TranslatedcopyofCloningandexpressionofthehumanerythropoietingene.docx

7/26/2019 TranslatedcopyofCloningandexpressionofthehumanerythropoietingene.docx

1/9

Kloning dan ekspresigen erythropoietin manusia

ABSTRAK

Gen erythropoietin manusia telah diisolasi dari sebuah perpustakaan fag genomric dengan

menggunakan campuran 20-mer dan 17-mer probe oligonukleotida. Seluruh wilayah coding

gen yang terkandung dalam 5!-kilobase "ind###-$am"#l fragmen. Gen berisi empat urutan

inter%ensi &15'2 pasang basa( dan lima ekson &5)2 pasangan basa(. #ni mengkodekan 27-

amino sinyal asam peptida dan asam protein matang 1''-amino dengan *r dihitung dari

1).+,,. Gen erythropoietin ketika diperkenalkan ke dalam sel o%arium hamster ina

menghasilkan erythropoietin yang biologis aktif in %itro dan in %i%o.

epentingan dalam erythropoietin &/( telah didokumentasikan seak pergantian abad &1(.

/po adalah hormon utama yang terlibat dalam regulasi dan pemeliharaan tingkat fisiologis

beredar eritrosit massa &2 +(. "ormon ini diproduksi terutama oleh ginal pada orang dewasa

dan oleh hati selama hidup anin &!-'( dan dipertahankan dalam sirkulasi pada konsentrasi

15-+0 miliunit 3 ml serum &7-,( atau sekitar 001 n* dalam kondisi fisiologis normal.

roduksi /po dirangsang dalam kondisi hipoksia &1 10(. /po diusulkan untuk mengerahkan

efek biologis dengan melampirkan ke situs mengikat tertentu pada sel-sel progenitor eritroid

untuk merangsang diferensiasi mereka menadi eritrosit dewasa &+ 11(. 4amun ketika ada

kerusakan progresif massa ginal seperti pada gagal ginal kronis sebuah hasil anemia karena

penurunan produksi dari /po &12 1+(. 6remik domba anemia dan tikus dengan kadar /podarah menurun menanggapi treament dengan /po &1! 15(. engan demikian peran terapi

untuk /po muncul kemungkinan dalam pengobatan anemia yang berhubungan dengan gagal

ginal. *iyake et al. &1'( dimurnikan /po untuk homogenitas dari urin pasien dengan anemia

aplastik berat. 4amun sudah sulit karena kelangkaan bahan awal untuk mendapatkan

umlah bahan dimurnikan diperlukan untuk menyelidiki memadai sifat biologis dan molekul.

ami elaskan di sini isolasi ofhuman gen /po berdasarkan terbatas asam amino urutan data

dari /po manusia. ua campuran penyelidikan setiap urutan mengandung-12)-

oligonukleotida yang digunakan dalam skrining perpustakaan. Gen ini ika dinyatakan

dalam sel mamalia mengkodekan produksi /po yang sepenuhnya biologis aktif in %itro dan

in %i%o. Sebuah laporan awal dari penelitian ini telah muncul &17(.

BAHAN DAN METODE


2/9

*anusia Genomic erpustakaan. Sebuah haron !8 fag-ditanggung manusia hati anin

pustaka genom dipersiapkan sesuai dengan prosedur 9awn et al. &1)( diperoleh dari :om

*aniatis &"ir%ard 6ni%ersity(.

Pemangunan Oligonu!leotide Proe

dimurnikan kemih /poisolated manusia dari urin pasien dengan anemia aplastik &1'( menadi

sasaran pencernaan tryptic. ;ragmen yang dihasilkan diisolasi dan disekuensing dengan

menggunakan 8pplied $iosystems fase gas microse-+2? 8: 7500-)000 i 3 mmol ( &1

i @ +7 G$50 ug dari proteinase per ml larutan buffer yang

mengandung 01 * :ris "l &p" )0( 015 * 4al 10 m* /:8 dan 02E 4aodS!?

