. Peningkatan linear arus anoda dari H2O2 hasil dari oksidasi NEFA diamati dengan peningkatan konsentrasi asam oleat. Hasil ini menunjukkan teknik menjanjikan dalam hal kesederhana, kecepatan dalam penentuan satu langkah dari NEFA untuk pengelolaan diabetes.

IntroductionDiabetes merupakan beban masyarakat yang utama dalam bidang kesehatan dan sosial-ekonomi . Dengan peningkatan orang yang didiagnosis ndengan diabetes tipe 2 (T2D), harus ada lebih banyak cara untuk memantau tidak hanya kadar glukosa darah tetapi juga metabolisme lainnya yang terkait dengan T2D. Hal ini semakin dipahami bahwa diabetes adalah gangguan metabolisme energi yang melibatkan pemanfaatan gula dan lemak. Pasien dengan T2D sering menunjukkan tingkat asam non-esterifikasi lemak (NEFA)yang lebih tinggi, terkait dengan peningkatan resistensi insulin (IR) dan tingkat pembuangan glukosa miskin (GDR) [2,3]. NEFA adalah sumber bahan bakar otot rangka yang penting. Perubahan dalam NEFAs plasma adalah indikator yang berguna dari tingkat lipolisis. Banyaknya NEFAs sebanyak 10% dari asam lemak darah total, biasanya dengan kisaran konsentrasi fisiologis antar 0,1-1,8 mmol/L [4]. Penyimpangan yang kronis konsentrasi NEFA di T2D mungkin terlibat dalam disfungsi -cell dan apoptosi[5]. Konsentrasi plasma NEFA digunakan sebagai penanda diagnosis untuk mengidentifikasi orang-orang yang lebih besar berisiko untuk perkembangan T2D sebelum munculnya resistensi dan cacat sekresi insulin. Hal ini penting dalam awal diagnosa T2D, menilai tingkat serangan jantung miokardial dan penyakit yang berhubungan dengan obesitas lainnya. Keberadaan pengelolaan diabetes mempromosikan pemantauan sendiri terhadap glukosa darah untuk penanganan penyakit dan pencegahan sekunder [6]. Pemantauan dari perubahan baik gula maupun NEFA selama proses metabolisme akan memberikan diagnosis yang lebih akurat, dan kemudian lebih efektif untuk pencegahan dan pengelolaan penyakit.

