b s t r a c tSebuah gas metode spektrometri massa kromatografi-sensitif dan akurat dikembangkan dan divalidasi untuk penentuan simultan levetiracetam dan lamotrigin dalam darah utuh. Ekstraksi Asolid-fase (SPE) Prosedur menggunakan kolom HF Obligasi Elut C18 diikuti oleh derivatisasi usingN-metil-N-tert-Butyldimethylsilyl-trifluoroasetamida (MTBSTFA) dengan 1% tert-butyldimethylsilylchloride (TBDMSCl) digunakan. Dalam pengujian ini, levetiracetam-d6 digunakan sebagai standar internal. Batas ofdetection dan kuantifikasi yang 0,15 dan 0,50? G / mL, masing-masing, untuk kedua analit. Metode wasproved harus linier dalam kisaran konsentrasi 0,50-50,0? G / mL (R2 0,992) untuk kedua pemulihan analytes.Absolute ditemukan setidaknya 90,0 dan 97,2% untuk levetiracetam dan lamotrigin, respec-masing. Intra-hari dan akurasi antar-hari nilai untuk kedua analit yang berkisar antara -6,5 ke 4,2 dan -6.6to 3,0%, masing-masing, sedangkan nilai presisi masing-masing kurang dari 11,4 dan 8,3%. Metode devel-oped telah berhasil digunakan di laboratorium kami untuk kuantifikasi konsentrasi levetiracetam dan lamotrigineblood selama penyidikan kasus forensik di mana obat-obatan antiepilepsi wereinvolved. Metode ini juga dapat digunakan untuk tujuan pemantauan obat terapeutik.

2. Bahan dan metode2.1. Kimia dan reagenLevetiracetam (99,0%, Neuland Laboratories Limited, Hyder-Abad, India) itu murah hati menawarkan dari Pharmathen (Athena, Yunani). Lamotrigin dengan kemurnian kimia menyatakan 99,9% dibeli dari LGC GmbH Standar (Luckenwalde, Jerman). Sebuah standar acuan levetiracetam-d6 (inter-nal standar) pada konsentrasi 100,0? G / mL dalam metanol dibeli dari Cerilliant Corporation (Round Rock, TX, USA). Pelarut yang digunakan (asetonitril, diklorometana, etil asetat, heksana, isopropanol dan metanol) yang HPLC grade dan dibeli dari Merck (Darmstadt, Jerman). Reagen analitis dibeli sebagai berikut: pentafluoro-propionat anhidrida (PFPA) 99% dan N, O-bis (trimetilsilil) -trifluoracetamide (BSTFA) dengan 1% trimethylchlorsilane (TMCS) dari Sigma-Aldrich (Steinheim, Jerman), N-metil N-tert-Butyldimethylsilyl-trifluoroasetamida (MTBSTFA) dengan 1% tert-butyldimethylsilylchloride (TBDMSCl), Heptafluorobutyric anhy-dride (HFBA) 99% dan asam trifluoroasetat (TFAA) 99% dari Fluka (Steinheim, Jerman), anhidrida asetat 97% dari Mallinckrodt (St.Louis, MO, USA) dan piridin 99,5% dari Ferak (Berlin, Jerman). Dalam penelitian ini, empat jenis (Obligasi Elut LRC Sertifikasi, Obligasi Elut LRCCertify II, HF Obligasi Elut LRC-C18 dan ABS Elut LRC-Nexus) ekstraksi fase padat (SPE) kolom yang digunakan dan semua diperoleh dari Agilent Technologies ( Lake Forest, CA, USA). Darah manusia diperoleh, setelah persetujuan, dari donor yang sehat dan sebelum penggunaannya itu disaring oleh GC / MS untuk kehadiran obat.