selama +0 menit pada 550. rehybridiFation dengan 3 1E larutan 1 * 4al 4aodS!

dilakukan pada 550 selama ! am atau lebih. "ibridisasi penyangga yang terdapat 0025

pmol 3 ml dari masing-masing 12) urutan probe 0, * 4al 3 5 m* /:8 3 50 m* natrium

fosfat p" '5 3 05E 4aodS! 3 100 g t48 ragi per ml. "ibridisasi dilakukan pada

!)0for 20 am dengan menggunakan campuran penyelidikan /H. #ni adalah 2: bawah

terendah suhu disosiasi dihitung &td( &2+( untuk anggota campuran. ada penyelesaianhibridisasi filter dicuci tiga kali dengan 0, * 4al 3 ,0 m* natrium sitrat p" 70 3 0. 1E


3/9

4aodS! pada suhu kamar dan dua atau tiga kali dengan 0, * 4al#,0 m* natrium

sitrat p" 70 3 1E 4aodS! pada suhu hibridisasi 10 menit per mencuci. Sebelum

hibridisasi dengan campuran pemeriksaan kedua filter diinkubasi pada 100 di 015 * 4al

15 m* natrium sitrat p" 70 3 01E 4aodS! selama 2 menit untuk menghapus probe

hibridisasi. ;ilter yang lagi prehybridiFed seperti dielaskan di atas dan kemudian hibridisasi

dengan /I probe campuran di !'0 &!A bawah td dihitung termurah untuk campuran ini(

dan dicuci seperti dielaskan di atas.

Ma#elis Ekspresi $e!tor untuk Epo %ene"6ntuk ekspresi langsung dari genom

yang gen /po !)-kilobase &kb( $st/##-$am"# fragmen ofJ"/1 &lihat "asil( yang berisi

seluruh gen /po digunakan. Setelah mengkon%ersi situs $st/## ke situs $am"# dengan

linker sintetis fragmen itu dimasukkan ke dalam situs $am"# unik dari %ektor ekspresi

pSH9 &data tidak dipublikasikan( yang berisi dihydrofolate reduktase &";( minigene

dari p*gl &2!(. lasmid yang dihasilkan pSH9-g"u/ &Gambar. 98( kemudian

digunakan untuk transfect ina hamster o%ary sel &"( ";- &25( dengan metode

kalsium fosfat microprecipitate &2'(. :ransforman dipilih oleh pertumbuhan dalam mediumkurang hipoksantin dan timidin. *edia kultur yang digunakan adalah modifikasi media /agle

ulbecco ini dilengkapi dengan 10E serum anin sapi penisilin streptomisin dan glutamin

&25(.

Epo:es.#n %itro dan in %i%o akti%itas biologis ditentukan dengan menggunakan sel

kultur tulang tikus sumsum &27( dan tikus polycythemic e=hypo=ic &2)( masing-masing. :he

radioimmunoassay untuk /po digunakan antibodi diaukan terhadap 1E murni kemih /po

manusia dan persiapan /po manusia kemih dari 1100 unit 3 mg &8:-1( sebagai standar.

&solasi Epo mRNA"6ntuk memperoleh /po m48 5!-kb "ind###-$am"#

pembatasan fragmen dari J"/1 &lihat "asil( dimasukkan ke dalam %ektor shuttle pSH!S:&data tidak dipublikasikan(. Cang dihasilkan plasmid chimeric pSHg"u/ &Gambar. 1$(

digunakan untuk transfect S-1 sel &8: 91'50( dengan metode kalsium fosfat

microprecipitate &2'(. Setelah budaya selama + hari 48 dibuat dari sel-sel transfected

dengan prosedur guanidinium tiosianat dari hirgwin et al. &2,( dan poli &8( K m48

diisolasi dengan mengikat oligo &d:( -cellulose &+0(.

'DNA 'loning"Sebuah /po c48 $ank dibangun sesuai dengan modifikasi dari

prosedur umum kayama dan $erg &+1( oleh menggunakan poly &8( K m48 yang

dielaskan di atas &data tidak dipublikasikan(.