Deteksi NEFA dalam darah dilakukan sejak tahun 1950-an, metode yang dikembangkan selama ini didasarkan baik pada titrasi kolorimetri asam lemak dengan adanya indikator pH [9] maupun spektrofotometri atau dengan menggunakan pengukuran radiokimia kompleks asam lemak dengan ion logam divalen seperti Cu2+, Ni2+ atau Co2+[10]. Metode-metode ini memakan waktu dan menunjukkan kurangnya sensitivitas yang baik. Metode lain menggunakan pengukuran spektroskopi yang berbeda, seperti kromatografi cair-spektroskopi massa dan Fourier Transform inframerah telah dikembangkan selama dekade terakhir [11,12].Hanya terdapat sedikit sekali laporan tentang deteksi elektrokimia dari NEFA dalam plasma atau serum darah [13,14]. Karube et al. telah melaporkan sensor elektrokimia NEFA yang pertama yang didasarkan pada reaksi enzim yang memanfaatkan asil-CoA sintetase (ACS) dan asil-CoA oksidase (ACOD) [14]. Mereka memantau konsumsi oksigen terlarut dengan dua reaksi berurutan yang dikatalisasi oleh enzim terimobilisasi dalam resin foto-lintas-linkable poli(vinil alkohol). Korelasi linear antara penurunan arus dan 0,3-2,6 mM asam oleat atau palmitat diamati. Namun, metode seperti 'sinyal-off' kurang memiliki spesifisitas yang tinggi karena banyak gangguan potensial yang dapat menyebabkan penurunan arus pada injeksi sampel dimana hal ini juga dialami oleh metode imobilisasi mereka dengan teknik jebakan enzim dalam lapisan membran.Sampai saat ini, terdapat dua uji kolorimetri enzimatik in-viitro komersial yang tersedia untuk penentuan kuantitatif NEFA dalam serum sampel. Mereka diproduksi oleh diagnosa Wako dan Roche yang secara berturut-turut digunakan untuk mendeteksi asam oleat dan asam palmitat [15,16]. Kedua metode didasarkan pada studi yang diterbitkan oleh Sakaru et al. [17]. Hal tersebut mengandalkan pada konversi pertama NEFA menjadi asil-koenzim A (asil CoA) dengan adanya asil-CoA sintetase (ACS) (Skema 1). Asil-CoA yang dihasilkan dioksidasi oleh asil-CoA oxidase (ACOD) dengan generasi hidrogen peroksida (H2O2). Dengan keberadaan peroksidase (POD), hidrogen peroksida yang terbentuk menghasilkan pigmen merah atau biru/ungu dengan oksidasi kondensasi kuantitatif menggunakan TBHB atau 3-metil-N-etil-N-(betahydroxyethlyl)-aniline(Meha), yang dapat diukur dengan spektrometer UV pada panjang gelombang tertentuMetode ini mahal, memakan waktu dan hanya dapat dioperasikan di laboratorium. Oleh karena itu, NEFAs tidak dapat secara rutin diperkirakan kecuali dalam kontek studi klinis tertentu meskipun NEFAs penting dalam penelitian diabetes dan penyakit. Jika H2O2 dihasilkan dari langkah 2, oksidasi asil-CoA oleh ACOD dengan adanya oksigen, dapat dideteksi secara elektrokimia, hal ini seharusnya memungkinkan untuk menentukan konsentrasi NEFA elektrokimia dari jumlah H2O2, mirip dengan metode kolorimetri. Hal ini bisa memberikan metode yang masuk akal untuk arus elektrokimia yang berdasarkan biosensor glukosa untuk mengembangkan platform biosensor multipleks untuk pengukuran simultan dari metabolisme yang berbeda.

Penelitian ini akan melihat deteksi elektrokimia H2O2 dari reaksi dalam Skema 1, menggunakan asam oleat (OA) sebagai NEFA yang menjadi pusat perhatian. Itu dipilih sebagai peneletian NEFA dalam penelitian ini karena merupakan salah satu NEFAs plasma yang paling banyak dan fungsionalnya yang terserap dalam otot dan hati adalah sama dengan total NEFA.Teknik Lapis demi lapis (LBL) adalah salah satu metode yang paling menjanjikan untuk modifikasi permukaan dan imobilisasi biomolekul karena kesederhanaan, fleksibilitas dan berbagai bahan dapat digunakan untuk perakitan film dalam metode tersebut [19,20]. Metode tersebut sebagian besar didasarkan pada pemasangan elektrostatik dari muatan polielektrolit yang berlawanan dengan muatan permukaan padat. Metode tersebut sudah banyak digunakan untuk pelapisan fungsional, bahan enkapsulasi, biosensing dan aplikasi lainnya [21-24]. Karena enzim juga polielektrolit, yang mana muatannya tergantung pada titik isoelektrik (Ip) dari protein dan pH larutan, mereka dapat dengan mudah bergerak dalam film LBL tanpa dehidrasi dan reaksi kimia yang kompleks. Dengan cara ini, simapan elektrostatis enzim dapat menyisakan aktivitas biologis yang baik [25]. Namun, umumnya polielektrolit digunakan dalam teknik LBL seperti poli (allyalmine hidroklorida) (PAH) / poli (sodium 4-styrenesulfonate) (PSS) dan poli (dimethyldiallyammonium klorida) (PDA) / asam polymethacrylic (PMAA) biasanya nonconduktif secara elektrik, yang akan menjadi faktor pembatas bagi mereka untuk digunakan dalam perangkat bioelektronik [23,26].Karbon nanotube (CNT) telah menarik perhatian besar sebagai bahan fungsional untuk persiapan elektroda enzim dan biosensor karena sifat elektrokatalitik yang unik dari mereka [27-30]. PDA adalah polikation kuat yang dapat dengan baik diserap pada karbon atau elektroda emas [31,32]. PDA telah dilaporkan memiliki afinitas yang baik untuk CNT dan nanopartikel emas (GNPs) [33]. Gabungan PDA konduktif dapat digunakan untuk imobilisasi enzim dengan cara LBL untuk aplikasi biosensor elektrokimia [34,35].Dalam pekerjaan ini, gabungan PDA-MWCNT dipekerjakan untuk LBL pembuatan elektroda enzim yang mengandung dua enzim: ACS dan ACOD pada cetakan elektroda karbon (C-SPE); enzim dimodifikasi menjadi elektroda digunakan untuk deteksi NEFA melalui pengukuran arus oksidasi H2O2 hasil dari reaksi enzim. Multilayer dipilih di urutan polimer/ACOD/polimer/ACS, untuk menjaga ketetapan dengan reaksi enzimatik. Hubungan linear yang baik antara konsentrasi NEFA dan arus oksidasi H2O2 diperoleh, menunjukkan satu langkah deteksi NEFA dicapai. Ini menyediakan dasar yang kuat untuk pengembangan platform sensor multipleks lebih lanjut.