2.2. Kalibrasi dan validasi standarPada praktikum ini dibuat larutan stok standar dari levetiracetam dan lamotrigin dengan konsentrasi 1 mg/mL dengan melarutkan 10 mg masing-masing senyawa dalam 10 mL metanol dan disimpan pada suhu -200C. Kemudian dibuat enam larutan kerja standar yang mengandung levetiracetam dan lamotrigin pada konsentrasi masing - masing 5, 10, 30, 100, 200, dan 500 g/mL, keenam larutan kerja standar tersebut disiapkan dengan memipet 0,05, 0,1, 0,3, 1, 2 dan 5 mL volume larutan stok 1 mg/mL kemudian diencerkan dengan metanol hingga volume 10 mL. Sampel darah untuk kurva kalibrasi (kalibrator) disiapkan dengan menambahkan 200 L darah manusia kosong dengan 20 L larutan standar campuran. Sehingga didapat enam larutan kalibrator yang mengandung levetiracetam dan lamotrigin pada konsentrasi yang sama yaitu 0,5, 1, 3, 10, 20 dan 50 g/mL. Kemudian disiapkan juga larutan kerja standar tambahan yang mengandung levetiracetam dan lamotrigin (di tiga konsentrasi yang berbeda yaitu 15, 150 dan 400 g/mL) dari larutan stok yang berbeda dari yang digunakan untuk kalibrator, dalam rangka mempersiapkan kontrol kualitas (QC) sampel darah. Tiga sampel darah QC tersebut disiapkan dengan cara yang sama dengan kalibrator sehingga mengandung levetiracetam dan lamotrigin dengan konsentrasi 1,5, 15 dan 40 g/mL. Larutan kerja disiapkan setiap hari untuk membuat larutan kerja yang fresh.Selain larutan kerja standar dan standar QC, pada praktikum ini juga disiapkan kerja kerja standar internal yang mengandung levetiracetam-d6 pada konsentrasi 20 g/mL untuk menyesuaikan dengan volume larutan stok standar metanol. Kurva kalibrasi (berdasarkan rasio luas puncak masing-masing analit dengan standar internal) diplot setiap hari dan digunakan untuk perhitungan konsentrasi analit.

2.3. Persiapan sampelLarutan kerja standar internal levetiracetam-d6 dengan konsentrasi 20 g/mL ditambahkan ke semua sampel sebanyak 20 L dan campuran tersebut divortex selama 15 detik. Tujuannya adalah menghomogenasikan campuran larutan tersebut, jika pencampuran dilakukan tanpa divortex maka larutan yang terbentuk tidak benar-benar homogen. Semua larutan kalibrator, larutan kerja QC dan sampel pasien ditambahkan dengan 20 L larutan standar internal levetiracetam-d6 sehingga kandungan di masing-masing larutan menjadi 2 g/mL. PH dari seluruh sampel ditetapkan pada pH 6 dengan cara penambahan 2 mL buffer fosfat 0,1 M (pH = 6,00). Pada pH 6 levetiracetam dan lamotrigin stabil berada pada sampel darah sehingga tidak akan mengganggu proses analisis (Siddiqui, 2014).Selanjutnya sampel darah yang telah ditambahkan dengan larutan standar internal diekstraksi menggunakan ekstraksi padat cair (SPE). Kolom SPE HF Obligasi Elut LRC-C18 dikondisikan dengan 2 mL metanol dan 2 mL air deionisasi sebelum dilakukan pengelusian sampel. Sampel dielusi pada kolom dengan menggunakan laju alir sekitar 1 mL/menit. Kemudian, kolom dicuci dengan 2 mL air deionisasi dan 50 L aseton. Pencucian ini dilakukan bertujuan untuk menghilangkan kotoran kotoran yang dapat mengganggu selama proses elusi. Setelah itu, mereka dikeringkan di bawah vakum bertekanan tinggi (10 mmHg) selama 5 menit untuk menghilangkan pelarut-pelarut yang digunkan selama pencucian. Analit dielusi dua kali dengan menggunakan 1,5 mL campuran pelarut diklorometana: isopropanol: amonium hidroksida (85: 15: 2, v / v / v). Eluat kemudian ditampung dalam tabung bersih dan diuapkan sampai kering di bawah aliran lembut dari gas N2 pada suhu 400C. Sampel yang telah diekstraksi selanjutnya diderivatisasi dengan sililasi menggunakan 30 L asetonotril dan 30 L MTBSTFA dengan 1% TBDMSCl untuk setiap tabung dan setelah divortex, tabung ditutup erat dan dipanaskan pada suhu 700C selama 20 menit. Setelah itu dilakukan pendinginan dan sampel siap diinjeksikan ke dalam sistem GC/MS sebanyak 1 L.