Southern lotting"*anusia limfosit 48 dicerna sampai selesai oleh berbagaienFim restriksi. Sampel 48 dicerna dielektroforesis pada gel agarosa 07E dan ditransfer

ke GeneScreenlus filter oleh modifikasi dari prosedur Selatan &+2(L setelah gel didenaturasi

dengan 05 * 4a" 3 15 * 4al itu dibilas sebentar dengan air suling dan kemudian

ditransfer dengan 15 * 4al 3 015 * natrium sitrat p" 70. ;ilter ini diselidiki dengan

nicktranslated +2-berlabel manusia clone /po c48 yang berisi wilayah coding dari situs

$st/## ke daerah ekor poli &8( &lihat Gambar. +(.

DNA Se(uen!ing" ;ragmen restriksi diklon ke *1+ %ektor fag oleh menggunakan

/scherichia coli strain M*10+ atau M*10, sebagai tuan rumah &++( dan disekuensing dengan

metode dideoksi dari Sanger et al. &+!(. $eberapa daerah yang diurutkan oleh label kinase


4/9

atau akhir-fill label fragmen restriksi diikuti oleh pembelahan kimia seperti yang dielaskan

oleh *a=am dan Gilbert &21(.

HAS&)

#solasi dan arakterisasi /po Gene dari Genomic erpustakaan *anusia. Sebuah hati

anin pustaka genom manusia dalam %ektor bakteriofag haron !8 diputar untuk coding gen

untuk /po. ua kolam renang oligonukleotida sintetik campuran yang digunakan sebagai

probe seperti yang dielaskan dalam $ahan dan *etode. Sebuah perpustakaan 1.500.000 klon

fag diputar secara berurutan dengan kedua campuran penyelidikan. 20-mer campuran

penyelidikan hibridisasi

untuk 272 plak fag dan

17-mer hibridisasi untuk

@ !00I plak. "anya !

plak hibridisasi dengankedua campuran

penyelidikan. 8nalisis

berikutnya Southern blot

dan 48 urutan

menegaskan bahwa tiga

dari empat klon yang

hibridisasi dengan kedua

campuran penyelidikan

mengandung setidaknya

sebagian dari gen /po.Satu klon J"/1 yang

berisi gen /po lengkap

dipilih untuk analisa lebih

lanut.

Gambar. 1. *aelis /po ekspresi plasmid. &8( pSH9g"u/ berisi minigene"; sebagai /co#-st # fragmen dari p*gl &diperoleh dari . Schimke( %irus simian !0


5/9

&SH!0( asal replikasi dan awal promotor 3 akhir fragmen "ind###-$am"# SH!0 nukleotida

&nt ( 25+)-2770 di $am"#-$cl aku fragmen p$+22 nt 2!!)-!+'2 &diperoleh dari . :ian(

di fragmen "ind###-/co# dan $st/##-$am"#fragment dari gen /po. :he SH!0 akhir

promotor digunakan untuk mendorong ekspresi gen /po. &$( pSHg"u/ mengandung asal

SH!0 replikasi awal 3 promIters akhir dan sinyal poli awal &8( dalam fragmen /co#-

$am"# p$+22 nt 2!!)-!+'2 dalam fragmen "ind###-/co# dan fragmen "ind###-$am"#

dari gen /po. anah menunukkan orientasi transkripsi. bp $asis pasang.

eta endonuklease restriksi dari gen /po manusia dari klon J"/1 ditunukkan pada

Gambar. 2. protein coding region gen dibagi oleh empat urutan inter%ensi. Seak situs inisiasi

transkripsi m48 untuk /po belum ditentukan karena kurangnya m48 aringan manusia

batas di sisi 5 ekson # tidak terdefinisi. Situs restriksi yang digunakan dalam analisis urutan

uga ditunukkan pada Gambar. 2 seperti segmen yang diurutkan.