2. Percobaan 2.1 BahanGaram litium Oleoil koenzim A (OACoA), garam litium palmitoil koenzim A (PACoA), garam natrium hidrat Koenzim A (CoA), garam disodium hidrat adenosine 5-triphosphate (ATP), poli(dimethyldiallyammonium klorida) (PDA) (Mw=200-250 kDa), natrium dihidrogen fosfat mengalami dehidrasi, dinatrium hidrogen fosfat dan kalium ferricyanide (K3[Fe(CN)6]) yang dibeli dari Sigma-Aldrich (Dorset, Inggris). 1 mM asam oleat (OA) adalah larutan standar Wako NEFA dibeli dari Wako HR-seri NEFA-HR (2) enzimatik NEFA assay kit (Neuss, Jerman); asil-CoA sintetase (ACS) juga dipasok dari uji kit ini dalam campuran solid dengan CoA, ATP dan reagen beberapa lainnya (R1A) [16]. Solusi enzim dibuat dengan melarutkan reagen R1A di PBS dengan konsentrasi ACS dari 4 U / ml. ACOD dibeli sebagai enzim murni dari Wako Kimia GmbH (Jerman). Karya validasi optik dilakukan menggunakan asam lemak bebas Roche, tes Half-mikro dari Roche diagnostik (Penzberg, Jerman). Sampel plasma pasien disediakan oleh Newcastle Medical School (Newcaslte pada Tyne, Inggris). MWCNTs dengan diameter dalam dari 20-50 nm dan luar diameter 70-200 nm diperoleh dari Applied Sciences Inc. (Ohio, USA). C-SPE (Model DRP-C110) berasal dari perusahaan Dropsens (Oviedo, Spanyol) [36]. Elektroda memiliki diameter bekerja elektroda 0.40 cm dan luas 0,13 cm2. Referensi elektroda adalah perak / ion perak (Ag) dan elektroda counter karbon. Dimensi dari elektroda adalah 3,40 cm 1,00 cm 0,05 cm (panjang lebar tinggi) masing-masing. Ini elektroda pakai digunakan sebagai dibeli tanpa pra-pengobatan. Potensi digunakan dalam penelitian ini didasarkan pada referensi elektroda Ag kecuali dinyatakan menyatakan.