Gambar. 2. peta embatasan gen /po manusia. /kson #H ditandai dengan kotak. otak-kotak

padat menunukkan daerah ekson yang diteremahkan. Garis putus-putus di sisi 5 ekson #

menunukkan bahwa situs awal untuk transkripsi tidak diketahui. Situs pengakuan

pembatasan endonucleas disingkat sebagai berikutL $ $G9 ##D "ind###D / $st/##D pn

#D * $am"#D st #D S Sma #D : Sst #D dan J J$8 #. eta arak ditampilkan di kb. anah

bawah peta menunukkan daerah yang diurutkan.

Gambar. + menunukkan urutan nukleotida gen /po manusia. /kson diidentifikasi oleh

perbandingan urutan nukleotida ke urutan asam amino dari /po kemih manusia &data tidakdipublikasikan( dan oleh perbandingan urutan genom untuk urutan c48 yang berasal dari

m48 diisolasi dari sel " memproduksi rekombinan /po. $atas ekson-intron gen /po

sesuai dengan aturan konsensus sambatan &+5(.

Gen /po mengkode protein dari 1,+ asam amino. $erdasarkan 4"2-terminal urutan asam

amino dari dimurnikan /po 1'' residu terakhir sesuai dengan protein dewasa dengan *r

dihitung dari 1).+,, dalam bentuk unglycosylated. 6rutan asam amino 27 pertama terutama

residu hidrofobik konsisten dengan wilayah ini pengkodean peptida pemimpin &+'(. 6rutan

asam amino mulai dari posisi 1 sesuai dengan urutan uung amino ofe=pressed produk /po

rekombinan dalam sel " &data tidak ditampilkan(. Seperti yang ditunukkan pada Gambar.


6/9

+ protein dewasa memiliki tiga lokasi potensial untuk glikosilasi 4-linked masing-masing di

ekson kedua ketiga dan keempat gen menurut aturan 8sn-J88-Ser 3 :hr &+7(.

Sebuah pencarian dari Seluruh wilayah '2'-bp hulu dari inisiasi protein kodon 8:G tidak

mengungkapkan urutan promoterlike seperti kotak 8:8 kotak 88: atau -100 wilayah

&+)( uga tidak setiap urutan seperti yang ditemukan di tempat lain di seluruh gen.

8da a 5'5-bp diteremahkan wilayah di uung + dari ekson lalu. 6rutan nukleotida hulu dari

situs poli &8( pada gen /po tidak mengandung konsensus poli &8( urutan sinyal 88:888

atau urutan terkait biasanya ditemukan di lokasi ini &+,-!1(. emikian pula konsensus poli

&8( sinyal tidak ditemukan di clone /po c48 dari cynomolgus monyet &data tidak

dipublikasikan(. Satu-satunya urutan menyerupai 88:888 adalah 88G88 ditemukan 11-

1+ nukleotida hulu dari poli &8( situs &Gambar. +(.

alam urutan inter%ensi antara ekson ### dan #H adalah anggota dari keluarga 8lu urutan

diulang. Ailayah ini adalah 70E homolog dengan konsensus 8lu urutan &!2(. Seperti khas

dari urutan ini daerah ini diapit oleh ulangi langsung tidak sempurna.

Ekspresi Epo %ene" $iologis aktif rekombinan /po manusia diproduksi dalam sel "

yang telah stabil berubah dengan %ektor ekspresi yang mengandung genom /po insert gen

didorong dengan SH!0 akhir promotor &Gbr. 18(. Sebuah sampel yang representatif dari 55-

hari 8 menengah dari sel pSH9-g"u/-transfected terkandung 1)2 unit /po per ml

bila diukur dengan radioimmunoassay dan 15) N !' dan 1') N +0 unit 3 ml bila diukur

dengan in %itro dan in tes %i%o masing-masing. eranian erat antara hasil tiga tes tersebut

menunukkan bahwa /po diproduksi dengan teknik rekombinan sepenuhnya biologis aktif.