2.2. Fabrikasi enzim C SPE Lapis demi lapisLarutan PDA-MWCNT disiapkan dengan mencampur 3 mg dari MWCNTs di 5 ml 1% PDA bawah sonikasi selama 3 jam dan suspensi dibiarkan semalam untuk setiap bahan padat sedimen. Setengah bagian atas dari larutan PDA-MWCNT digunakan. Enzim elektroda (PDA-MWCNT/ACOD)n dirakit untuk Penentuan asil CoA dan elektroda bi-enzim (PDA-MWCNT / ACS / PDA-MWCNT / ACOD)n dirakit untuk penentuan NEFA.Untuk merakit lapisan multilayer dari (PDA-MWCNT/ACOD) di elektroda, larutan sebanyak 15 l PDA-MWCNT diteteskan ke elektroda pada suhu 4C selama 30 menit. Elektroda tersebut kemudian dicuci dengan 15 l PBS dua kali untuk menghilangkan jumlah yang berlebihan dari PDA-MWCNT yang tidak atau lemah teradsorpsi. Setelah itu, 15 l ACOD (4U/ml) larutan diteteskan ke modifikasi elektroda PDA-MWCNT pada 4C selama 30 menit. Elektroda tersebut kemudian dicuci lagi dengan 15l dari PBS dua kali untuk menyelesaikan lapisan penyalut ganda (PDA-MWCNT/ACOD) pertama pada elektroda. Dua lapisan ganda (PDA-MWCNT / ACOD) telah berkumpul di elektroda untuk fabrikasi enzim elektroda. Lapisan multilayer dirakit tanpa pengeringan selama tiap-tiap langkah deposisi. Elektroda bi-enzim disiapkan dengan cara yang sama dengan alternatif lapisan PDA-MWCNT/ACS dan PDA-MWCNT/ACOD. Satu atau empat multi-lapisan (PDA-MWCNT / ACS / PDA-MWCNT / ACOD) berkumpul, masing-masing. Skema untuk proses perakitan ditunjukkan pada Gambar. 1. Dispersi MWCNT pada muatan positif polikation PDA adalah mungkin karena lemahnya interaksi supramolekul antara mereka, yang mengikat secara elektrostatis ke muatan negatif (polyanion) asil-koenzim A oxidase (ACOD) pada pH 7,4, sebagai titik isoelektrik ACOD adalah 5.5 [37].

2.3. Pengukuran elektrokimiaPengukuran elektrokimia dilakukan oleh Autolab potensiostat-galvanostat (PGSTAT302). Linear sweep voltammetry dan chronoamperometry dilakukan dalam 0,1 M PBS dengan variasi konsentrasi PACoA / OACoA atau OA. Perbedaan konsentrasi PACoA/OACoA dicapai dengan menambahkan sedikit 10 mM larutan PACoA/OACoA ke sel yang terisi 0,5 ml PBS. Untuk penentuan OA pada elektroda bi-enzim, perbedaan konsentrasi OA dicapai dengan pengenceran 1 mM larutan standar OA dalam sel yang terisi dengan PBS yang mengandung ATP dan CoA sebagai kofaktor untuk asilasi reaksi NEFA (langkah 1 dalam Skema 1). konsentrasi ATP dan CoA keduanya dikendalikan menjadi 1 mM dalam larutan untuk setiap analisis konsentrasi asil-CoA/NEFA. Pengukuran impedansi elektrokimia dilakukan untuk memantau pembentukan lapisan dalam 5 mM K3[Fe(CN)6] sebagai probe redoks dalam rentang frekuensi antara 0,1 Hz dan 100.000 Hz, pada potensial tetap 0,17 V. Amplitudo dari alternatif tegangan adalah 10 mV. Semua percobaan elektrokimia dilakukan pada suhu kamar.

2.4. Validationof deteksi elektrokimia NEFA terhadap metode kolorimetriBeberapa konsentrasi OA dari 0,0 mM ke 0,9 mM diukur dengan metode kolorimetri menggunakan larutan standar NEFA komersial dari Wako[16] dan metode elektrokimia kami pada elektroda enzim, berturut-turut. Masing-masing konsentrasi diukur tiga kali dan nilai rata-rata digunakan untuk memperoleh grafik kalibrasi untuk masing-masing metode. 0,3 mM dan 0,6 mM sebagai dua konsentrasi OA yang diketahui diukur tiga kali secara independen oleh kolorimetri dan metode elektrokimia, dan nilai rata-rata yang diperoleh dari masing-masing konsentrasi digunakan agar sesuai dengan kurva kalibrasi dari setiap metode, masing-masing.2.5. Deteksi elektrokimia NEFA dalam plasma manusia pada elektroda enzimSampel plasma pasien disediakan oleh Sekolah Newcastle Medis dimana pertama-tama diencerkan ke dalam konsentrasi yang berbeda dengan buffer PBS dan kemudian dianalisis dengan Roche kit untuk menentukan konsentrasi NEFA. Sampel yang sama kemudian dianalisis dengan Metode elektrokimia pada elektroda enzim (PDA-MWCNT/ACOD/PDA-MWCNT/ACS). Pengukuran elektrokimia mencakup linear sweep voltammetry dan chronoamperometry.

3. Results and discussion3.1. Penentuan PACoA di C-SPE dengan ACOD dalam larutanDeteksi PACoA yang merupakan bentuk terasilasi dari NEFA asam palmitat (PA) (langkah 1 dalam Skema 1) berkaitan dengan penentuan PA, demikian NEFAs. Pertama, kelayakan penentuan PACoA dari reaksi enzim dilakukan pada C-SPE yang memiliki ACOD dan PACoA dalam larutan PBS. Gambar. 2a menunjukkan chronoamperometry yang (CA) (E = 500 mV) untuk konsentrasi PACoA hingga 1,2 mM. Grafik kalibrasi A (Gbr. 2b) diperoleh dari arus yang dihasilkan dalam 500 s. peningkatan arus Linear diamati dengan meningkatnya konsentrasi PACoA. Arus oksidasi ini terkait dengan dekomposisi H2O2 menjadi O2. Jumlah H2O2 yang dihasilkan dari reaksi sebanding dengan jumlah PACoA. Hasil ini menunjukkan bahwa pendeteksian PACoA secara elektrokimia adalah layak. Demikian pula, deteksi elektrokimia OACoA, bentuk terasilasi OA juga dicapai (Gambar. S1).

3.2. Pembuatan dan karakterisasi polimer-enzim multilayer dimodifikasi elektrodaTeknik LBL diterapkan untuk membuat elektroda enzim dengan imobilisasi ACOD dan ACS pada polimer PDA. Spektroskopi impedansi elektrokimia (EIS) digunakan untuk memantau perubahan resistensi transfer muatan (Rct) selama perakitan lapisan tipis multilayer dari (PDA-MWCNT/ACOD) atau (PDA-MWCNT/ACOD/PDA-MWCNT/ACS) selama proses modifikasi. Pemilihan 0,17 V adalah karena besarnya tegangan tersebut dekat dengan keseimbangan tingkat reduksi dan oksidasi dari pasangan K3[Fe(CN)6]:K4[Fe(CN)6], dan spesies redoks tidak akan habis di dekat permukaan elektroda selama pengukuran impedansi [31]. Gambar. 3 menunjukkan plot Nyquist dari modifikasi elektroda dengan berbagai lapisan (PDA-MWCNT/ACOD). Diameter Unsur semicicular masing-masing sesuai dengan Rct, yang pada 1000 pada C-SPE sebelum modifikasi permukaan; nilai tersebut meningkat menjadi 3400 setelah satu lapisan (PDA/MWCNT/ACOD) diendapkan pada elektroda dan peningkatan lebih lanjut untuk sekitar 5000 setelah dua lapisan. Rct meningkat seiring dengan peningkatan jumlah lapisan lapisan polimer-enzim. Hal ini juga diamati dengan pembentukan lapisan polimer-bienzyme (PDA-MWCNT/ACOD/PDA-MWCNT/ACS) (data tidak ditampilkan). Resistensi transfer muatan mengontrol probe redoks proses kinetik transfer elektron pada antarmuka elektroda [38], dan Rct tergantung pada fitur dielektrik dan isolasi pada elektroda/elektrolit antarmuka [39]. Peningkatan Rct karena polimer dan deposisi enzim mengkonfirmasi langkah-langkah pembentukan film multilyer.