/po yang disekresikan memiliki *r elas +!.000 ketika dianalisis di transfer blot

elektroforesis. /ndo-$4-asetil pengobatan ; mengurangi *r rekombinan /po dari +!.000 ke

-1,000 &data tidak dipublikasikan( menunukkan bahwa protein tersebut glikosilasi.

ekombinan /po telah ditentukan mengandung asam sialat dengan kromatografi gas &data

tidak dipublikasikan(. 8sam sialat terminal struktur karbohidrat /po telah terbukti diperlukan

untuk in %i%o akti%itas &!+(.

%enomi! Organisasi Epo %ene"8nalisis restriksi fragmen 48 limfosit manusia diperiksa

dengan manusia /po c48 mengungkapkan satu band di mencerna dari $am"# /co# 3

"ind### /co# 3 $am"# dan "ind###l $am"#. 8da tiga band terlihat dalam st # digest

&Gambar. !(. 6kuran band hibridisasi dari "ind### 3 $am"# dan st # adalah sama dengan

yang di terisolasi /po genom clone J"/1 seperti ditunukkan pada Gambar. 2. "ibridisasi di

keketatan rendah &55:( tidak mengungkapkan band tambahan yang menunukkan bahwatidak ada yang terkait erat gen /po lain atau pseudogen. Sebuah pencarian homologi dibantu

komputer dari gen /po manusia dan monyet terhadap Gen$ank dan seluruh $ank protein

ayhoff tidak mengungkapkan homologi signifikan dengan 48 atau protein urutan

diterbitkan termasuk angiotensinogen yang telah diusulkan sebagai kemungkinan /po

prekursor &!!(.

PEMBAHASAN


7/9

ampuran pendek probe oligonukleotida sintetik telah digunakan untuk mengisolasi klon dari

perpustakaan c48 &!5 !'(D 4amun probe oligonukleotida campuran belum pernah

digunakan sebelumnya untuk isolasi gen dari perpustakaan genom mamalia terutama karena

kompleksitas dari genom. *emanfaatkan dua campuran dari 12) urutan panang 17 dan 20

nukleotida kami telah dengan cepat mengisolasi gen /po manusia dari pustaka genom

menggunakan Odua-situsO pendekatan konfirmasi. endekatan ini untuk skriningperpustakaan genom menghilangkan seumlah besar positif palsu terkait dengan pendekatan

campuran tunggal-probe. alam penelitian ini tiga dari empat klon yang hibridisasi dengan

kedua campuran penyelidikan yang otentik klon /po seperti ditegaskan oleh urutan 48

atau blot Southern analisis. 8kurasi yang tinggi dari teknik ini merupakan penghematan besar

dalam waktu dan upaya yang diperlukan untuk mengisolasi gen yang diinginkan. unci

keberhasilan pendekatan screening dalam optimalisasi berbagai langkah dalam hibridisasi.

Gunakan filter GeneScreenlus mengakibatkan lebih efisien mengikat 48 dari yang

diperoleh dengan filter nitroselulosa dan uga memiliki keuntungan dari penggunaan

berulang. Sebuah media yang kaya seperti 4BC8* diperlukan untuk mendukung amplifikasi

yang baik dari fag pada enis filterD kelalaian asam casamino atau maltosa menghasilkan

sinyal hibridisasi lemah. :he proteinase pencernaan langkah sangat berkurang latarbelakang spesifik yang membuat menyelidik dengan campuran 12) urutan mungkin. i

bawah dipilih kondisi hibridisasi ketat &2-!0 di bawah td( konsentrasi probe 0025 pmol 3

ml setiap urutan mendekati optimum diperlukan untuk mencapai rasio signal-to-noise yang

baik saat menggunakan campuran dari ukuran ini. 9angkah-langkah optimasi ini bersama-

sama membuat skrining genom dengan oligonukleotida pendek mungkin. elayakan dan

kemudahan menggunakan campuran besar probe oligonukleotida pendek untuk mengisolasi

gen genom mamalia membuka alan baru untuk isolasi gen yang ada m48 atau antibodi

sumber diketahui tersedia dan yang hanya terbatas urutan asam amino yang dikenal.