3.3 penentuan PACoA pada multilayer (PDAMWCNT/ACOD)2 C-SPE termodifikasiGambar. 4 menunjukkan voltamogram linear sweep pada elektroda C-SPE dimodifikasi dengan lapisan (PDA-MWCNT/ACOD)2 dengan konsentrasi PACoA yang berbeda (hingga 1,2 mM). Arus meningkat dengan meningkatkan konsentrasi PACoA. Kurva kalibrasi diperoleh pada 500 mV memperlihatkan korelasi linear (R2 = 0.99) antara konsentrasi PACoA dan arus oksidasi, yang berasal dari H2O2 hasil oksidasi PACoA oleh ACOD dan oksigen. Hal ini sesuai dengan studi larutan dalam Bagian 3.1. Hal ini menunjukkan bahwa aktivitas ACOD dipertahankan dalam multilayer PDA-MWCNT, dan elektroda enzim dapat digunakan untuk menentukan konsentrasi PACoA. OACoA juga ditentukan berdasarkan elektroda enzim ini dalam cara yang sama (Gambar. S2).

3.4. Penentuan NEFA dalam (PDACNT / ACOD / PDACNT / ACS) C-SPE termodifikasiSetelah penegasan dari bfungsi multilayers PDA-MWCNT-ACOD untuk menentukan konsentrasi PACoA, elektroda enzim mengandung enzim ACOD dan ACS dibuat untuk penentuan konsentrasi asam oleat. Gambar. 5a menunjukkan LSVs diperoleh dari berbagai konsentrasi OA pada C-SPE termodifikasi dengan (PDA-MWCNT/ACOD/PDA-MWCNT/ACS)1. Kalibrasi OA (Gambar. 5b) diperoleh pada 500 mV menunjukkan korelasi linier yang baik antara konsentrasi OA dan arus oksidasi, menunjukkan metode yang menjanjikan untuk penetuan NEFA dengan satu langkah operasi. Puncak sekitar 370 mV ini disebabkan oleh ACS yang digunakan dari kotak penetuan NEFA Wako komersial.Untuk menguji pengaruh jumlah lapisan polimer-enzim pada respon arus, tes spiking OA dilakukan pada satu lapisan bienzyme dari (PDA-MWCNT/ACOD/PDA-MWCNT/ ACS)1 dan empat lapisan bienzyme dari (PDA-MWCNT/ACOD/PDA-MWCNT/ACS)4. Hasil penelitian menunjukkan bahwa metode LBL menghasilkan ketebalan yang baik dari lapisan polimer-enzim. Dan lapisan ini tidak mencegah transportasi massa reaktan mengalir ke bawah lapisan untuk memenuhi dua langkah reaksi enzimatik secara berurutan (Gambar. S3). Elektroda dengan empat lapisan bienzyme menunjukkan respon arus yang lebih tinggi daripada satu lapisan elektroda bienzyme baik sebelum maupun setelah menambahkan OA. Hal ini disebabkan oleh arus lebih banyak dihasilkan dari jumlah lapisan polimer-enzim yang lebih banyak pula, dan peningkatan jumlah enzim ini. Lapisan satu bienzyme dari (PDA-MWCNT / ACOD / PDA-MWCNT / ACS)1 umumnya diadopsi sebagai kondisi perakitan multilayer untuk deteksi NEFA dalam studi arus kecuali dinyatakan lain, yang merupakan kondisi yang optimal untuk fabrikasi elektroda enzim yang sangat reptoducible dan juga untuk deteksi NEFA efektif.

3.5. Validasi deteksi elektrokimia NEFA terhadap metode kolorimetriDengan metode elektrokimia dan metode kolorimetri, secara berturut-turut 0,3 mM dan 0,6 mM sebagai dua konsentrasi OA yang diketahui diukur secara independen. Arus yang dihasilkan dari dua konsentrasi ini pada elektroda termodifikasi menunjukkan kesesuaian yang bagus di kurva kalibrasi yang diperoleh sebelumnya oleh metode elektrokimia (Gambar. 6a) (kesalahan 2.7% dan 1.1%, berturut-turut). Hal ini konsisten dengan pembacaan diperoleh dengan metode kolorimetri menggunakan kit penentuan NEFA komersial dari Wako (Gambar. 6b) (kesalahan adalah 5,9% dan 1,0%, masing-masing). Hasil ini mengkonfirmasi bahwa metode elektrokimia menggunakan elektroda multienzim sangat handal dan direproduksi untuk penentuan NEFA. Pekerjaan lebih lanjut akan dilakukan untuk menyelidiki efek dari gangguan dan menguji dengan sampel serum.

3.6. Deteksi elektrokimia NEFA dari plasma manusiaElektroda enzim digunakan untuk sampel plasma manusia untuk deteksi NEFA dalam kondisi aplikasi nyata. Sampel dari satu pasien telah dipilih untuk penelitian, Konsentrasi NEFA pertama dianalisis oleh kit Roche, dan mereka dianalisis secara elektrokimia menggunakan elektroda enzim. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 7, hubungan linear antara konsentrasi sampel dan arus (E = 500 mV) dihasilkan dari voltamogram linear sweep. Karakterisasi oleh chronoamperometry menunjukkan hasil yang sangat konsisten (Gambar. S4). Rentang arus yang diperoleh dari sampel plasma lebih tinggi daripada yang dihasilkan dari pengukuran standar OA (Gambar. 5b). Hal ini diharapkan karena ada beberapa gangguan hadir dalam plasma manusia, yang bervariasi pada pasien yang berbeda dan juga dengan waktu. Karena profil pasien yang berbeda, matriks kalibrasi perlu dibentuk untuk meningkatkan penentuan NEFA oleh elektroda enzim dalam aplikasi nyata.Namun, hal tersebut dapat diharapkan bahwa lapisan polimer-enzim yang dirakit pada permukaan elektroda sudah dapat memberikan beberapa pencegahan dasar ikatan non-spesifik dari biomolekul lainnya (yang mengganggu) dibandingkan dengan elektroda telanjang. Juga, salah satu Keuntungan dari teknik LBL adalah kemampuan menggabungkan polimer yang berbeda untuk multifunctionalities dalam film. Berbeda polimer seperti bovine serum albumin, poli (asam metakrilat) dan poli (sodium stirena sulfonat) sedang diselidiki sebagai tambahan melapisi lapisan pada film enzim ini, bertujuan untuk memberikan peningkatan stabilitas dan mengurangi gangguan.

4. KesimpulanElektroda bi-enzim dibuat menggunakan konfigurasi lapis demi lapis mengandung multilayer dari lapisan tipis PDA-MWCNT/enzim komposit untuk deteksi elektrokimia NEFA. Konsentrasi NEFA ditentukan dengan mengukur arus oksidasi H2O2. Sebagai produk dari oksidasi asil-CoA untuk rute Beta oksidasi untuk NEFA, jumlah H2O2 sebanding dengan jumlah substrat. Enzim ACS dan ACOD memiliki aktivitas biologis yang tetap dalam lapisan, dan elektroda enzim menunjukkan aktivitas elektrokatalitik yang baik untuk langkah oksidasi NEFA. Lapisan polimer-enzim yang diproduksi baik dengan metode LBL mengijinkan transportasi massa dari reaktan mengalir ke bawah lapisan untuk mencapai reaksi enzim dua langkah. Hubungan linier yang baik antara konsentrasi NEFA dan arus oksidasi menunjukkan teknik yang menjanjikan untuk satu langkah penentuan NEFA untuk pengeloalaan diabetes. Membangun matriks kalibrasi membuktikan butuhnya menggunakan elektroda bi-enzim untuk Penentuan NEFA dalam aplikasi klinis nyata. Karya ini memberikan teknologi untuk platform sensor multipleks mengukur berbagai biomarker metabolisme secara bersamaan.