Selanutnya gen yang dapat dinyatakan dalam %ektor ekspresi mamalia yang pada

gilirannya memungkinkan untuk isolasi m48 dan pembangunan perpustakaan c48.

etersediaan urutan c48 memberikan tugas yang akurat dari protein coding daerah dan

ekson-intron unction sambatan.

$ukti bahwa klon genom terisolasi mengandung gen /po didasarkan pada hasil yang

diperoleh ketika 48 ini dimasukkan ke dalam plasmid SH!0 promotor yang mengandung .

lasmid ini ketika transfected ke sel " menyebabkan produksi protein yang memiliki

akti%itas biologis /poi.e. protein merangsang produksi eritrosit. #se%ident ini dari hasil

bioassay in %i%o berdasarkan 5,;e penggabungan ditingkatkan menadi heme dalam eritrosit

tikus diobati dengan protein dan pada nilai hematokrit yang meningkat ketika protein tersebut

disuntikkan ke tikus normal &data tidak dipublikasikan(. :elah diusulkan bahwa bentuk-

bentuk biologis aktif dari /po disebut erythropoietinogen dan proerythropoietin diproduksidi ginal &lihat ref. + untuk diperiksa(. 8nalisis urutan 48 tidak mendukung hipotesis

tersebut. Gen /po mengkodekan preprotein mungkin terdiri dari 27-amino sinyal asam

peptida dan protein asam 1''-amino matang. rotein yang matang telah terbukti secara

biologis aktif.

Gambar. +. nukleotida urutan gen /po manusia. aerah coding dari ekson telah

diteremahkan dan urutan asam amino yang dikodekan ditampilkan di atas urutan nukleotida.

esidu asam amino diberi nomor dan situs potensial 4-linked glikosilasi yang ditunuk olehtanda bintang. anah atas urutan nukleotida menunukkan wilayah yang berhubungan dengan


8/9

keluarga 8lu urutan diulang. anah bawah urutan nukleotida menunukkan ulangi langsung

mengapit urutan 8lu. Situs yang polyadenylylated dalam m48 digarisbawahi. oli &8(

dapat ditambahkan setelah salah satu dari tiga kemungkinan posisi. otensi poli &8(

88G88 sinyal o%erlined.

Gambar. !. hibridisasi Southern 48 limfosit manusia dicerna dengan pembatasan

endonuklease. 9ane 1 +2-berlabel fragmen J"ind### mencerna dan J17! "ae ### digest

sebagai penanda berat molekulD alur 2 $am"#D alur + "ind### K /co#D lane ! $am"# K

/co#D lane 5 $am"# K "ind###D alur ' st #. 48 dicerna menadi sasaran elektroforesis

pada gel agarosa 07E ditransfer ke GeneScreenlus filter dan hibridisasi dengan nick-

diteremahkan +2-berlabel /po c48 di '50. *encuci posthybridiFation dilakukan di

'50 dengan 015 * 4a9 3 15 m* natrium sitrat p" 70 3 1E 4aodS!.


9/9

:idak ada bukti dari urutan gen yang bentuk lain dari pengolahan diperlukan.

etersediaan umlah yang cukup dari rekombinan /po akan memfasilitasi pemahaman yang

lebih lengkap tentang struktur dan fungsi molekul ini di hemopoiesis dan in%estigasipenggunaan potensinya sebagai agen terapi untuk pasien anemia.

Setelah selesai naskah ini Macobs et al. &!7( melaporkan isolasi gen /po manusia

menggunakan campuran probe oligonukleotida pendekatan yang sama dengan kita yang

mengkode protein /po dengan urutan asam amino identik dengan kita. Sebelumnya 9ee-

"uang &!)( melaporkan isolasi klon /po c48 manusia dari sebuah bank c48 manusia

menggunakan antibodi monoklonal. arena tidak ada informasi urutan diberikan dalam

makalahnya kita tidak bisa membandingkan clone ini dengan kita.

TranslatedcopyofCloningandexpressionofthehumanerythropoietingene.docx

Documents

Transcript of TranslatedcopyofCloningandexpressionofthehumanerythropoietingene.docx